Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП)
Досліджено нові флуоресцентні зонди на основі тозилатів 2- і 4-(4-диметиламінофеніл)-1-етеніл)-1-алкілпіридинію (ДСП) щодо визначення вмісту і конформаційного стану сироваткового альбуміну людини і тварин (бик, кінь) та оцінки ефективності процедур озонотерапії. Встановлено, що при внутрішньовенному...
Saved in:
| Published in: | Доповіді НАН України |
|---|---|
| Date: | 2011 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2011
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38558 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) / О.А. Соколик, Т.С. Дюбко, Ю.И. Козин, И.А. Федюняева, Л.Д. Паценкер // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 136-145. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859666452941897728 |
|---|---|
| author | Соколик, О.А. Дюбко, Т.С. Козин, Ю.И. Федюняева, И.А. Паценкер, Л.Д. |
| author_facet | Соколик, О.А. Дюбко, Т.С. Козин, Ю.И. Федюняева, И.А. Паценкер, Л.Д. |
| citation_txt | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) / О.А. Соколик, Т.С. Дюбко, Ю.И. Козин, И.А. Федюняева, Л.Д. Паценкер // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 136-145. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Доповіді НАН України |
| description | Досліджено нові флуоресцентні зонди на основі тозилатів 2- і 4-(4-диметиламінофеніл)-1-етеніл)-1-алкілпіридинію (ДСП) щодо визначення вмісту і конформаційного стану сироваткового альбуміну людини і тварин (бик, кінь) та оцінки ефективності процедур озонотерапії. Встановлено, що при внутрішньовенному введенні озонованої крові пацієнтів відбуваються більш істотні зміни в гідрофобних областях альбуміну плазми, ніж при введенні озонованого фізіологічного розчину. Показано, що ці зонди мають ряд переваг порівняно з іншими відомими зондами.
The advantages of the new fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)-1-ethenyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP) to determine the content and the conformational state of human and animal (bovine and horse) serum albumin and to estimate the effectiveness of ozonotherapy are demonstrated. An intravenous injection of patient's ozonated blood is found to cause a more pronounced impact on the serum albumin hydrophobic regions as compared to the injection of the ozonated physiological solution.
|
| first_indexed | 2025-11-30T11:21:43Z |
| format | Article |
| fulltext |
оповiдi
НАЦIОНАЛЬНОЇ
АКАДЕМIЇ НАУК
УКРАЇНИ
8 • 2011
БIОЛОГIЯ
УДК 77.352.336
© 2011
О.А. Соколик, Т.С. Дюбко, Ю. И. Козин, И. А. Федюняева,
Л.Д. Паценкер
Анализ влияния озона на сывороточный альбумин
с применением флуоресцентных зондов на основе
тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-
алкилпиридиния (ДСП)
(Представлено академиком НАН Украины В.И. Грищенко)
Дослiджено новi флуоресцентнi зонди на основi тозилатiв 2- i 4-(4-диметиламiнофе-
нiл)-1-етенiл)-1-алкiлпiридинiю (ДСП) щодо визначення вмiсту i конформацiйного ста-
ну сироваткового альбумiну людини i тварин (бик, кiнь) та оцiнки ефективностi про-
цедур озонотерапiї. Встановлено, що при внутрiшньовенному введеннi озонованої кровi
пацiєнтiв вiдбуваються бiльш iстотнi змiни в гiдрофобних областях альбумiну плазми,
нiж при введеннi озонованого фiзiологiчного розчину. Показано, що цi зонди мають ряд
переваг порiвняно з iншими вiдомими зондами.
Альбумин является одним из важнейших компонентов плазмы крови, ответственным за свя-
зывание и транспортировку метаболитов, лекарственных препаратов, токсинов и других
низкомолекулярных веществ. Изучение изменений структурно-функциональных свойств
сывороточного альбумина, вызванных различными патологическими и физико-химически-
ми факторами, весьма важно для решения ряда биомедицинских задач, в том числе для
диагностики заболеваний [1] и оценки эффективности лечения, в частности, при проведе-
нии процедур озонотерапии [2] — современного метода коррекции многих патологических
состояний [3].
