Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом
Ген ВСАТ2 томата було картовано на хромосомі 7 за допомогою методу поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів. Шляхом Нозерн-блот-гібридизації вивчено рівень експресії даного гена в різних типах тканин. Дослідження субклітинної локалізації ВСАТ2-GFP протеїну проведено з використанням конфокальної...
Gespeichert in:
| Datum: | 2011 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainian |
| Veröffentlicht: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Schriftenreihe: | Доповіді НАН України |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37562 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом / А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 161-165. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-37562 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-375622025-02-23T17:48:28Z Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом Molecular cloning and analysis of Lycopersicon esculentum gene encoding the tomato mitochondrial-targeted BCAT Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. Біологія Ген ВСАТ2 томата було картовано на хромосомі 7 за допомогою методу поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів. Шляхом Нозерн-блот-гібридизації вивчено рівень експресії даного гена в різних типах тканин. Дослідження субклітинної локалізації ВСАТ2-GFP протеїну проведено з використанням конфокальної мікроскопії. Виявлено, що ВСАТ2 локалізується в мітохондріях. Отримані результати обговорюються з огляду на участь даного ферменту в метаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом. Tomato BCAT2 gene is mapped on chromosome 7 by the RFLP-method. Its expression level in various tissue types is determined by Northern blot hybridization. Subcellular localization of ВСАТ2-GFP protein is investigated with the help of confocal microscopy. It was localized in mithochondria. The results obtained are discussed with regard to the role of this enzyme in the metabolism of branched-chain amino acids. 2011 Article Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом / А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 161-165. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37562 577.152.2:575.116.4 uk Доповіді НАН України application/pdf Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Ukrainian |
| topic |
Біологія Біологія |
| spellingShingle |
Біологія Біологія Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом Доповіді НАН України |
| description |
Ген ВСАТ2 томата було картовано на хромосомі 7 за допомогою методу поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів. Шляхом Нозерн-блот-гібридизації вивчено рівень експресії даного гена в різних типах тканин. Дослідження субклітинної локалізації ВСАТ2-GFP протеїну проведено з використанням конфокальної мікроскопії. Виявлено, що ВСАТ2 локалізується в мітохондріях. Отримані результати обговорюються з огляду на участь даного ферменту в метаболізмі амінокислот з розгалуженим ланцюгом. |
| format |
Article |
| author |
Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. |
| author_facet |
Кочевенко, А.С. Ферні, А.Р. |
| author_sort |
Кочевенко, А.С. |
| title |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| title_short |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| title_full |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| title_fullStr |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| title_full_unstemmed |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| title_sort |
клонування і аналіз гена lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом |
| publisher |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| publishDate |
2011 |
| topic_facet |
Біологія |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/37562 |
| citation_txt |
Клонування і аналіз гена Lycopersicon esculentum, що кодує мітохондріальну ізоформу трансамінази амінокислот з розгалуженим ланцюгом / А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi // Доп. НАН України. — 2011. — № 5. — С. 161-165. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
| series |
Доповіді НАН України |
| work_keys_str_mv |
AT kočevenkoas klonuvannâíanalízgenalycopersiconesculentumŝokoduêmítohondríalʹnuízoformutransamínaziamínokislotzrozgaluženimlancûgom AT ferníar klonuvannâíanalízgenalycopersiconesculentumŝokoduêmítohondríalʹnuízoformutransamínaziamínokislotzrozgaluženimlancûgom AT kočevenkoas molecularcloningandanalysisoflycopersiconesculentumgeneencodingthetomatomitochondrialtargetedbcat AT ferníar molecularcloningandanalysisoflycopersiconesculentumgeneencodingthetomatomitochondrialtargetedbcat |
| first_indexed |
2025-11-24T05:28:26Z |
| last_indexed |
2025-11-24T05:28:26Z |
| _version_ |
1849648329586114560 |
| fulltext |
УДК 577.152.2:575.116.4
© 2011
А.С. Кочевенко, А.Р. Фернi
Клонування i аналiз гена Lycopersicon esculentum,
що кодує мiтохондрiальну iзоформу трансамiнази
амiнокислот з розгалуженим ланцюгом
(Представлено академiком НАН України Ю.Ю. Глебою)
Ген ВСАТ2 томата було картовано на хромосомi 7 за допомогою методу полiморфiз-
му довжин рестрикцiйних фрагментiв. Шляхом Нозерн-блот-гiбридизацiї вивчено рi-
вень експресiї даного гена в рiзних типах тканин. Дослiдження субклiтинної локалiзацiї
ВСАТ2-GFP протеїну проведено з використанням конфокальної мiкроскопiї. Виявлено,
що ВСАТ2 локалiзується в мiтохондрiях. Отриманi результати обговорюються з огля-
ду на участь даного ферменту в метаболiзмi амiнокислот з розгалуженим ланцюгом.
