Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак
Визначено вміст глюкозо-6-фосфату, АТФ, піровиноградної та молочної кислот в клітинах кісткового мозку собак до та після кріоконсервування з ДМСО. Показано, що 7% ДМСО є ефективним кріопротектором, забезпечуючи 83,51±1,9% збереження клітин. Показники рівня АТФ, піровиноградної та молочної кислот в к...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Дата: | 2011 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37385 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак / Г.Ф. Жегунов, Л.А. Водопьянова // Доп. НАН України. — 2011. — № 4. — С. 148-152. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860227646795808768 |
|---|---|
| author | Жегунов, Г.Ф. Водопьянова, Л.А. |
| author_facet | Жегунов, Г.Ф. Водопьянова, Л.А. |
| citation_txt | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак / Г.Ф. Жегунов, Л.А. Водопьянова // Доп. НАН України. — 2011. — № 4. — С. 148-152. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Доповіді НАН України |
| description | Визначено вміст глюкозо-6-фосфату, АТФ, піровиноградної та молочної кислот в клітинах кісткового мозку собак до та після кріоконсервування з ДМСО. Показано, що 7% ДМСО є ефективним кріопротектором, забезпечуючи 83,51±1,9% збереження клітин. Показники рівня АТФ, піровиноградної та молочної кислот в клітинах кісткового мозку собак після заморожування—відігріву в присутності ДМСО залишались близькими до контролю.
The researches of glucoso-6-phospate, ATP, pyruvic acid, and lactic acid in the dog's bone marrow cells before and after cryopreservation with DMSO have been performed. It has been found that 7% DMSO is the most effective cryoprotectant, and 83.51±1.9% of cells survive. The ATP, pyruvic and lactic acids levels in dogs' bone marrow cells after freezing-thawing with DMSO were near control values.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:20:20Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 636.7:611.018.46:577.121:57.086.13
© 2011
Г.Ф. Жегунов, Л. А. Водопьянова
Влияние ДМСО и замораживания—отогрева
на сохранность и содержание субстратов
энергетического обмена в клетках костного мозга собак
(Представлено академиком НАН Украины А.Н. Гольцевым)
Визначено вмiст глюкозо-6-фосфату, АТФ, пiровиноградної та молочної кислот в клi-
тинах кiсткового мозку собак до та пiсля крiоконсервування з ДМСО. Показано, що 7%
ДМСО є ефективним крiопротектором, забезпечуючи 83,51±1,9% збереження клiтин.
Показники рiвня АТФ, пiровиноградної та молочної кислот в клiтинах кiсткового моз-
ку собак пiсля заморожування—вiдiгрiву в присутностi ДМСО залишались близькими
до контролю.
Костный мозг — это комплекс гемопоэтических клеток и элементов микроокружения, ко-
торые активно участвуют в кроветворении. Гемопоэтические клетки костного мозга (ККМ)
через репликацию и дифференцировку поддерживают гемопоэз в течение жизни животно-
го, а клетки микроокружения (ретикулярные, эндотелиальные, остеогенные и др.) коор-
динируют процесс их дифференцировки. Высокий терапевтический потенциал ККМ дает
возможность использовать их при лечении различных нарушений гемопоэза, восстановле-
ния дефицита иммунной системы, коррекции гомеостаза организма после химио- и радио-
терапии [1]. Подобные методы терапии являются новыми для ветеринарии, однако уже по-
казали свою результативность. Таким образом, клиническая потребность в ККМ постоянно
возрастает и требует создания резерва ККМ домашних животных.
Несмотря на то, что в последнее время клетки гемопоэтической системы активно изу-
чаются, многие аспекты их биохимии все еще неопределенны и заслуживают особого вни-
мания. В клинической ветеринарии и трансплантологии актуальным стало хранение ККМ
с помощью технологии замораживания. Известно, что в замороженном состоянии биообъек-
ты хранятся продолжительное время, это позволяет создавать банки клеточного материа-
ла. Многие годы ведутся исследования, направленные на изучение механизмов и борьбу
с негативными последствиями криоповреждения. Применение криопротекторов позволяет
повысить сохранность клеток, но связь между изменением энергетического потенциала и со-
хранностью клеток после криоконсервирования мало изучена.
