Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты
Досліджено наявність трипсиноподібних протеїназ та їх інгібіторів у донорській крові людини, промислових відходах одержання гаммаглобуліну, комерційних вітчизняних препаратах (імуноглобулін, інтерферон, герпетична та туляремійна вакцини), у закордонних препаратах (протигрипозні вакцини — ''...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Datum: | 2011 |
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37557 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты / В.А. Дивоча, А.И. Гоженко, В.Н. Михальчук // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 188-196. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860183358876680192 |
|---|---|
| author | Дивоча, В.А. Гоженко, А.И. Михальчук, В.Н. |
| author_facet | Дивоча, В.А. Гоженко, А.И. Михальчук, В.Н. |
| citation_txt | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты / В.А. Дивоча, А.И. Гоженко, В.Н. Михальчук // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 188-196. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Доповіді НАН України |
| description | Досліджено наявність трипсиноподібних протеїназ та їх інгібіторів у донорській крові людини, промислових відходах одержання гаммаглобуліну, комерційних вітчизняних препаратах (імуноглобулін, інтерферон, герпетична та туляремійна вакцини), у закордонних препаратах (протигрипозні вакцини — ''Інфлувак'', ''Ваксігрип'', ''Флюарікс'', вакцина проти гепатиту А — ''Аваксім''; препарати з крові — ''Фраксіпарин'' і ''Солкосерил''). З промислових відходів одержання гаммаглобуліну людини виділено ізоформу інгібітора трипсиноподібних протеїназ, що має захисну дію при зараженні експериментальних тварин смертельною дозою вірусу грипу A/PR/8/34 (А/Н1N1).
The presence of the trypsin-like proteinases and their inhibitors in the blood of human donors, in industrial wastes of gamma-globulin, in commercial domestic preparations (immunoglobulin, interferon, vaccine for herpes and tularemia), in foreign preparations (anti-influenza vaccine — Influvac, Vaxigrір, Fluarix, vaccines for hepatitis A — Avaxim; preparations from blood — Fraxiparine, Solcoseryl) is studied. From the industrial wastes of the gamma-globulin production, an isoform of trypsin-like proteinases with protective activity at infection of experimental animals with a lethal dose of A/PR/8/34 (А/Н1N1) grippe is selected.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:03:27Z |
| format | Article |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
5 • 2011
МЕДИЦИНА
УДК 613.22:517.156:576.858/8.0947
© 2011
В.А. Дивоча, А. И. Гоженко, В. Н. Михальчук
Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах
противовирусной защиты
(Представлено академиком НАН Украины В.В. Гончаруком)
Дослiджено наявнiсть трипсиноподiбних протеїназ та їх iнгiбiторiв у донорськiй кро-
вi людини, промислових вiдходах одержання гаммаглобулiну, комерцiйних вiтчизняних
препаратах (iмуноглобулiн, iнтерферон, герпетична та туляремiйна вакцини), у за-
кордонних препаратах (протигрипознi вакцини — “Iнфлувак”, “Ваксiгрип”, “Флюарiкс”,
вакцина проти гепатиту А — “Аваксiм”; препарати з кровi — “Фраксiпарин” i “Солко-
серил”). З промислових вiдходiв одержання гаммаглобулiну людини видiлено iзоформу
iнгiбiтора трипсиноподiбних протеїназ, що має захисну дiю при зараженнi експеримен-
тальних тварин смертельною дозою вiрусу грипу A/PR/8/34 (А/Н1N1).
Грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) являются глобальной пробле-
мой, они занимают первое место по частоте и количеству случаев в мире и составляют 95%
всех инфекционных заболеваний [1]. По данным Всемирной организации здравоохранения
(ВОЗ), каждый год является годом гриппа, а пандемии происходят раз в 10–40 лет [2].
2009 г. был объявлен годом пандемии гриппа. В Украине в течение 2009 г. умерло от
пневмонии 1127 человек, из них 100 беременных женщин. За медицинской помощью по
поводу ОРВИ и гриппа к врачам обратилось около 5 млн человек [3]. На лечение гриппа
и его осложнений ежегодно в мире расходуется почти 15 млрд долларов США, а в Украине
убыток от каждого случая гриппа в среднем составляет 800–1200 грн.