Одним из наиболее эффективных, информативных и высокочувствительных методов
изучения структурных состояний альбумина является метод флуоресцентных зондов [4],
основанный на регистрации изменений параметров флуоресценции специальных красите-
лей (зондов) в зависимости от физико-химических свойств их микроокружения. В качест-
ве таких зондов потенциально можно использовать любой флуоресцирующий краситель,
способный нековалентно (за счет гидрофобного и/или специфического взаимодействия)
связываться с биомолекулами и изменять при этом свои параметры флуоресценции, такие
как интенсивность, положение спектрального максимума, квантовый выход, поляризация
136 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
или время жизни флуоресценции [4]. Изменения этих параметров служат источником важ-
ной информации о структурном и функциональном состоянии биомолекул.
Разработанные ранее зонды АВМ [5–9] и МНБИС [10, 11] показали свою пригодность при
изучении конформационных изменений альбумина при патологических состояниях и при
действии физико-химических факторов. Вместе с тем по мере накопления эксперименталь-
ного материала стало очевидно, что эти зонды обладают рядом ограничений при связыва-
нии с белком, а именно недостаточной избирательностью, малой чувствительностью и сла-
бой фотостабильностью. Эти недостатки становятся особенно ощутимыми при широком
внедрении в исследовательскую и медицинскую практику аппаратурных методов. Поэто-
му актуальной задачей является создание и исследование новых зондов с улучшенными
характеристиками для решения конкретных биомедицинских задач.
В этой работе анализируется применимость новых флуоресцентных зондов на основе то-
зилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП-n-2 и ДСП-n-4)
с разной длиной алкильного заместителя (n) для исследования альбумина и его конформа-
ционных изменений, индуцированных действием озона.
Материалы и методы. Сывороточный альбумин человека (САЧ; фракция V) получа-
ли из “Sigma” (США) и использовали без дополнительной очистки. Кровь лошади и быка,
забранную на гепарине в качестве антикоагулянта, получали из Харьковской государствен-
ной зооветеринарной академии (пос. Малая Даниловка, Харьковская обл.). Кровь пациен-
тов с различными формами урогенитальных инфекций (цирвицит, эндометрит, аднексит,
уреопростатит, хронический калькулезно-фиброзный простатит, орхоэпидидимит) (всего 19
чел.), проходивших курс озонотерапии в течение 10–15 дней, забранную на гепарине, по-
лучали из Харьковского противоболевого центра. Плазму крови отделяли однократным
центрифугированием цельной крови (800 g, 5 мин).
Озон вводили пациентам внутривенно в виде предварительно озонированных физиоло-
гического раствора (ОФР) или собственной крови (процедура БАГОТ) как описано в [2].
Для озонирования применяли озоно-кислородную смесь с концентрацией озона от 2,0 до
17 мг/л в зависимости от патологии и индивидуальной чувствительности пациента. Озо-
нирование изолированного альбумина, плазмы крови человека и животных осуществляли
смешиванием в соотношении 1 : 1 с озонированным физиологическим раствором.
Тозилаты 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния с длиной алкиль-
ной цепи C1–C13 (ДСП-1 — ДСП-13) синтезированы в ГНУ “НТК “Институт монокристал-
лов” НАН Украины (Харьков). Зонд АВМ любезно предоставлен И. Э. Калниня (Риж-
ский политехнический университет, Латвия). Краситель МНБИС любезно предоставлен
Ю.А. Гуркаленко (Институт сцинтилляционных материалов НАН Украины, Харьков). Зон-
ды использовали в виде этанольных растворов с концентрацией (4 ÷ 5) · 10−7 M.
Электронные спектры поглощения записывали в стандартных 1-см кварцевых кюветах
на сканирующем двухлучевом спектрофотометре PerkinElmer Lambda 35. Спектры флуо-
ресценции регистрировали в 1-см стандартных кварцевых кюветах на сканирующем спе-
ктрофлуориметре Varian Cary Eclipse и исправляли с учетом коэффициентов спектраль-
ной чувствительности прибора. Точность определения максимумов спектров флуоресцен-
ции и поглощения составляла ±0,5 нм.
Статистическую обработку проводили по методу Стьюдента–Фишера.
Результаты и обсуждение. Спектральные характеристики свободных кра-
сителей. Прежде всего мы изучили спектрально-люминесцентные свойства красителей
серии ДСП, такие как положение максимумов полос поглощения (λмакс.п), флуоресценции
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 137
(λмакс. ф), коэффициент экстинкции (ε), квантовый выход флуоресценции (ΦF ), яркость
красителей, оцененную как произведение коэффициента экстинкции на квантовый выход
(εΦF ), а также изменение квантового выхода при связывании с белком (табл. 1). Получен-
ные результаты сопоставлены с известными данными для зондов АВМ и МНБИС.
