Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами
За допомогою вдосконаленої моделі кріоскопічного осмометра, який дозволяє визначати активність води в біологічних середовищах з точністю ±0,001 Aw, досліджено зміни активності води в суспензіях еритроцитів коня після додавання кріопротекторів 1,2-пропандіолу, диметилсульфоксиду і гліцерину в концент...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30717 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами / В.Н. Кучков, В.Д. Зинченко // Доп. НАН України. — 2010. — № 10. — С. 184-189. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-30717 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Кучков, В.Н. Зинченко, В.Д. 2012-02-12T09:32:07Z 2012-02-12T09:32:07Z 2010 Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами / В.Н. Кучков, В.Д. Зинченко // Доп. НАН України. — 2010. — № 10. — С. 184-189. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30717 577.356:547.42:611.018.51 За допомогою вдосконаленої моделі кріоскопічного осмометра, який дозволяє визначати активність води в біологічних середовищах з точністю ±0,001 Aw, досліджено зміни активності води в суспензіях еритроцитів коня після додавання кріопротекторів 1,2-пропандіолу, диметилсульфоксиду і гліцерину в концентраціях від 0,004 до 0,1% (мас.). Встановлено існування концентраційних областей кріопротекторів, в яких дія кріопротекторів на активність води відображає такі процеси взаємодії кріопротектор/клітина, як адсорбція і конкурентне зв'язування кріопротектора в гідратній оболонці клітинних структур. Using the advanced model of cryoscopic osmometer that allows one to determine the water activity (Aw) in biological environments with an accuracy of ±0.001 Aw, the changes of Aw in equine erythrocyte suspensions with cryoprotectant 1,2-propanediol, dimethyl sulfoxide, and glycerin in concentration from 0.004 till 0.1% (weights) are investigated. The existence of cryoprotectant concentration areas, where the cryoprotectants influence on water activity reflects such processes of cryoprotectant/cell interaction as the adsorption and the competitive binding in a hydration shell of cells structures, is established. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біофізика Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами Water activity as an indicator of cryoprotectant binding with erythrocytes Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| spellingShingle |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами Кучков, В.Н. Зинченко, В.Д. Біофізика |
| title_short |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| title_full |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| title_fullStr |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| title_full_unstemmed |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| title_sort |
активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами |
| author |
Кучков, В.Н. Зинченко, В.Д. |
| author_facet |
Кучков, В.Н. Зинченко, В.Д. |
| topic |
Біофізика |
| topic_facet |
Біофізика |
| publishDate |
2010 |
| language |
Russian |
| container_title |
Доповіді НАН України |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Water activity as an indicator of cryoprotectant binding with erythrocytes |
| description |
За допомогою вдосконаленої моделі кріоскопічного осмометра, який дозволяє визначати активність води в біологічних середовищах з точністю ±0,001 Aw, досліджено зміни активності води в суспензіях еритроцитів коня після додавання кріопротекторів 1,2-пропандіолу, диметилсульфоксиду і гліцерину в концентраціях від 0,004 до 0,1% (мас.). Встановлено існування концентраційних областей кріопротекторів, в яких дія кріопротекторів на активність води відображає такі процеси взаємодії кріопротектор/клітина, як адсорбція і конкурентне зв'язування кріопротектора в гідратній оболонці клітинних структур.
Using the advanced model of cryoscopic osmometer that allows one to determine the water activity (Aw) in biological environments with an accuracy of ±0.001 Aw, the changes of Aw in equine erythrocyte suspensions with cryoprotectant 1,2-propanediol, dimethyl sulfoxide, and glycerin in concentration from 0.004 till 0.1% (weights) are investigated. The existence of cryoprotectant concentration areas, where the cryoprotectants influence on water activity reflects such processes of cryoprotectant/cell interaction as the adsorption and the competitive binding in a hydration shell of cells structures, is established.