Ведущая роль в профилактике и лечении гриппа принадлежит вакцинации. Кроме ва-
кцин существует большой выбор лекарственных средств: “Амантадин”, “Ремантадин”, “Ан-
тигрипин” I, II, III, “Арбидол”, “Лаферон”, “Кагоцел”, “Ингаверин”, “Амиксин”, “Интерферон”
и др. [4, 5]. В последнее время используются два новых препарата — “Занамивир” (Relenza)
и “Озельтамивир” (Tamyflu), которые являются ингибиторами нейраминидазы вируса грип-
па и получены путем генной инженерии и кристаллографии [6].
Отечественные ученые, используя эффект расщепления гемагглютинина вируса грипа
трипсиноподобными протеиназами клеток эпителия респираторного тракта на две субъе-
188 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
Рис. 1. Выделение и очистка ингибитора трипсиноподобных протеиназ из отходов I стадии (II + III) про-
мышленного получения гаммаглобулина. Высота колонки — 19,0 см, диаметр — 2,5 см, объем фракций —
10,0 мл, скорость — 40,0 мл/ч. Элюирование 0,1 М фосфатным буфером, pH 7,5, и ступенчатым градиентом
NaCl. Нанесено 9,2 мг белка
диницы (НА1, НА2), получили ингибитор трипсиноподобных протеиназ из клеток здоро-
вых легких мышей, который блокировал развитие гриппа у белых мышей, зараженных
смертельной дозой вируса, вследствие чего 60% животных остались живы. Итогом стало
создание ингибиторно-протеиназной теории гриппа [7].
Целью нашего исследования было обоснование и разработка биотехнологии получения
противовирусного препарата для человека по результатам анализа взаимодействия фер-
ментной системы клетки с вирусом гриппа на основе ингибиторно-протеиназной теории.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) изучить наличие трипси-
ноподобных протеиназ и их ингибиторов в донорской крови человека в отдельных фракциях
плазмы крови; 2) проанализировать наличие протеиназ и ингибиторов трипсиноподобных
протеиназ в вакцинах и препаратах аптечной сети, полученных с крови человека; 3) изу-
чить наличие содержания ингибиторов и протеиназ на всех этапах получения гаммаглобу-
лина промышленным способом и из отходов гаммаглобулинового производства; 4) получить
и очистить ингибиторы сериновых протеиназ из отходов гаммаглобулинового производства;
5) исследовать защитные свойства ингибиторов трипсиноподобных протеиназ, полученных
из отходов гаммаглобулинового производства; 6) обосновать и разработать биотехнологию
получения противовирусного препарата для человека.
Материалы и методы исследований. Вирусы гриппа А/РR/8/34 (А/Н1N1) и В,
штамм РR-109, полученный рекомбинацией вирусов В/Lее/40 и В/СССР/100/83, которые
были вырощены на девятидневных куриных эмбрионах. Штаммы вирусов гриппа получе-
ны в НИИ вирусологии им. И.Д. Ивановского АМН России. В исследованиях использовали
беспородных белых мышей и мышей линии “Ваlbс”, куриные эмбрионы, донорскую кровь 30
человек в возрасте от 18 до 24 лет, донорскую плазму четырех групп крови, эритроцитар-
ную массу, сыворотку крови человека, отходы промышленного получения гаммаглобулина
и альбумина, отечественные препараты: интерферон, иммуноглобулин человеческий, гер-
петическую, туляремийную и гонококковую вакцины.
Консервированная эритроцитарная масса тридцати доноров получена из отделения ре-
анимации второй городской клинической больницы г. Одесса, эритроцитарная масса с про-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 189
сроченным сроком годности (после 21 сут хранения) — на областной станции перелива-
ния крови г. Одесса. Интерферон лейкоцитарный человеческий, иммуноглобулин челове-
ческий плацентарный и донорский 10% (Киев, “Биофарма”), вакцина герпетическая (Одес-
са, “Завод бакпрепаратов”) были закуплены в аптеках г. Одесса. Плазма крови человека
четырех групп крови и отходы после выделения гаммаглобулина и альбумина получены
на областной станции переливания крови г. Одесса. Препараты “Инфлувак”, “Аваксим”,
“Флюарикс”, “Фраксипарин”, “Ваксигрип” и “Солкосерил” изучались до окончания срока их
годности.