Красители ДСП-n-2 в этаноле поглощают в области ∼ 465 нм и флуоресцируют при
590–596 нм, а ДСП-n-2 — в более длинноволновой области (λмакс. п 480–484 нм и λмакс. ф
608–612 нм). С удлинением алкильного заместителя наблюдается небольшое длинноволно-
вое смещение максимумов (до 4 нм), а также закономерное возрастание значений ε и ΦF
(см. табл. 1). Наибольшими значениями ε и ΦF обладает ДСП-13-4. Перемещение диметила-
миногруппы в положение 2 (серия ДСП-n-2) приводит к существенному коротковолновому
смещению полос поглощения (18–19 нм) и флуоресценции (16–22 нм), а также примерно
двукратному снижению коэфициента экстинкции и уменьшению квантового выхода флу-
оресценции в 1,6–1,7 раза.
В водной среде (фосфатный буфер), обладающей бóльшей полярностью по сравнению
с этанолом, происходит характерное для донорно-акцепторных красителей длинноволно-
вое смещение полос излучения, а также существенное, в 4,4–6,5 раз, снижение квантового
выхода флуоресценции. Из-за сильно полярного строения молекул красители ДСП обла-
дают слабой флуоресценцией в водных растворах, но квантовый выход сильно возрастает
в более гидрофобных и менее полярных растворителях, таких как этанол, хлороформ и то-
луол, а также в биологических системах. Это дает возможность применять их для флу-
оресцентного зондирования белков, клеток и других высокомолекулярных биологических
Таблица 1. Спектральные характеристики исследованных красителей: максимумы полос поглощения
(λмакс. п) и флуоресценции (λмакс. ф), коэффициент экстинкции (ε), квантовый выход (ΦF ) и яркость све-
чения (εΦF )
Зонд MW
Этанол
Водный фосфатный
буфер, pH 7,4
САЧ / фосфатный
буфер, pH 7,4
λмакс. п,
нм
ε,
М−1
·см−1
λмакс. ф,
нм
ΦF
λмакс. ф,
нм
ΦF
λмакс. ф.,
нм
ΦF
εΦF ,
М−1
·см−1
ДСП-1-4 410,53 480 49500 608 0,024 616 0,004 583 0,025 1200
ДСП-2-4 424,56 481 49600 610 0,026 615 0,004 583 0,032 1600
ДСП-6-4 480,66 483 50000 611 0,030 614 0,006 587 0,052 2600
ДСП-8-4 508,72 484 50200 612 0,031 613 0,007 596 0,23 11600
ДСП-13-4 578,85 484 50500 612 0,032 610 0,007 599 0,26 13100
ДСП-8-2 508,72 466 24000 596 0,019 586 0,004 570 0,15 3600
ДСП-13-2 578,85 465 24600 590 0,020 585 0,004 571 0,21 5200
ABM 315,37 483 12000 650 — 640 0,076 631 0,30 3600
МНБИС 435,45 ∼ 445 7070 515 — 532 0,006 520 0,054 380
138 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
объектов. Аналогичными свойствами обладают ABM и МНБИС, молекулы которых также
представляют собой сильные донорно-акцепторные системы. Квантовый выход красителей
ДСП в воде имеет примерно такие же значения (ΦF 0,004–0,007), что и МНБИС (0,006),
но почти в 10 раз меньше, чем ABM (0,076). Тем не менее такие величины ΦF вполне дос-
таточны для измерений на современных спектрофлуориметрах, что позволяет создавать
надежные биоаналитические и диагностические методы анализа.
Красители ДСП-n-2 и, особенно, ДСП-n-4 обладают существенно бóльшими значениями
коэффициента экстинкции (ε ∼ 24000–50500 М−1
· см−1) по сравнению с ABM и МНБИС
(см. табл. 1), благодаря чему эти красители пригодны для возбуждения синими свето-
диодами и полупроводниковыми лазерами. Преимуществом серии ДСП-n-4 по сравнению
с ДСП-n-2 является ее лучшая совместимость с широко распространенным диодным ла-
зером с длиной волны 488 нм и бóльшая яркость (бóльшие значения ε и ΦF ). Это весьма
важно для современных аппаратурных методов анализа — конфокальной флуоресцентной
микроскопии, проточной цитофлуориметрии, флуориметрии с применением планшетных
ридеров и других высокопроизводительных флуориметрических систем.