|
| issn |
1025-6415 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/30717 |
| citation_txt |
Активность воды как показатель связывания криопротектора с эритроцитами / В.Н. Кучков, В.Д. Зинченко // Доп. НАН України. — 2010. — № 10. — С. 184-189. — Бібліогр.: 14 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT kučkovvn aktivnostʹvodykakpokazatelʹsvâzyvaniâkrioprotektoraséritrocitami AT zinčenkovd aktivnostʹvodykakpokazatelʹsvâzyvaniâkrioprotektoraséritrocitami AT kučkovvn wateractivityasanindicatorofcryoprotectantbindingwitherythrocytes AT zinčenkovd wateractivityasanindicatorofcryoprotectantbindingwitherythrocytes |
| first_indexed |
2025-11-26T01:45:53Z |
| last_indexed |
2025-11-26T01:45:53Z |
| _version_ |
1850604229788434432 |
| fulltext |
УДК 577.356:547.42:611.018.51
© 2010
В.Н. Кучков, В.Д. Зинченко
Активность воды как показатель связывания
криопротектора с эритроцитами
(Представлено академиком НАН Украины В.И. Грищенко)
За допомогою вдосконаленої моделi крiоскопiчного осмометра, який дозволяє визнача-
ти активнiсть води в бiологiчних середовищах з точнiстю ±0,001 Aw, дослiджено
змiни активностi води в суспензiях еритроцитiв коня пiсля додавання крiопротекто-
рiв 1,2-пропандiолу, диметилсульфоксиду i глiцерину в концентрацiях вiд 0,004 до 0,1%
(мас.). Встановлено iснування концентрацiйних областей крiопротекторiв, в яких дiя
крiопротекторiв на активнiсть води вiдображає такi процеси взаємодiї крiопроте-
ктор/клiтина, як адсорбцiя i конкурентне зв’язування крiопротектора в гiдратнiй обо-
лонцi клiтинних структур.
Взаимодействие криопротекторов с клетками является показателем того, что криопротек-
торы не являются инертными веществами по отношению к клеткам. Известно, что мно-
гие, наиболее часто используемые криопротекторы, такие как диметилсульфоксид (ДМСО),
1,2-пропандиол (1,2-ПД), глицерин (ГЛ), являются пертурбантами плазматических мемб-
ран и обладают способностью заменять гидратную воду, стабилизирующую конформацию
белков, липидов и других биомолекул [1]. Токсичность данных веществ рассматривается
с точки зрения гипотезы денатурации белков [2], согласно которой криопротекторы свя-
зывают воду, препятствуя тем самым нормальной гидратации белков и других макромо-
лекул. В работе [3] в контексте токсичности криопротекторов рассмотрены перестройки
внутриклеточной воды, индуцированные данными агентами, а также влияние каждого из
них на макромолекулы (например, превращение глицерина в токсические вещества в ходе
реакций метаболизма). Бакалтчевой и др. [4] показано, что физико-химическая токсичность
алканолов, диолов и глицерина при инкубировании с эритроцитами может быть результа-
том температурозависимых гидрофобных взаимодействий данных веществ с мембранами
клеток, а также следствием их способности изменять диэлектрическую проницаемость сре-
ды и самой мембраны.
Реакционная способность ферментов в системе криопротектор–белок–вода при низко-
температурном хранении биообъектов зависит от состояния воды в системе, для характе-
ристики которого в работе [5] используется такой показатель, как активность воды.
Термин “активность воды”, как и активность любого компонента раствора, известен из
основ физической химии и представляет собой произведение коэффициента активности дан-
ного компонента раствора на его концентрацию [6]. Коэффициент активности — это функ-
ция, впервые введенная Льюисом [7], характеризующая изменения взаимодействия молекул
i -го компонента раствора между собой при переходе от разбавленного раствора к данному.
Другими словами, изменение активности вещества, в том числе и воды, в растворе является
индикатором межмолекулярных взаимодействий в рассматриваемой системе.
Среди экспериментальных методов определения активности воды наибольшее распро-
странение получили методы, основанные на измерении давления насыщенного пара над
184 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №10
поверхностью образца, которое, согласно закону Рауля, является функцией активности во-
ды. Эти методы имеют высокую точность и требуют малого времени для измерения (около
5 мин на одно измерение), однако для анализа необходимо значительное количество образца
(рекомендуемый объем — около 7 мл). В то же время приборы с диэлектрическим датчи-
ком влажности более низкого класса точности (±0,02 Aw — ±0,01 Aw) и не пригодны для
исследования малых изменений активности воды (±0,001 Aw), к тому же длительность
измерения составляет от 30 до 90 мин [8]. Метод криоскопии, обычно применяемый для на-
хождения молекулярных масс растворенных веществ или осмолярности растворов, может
быть использован для определения активности воды в водных растворах.