В работе использовали вирусологические и биохимические методы исследования.
Результаты и их обсуждение. По результатам изучения донорской крови человека
и отдельных фракций крови на наличие в них трипсиноподобных протеиназ было установ-
лено, что донорская кровь человека содержит как трипсиноподобную протеиназу, так и ее
эндогенный ингибитор (табл. 1).
В среднем активность трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора составляли (21,4±
± 1,96) ммоль/(мин · мг белка) и (62,7 ± 7,31) у. е. (1 у. е. соответствует 1 мкг инактивиро-
ванного кристаллического трипсина) соответственно. Наибольшая активность протеиназы
выявлена в донорской крови II группы — (22,85± 2,06) ммоль/(мин ·мг белка). Активность
ингибитора трипсиноподобных протеиназ была самой высокой и практически одинаковой
в донорской крови I и IV групп — (70,07 ± 6,80) и (70,26 ± 8,11) у. е. соответственно [8]. Во
II группе крови активность ингибитора была наименьшей — (51,59 ± 5,06) у. е. Этот дис-
баланс во II группе крови можно объяснить дефицитом синтеза эндогенного ингибитора
трипсиноподобной протеиназы.
В эритроцитарной массе донорской крови активность трипсиноподобной протеиназы
была в 1,5 раза выше, чем в сыворотке крови. Активность протеиназы в эритроцитарной
массе донорской крови IV группы была в 2,0 раза выше, чем в сыворотке крови доноров
этой же группы. Для увеличения выхода фермента была использована методика гемолиза
эритроцитов. Как показали исследования, двухкратное замораживание и оттаивание не
влияло на выход фермента. При хранении донорской крови человека на протяжении года
при −18
◦С активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ уменьшалась в 5,0 раз.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что свежая донорская кровь содержит
высокоактивную трипсиноподобную протеиназу и ее ингибитор. Активность ингибитора
трипсина была больше в сыворотке, чем в эритроцитарной массе, и не зависела от актив-
ности протеиназы.
В исследованных коммерческих препаратах — человеческом иммуноглобулине, интер-
фероне лейкоцитарном, герпетической вакцине, выявлено наличие трипсиноподобной про-
теиназы и ингибитора трипсиноподобных протеиназ. Наибольшая активность ингибитора
трипсиноподобных протеиназ обнаружена в человеческом плацентарном иммуноглобули-
не — 60,185 у. е. (1 у. е. соответствует 1 мкг инактивированного трипсина). Ингибитор был
выявлен в интерфероне (15,79 у. е.) и в герпетической вакцине (19,750 у. е.). Туляремийная
вакцина содержала только следы ингибитора (0,544 у. е.). В гоновакцине не было установ-
лено ни протеиназной, ни ингибиторной активности. Активность ингибитора трипсинопо-
добных протеиназ в иммуноглобулине была в 4,0 раза больше, чем в интерфероне [9].
Полученные результаты позволили нам предположить, что отечественные препараты
недостаточно очищены от балластных белков. Поэтому в дальнейшем нами определялось
наличие протеолитических ферментов и их ингибиторов в вакцинах и препаратах крови,
которые выпускаються фирмами разных зарубежных стран.
190 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
Как показали исследования (табл. 2), все коммерческие препараты зарубежных стран
содержали в себе как ингибитор, так и трипсиноподобную протеиназу. Наибольшая актив-
ность ингибитора установлена в противогриппозной вакцине “Инфлувак” — 180,86 у. е. во-
дной суспензии (1 у. е. соответствует 1 мкг инактивированного трипсина), и в препарате
“Фраксипарин” — 111,30 у. е. водной суспензии. Наименшая активность ингибитора трипси-
ноподобных протеиназ наблюдалась в препарате “Аваксим” — инактивированная вакцина
против гепатита А.
Противогриппозные вакцины: “Ваксигрип” и “Флюарикс” в своем составе содержали
большое количество ингибитора и трипсиноподобную протеиназу. Среди исследуемых вак-
Таблица 1. Активность трипсиноподобной протеиназы и ее ингибитора в донорской крови человека
№ п/п
Группа
крови
Объем
крови, мл
Активность протеиназы,
ммоль арг/(мин · мг белка)
Содержание
белка, г/мл
Активность
ингибитора (ИА), у. е.