Амiнокислоти з розгалуженим ланцюгом (АКРЛ) валiн, лейцин та iзолейцин є незамiнними
амiнокислотами, якi не синтезуються в органiзмi людини i тому повиннi потрапляти до
органiзму людини в достатнiй кiлькостi iз їжею. Нестача цих амiнокислот або порушення
їх метаболiзму призводять до цiлого спектра захворювань, таких як дисбаланс азотного
метаболiзму, порушення функцiонування нервової системи, розвиток аномалiй мозку тощо.
На вiдмiну вiд тварин рослини здатнi не лише до деградацiї валiну, лейцину та iзолейцину,
але й їх синтезу. Вiдомо, що бiосинтез АКРЛ вiдбувається в пластидах, тодi як процес
деградацiї локалiзований у мiтохондрiях [1–3].
Трансамiнази є важливим класом ферментiв, задiяних у метаболiзмi АКРЛ. Вони ка-
талiзують процес переносу амiногруп мiж глютаматом i специфiчною альфа-кетокислотою
з розгалуженим ланцюгом у прямому i зворотному напрямках. Завдяки цьому трансамiнази
вiдiграють важливу роль як у бiосинтезi, так i деградацiї АКРЛ. Трансамiназна активнiсть
була описана для широкого кола еукарiотичних органiзмiв, а саме: щурiв, людей, дрiжджiв,
кукурудзи, шпинату, гороху, томата та iн. [4]. Як правило, для рослин характерна наявнiсть
невеликого сiмейства ВСАТ-генiв. Наприклад, у модельного об’єкта Arabidopsis thaliana
трансамiнази АКРЛ кодуються шiстьма генами. Цi iснуючi окремi iзоформи мають рiзнi
типи експресiї та рiзну субклiтинну локалiзацiю. AtBCAT2, AtBCAT3, AtBCAT5 локалiзо-
ванi в хлоропластах, тодi як AtBCAT1, AtBCAT4, AtBCAT6 функцiонують у мiтохондрiях
i цитозолi вiдповiдно [2, 5].
Метою проведеного дослiдження було встановлення повнокодуючої послiдовностi, зна-
ходження на хромосомнiй картi та експресiї гена ВСАТ2 Lycopersicon esculentum, а також
вивчення бiохiмiчних властивостей бiлка, що ним кодується.
Ген ВСАТ2 було картовано методом аналiзу полiморфiзму довжини рестрикцiйних фра-
гментiв (ПДРФ) в популяцiї iнтрогресивних лiнiй томата, отриманих вiд схрещування Lyco-
persicon esculentum i L. pennellii. Тотальну ДНК iнтрогресивних лiнiй томата та батькiв-
ських видiв екстрагували з листкової тканини за методом [6]. Пiсля iнкубацiї iзольованої
ДНК з РНКазою (Promega) алiквоту в кiлькостi 15 мкг обробляли рестриктазою Xba I
(“Roche”, Нiмеччина). Продукти рестрикцiї роздiляли в агарозному гелi (1%) i переносили
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 161
Рис. 1. Картування гена ВСАТ2 (а, б ) та аналiз його експресiї (в): а — локалiзацiя на хромосомнiй картi;
б — результати блотингу за Саузерном; IL7-1 — IL7-5-5 — iнтрогресивнi лiнiї томата; Le — L. esculentum;
Lp — L. pennellii ; в — Нозерн-блот-гiбридизацiя; 1 — РНК iз стебел; 2 — РНК з листкiв; 3 — РНК з квiток;
4 — РНК з плодiв 10 д. п. р. к.; 5 — РНК з плодiв 20 д. п. р. к.; 6 — РНК з плодiв 30 д. п. р. к.; 7 — РНК
з плодiв 40 д. п. р. к. (д. п. р. к. — день пiсля розкриття квiтки)
на нейлонову мембрану Porablot N+ (“Macherey-Nagel”, Нiмеччина). Гiбридизацiю з радiо-
активно мiченим зондом (як такий використовували кДНК вставку EST клону cLEC38O16)
проводили протягом 8 год при 65 ◦С. За результатами Саузерн-блот-гiбридизацiї ген ВСАТ2
було локалiзовано на хромосомi 7 мiж маркерами TG61 i CT158 (рис. 1, а, б ).