Привлекательность данного метода состоит в использовании малых объемов исследуе-
мого материала (около 0,15 мл) [9] и экспреcсности получаемой информации (одно измере-
ние занимает примерно 5 мин).
В настоящей работе приведены результаты изучения взаимодействия криопротекто-
ров — 1,2-ПД, ДМСО и глицерина с эритроцитами лошади на основании анализа актив-
ности воды в суспензиях этих клеток. Главное внимание было уделено диапазону низких
концентраций криопротекторов, где вклад адсорбционных взаимодействий криопротекто-
ров с клетками существенный.
Материалы и методы. В качестве криопротекторов использовали 1,2-ПД, глицерин
и ДМСО. Калибровочные растворы NaCl, по температурам замерзания которых определя-
ли температуру замерзания исследуемых образцов, готовили согласно протоколу, прилага-
емому к осмометру ОМКА 1Ц-01 (“Медлабортехника”, Одесса). Образцы цельной крови,
взятые из яремной вены лошади, стабилизировали гепарином (ЗАТ “Бiолiк”, Украина).
Измерение активности воды. Лабораторные осмометры, применяемые в клинической
практике, в большинстве случаев предназначенные для определения осмолярности биоло-
гических жидкостей, не требуют высокой точности. Такие осмометры не позволяют ре-
гистрировать малые изменения осмолярности растворов, которые возникают при малых
вариациях концентрации осмотически активных веществ.
Для достижения необходимой точности измерения использовали охлаждающую и тер-
моизмерительную системы осмометра ОМКА 1Ц-01 с модифицированной нами криоскопи-
ческой ячейкой [10]. Объем кюветы составлял 0,12 мл. Погрешность определения активно-
сти воды не превышала ±0,001 Aw.
Ранее метод криоскопии использовали В.И. Шипулин, Г.А. Аксенова и Н.Д. Лупанди-
на [11] для изучения показателей активности воды в мясных полуфабрикатах, С. Г. Юзов
[9] — в высоковлажных продуктах, C. F. Fontan, J. Chirife [12] — в различных растворах
электролитов и неэлектролитов.
Значения активности воды находили по формуле, полученной из уравнения Клаузиуса–
Клапейрона [13]:
ln(a) =
L(T − T0)
vRTT0
, (1)
где a = P/P0 — активность воды; T0 и T — температуры замерзания чистой воды и иссле-
дуемого раствора соответственно; P0 и P — давление насыщенного пара над чистой водой
и над исследуемым раствором соответственно; ν — количество молей воды; L — теплота
плавления льда; R — универсальная газовая постоянная.
Схема эксперимента. К четырехкратно отмытым эритроцитам лошади, ресуспедиро-
ванным раствором хлорида натрия (300 mOsm), добавляли криопротекторы в различных
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №10 185
Рис. 1. Зависимость активности воды от концентрации 1,2-пропандиола в физиологическом растворе (0,15 М
NaCl): 1 — без эритроцитов; 2 — в том же растворе в присутствии эритроцитов лошади (гематокрит 34%).
На вставке показан фрагмент кривой 2 в диапазоне концентраций криопротектора от 0 до 0,004%
Рис. 2. Зависимость активности воды от концентрации диметилсульфоксида в физиологическом раство-
ре (0,15 М NaCl): 1 — без эритроцитов; 2 — в том же растворе в присутствии эритроцитов лошади (гема-
токрит 52%)
концентрациях. Все образцы центрифугировали (3000 g 5 мин), после чего в измерительную
кювету отбирали супернатант для определения температуры замерзания раствора.
Исследуемые растворы содержали криопротекторы в низких концентрациях (0,004–
0,1%), что позволило оценить влияние адсорбционных взаимодействий криопротекторов
с эритроцитами. Все значения концентраций здесь и далее указаны в массовых процентах.
Количество общей воды в образцах поддерживалось постоянным (варьировалось не бо-
лее чем на 0,001 г при массе образца 1,100 г).