1 0/I 250,0 14,92 3,97 37,36
2 250,0 25,83 3,42 186,83
3 125,0 5,31 4,71 81,52
4 125,0 16,24 5,89 57,75
5 150,0 22,72 4,54 52,47
6 150,0 25,15 4,40 9,26
7 150,0 18,56 4,62 64,81
8 125,0 13,62 4,66 30,86
9 125,0 19,27 4,59 154,32
10 115,0 25,07 4,79 141,18
11 115,0 21,43 4,33 108,02
12 140,0 13,82 2,24 50,26
13 150,0 26,73 1,92 50,26
14 125,0 29,14 1,60 17,48
15 5,0 29,45 2,81 8,74
0/I (M ±m) 20,47 ± 1,89 3,90 ± 0,34 70,07 ± 6,80
16 А/II 2,0 24,32 3,47 16,98
17 2,0 20,43 2,52 122,26
18 150,0 18,71 5,95 40,76
19 140,0 17,44 4,91 71,33
20 150,0 19,82 5,15 30,57
21 125,0 20,47 4,70 10,19
22 125,0 26,52 4,45 20,38
23 125,0 26,74 1,88 43,71
24 125,0 27,00 1,77 98,34
25 150,0 22,43 1,64 122,34
26 125,0 26,51 4,45 20,38
27 150,0 23,88 2,13 21,85
А/II (M ±m) 22,85±2,06 3,59 ± 0,32∗ 51,59 ± 5,06∗
28 АВ/IV 250,0 21,04 3,77 4,00
29 1 23,23 4,61 185,19
30 1 17,73 4,89 21,60
АВ/IV (M ±m) 20,67 ± 1,84 4,42 ± 0,41 70,26 ± 8,11
В среднем (M ±m) 21,40 ± 1,96 3,83 ± 0,28 62,70 ± 7,31
Пр и м е ч а н и е . Здесь и в табл. 2 активность ингибитора трипсина, у. е. — 1 у. е. соответствует 1 мкг
инактивированного кристаллического трипсина. ∗Достоверное снижение показателя относительно показа-
телей АВ/IV группы крови.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 191
цин меньше всего трипсиноподобной протеиназы содержалось в препарате “Аваксим” —
0,24 ммоль/(мин ·мг белка водной суспензии), в то же время в препарате “Инфлувак” была
определена самая высокая активность трипсиноподобной протеиназы — 1,53 ммоль/(мин·мг
белка водной суспензии). В составе препарата “Солкосерил” установлена активность инги-
битора трипсина (84,34 у. е.), активность протеиназы (0,26 ммоль/(мин ·мг белка)) и очень
большое количество общего белка.
Исходя из вишеизложенного можно сделать вывод, что зарубежные препараты не очи-
щены на 100% от белковых примесей, или невозможно отделить вирусные белки от ком-
понентов клетки. Вирусные белки крепко ассоциированы с компонентами клетки, поэтому
структуру вируса гриппа необходимо рассматривать с учетом взаимодействия с клеточными
ферментами и их ингибиторами.
В связи с тем, что высокая активность трипсиноподобной протеиназы была определе-
на в препаратах из плазмы донорской крови, мы решили провести проверку отходов всех
стадий получения гаммаглобулина на наличие в них трипсиноподобной протеиназы и ее
ингибитора.
На I стадии выделения гаммаглобулина с человеческой донорской крови получают
фракцию II + III, с которой затем выделяют гаммаглобулин и альбумин, а фракция фи-
бриногена идет в отходы (утилизируется). Как показали результаты наших исследований
(табл. 3), в супернатанте и в осадке содержались трипсиноподобная протеиназа и ин-
гибитор трипсиноподобной протеиназы — 481,11 мг/кг (мг ингибитора на 1,0 кг отхо-
дов). Также в материале обнаружен α1-антитрипсин, или α2-ингибитор протеиназ, ко-
торый является основным ингибитором сериновых протеиназ плазмы крови человека.