Одним из наиболее важных свойств зонда является его способность связываться с био-
логическими объектами — встраиваться в липидный бислой мембран или гидрофобные по-
лости белков и проникать сквозь клеточную мембрану. Эта способность связана, в частнос-
ти, с размером, формой и электронным зарядом молекул зонда. Красители ДСП имеют
примерно такой же размер и молекулярную массу (MW), как ABM и МНБИС. Тем не менее
они различаются по форме: молекулы ABM и МНБИС являются плоскими и дискообраз-
ными, с примерно одинаковыми размерами в обоих направлениях, а электронодонорный
морфолиновый заместитель придает молекулам слегка вытянутую форму; молекулы ДСП
имеют сильно вытянутое строение, которое становится еще более ощутимым при удлинении
конформационно лабильного алкильного заместителя.
Еще одно важное отличие в молекулярном строении исследованных красителей заклю-
чается в их электронном строении и растворимости в водных средах. Молекула ABM яв-
ляется электронейтральной, а слабую растворимость в воде ей придает гидрофильный мор-
фолиновый цикл. Хромофорная система молекулы МНБИС также является незаряженной,
однако этот краситель гораздо лучше растворяется в водных средах, так как содержит не
только морфолиновый цикл, но и сильно гидрофильную сульфогруппу, которая, к тому же,
диссоциирует в водных средах, превращая электронейтральную молекулу в отрицательно
заряженный ион. ДСП являются катионными красителями, в которых положительный за-
ряд делокализован на всей хромофорной части молекулы. Таким образом, проникающая
способность красителей ДСП, ABM и МНБИС, их способность окрашивать биологические
системы и специфически связываться с определенными структурными фрагментами био-
систем может быть существенно различной.
Фотостабильность зондов. Фотостабильность является одним из наиболее важных
параметров, определяющих практическую пригодность флуоресцентных красителей для
их применения в качестве зондов для медико-биологических исследований и анализов. Ста-
бильность спектральных характеристик во времени обеспечивает надежность и воспроизво-
димость получаемых экспериментальных данных при проведении анализов и тестов. Как
видно из рис. 1, наибольшей фотостабильностью обладают красители серии ДСП: фор-
ма их спектров флуоресценции, интенсивность и положение максимумов изменяются при
облучении в наименьшей степени. Спектр флуоресценции АВМ при облучении существенно
меняется, а наименьшей стабильностью обладает МНБИС.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 139
Рис. 1. Фотостабильность: изменение интенсивности (а) и спектров флуоресценции (б ) этанольных раство-
ров красителей С-13-4, МНБИС и ABM при облучении металл-галогеновой лампой (400 Вт). Спектры до
облучения показаны сплошной линией, после облучения (156 ч) — штриховой
Таким образом, преимуществами красителей ДСП являются не только их высокая яр-
кость, чувствительность к белкам и совместимость с популярными источниками возбужде-
ния, но и более высокая фотостабильность по сравнению с другими известными зондами
для этой же спектральной области.
Связывание зондов с альбумином человека. Как уже отмечалось, катионные кра-
сители серии ДСП в водных растворах обладают слабой флуоресценцией. В присутствии
альбумина (САЧ) — глобулярного белка плазмы крови, имеющего суммарный отрица-
тельный заряд и гидрофобные полости, происходит существенное возрастание интенсив-
ности свечения красителей, сопровождающееся коротковолновым (11–33 нм) смещением
спектров флуоресценции (см. табл. 1). Такая закономерность является характерной для
донорно-акцепторных молекул при переходе от более полярной (вода) к менее полярной
среде (белок).