Известно, что всем клеткам постоянно необходима энергия в виде АТФ. Вместе с тем
запаса АТФ в клетках практически не существует и идет его постоянный синтез [2]. Наруше-
ние какого-либо этапа метаболизма, приводящего к прекращению синтеза АТФ, губительно
для клетки. В связи с этим наша цель состояла в изучении связи между энергетическим
статусом ККМ собак и их сохранностью после действия криопротектора и замораживания—
отогрева.
Материалы и методы. Получение интактных ККМ. ККМ были получены от 3–4-лет-
них собак (n = 10). Все животные были свободны от паразитов и вакцинированы. ККМ
из бедренной кости получали методом костномозговой пункции с вымыванием средой 199.
148 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №4
Концентрацию клеток в суспензии доводили до 1 · 10
7/мл путем разведения средой, содер-
жащей 3% эмбриональной сыворотки крови теленка, 91% среды 199, 6% цитрата натрия
(рабочая среда) [3].
Обработка ККМ ДMСO и замораживание—отогрев. ДMСO постепенно добавляли в су-
спензию ККМ до конечной концентрации 5, 7 и 10% при 4 ◦C. Инкубация при 4 ◦C с ДMСO
длилась 10 мин. Замораживание проводили в пластиковых контейнерах “Eppendorf” по
двухэтапной программе: охлаждение от 4 ◦C со скоростью 2–3 ◦C/мин, до −80
◦C, с дальней-
шим погружением контейнера в жидкий азот (−196
◦C на 24 ч) [4–7]. Отогрев осуществляли
в воде при 41 ◦C. После отогрева ДМСО удаляли путем двухступенчатого разбавления су-
спензии ККМ рабочей средой с последующим центрифугированием (90g, при 4 ◦C, 10 мин).
Затем клетки переносили в фосфатный буфер (pH 7,4) и сразу определяли содержание ме-
таболитов.
Определение сохранности клеток. ККМ окрашивали трипановым синим [6]. Поврежден-
ные клетки окрашиваются в синий цвет, жизнеспособные клетки остаются неокрашенными.
Количество окрашенных и неокрашенных клеток выражали в процентах.
Определение содержания АТФ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф), пировиноград-
ной кислоты (ПВК) и лактата. Содержание метаболитов определяли в безбелковом эк-
стракте из свежеполученных ККМ собак, а также отмытых от 7 и 10% ДМСО после ин-
кубации и замораживания—отогрева [8].
Уровень АТФ и Г-6-Ф определяли в ходе одной ферментативной реакции, где АТФ
в присутствии гексокиназы фосфорилирует глюкозу, образующийся при этом Г-6-Ф, в свою
очередь, служит субстратом для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции. Уровень ПВК
и лактата определяли в ходе ферментативных реакций с лактатдегидрогеназой. Данные
регистрировали спекрофотометрически на СФ-46 (ЛОМО, Россия) при длине волны 340 нм.
Содержание метаболитов выражали в мкмоль/г белка.
Определение содержания белка. Общее количество белка определяли по методу Бред-
форд [9]. К разведенным аликвотам белка добавляли в равном объеме реактив Бредфорд.
После появления окраски измеряли оптическую плотность на СФ-46 (ЛОМО, Россия) при
длине волны 595 нм. Рассчитывали концентрацию белка по калибровочной кривой.
Статистический анализ. Данные представлены как средние значения (M ±m) восьми
независимых экспериментов. Статистическую обработку результатов проводили по методу
Стьюдента–Фишера с использованием программы Microsoft Offiсe Excel.
Результаты и их обсуждение. Ранее нами были проведены сравнительные иссле-
дования показателей сохранности ККМ собак после замораживания—отогрева в присут-
ствии непроникающих и проникающих криопротекторов [10]. Было установлено, что при
замораживании ККМ собак по двухэтапной программе глицерин (10, 20 и 30%) как кри-
опротектор был не эффективен. Также было установлено, что ПЭО-400 (10, 15, 20%) не
способствует достаточно высокой сохранности ККМ собак после замораживания—отогрева.