Таблица 2. Наличие трипсиноподобной протеиназы и активность ее ингибитора в коммерческих иммуно-
биологических препаратах, выпускаемых фирмами зарубежных стран (n = 3)
Название
препарата
Фирма, страна
Содержание белка,
г белка/л водной
суспензии
Активность
протеиназы, ммоль
арг/(мин · мг белка)
Активность
ингибитора
(ИА), у. е.
“Инфлувак” “Solvay”, Нидерланды 16,34 ± 1,20 1,53 ± 0,14 180,86 ± 17,34
“Флюарикс” “Смит Клейн”, Германия 9,60± 0,81 0,61 ± 0,054 96,52 ± 9,24
“Ваксигрип” “Пастер”, Франция 2,92± 0,30 0,31 ± 0,03 101,73 ± 9,01
“Аваксим” “Пастер”, Франция 14,73 ± 1,32 0,24 ± 0,02 8,924 ± 0,77
“Фраксипарин” “Sanofi”, Франция 4,81± 0,42 0,28 ± 0,03 111,30 ± 10,24
“Солкосерил” “Солко”, Швейцария 18,69 ± 1,70 0,26 ± 0,02 84,34 ± 8,27
Таблица 3. Активность трипсиноподобной протеиназы и содержание ее эндогенного ингибитора во фракци-
ях отходов получения гаммаглобулина промышленным способом
Фракция
Показатель
Активность
протеиназы, ∆E508
Содержание белка,
г белка/кг отходов
Содержание ингибитора,
мг ингибитора/кг отходов
II+III-глобулины, центрифугат 0,210 ± 0,02 4,262 ± 0,38 481,0 ± 23,4
Осадок протромбина 0,210 ± 0,02 2,167 ± 0,19 436,0 ± 16,3
Осадок α, β-глобулины
и липоиды 0,250 ± 0,02 4,381 ± 0,42 469,0 ± 18,4
IV осадок
(альбумин + другие белки) 0,157 ± 0,01 3,270 ± 0,31 137,0 ± 6,1
Фильтрат (альбумин) 0,120 ± 0,01 4,800 ± 0,45 166,0 ± 8,5
192 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
На его часть в норме приходится 90 % антитрипсиновой активности плазмы крови че-
ловека [10].
В отходах II стадии очистки гаммаглобулина содержалось большое количество α, β-гло-
булинов и липоидов. Активность трипсиноподобной протеиназы в этих отходах была самой
высокой. Содержание ингибитора трипсиноподобных протеиназ составляло 469,87 мг/кг.
В данном материале выявлен протромбин 3 (АТ-3), он же фактор гепарина — регулято-
ра свертывания системы крови. В зоне α-глобулинов обнаружены также α1-антитрипсин
и α2-макроглобулин, которые являются основными ингибиторами сериновых протеиназ
крови человека.
На III стадии промышленного получения гаммаглобулина в отходы идет осадок, со-
держащий профибринолизин (плазминоген), из которого виделяют плазминоген, который
является протеолитическим ферментом (трипсиноподобная протеиназа). Содержание ин-
гибитора трипсиноподобных протеиназ в отходах этой стадии получения гаммаглобулина
составляло 137,40 мг/кг, что в четыре раза меньше, чем после I и II стадий.
На IV стадии получения гаммаглобулина после фильтрации супернатанта № 3 (завод-
ской номер) на бумажных фильтрах оставалось большое количество трипсиноподобной
протеиназы и 166,37 мг/кг ингибитора.
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что сырьем для получе-
ния ингибитора трипсиноподобных протеиназ могуть быть отходы I и II стадий техноло-
гического процесса промышленного выделения гаммаглобулина, которые содержали наи-
большее количество этого ингибитора.
Разработка способа получения ингибитора в очищенном виде включала следующие эта-
пы: экстракцию фермента, ультразвуковую дезинтеграцию отходов, ионообменную хрома-
тографию на ДЭАЭ-целлюлозе, диализ, аффинную хроматографию на трипсин-сефарозе
4В и лиофильное высушивание. Ионообменную хроматографию проводили в 0,1 М фосфат-
ном буфере (pH 7,5). Линейный градиент создавали в интервале 0–0,1 М NаСl на этом же
буфере.