Квантовый выход красителей с коротким алкилом (ДСП-1-4 и ДСП-2-4) при связыва-
нии с белком увеличивается всего в 6–8 раз, в то время как для красителей с длинным
алкилом (ДСП-8-4 и ДСП-13-4) — в 33–37 раз, а для ДСП-8-2 и ДСП-13-2 это возрастание
еще более существенное и достигает соответственно 37,5 и 52,5 раз. Для сравнения: возра-
стание квантового выхода для ABM и МНБИС составляет всего 4 и 9 раз, т. е. красители
серии ДСП существенно более чувствительны к изменениям концентраций САЧ. Таких
изменений флуоресцентного сигнала вполне достаточно для надежного количественного
определения белка. При этом важно отметить, что с удлинением алкильного заместителя
CnH2n+1 повышается избирательность (селективность) зонда к белку. Так, для красите-
лей с коротким алкилом (ДСП-1-4 и ДСП-2-4) квантовый выход в водном растворе бел-
ка мало отличается от такового в этаноле, а с удлинением алкила (ДСП-8-4, ДСП-13-4,
ДСП-8-2 и ДСП-13-2) квантовый выход в присутствии белка уже в 8–10 раз превышает
таковой, измеренный в этаноле. Интересно, что в то время как при удлинении алкильного
заместителя квантовый выход свободных красителей в воде слабо и плавно увеличивается,
квантовый выход комплексов с САЧ скачкообразно возрастает при переходе от ДСП-6-4
к ДСП-8-4 (рис. 2). Это может быть связано с улучшением встраивания более длинных
алкильных производных в гидрофобные полости так называемых лекарственных центров
альбумина. Это “варфариновый” центр I, имеющий глубину 19 Å, и “бензодиазепамовый”
центр II с глубиной 12–16 Å [1].
140 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
Рис. 2. Зависимость квантовых выходов свободных красителей ДСП-n-4 и их комплексов с САЧ от длины
алкильного заместителя
Рис. 3. Кривые флуоресцентного титрования красителей ДСП (c = 0,5 мкМ) озонированным (штриховая
линия) и неозонированным (сплошная линия) раствором САЧ. Концентрация озона 4,6 мг/л
Яркость красителей ДСП после полного связывания с белком (см. табл. 1) составляет
1200–13100 М−1
· см−1 и существенно возрастает с удлинением алкильного заместителя
и при перемещении диметиламиногруппы из положения 2 в положение 4. При этом яркость
МНБИС в 3 раза хуже, чем для наименее яркого из исследованных зондов — ДСП-1-4,
а яркость ABM соответствует таковой для ДСП-8-2, что в 3,6 раза хуже, чем для ДСП-13-4.
Для выяснения нижней и верхней границ определения белка мы провели флуоресцент-
ное титрование красителей ДСП раствором САЧ. Данная концентрация красителя выбира-
лась таким образом, чтобы обеспечить надежную регистрацию флуоресцентного сигнала и
в то же время исключить агрегацию молекул красителя. Кроме того, при низкой концент-
рации краситель связывается исключительно с сильными центрами связывания белка [12],
представляющими наибольший интерес для рассмотрения, но не образует комплексов со
“слабыми” центрами, обладающими меньшей афинностью к красителю и другим соедине-
ниям, таким как, например, фармакологические препараты.
Характер полученных кривых титрования в значительной мере зависит от строения
молекул красителя: удлинение алкильного заместителя приводит к значительному возрас-
танию интенсивности флуоресценции, причем красители серии ДСП-n-4 демонстрируют бо-
лее существенный и более крутой рост, чем ДСП-n-2 (рис. 3). С увеличением концентрации
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 141
Рис. 4. Пространственное строение молекул ДСП-1-4 и ДСП-1-2
белка кривые титрования достигают насыщения, причем концентрационный порог этого
насыщения обратно пропорционален скорости возрастания интенсивности флуоресценции,
т. е. чем круче возрастает кривая титрования, тем раньше наступает насыщение (см. рис. 3).
Поэтому красители ДСП-1-4 и ДСП-2-4, обладающие при связывании с белком наименьшей
яркостью флуоресценции, имеют наибольший концентрационный диапазон изменений ин-
тенсивностей и позволяют определять концентрации САЧ до ∼ 25 мкМ. Эти зонды наилуч-
шим образом подходят для исследования свойств поверхностных центров связывания, пос-
кольку являются наименее специфичными [12, 13]. Красители ДСП-13-2 и ДСП-13-4 имеют
наибольшую интенсивность флуоресценции в присутствии белка, но насыщение наступает
уже при концентрациях порядка 2,5 и 5 мкМ. Красители ДСП-6-4 и ДСП-8-2 позволяют
надежно определять концентрации САЧ до 15 и 10 мкМ соответственно. Данные зонды
являются наиболее специфичными [12] и подходят для исследования свойств гидрофобных
(“лекарственных”) центров связывания.
Действие озона на альбумин. Известно, что озон действует преимущественно на
индольные кольца аминокислотных остатков и способен окислять их двойные связи, что
приводит к конформационным изменениям белка [1].