Рiвень експресiї гена ВСАТ2 у рiзних типах тканин оцiнювали за допомогою Но-
зерн-блот-гiбридизацiї. Для цього тотальну РНК видiляли з 1 г замороженої тканини за
наведеним ранiше методом [7]. Пiсля обробки ДНКазою I алiквоту РНК (25 мкг), iзольова-
ну з листкiв, стебла, квiток та плодiв рiзного ступеня стиглостi, роздiляли в денатуруючо-
му формальдегiдному агарозному гелi (1,5%) i переносили на нейлонову мембрану Porablot
N+ (“Macherey-Nagel”, Нiмеччина) за допомогою капiлярного методу. Як зонд для гiбри-
дизацiї використовували фрагмент кДНК, який мiстив разом iз 5′ послiдовнiстю, яка не
транслюється, частину (225 нуклеотидiв) кодуючої послiдовностi гена ВСАТ2. Використан-
ня такої високоспецифiчної проби дозволило уникнути крос-гiбридизацiї з транскриптами,
якi кодують решту амiнотрансфераз, задiяних у метаболiзмi АКРЛ. На авторадiограмi бу-
ло виявлено один мажорний транскрипт розмiром 1500 п. н. (див. рис. 1, в). Експресiя гена
ВСАТ2 була найвищою в листках i квiтках, тодi як у стеблi i плодах, особливо на пiзнiх
стадiях стиглостi, рiвень експресiї був значно нижчим.
3′ i 5′ RACE ПЛР було задiяно для встановлення повнорозмiрної кодуючої послiдовнос-
тi даного гена. Використовували SMART RACE набiр (“Invitrogen”, Нiмеччина), всi реакцiї
проводили згiдно з рекомендацiями фiрми виробника, 3′ i 5′ RACE зворотно транскрибо-
162 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
Рис. 2. Конфокально-мiкроскопiчний аналiз мезофiльних протопластiв тютюну, що експресують химерний
протеїн ВСАТ2-GFP. Флуоресцентнi маркери: а — зелений флуоресцентний протеїн GFP; б — барвник
MitoTracker; в — об’єднане зображення автофлуоресценцiї хлорофiлу, GFP i MitoTracker
вану мРНК з листкiв Lycopersicon esculentum сорту М82 булo використано як матрицю.
RACE ПЛР амплiфiкованi продукти були клонованi у вектор pCR4Blunt-TOPO i секвено-
ванi. Пiсля встановлення нуклеотидної послiдовностi на кiнцях RACE ПЛР продуктiв були
синтезованi праймери, за допомогою яких вдалося амплiфiкувати повну кодуючу послiдов-
нiсть гена ВСАТ2.
Аналiз субклiтинної локалiзацiї бiлка є однiєю з необхiдних складових для його де-
тальної функцiональної характеристики. Тому наступним етапом було створення химерно-
го протеїну мiж ВСАТ2 та зеленим флуоресцентним протеїном (GFP), який вiдiграє роль
флуоресцентної мiтки, що дозволяє виявити мiсцезнаходження бiлка в клiтинi. Повнороз-
мiрна кодуюча послiдовнiсть гена ВСАТ2 без стоп-кодона була амплiфiкована з викорис-
танням прямого ВСАТ2F CACCATGATTCAAAGGGCCGCACCTG та зворотного ВСАТ2R
TTCAATGTCAACAATCCAATCCC олiгонуклеотидних праймерiв. Амплiфiкований про-
дукт за розмiром 1153 п. н. спочатку клонували в промiжний вектор pENTR-SD-D-ТОРО,
пiсля чого його було субклоновано у вектор pK7FWG2 з використанням Gateway LR Re-
combinase (“Invitrogen”, Нiмеччина). Таким чином, повнорозмiрна кодуюча послiдовнiсть
ВСАТ2 була злита з послiдовнiстю гена EGFP. Конструкцiя 35S:ВСАТ2-GFP була введена
в мезофiльнi протопласти тютюну за допомогою методу ПЕГ-обумовленої трансформацiї.