Результаты и обсуждение. На рис. 1, 2, 3 (кривые 1 ) приведены зависимости актив-
ности воды от концентрации криопротекторов 1,2-ПД, ДМСО и глицерина, растворенных
186 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №10
Рис. 3. Зависимость активности воды от концентрации глицерина в физиологическом растворе (0,15 М
NaCl): 1 — без эритроцитов; 2 — в том же растворе в присутствии эритроцитов лошади (гематокрит 48%)
в изотоническом (0,15 М) растворе хлорида натрия без эритроцитов. Наблюдается линейное
снижение активности воды при увеличении концентрации криопротектора от 0,004 до 0,1%.
Полученная экспериментальная зависимость хорошо согласуется с выражением (1) при
малых значениях концентраций растворенных веществ, при которых логарифм может быть
разложен в ряд по малым значениям аргумента и взят линейный член разложения. Откло-
нение от зависимости, описываемой выражением (1), указывает на образование молекуляр-
ных ассоциатов или диссоциацию растворенного вещества [14]. Следовательно, при добавле-
нии криопротекторов в водный раствор хлорида натрия в данном концентрационном диапа-
зоне не происходит образование молекулярных ассоциатов криопротектор–криопротектор
или криопротектор–ион.
При внесении в такую систему эритроцитов для всех исследуемых криопротекторов на-
блюдается общее снижение активности воды в системе — значения активности воды на
кривых 2 на рис. 1–3 смещены вниз относительно таковых для соответствующих растворов
криопротекторов без клеток (кривые 1 на рис. 1–3). По нашему мнению, это обусловлено
связыванием воды с самими клетками. Для проверки этого предположения мы измерили
активность воды в растворе криопротектора одной и той же концентрации (0,0847%), но
с разным содержанием клеток (рис. 4). С целью обеспечения точности измерений экспери-
мент проводили таким образом, чтобы общее количество воды в каждом из исследуемых
образцов поддерживалось постоянным. Обычно готовилось такое количество образца, что
в нем содержалось (0,968± 0,001) г воды и варьировалось содержание других компонентов.
Таким образом, устранялось влияние одной из переменных — общего содержания воды,
в результате чего ее активность определялась только соотношением других компонентов
системы.
Из рис. 4 видно, что активность воды достоверно снижается при увеличении гематокри-
та до 67,2%. Для глицерина и ДМСО наблюдалась аналогичная картина. Это является до-
казательством высказанного выше предположения, что активность воды снижается за счет
увеличения доли воды, связанной с клетками, при увеличении их содержания в системе.
Обратимся к зависимостям, приведенным на рис. 1, 2, 3, кривые 2. При нулевой концент-
рации криопротектора снижение активности воды обусловлено именно действием клеток.
Существует область низких концентраций криопротектора, в пределах которой вариации
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №10 187
Рис. 4. Значение активности воды в суспензиях эритроцитов лошади с разным гематокритом, содержа-
щих 0,0156% 1,2-ПД: 1 — физиологический раствор, содержащий 0,0156% 1,2-ПД, без клеток; 2, 3 — тот же
раствор с эритроцитами с гематокритом 37,9 и 67,2% соответственно. * — различие между контрольным
раствором без клеток и исследуемой суспензией достоверно при p 6 0,05
его содержания в системе не влияют на активность воды. Это достаточно узкий диапазон
концентраций — от 0 до 0,004, 0,005 и 0,0048% для 1,2-ПД, ДМСО и ГЛ соответственно
(см. рис. 1, вставка). Мы объясняем это связыванием молекул криопротектора с клетка-
ми. Связываясь с клетками, молекулы криопротектора “выбывают из игры” и не влияют
на активность воды в системе. При дальнейшем увеличении концентрации криопротекто-
ра следовало бы ожидать снижения активности воды в системе согласно выражению (1),
поскольку общая концентрация растворенных веществ возрастает. Однако, как видно из
рисунков, наблюдается, напротив, повышение активности воды с увеличением концентра-
ции криопротектора в диапазоне концентраций от 0,004 до 0,098% для 1,2-ПД, от 0,005
до 0,025% для ДМСО и от 0,005 до 0,05% для глицерина. Мы объясняем этот эффект
конкурентным связыванием криопротектора с поверхностью клеток, в результате которого
молекулы криопротектора, взаимодействуя с центрами связывания, вытесняют гидратную
воду. При дальнейшем увеличении концентрации криопротектора центры связывания за-
полняются и снижение активности воды определяется концентрацией добавленного крио-
протектора.