Для выяснения чувствительности новых красителей, в сравнении с известными, к кон-
формационным изменениям изолированного альбумина под действием озона нами проана-
лизированы кривые флуоресцентного титрования красителей неозонированным и озони-
рованным САЧ (рис. 4). Известно, что при завершении титрования, т. е. при достижении
избытка белка, флуоресцентный зонд начинает выступать в качестве маркера структур-
ного состояния САЧ [12]. Как видно из рис. 3, ДСП-13-2 по сравнению с другими зон-
дами проявляет аномально высокую чувствительность к структурным изменениям САЧ,
вызванным озонированием. Скорее всего, это связано с тем, что данный зонд имеет наибо-
лее благоприятное электронное и пространственное строение, которое делает его особенно
чувствительным к конформационным изменениям белка. Действительно, в то время как,
например, молекула ДСП-13-4 является планарной, молекула ДСП-13-2 сильно разуплоще-
на за счет стерических препятствий, создаваемых орто-диметиламиногруппой (см. рис. 4).
Оптимальный баланс гидрофобно-гидрофильных свойств этого зонда, обеспечиваемый по-
лярным строением хромофорной части и гидрофобным алкильным заместителем, позволя-
ет ему, по-видимому, концентрироваться именно в тех участках белка, которые наиболее
чувствительны к действию озона.
Для того чтобы выяснить, насколько адекватно красители ДСП-13-2 и ДСП-13-4 способ-
ны отражать изменения конформационного состояния альбумина плазмы, нами проведено
142 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
сравнение показателей относительного квантового выхода и положения спектров в усло-
виях, моделирующих процентное содержание в плазме крови человека альбумина и имму-
ноглобулинов. Оказалось, что в смеси этих белков зонды ДСП-13-2 и ДСП-13-4 преимуще-
ственно (на 90 ± 5%) связываются с альбумином, а спектры этих зондов при связывании
с изолированным САЧ сдвинуты по сравнению с таковыми во фракции иммуноглобулинов
соответственно на 18 и 13 нм. Это означает, что данные красители могут быть использова-
ны для изучения свойств альбумина не только в изолированном состоянии, но и в составе
плазмы.
Анализ влияния озона на конформационное состояние альбумина плазмы человека и жи-
вотных (лошади и быка) с помощью зондов ДСП-13-2 и ДСП-13-4 показал, что несмотря на
некоторые отличия в исходной интенсивности и положении максимумов спектров, обуслов-
ленные разницей в видовом составе белков плазмы, данные красители проявляют высокую
чувствительность к конформационным изменениям альбумина плазмы при озонировании.
После процедуры ОФР интенсивность флуоресценции красителей снижается на 25–30%.
Однако эти изменения нельзя объяснить только уменьшением содержания альбумина [2],
поскольку они сопровождаются также длинноволновым смещением спектров и свидетель-
ствуют, по нашему мнению, о конформационных изменениях белков под влиянием озо-
на. Благодаря длинным алкильным заместителям молекулы ДСП-13-2 и ДСП-13-4 лег-
ко встраиваются в малополярные области белка, что является причиной их высокой чув-
ствительности к конформационным изменениям гидрофобных полостей альбумина, вы-
званным действием озона. По-видимому, данный эффект можно отнести к общим зако-
номерностям действия озона на сывороточные альбумины плазмы крови человека и жи-
вотных.
Красители серии ДСП обнаруживают также высокую чувствительность к состоянию
альбумина плазмы пациентов, проходивших процедуры озонотерапии. В частности, с по-
мощью зонда ДСП-13-4 обнаружено, что после процедуры БАГОТ происходят более выра-
женные изменения в гидрофобных областях альбумина плазмы по сравнению с введением
ОФР. Так, после БАГОТ отмечается уменьшение интенсивности флуоресценции в среднем
на 49%, в то время как после ОФР — всего на 7%. К причинам наблюдаемого эффекта
можно отнести как более сильное влияние озона и продуктов его распада на белки плазмы
при процедуре БАГОТ [2], так и, возможно, бóльшую степень “очистки” молекул альбумина
от связанных низкомолекулярных токсических лигандов [1].
Таким образом, проведенные исследования показали пригодность новых флуоресцен-
тных зондов серии ДСП для решения медико-биологических задач, связанных с определе-
нием содержания и структурного состояния альбумина человека и животных и их преиму-
щества перед известными зондами, такими как АВМ и МНБИС.