ДМСО показал себя более перспективным криопротектором, поэтому при изучении сохран-
ности и важнейших энергетических субстратов клетки мы использовали ряд концентраций
ДМСО. Показано, что ДМСО в концентрации 7 и 10% обеспечивает максимальную со-
хранность биоматериала (выше 80%) как после инкубации, так и после замораживания—
отогрева (табл. 1).
При изучении содержания энергетических субстратов установлено, что изменения в со-
держании АТФ и Г-6-Ф в клетках происходят уже на этапе инкубации. Причем уровень
этих веществ снижается как в присутствии криопротектора в среде инкубации, так и без
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №4 149
него (табл. 2). При этом не отмечено достоверных изменений в содержании ПВК. Уровень
молочной кислоты в клетках, инкубированных без криопротектора, не повышается относи-
тельно контроля, а в присутствии ДМСО в концентрации 10 и 7% повышается на 25 и 9%
соответственно.
После криоконсервирования клеток с ДМСО наблюдается небольшое увеличение уров-
ня Г-6-Ф и лактата в сравнении с данными контроля. При этом отмечено незначительное
снижение уровня АТФ.
Известно, что при воздействии растворов криопротекторов и температур, близких к 0 ◦C,
скорость и согласованность биохимических процессов в клетках изменяется [1, 2]. При этом
повышаются расходы энергетического потенциала, что обусловлено многочисленными фак-
торами: переходом на анаэробный гликолиз в клетках in vitro, угнетением биологического
окисления различными ингибиторами, формированием дополнительных путей метаболиз-
ма, идущих на устранение повреждающих факторов и др. [1]. Этим можно объяснить изме-
нения в содержании АТФ и Г-6-Ф в ККМ собак на этапе инкубации.
Установлено, что ККМ зачастую используют анаэробный гликолиз для синтеза АТФ [11–
13]. Это характерно для клеток эритроцитарного, макрофагального ряда, гранулоцитов, мо-
ноцитов и лимфоцитов, клеток, генетически приспособленных к выполнению своих функ-
ций как в условиях нормоксии, так и гипоксии (ишемии при воспалении) [11–13]. Продолжи-
тельное хранение ККМ in vitro невозможно, так как в клетках уменьшается окислительное
декарбоксилирование ПВК и повышается образование лактата, а его накопление губительно
Таблица 1. Влияние ДМСО на сохранность ККМ собак, %
Вариант Инкубация Замораживание—отогрев
Интактные ККМ 98,26 ± 0,3 —
Без криопротектора 97,16 ± 1,84 5,7± 2
∗
ДМСО, 10% 87,63 ± 1,69
∗
82,92 ± 2
∗
ДМСО, 7% 89,72 ± 1,68
∗
83,51 ± 1,9
∗
ДМСО, 5% 89,91 ± 1,23
∗
60,43 ± 2,34
∗#
∗Значения достоверны относительно интактных ККМ собак (контроль), P < 0,001.
#Значения достоверны относительно клеток после инкубации с криопротектором, P < 0,001.
Таблица 2. Влияние ДМСО на содержание субстратов энергетического обмена в ККМ собак, мкмоль/г
белка
Вариант АТФ Г-6-Ф ПВК Лактат
Интактные ККМ 2,318 ± 0,067 0,702 ± 0,042 0,141 ± 0,01 1,256 ± 0,063
Инкубированные
без криопротектора 2,000 ± 0,028
∗
0,500 ± 0,06
∗∗∗
0,145 ± 0,004 1,310 ± 0,079
Инкубированные
с ДМСО 10% 2,091 ± 0,05
∗
0,750 ± 0,045 0,156 ± 0,002 1,318 ± 0,07
∗∗
Инкубированные
с ДМСО 7% 2,208 ± 0,09 0,686 ± 0,052 0,149 ± 0,003 1,130 ± 0,08
Криоконсервированные
с ДМСО 10% 1,737 ± 0,108
∗∗
0,809 ± 0,027
∗
0,166 ± 0,004
∗∗,#
1,567 ± 0,069
∗∗,#
Криоконсервированные
с ДМСО 7% 2,046 ± 0,087
∗
0,852 ± 0,052
∗∗∗,#
0,163 ± 0,003
∗
1,371 ± 0,043
∗∗,#
∗Значения достоверны относительно интактных ККМ собак (контроль), P < 0,05.