Нами установлено, что в отходах I стадии промышленного получения гаммаглобули-
на содержалось пять изоформ ингибитора трипсиноподобных протеиназ, которые отлича-
лись между собой как зарядом, так солерастворимостью. Наибольшее количество ингиби-
тора трипсиноподобной протеиназы содержалось в пятой изоформе, которая элюировалась
с колонки 0,5 М NаСl, а наименьшее — в четвертой и третей изоформах, которые элюи-
ровались с колонки 0,2 и 0,1 М NаСl [11]. Эти отличия могут быть обусловлены разли-
чием в аминокислотном составе и большим количеством форм данного ингибитора. Пя-
тую изоформу, которая обладала самой высокой активностью ингибитора, в дальнейшем
использовали для изучения терапевтических свойств при экспериментальном гриппе у бе-
лых мышей.
Кроме того, с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе из отходов
IV стадии промышленного получения гаммаглобулина (метод Кона) в хроматографичес-
ких фракциях выявлено девять изоформ, которые обладали ингибирующей активностью
по отношению к трипсиноподобным протеиназам. Пять изоформ (I–V), которые обладали
ингибирующей активностью, элюировались с колонки с основными белками 0,1 М NаСl
фосфатным буфером, pH 7,5.
Четыре изоформы (VI–IX), которые обладали ингибирующей активностью по отноше-
нию к трипсиноподобным протеиназам, элюировались с колонки линейным градиентом —
0,01–1,0 М NаСl. Анализ ингибирующей активности показал, что наибольшей активностью
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 193
обладала пятая изоформа ингибитора (180,13 у. е.), а наименьшей — первая (83,3 у. е.).
Наибольший выход белка установлен для шестой изоформы ингибитора, а наименьший —
для пятой изоформы. Эти результаты свидетельствуют о том, что наибольшей удельной
активностью обладала пятая изоформа ингибитора.
Методом ионообменной хроматографии ингибиторы трипсиноподобных протеиназ были
очищены от балластных белков в среднем на 99,9%. Четыре изоформы ингибитора (V, VI,
VII и IX), которые обладали максимально высокой ингибирующей активностью, в дальней-
шем использовали для изучения терапевтических свойств при экспериментальной гриппо-
зной инфекции у мышей.
Для изучения защитного действия ингибиторов трипсиноподобных протеиназ на выжи-
ваемость мышей, зараженных смертельной дозой вируса гриппа А/РR/8/34, были исполь-
зованы белые мыши линии “Ваlbс” массой 16–18 г и пятая изоформа ингибитора, выде-
ленного из отходов I стадии промышленного получения гаммаглобулина, потому что она
имела самую высокую активность ингибитора (132,52 у. е.) и низкие показатели активно-
сти трипсиноподобной протеиназы (0,0027 ммоль/(мин ·мг белка в пробе)). По результатам
исследований (табл. 4), животные 1-й и 2-й групп погибли на 6–7-е сутки после инфици-
рования вирусом гриппа. В 3-й группе из 15 животных на 14-е сутки после заражения
и лечения выжило 12 особей (80 %).
Животные 4, 5, 6 и 7-й групп оставались живыми в течение всего срока наблюдения.
Кроме того, установлено, что пятая изоформа ингибитора не оказывала токсического дей-
ствия, потому что белые мыши 4-й группы оставались живыми и на 15-е сутки после вве-
дения ингибитора.
Для изучения защитного действия ингибиторов трипсиноподобных протеиназ, выделен-
ных из отходов IV стадии получения гаммаглобулина методом Кона, были изучены че-
тыре фракции (№ 77, 107, 117, 166) после ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлю-
лозе, которые имели высокие показатели содержания ингибитора и в которых почти не
определялась активность трипсиноподобной протеиназы. Белые мыши были разделены на
шесть групп по пять особей в каждой. Животных заражали интраназально вирусом гриппа
А/PR/8/34 в объеме 0,05 мл, в дозе 1 : 4 гемагглютинирующей активности. Как показа-
Таблица 4. Влияние пятой изоформы ингибитора трипсиноподобных протеиназ на выживаемость мышей,
зараженных смертельной дозой (2,5−2 ЛД50) вируса гриппа А/PR/8/34
Группа
Количество
животных
в группе
Доза
вируса
Доза ингибитора
на мышь,
мкг белка
Количество
мышей
Количество
животных, которые
выжили, %пало выжило
1, вирус гриппа 15 10−1 — 15 — 0
2, вирус гриппа
+ трипсин крист. 15 10−1 20 мкг 15 — 0
3, вирус гриппа
+ ингибитор из отходов 15 10−1 20 мкг 3 12 80
4, ингибитор из отходов
(токсичность) 15 — 20 мкг — 15 100
5, трипсин крист.