Аналiз тимчасової експресiї химерного протеїну ВСАТ2-GFP проводили за допомогою кон-
фокального лазерного сканувального мiкроскопа (DM IRB, Leica, “Bensheim”, Нiмеччина).
Для збудження GFP флуоресценцiї використовували аргоновий лазер 488 нм, флуоресцен-
цiю реєстрували у межах 505–530 нм. Флуоресцентний барвник MitoTracker (“Invitrogen”,
Нiмеччина) використовували для специфiчного фарбування мiтохондрiй. Детекцiю сигналу
проводили в межах 585–605 нм, при збудженнi гелiй-неоновим лазером 543 нм. Колокалi-
зацiя сигналiв флуоресценцiї для ВСАТ2-GFP i MitoTracker вказувала на те, що ВСАТ2
локалiзується в мiтохондрiях (рис. 2).
Для бiохiмiчної характеристики кодуюча нуклеотидна послiдовнiсть гена ВСАТ2 без
стоп-кодону, яка знаходилась у векторi pENTR/D/-TOPO була субклонована у вектор
pYES-DEST52. Таким чином, була отримана конструкцiя, що кодує ВСАТ2-His6 рекомбi-
нантний протеїн пiд контролем галактозного промотера (GAL1). Експресiю рекомбiнантно-
го протеїну проводили в мутантному штамi дрiжджiв ∆bat1∆bat2, у якого вiдсутнi обидвi
амiнотрансферази АКРЛ. Дрiжджову культуру нарощували при 30 ◦С до оптичної густи-
ни A600 — 0,5–0,7 у мiнiмальному середовищi SC, яке мiстило 2% глюкози як джерело
вуглецю. Експресiю протеїну iндукували шляхом замiни джерела вуглецю в живильному
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 163
Рис. 3. Ензиматична активнiсть ВСАТ2. Залежнiсть швидкостi реакцiї деамiнування вiд кiлькостi субстрату.
a — лейцин (1 ), iзолейцин (2 ) як субстрат; б — валiн (3 ) як субстрат
середовищi, замiсть глюкози використовували галактозу, кiнцева концентрацiя якої в iн-
дукцiйному середовищi становила 2 г/л. Пiсля iндукцiї експресiї культуру iнкубували ще
8–12 год при 30 ◦С. Пiсля цього клiтини були осадженi центрифугуванням (5000 g, 10 хв)
i лiзованi в буферi YeastBusterTM (“Novagen”, Нiмеччина). Очищення рекомбiнантного про-
теїну здiйснювали методом металоафiнної хроматографiї на Ni2+ -NTA агарозi (“Qiagen”,
Нiмеччина) згiдно з рекомендацiями фiрми виробника. Активнiсть очищеного протеїну ви-
значали спектрофотометрично за методом [8]. Кiнетичнi параметри реакцiй (KМ, Vmax)
були розрахованi з трьох незалежних експериментiв за рiвнянням Мiхаелiса–Ментен з ви-
користанням програми GraphPad Prism 5.
Iзольований ВСАТ2 протеїн був здатним каталiзувати перетворення валiну, лейцину та
iзолейцину у вiдповiднi альфа-кетокислоти. Найвища активнiсть ферменту була зафiксова-
на у разi лейцину та iзолейцину як субстрату (рис. 3, табл. 1). Результати ензиматичного
аналiзу свiдчать про те, що ВСАТ2 може розпочинати деградацiю всiх трьох АКРЛ. Подiбнi
результати було отримано пiд час вивчення мiтохондрiальної iзоформи амiнотрансферази
(AtВСАТ1) у Arabidopsis thaliana [3]. AtВСАТ1, як i ВСАТ2 томата, мала найменшу спо-
рiдненiсть до валiну як субстрату. Однак AtВСАТ1, на вiдмiну вiд ВСАТ2, мала бiльшу
спорiдненiсть до iзолейцину, нiж до лейцину.