Установлено, что варьирование положения диметиламиногруппы и длины алкильного
заместителя позволяет оптимизировать зонды для решения конкретной задачи при анализе
конформационных изменений альбумина. Удлинение алкильного заместителя в молекулах
зондов и перемещение диалкиламиногруппы из положения 2 (ДСП-13-2) в положение 4
(ДСП-13-4) приводит к усилению флуоресцентного сигнала при связывании зондов с бел-
ком. Показана пригодность зондов ДСП-13-2 и ДСП-13-4 для определения концентрации
альбумина в растворе в диапазоне концентраций САЧ от 0,5 до ∼25 мкМ.
Зонды серии ДСП в зависимости от длины алкильного радикала обнаруживают раз-
личную чувствительность и специфичность по отношению к сывороточному альбумину.
Это может быть использовано как в диагностических целях, так и для корректировки
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 143
и прогнозирования результатов терапевтического воздействия озона. Красители ДСП-13-2
и ДСП-13-4 проявляют высокую чувствительность к структурным изменениям гидрофо-
бных областей молекул альбумина человека и животных, индуцированных действием озона
как в модельных условиях (изолированный альбумин), так и в составе плазмы. В резуль-
тате действия озона происходит не только увеличение полярности микроокружения зон-
дов, но и, по-видимому, “разрыхление” гидрофобных полостей молекулы белка. Установле-
но, что при внутривенном введении озонированной крови пациентов (процедура БАГОТ)
изменения в гидрофобных областях альбумина плазмы более выражены, чем при введении
ОФР.
1. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине / Под ред. Ю. А. Грызунова, Г. Е. Добрецова.
Кн. 2. – Москва: ГЭОТАР, 1998. – 440 с.
2. Козин Ю.И., Ромасько Н.В., Дюбко Т.С. и др. Изучение методом флуоресцентной спектроскопии
влияния озонирования крови больных с различной патологией на белки сыворотки // Эксперим. и
клинич. медицина. – 2005. – № 2. – С. 81–88.
3. Нижегородский медицинский журнал. Прил. Озонотерапия. – Нижний Новгород, 2003. – 340 с.
4. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. – Москва:
Наука, 1989. – 277 с.
5. Kalnina I., Meirovics I. A new fluorescent probe, ABМ: Properties and application in clinical diagnostics //
J. Fluoresc. – 1999. – 9, No 1. – P. 27–32.
6. Gorbenko G., Trusova V., Kirilova E. et al. New fluorescent probes for detection and characterization of
amyloid fibrils // Chem. Phys. Letters. – 2010. – 495, Iss. 4–6. – P. 275–279.
7. Kalnina I., Kirilova E., Klimkane L., Kirilov G. Altered plasma albumin characteristics and lymphocyte
populations in gastrointestinal cancer patients: Detection using modified fluorescence responses // J. Immu-
notoxicol. – 2009. – 6, No 4. – P. 293–300.
8. Kalnina I., Zvagule T., Bruvere R., Meirovics I. Fluorescent characteristics of rheumatoid arthritis patients
blood lymphocytes // J. Fluoresc. – 2005. – 15, No 2. – P. 105–110.
9. Kalnina I., Bruvere R., Zvagule T. et al. Fluorescent probe ABM and estimation of immune state in
patients with different pathologies (Review Article) // Ibid. – 2010. – 20, No 1. – P. 9–17.
10. Дистанов В. Б., Ромоданова Э.А., Рошаль А.Д. и др. Перспективы использования производных
нафталевой кислоты в научных исследованиях и промышленных технологиях // Вост.-европ. журн.
передов. технологий. – 2004. – № 5(11). – С. 43–48.
11. Ромоданова Э.А., Дюбко Т.С., Рошаль А.Д., Дистанов В. Б. МНБИС как маркер изменений мак-
роструктуры белка // Вiсн. ХНУ iм. В.Н. Каразiна. № 570. – Сер. Радiофiзика та електронiка. –
2002. – Вип. 2. – С. 302–307.
12. Гаврилов В.Б. Характеристика чувствительности и специфичности флуоресцентных маркеров струк-
турного состояния и связывающей способности белков // Биофизика. – 2000. – 45, вып. 5. – С. 421–426.
13. Окладной Ю.Г., Дюбко Т.С. Унификация подхода к оценке чувствительности и специфичности но-
вых красителей и потенциальных флуоресцентных зондов для белков // Функц. материалы. – 2005. –
12, № 3. – С. 583–586.