(контроль) 10 — 20 мкг — 10 100
6, фосфатный буфер
(контроль) 10 — 0,2 мл — 10 100
7, контроль животных 10 — — — 10 100
194 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
ли результаты исследований, на 14-е сутки после инфицирования гемагглютинирующая
активность отмечалась как в легких, так и в сыворотке крови всех животных, которых
предварительно заражали вирусом гриппа A/PR/8/34.
Таким образом, ингибиторы трипсиноподобных протеиназ, которые были выделены из
отходов IV стадии промышленного получения гаммаглобулина, не обладали защитным эф-
фектом при экспериментальном гриппе. Пятая изоформа ингибитора трипсиноподобных
протеиназ, выделенных из отходов I стадии промышленного получения гаммаглобулина,
имела выраженные противовирусные свойства. Не исключено, что эта изоформа может
быть использована не только для лечения гриппа, но и при других вирусных инфекциях,
в которых расщепление белка-предшественника вирусов проводится клеточными трипси-
ноподобными протеиназами.
Следовательно, полученные данные подтверждают выдвинутую нами протеиназно-ин-
гибиторную теорию патогенеза гриппа, причем дают основания для разработки новой ме-
тодики лечения гриппа и профилактики его осложнений.
1. Онищенко В. В., Зверев В. В., Катлинский А.В. и др. Тетравакцина – новый принципиальный подход
к предотвращению пандемии гриппа // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. –
2007. – № 4. – С. 15–16.
2. Грипп и другие вирусные респираторные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и
терапия / Под ред. О.И. Киселева, А.А. Сомининой, И. Г. Маринича. – Москва: Боргес, 2003. – 244 с.
3. Актуальнi питания вакцинацiї в Українi: Постанова № 3 Засiдання Вченої медичної ради МОЗ Укра-
їни вiд 24 листопада 2009 року.
4. Ленева И.А., Федякина И.Т., Гуськова Т.А. и др. Чувствительность различных штаммов вируса к
арбидолу. Изучение эффекта арбидола на репродукцию вируса гриппа А в комбинации с разными
противовирусными препаратами // Терапевт. архив. – 2005. – № 8. – С. 84–88.
5. Дiвоча В.А., Михальчук В.М. Традицiйнi та перспективнi пiдходи до профiлактики грипу // Вiсн.
наук. дослiджень. – 2008. – № 3 (52). – С. 4–6.
6. Ferraris O., Kessler N., Lina B. Sensitivity of influenza viruses to Zanamivir and Oseltamivir: study
performed on viruses circulating in France prior the introduction of neuraminidase inhibitors in clinical
practice // Antivirical Res. – 2005. – 68. – P. 43–48.
7. Дивоча В.А., Михальчук В.М., Гоженко А.И. Молекулярно-биологическое обоснование антипротеи-
назной терапии гриппа // Журн. АМН України. – 2009. – 15, № 1. – С. 19–21.
8. Divocha V. P., Mikhalchuk V.M., Gozhenko A. I. et al. Serynopodobne proteinazy w niektórych procesach
fizjologicznych // Biomedyczne aspekty turystyki i rekreacji. WWSTiZ, WSG. ORSE. – Poznaс: Bydgoszcz,
2009. – С. 198–204.
9. Дивоча В.А., Михальчук В.Н., Гоженко А.И. и др. Трипсиноподобная протеиназа и ее ингибиторы
в вакцинах и иммунобиологических препаратах крови // Журн. АМН України. – 2009. – 15, № 3. –
С. 609–625.
10. Михальчук В.Н., Дiвоча В.А., Гоженко А. I. Наявнiсть трипсиноподiбної протеази та її iнгiбiторiв у
вiдходах отримання гаммаглобулiну // Мед. хiмiя. – 2006. – 8, № 1. – С. 60–63.
11. Дивоча В.А., Михальчук В.Н., Гоженко А.И. Трипсиноподобные протеиназы – мишень для созда-
ния противовирусных препаратов // Современные проблемы инфекционной патологии человека: Сб.