∗∗Значения достоверны относительно контроля, P < 0,01.
∗∗∗Значения достоверны относительно контроля, P < 0,001.
#Значения достоверны относительно клеток после экспозиции с криопротектором, P < 0,05.
150 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №4
для клетки [11]. Замедление метаболизма, вплоть до минимальной потребности в глюкозе
и АТФ, возможно только при криоконсервировании.
Снижение уровня АТФ после криоконсервирования может быть связано с повышением
затрат энергетического материала на восстановление структуры и функций в клетках, что
влечет за собой компенсаторное увеличение уровня Г-6-Ф (см. табл. 2) [1].
Снижение уровня ПВК и повышенное содержание молочной кислоты после отогрева
свидетельствует о доминировании анаэробных процессов в размороженных клетках, однако
аэробное получение энергии возможно сразу после введения клеток in vivo.
Полученные данные, подтверждают предположение о существовании зависимости ме-
жду уровнем энергетического обмена и сохранностью криоконсервированых ККМ. Приме-
нение 7% ДМСО способствует не только высокой сохранности ККМ собак, но и сохранению
уровня Г-6-Ф, АТФ, ПВК.
Естественно, что восстановление метаболизма и прежде всего энергетических процес-
сов произойдет быстрее в клетках, где биохимические сдвиги были минимальны [1]. Таким
образом, можно сделать заключение, что сохранение уровня основных метаболитов энерге-
тического обмена свидетельствует о том, что клетки после криоконсервирования с ДМСО
могут поддерживать метаболизм на приемлемом для трансплантации уровне.
1. Taylor M. J. Biology of cell survive in the cold: the basis for biopreservation of tissues and organs / Ed. by
J.G. Baust, J. M. Baust. – Boca Raton: CRC Press, 2007. – P. 15–62.
2. Mamprin M.E., Vega F., Rodrigues J. V. Adenosine 5 triphoshate transport and accumulation during the
cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin solution // World J. Gastroenterol. – 2005. –
11, No 13. – P. 1957–1964.
3. Гольцев А.М., Дубрава Т. Г., Козлова Ю.А. и др. Оценка гемопоэтического потенциала стволовых
кроветворных клеток костного мозга с измененным исходным статусом под действием факторов кри-
оконсервирования // Проблемы криобиологии. – 2005. – 15, № 3. – С. 320–323.
4. Белоус А.М., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты. – Киев: Наук. думка, 1979. – 197 с.
5. Kawano Y., Lee C. L., Watanabe T. et al. Cryopreservation of mobilized blood stem cells at a higher cell
concentration without the use of a programmed freezer // Ann. Hematol. – 2004. – 83, No 1. – P. 50–54.
6. Пушкарь Н.С., Цуцаева А.А., Иткин Ю.А., Шраго М.И. Консервирование костного мозга при уль-
транизких температурах с ПЭО-400: Методич. рекомендации. – Москва, 1984. – 11 с.
7. Idei K., Matsuura S., Fujino Y. et al. Investigation of Various Methods for the Cryopreservation of Canine
Bone Marrow – Derived CD34 + Cells // J. Vet. Med. Sci. – 2008. – 70, No 11. – P. 1211–1217.
8. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / Под ред. М.И. Прохо-
ровой. – Ленинград: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. – 272 с.
9. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – 72, No 1. – P. 248–254.
10. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Сохранность клеток костного мозга собак после экспозиции с кри-
опротекторами и замораживания в жидком азоте // Пробл. криобиологии. – 2006. – 16, № 2. –
С. 207–210.