Таким чином, наведенi данi про субклiтинну локалiзацiю та ензиматичнi властивостi
протеїну ВСАТ2 переконливо вказують на те, що вiн виконує специфiчнi функцiї в ка-
таболiзмi АКРЛ. Встановлення ж мiсцезнаходження на хромосомнiй картi та нуклеотид-
ної послiдовностi гена ВСАТ2 має не тiльки фундаментальне, але й прикладне значення,
оскiльки ця iнформацiя може бути використана пiд час розробки проектiв та пiдходiв iз за-
стосуванням трансгеномних технологiй або маркер-допомiжної селекцiї, якi мають за мету
модифiкацiю вмiсту АКРЛ у томатi чи iнших спорiднених видах.
Таблиця 1. Кiнетичнi параметри ВСАТ2. Значення константи Мiхаeлiса (KМ) i максимальної швидкостi
(Vmax) реакцiї деамiнування для очищеної амiнотрансферази томата (M ±m, n = 5)
Субстрат KМ, мМ Vmax, мкМ/(хв · мг бiлка)
Лейцин 0,32 ± 0,01 122,50 ± 1,87
Iзолейцин 0,43 ± 0,07 109,80 ± 6,24
Валiн 1,38 ± 0,14 61,24 ± 2,78
164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №5
1. Fujiki Y., Sato T., Ito M., Watanabe A. Isolation and chracterization of cDNA clones for E1_ and E2
subunits of the branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex in Arabidopsis // J. Biol. Chem. –
2000. – 275. – P. 6007–6013.
2. Diebold R., Schuster J., Daschner K., Binder S. The branched-chain amino acid transaminase gene family
in Arabidopsis encodes plastid and mitochondrial proteins // Plant Physiol. – 2002. – 129. – P. 540–550.
3. Schuster J., Binder S. The mitochondrial branched-chain aminotransferase (AtBCAT1) is capable to ini-
tiate degradation of leucine, isoleucine and valine in almost all tissue of Arabidopsis thaliana // Plant Mol.
Biol. – 2005. – 57. – P. 241–254.
4. Singh B.K. Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine // Plant amino acids: biochemistry and bio-
technology. – New York: Marcel Dekker, 1999. – P. 227–247.
5. Schuster J., Knill T., Reichelt M. et al. Branched-chain aminotransferase4 is part of the chain elongation
pathway in the biosynthesis of methionine-derived glucosinolates in Arabidopsis // Plant Cell. – 2006. –
18. – P. 2664–2679.
6. Doyle J. J., Doyle J. L. Isolation of Plant DNA from fresh tissue // Focus. – 1990. – 12. – P. 13–15.
7. Robaglia C., Bruening G., Haseloff J., Gerlach W.L. Evolution and replication of tobacco ringspot virus
satellite RNA mutants // EMBO J. – 1993. – 12. – P. 2969–2976.
8. Prohl C., Kispal G., Lill R. Branched-chain-amino-acid transaminases of yeast Saccharomyces cerevisiae //
Methods Enzymol. – 2000. – 324. – P. 365–375.
Надiйшло до редакцiї 03.11.2010Iнститут клiтинної бiологiї та генетичної
iнженерiї НАН України, Київ
Макс-Планк-Iнститут молекулярної
фiзiологiї рослин, Гольм
A. S. Kochevenko, A.R. Fernie
Molecular cloning and analysis of Lycopersicon esculentum gene
encoding the tomato mitochondrial-targeted BCAT
Tomato BCAT2 gene is mapped on chromosome 7 by the RFLP-method. Its expression level
in various tissue types is determined by Northern blot hybridization. Subcellular localization of
ВСАТ2-GFP protein is investigated with the help of confocal microscopy. It was localized in mi-
thochondria. The results obtained are discussed with regard to the role of this enzyme in the
metabolism of branched-chain amino acids.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №5 165
|