науч. работ. – Минск, 2008. – Вып. 1. – С. 123–126.
Поступило в редакцию 29.11.2010Государственное предприятие “Украинский НИИ
медицины транспорта” МЗО Украины, Одесса
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 195
V.A. Divocha, A. I. Gozhenko, V. M. Mikhalchuck
The role of proteinases of blood and their inhibitors in the mechanisms
of anti-influenza defense
The presence of the trypsin-like proteinases and their inhibitors in the blood of human donors,
in industrial wastes of gamma-globulin, in commercial domestic preparations (immunoglobulin,
interferon, vaccine for herpes and tularemia), in foreign preparations (anti-influenza vaccine —
Influvac, Vaxigriр, Fluarix, vaccines for hepatitis A — Avaxim; preparations from blood — Fraxi-
parine, Solcoseryl) is studied. From the industrial wastes of the gamma-globulin production, an
isoform of trypsin-like proteinases with protective activity at infection of experimental animals
with a lethal dose of A/PR/8/34 (А/Н1N1) grippe is selected.
196 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-37557 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:03:27Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Дивоча, В.А. Гоженко, А.И. Михальчук, В.Н. 2012-10-17T14:47:49Z 2012-10-17T14:47:49Z 2011 Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты / В.А. Дивоча, А.И. Гоженко, В.Н. Михальчук // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 188-196. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37557 613.22:517.156:576.858/8.0947 Досліджено наявність трипсиноподібних протеїназ та їх інгібіторів у донорській крові людини, промислових відходах одержання гаммаглобуліну, комерційних вітчизняних препаратах (імуноглобулін, інтерферон, герпетична та туляремійна вакцини), у закордонних препаратах (протигрипозні вакцини — ''Інфлувак'', ''Ваксігрип'', ''Флюарікс'', вакцина проти гепатиту А — ''Аваксім''; препарати з крові — ''Фраксіпарин'' і ''Солкосерил''). З промислових відходів одержання гаммаглобуліну людини виділено ізоформу інгібітора трипсиноподібних протеїназ, що має захисну дію при зараженні експериментальних тварин смертельною дозою вірусу грипу A/PR/8/34 (А/Н1N1). The presence of the trypsin-like proteinases and their inhibitors in the blood of human donors, in industrial wastes of gamma-globulin, in commercial domestic preparations (immunoglobulin, interferon, vaccine for herpes and tularemia), in foreign preparations (anti-influenza vaccine — Influvac, Vaxigrір, Fluarix, vaccines for hepatitis A — Avaxim; preparations from blood — Fraxiparine, Solcoseryl) is studied. From the industrial wastes of the gamma-globulin production, an isoform of trypsin-like proteinases with protective activity at infection of experimental animals with a lethal dose of A/PR/8/34 (А/Н1N1) grippe is selected. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Медицина Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты The role of proteinases of blood and their inhibitors in the mechanisms of anti-influenza defense Article published earlier |
| spellingShingle | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты Дивоча, В.А. Гоженко, А.И. Михальчук, В.Н. Медицина |
| title | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| title_alt | The role of proteinases of blood and their inhibitors in the mechanisms of anti-influenza defense |
| title_full | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| title_fullStr | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| title_full_unstemmed | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| title_short | Роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| title_sort | роль протеиназ крови и их ингибиторов в механизмах противовирусной защиты |
| topic | Медицина |
| topic_facet | Медицина |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37557 |
| work_keys_str_mv | AT divočava rolʹproteinazkroviiihingibitorovvmehanizmahprotivovirusnoizaŝity AT goženkoai rolʹproteinazkroviiihingibitorovvmehanizmahprotivovirusnoizaŝity AT mihalʹčukvn rolʹproteinazkroviiihingibitorovvmehanizmahprotivovirusnoizaŝity AT divočava theroleofproteinasesofbloodandtheirinhibitorsinthemechanismsofantiinfluenzadefense AT goženkoai theroleofproteinasesofbloodandtheirinhibitorsinthemechanismsofantiinfluenzadefense AT mihalʹčukvn theroleofproteinasesofbloodandtheirinhibitorsinthemechanismsofantiinfluenzadefense |