11. Patel S. D., Paroutsakis E. T., Winter J. N., Muller W.M. The lactate issue revisited: novel feeding
protocols to examine inhibition of cell proliferation and glucose metabolism in hematopoietic cell cultures //
Biotechnol. Prog. – 2000. – 16, No 5. – P. 885–892.
12. Murdoch C., Muthana M., Lewis C. E. Hypoxia regulates macrophage functions in inflammation // J. Immu-
nol. – 2005. – 175, No 10. – P. 6257–6263.
13. Weisdorf D. J., Craddock P. R., Jacob H. S. Granulocytes utilize different energy sources for movement and
phagocytosis // Inflammation. – 1982. – 6, No 3. – P. 245–256.
Поступило в редакцию 09.07.2010Харьковская государственная зооветеринарная академия
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №4 151
G.F. Zhegunov, L.A. Vodop’yanova
Effects of DMSO and freezing — thawing on the preservation and the
content of energy-exchange substrates in dog’s bone marrow cells
The researches of glucoso-6-phospate, ATP, pyruvic acid, and lactic acid in the dog’s bone marrow
cells before and after cryopreservation with DMSO have been performed. It has been found that 7%
DMSO is the most effective cryoprotectant, and 83.51 ± 1.9% of cells survive. The ATP, pyruvic
and lactic acids levels in dogs’ bone marrow cells after freezing-thawing with DMSO were near
control values.
152 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №4
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-37385 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:20:20Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Жегунов, Г.Ф. Водопьянова, Л.А. 2012-10-09T18:03:49Z 2012-10-09T18:03:49Z 2011 Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак / Г.Ф. Жегунов, Л.А. Водопьянова // Доп. НАН України. — 2011. — № 4. — С. 148-152. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37385 636.7:611.018.46:577.121:57.086.13 Визначено вміст глюкозо-6-фосфату, АТФ, піровиноградної та молочної кислот в клітинах кісткового мозку собак до та після кріоконсервування з ДМСО. Показано, що 7% ДМСО є ефективним кріопротектором, забезпечуючи 83,51±1,9% збереження клітин. Показники рівня АТФ, піровиноградної та молочної кислот в клітинах кісткового мозку собак після заморожування—відігріву в присутності ДМСО залишались близькими до контролю. The researches of glucoso-6-phospate, ATP, pyruvic acid, and lactic acid in the dog's bone marrow cells before and after cryopreservation with DMSO have been performed. It has been found that 7% DMSO is the most effective cryoprotectant, and 83.51±1.9% of cells survive. The ATP, pyruvic and lactic acids levels in dogs' bone marrow cells after freezing-thawing with DMSO were near control values. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біологія Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак Effects of DMSO and freezing—thawing on the preservation and the content of energy-exchange substrates in dog's bone marrow cell Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак Жегунов, Г.Ф. Водопьянова, Л.А. Біологія |
| title | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| title_alt | Effects of DMSO and freezing—thawing on the preservation and the content of energy-exchange substrates in dog's bone marrow cell |
| title_full | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| title_fullStr | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| title_full_unstemmed | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| title_short | Влияние ДМСО и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| title_sort | влияние дмсо и замораживания—отогрева на сохранность и содержание субстратов энергетического обмена в клетках костного мозга собак |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37385 |
| work_keys_str_mv | AT žegunovgf vliâniedmsoizamoraživaniâotogrevanasohrannostʹisoderžaniesubstratovénergetičeskogoobmenavkletkahkostnogomozgasobak AT vodopʹânovala vliâniedmsoizamoraživaniâotogrevanasohrannostʹisoderžaniesubstratovénergetičeskogoobmenavkletkahkostnogomozgasobak AT žegunovgf effectsofdmsoandfreezingthawingonthepreservationandthecontentofenergyexchangesubstratesindogsbonemarrowcell AT vodopʹânovala effectsofdmsoandfreezingthawingonthepreservationandthecontentofenergyexchangesubstratesindogsbonemarrowcell |