Таким образом, нами разработан методический подход исследования взаимодействия
неводного компонента раствора (криопротектора) с клетками. Исследования, проведенные
на эритроцитах лошади, позволили установить существование концентрационных областей
криопротекторов, в которых действие криопротекторов на активность воды отражает такие
процессы взаимодействия криопротектор/клетка, как адсорбция и конкурентное связыва-
ние криопротектора в гидратной оболочке клеточных структур.
1. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. – Киев: Наук. думка, 1994. – 430 с.
2. Arakawa T., Carpenter J. F., Kita Y.A., Crowe J. H. Basis for toxicity of certain cryoprotectants: a
hypothesis // Cryobiology. – 1990. – 27, Issue 4. – P. 401–415.
3. Fahy G.M., Wowk B., Wu J., Paynter S. Improved vitrification solutions based on the predictability of
vitrification solution toxicity // Cryobiology. – 2004. – 48, Issue 1. – P. 22–35.
4. Bakaltcheva I. B., Odeyaleb С.О., Spargo B. J. Effects of alkanols, alkanediols and glycerol on red blood
cell shape and hemolysis // Biochim. et biophys. acta. Biomembranes. – 1996. – 1280, Issue 1. – P. 73–80.
5. Fink A.L. Cryoenzymology: the use of sub-zero temperatures and fluid solutions in the study of enzyme
mechanisms // J. Theor. Biol. – 1976. – 61, Issue 2. – P. 419–445.
188 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2010, №10
6. Физическая химия. Теоретическое и практическое руководство: Учеб. пособие для вузов / Под ред.
Б.П. Никольского. – 2-е изд., перераб. и доп. – Ленинград: Химия, 1987. – 880 с.
7. Льюис Дж.Н., Рендалл М. Химическая термодинамика. – Ленинград: ОНТИ, Химтеорет, 1936. –
532 с.
8. Jarrett M.A., Gusler B., Xiang T., Clapper D. Improved competence in water activity measurement //
AADE 2004. – Technology Conference, Radisson Astrodome, Houston, Texas, 2004. – P. 1–8.
9. Юзов С.Г. Определение активности воды в высоковлажных пищевых продуктах по криоскопической
температуре // Все о мясе. – 2009. – No 1. – С. 29–32.
10. А.с. 4205120/31-25. СССР. Осмометр / В. Д. Зинченко. – Опубл. 30.09.89, БИ No 36. – С. 82.
11. Шипулин В. И., Аксенова Г.А., Лупандина Н.Д. Изучение показателя активности воды мясных
полуфабрикатов в зависимости от уровня введения лактата натрия // Вестн. Сев.-Кавказ. гос. техн.
ун-та. – 2008. – No 2. – С. 97–100.
12. Fontan C. F., Chirife J. The evaluation of water activity in aqueous solutions from freezing point depres-
sion // Int. J. Food Science & Technology. – 2007. – 16, Issue 1. – P. 21–30.
13. Цейтлин Н.А., Зайцев И.Д. Формулы для расчета температуры замерзания водного раствора эле-
ктролита по активности воды // Журн. физ. химии. – 1985. – 59, No 7. – С. 1809–1810.
14. Reif-Acherman S. The pre-history of cryoscopy: what was done before Raoult? // Quimica Nova. – 2009. –
32, Issue 6. – P. 1677–1684.
Поступило в редакцию 16.03.2010Институт проблем криобиологии
и криомедицины НАН Украины, Харьков
V.N. Kuchkov, V. D. Zinchenko
Water activity as an indicator of cryoprotectant binding with
erythrocytes
Using the advanced model of cryoscopic osmometer that allows one to determine the water acti-
vity (Aw) in biological environments with an accuracy of ±0.001 Aw, the changes of Aw in equi-
ne erythrocyte suspensions with cryoprotectant 1,2-propanediol, dimethyl sulfoxide, and glycerin
in concentration from 0.004 till 0.1% (weights) are investigated. The existence of cryoprotectant
concentration areas, where the cryoprotectants influence on water activity reflects such processes of
cryoprotectant/cell interaction as the adsorption and the competitive binding in a hydration shell
of cells structures, is established.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2010, №10 189
|