Поступило в редакцию 13.12.2010Государственное научное учреждение НТК “Институт
монокристаллов” НАН Украины, Харьков
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, Харьков
Харьковский национальный медицинский университет
144 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №8
O.O. Sokolyk, T. S. Dyubko, Yu. I. Kozin, I. A. Fedyunyayeva, L. D. Patsenker
Investigation of the ozone impact on serum albumin using the
fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)-
1-ethenyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP)
The advantages of the new fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)-1-ethe-
nyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP) to determine the content and the conformational state
of human and animal (bovine and horse) serum albumin and to estimate the effectiveness of
ozonotherapy are demonstrated. An intravenous injection of patient’s ozonated blood is found to
cause a more pronounced impact on the serum albumin hydrophobic regions as compared to the
injection of the ozonated physiological solution.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №8 145
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-38558 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T11:21:43Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Соколик, О.А. Дюбко, Т.С. Козин, Ю.И. Федюняева, И.А. Паценкер, Л.Д. 2012-11-12T18:03:53Z 2012-11-12T18:03:53Z 2011 Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) / О.А. Соколик, Т.С. Дюбко, Ю.И. Козин, И.А. Федюняева, Л.Д. Паценкер // Доп. НАН України. — 2011. — № 8. — С. 136-145. — Бібліогр.: 13 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38558 77.352.336 Досліджено нові флуоресцентні зонди на основі тозилатів 2- і 4-(4-диметиламінофеніл)-1-етеніл)-1-алкілпіридинію (ДСП) щодо визначення вмісту і конформаційного стану сироваткового альбуміну людини і тварин (бик, кінь) та оцінки ефективності процедур озонотерапії. Встановлено, що при внутрішньовенному введенні озонованої крові пацієнтів відбуваються більш істотні зміни в гідрофобних областях альбуміну плазми, ніж при введенні озонованого фізіологічного розчину. Показано, що ці зонди мають ряд переваг порівняно з іншими відомими зондами. The advantages of the new fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)-1-ethenyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP) to determine the content and the conformational state of human and animal (bovine and horse) serum albumin and to estimate the effectiveness of ozonotherapy are demonstrated. An intravenous injection of patient's ozonated blood is found to cause a more pronounced impact on the serum albumin hydrophobic regions as compared to the injection of the ozonated physiological solution. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Доповіді НАН України Біологія Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) Investigation of the ozone impact on serum albumin using the fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)- 1-ethenyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP) Article published earlier |
| spellingShingle | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) Соколик, О.А. Дюбко, Т.С. Козин, Ю.И. Федюняева, И.А. Паценкер, Л.Д. Біологія |
| title | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) |
| title_alt | Investigation of the ozone impact on serum albumin using the fluorescent probes based on 2- and 4-(4-dimethylaminophenyl)- 1-ethenyl)-1-alkylpyridinium tosylates (DSP) |
| title_full | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) |
| title_fullStr | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) |
| title_full_unstemmed | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) |
| title_short | Анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (ДСП) |
| title_sort | анализ влияния озона на сывороточный альбумин с применением флуоресцентных зондов на основе тозилатов 2- и 4-(4-диметиламинофенил)-1-этенил)-1-алкилпиридиния (дсп) |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38558 |
| work_keys_str_mv | AT sokolikoa analizvliâniâozonanasyvorotočnyialʹbuminsprimeneniemfluorescentnyhzondovnaosnovetozilatov2i44dimetilaminofenil1étenil1alkilpiridiniâdsp AT dûbkots analizvliâniâozonanasyvorotočnyialʹbuminsprimeneniemfluorescentnyhzondovnaosnovetozilatov2i44dimetilaminofenil1étenil1alkilpiridiniâdsp AT kozinûi analizvliâniâozonanasyvorotočnyialʹbuminsprimeneniemfluorescentnyhzondovnaosnovetozilatov2i44dimetilaminofenil1étenil1alkilpiridiniâdsp AT fedûnâevaia analizvliâniâozonanasyvorotočnyialʹbuminsprimeneniemfluorescentnyhzondovnaosnovetozilatov2i44dimetilaminofenil1étenil1alkilpiridiniâdsp AT pacenkerld analizvliâniâozonanasyvorotočnyialʹbuminsprimeneniemfluorescentnyhzondovnaosnovetozilatov2i44dimetilaminofenil1étenil1alkilpiridiniâdsp AT sokolikoa investigationoftheozoneimpactonserumalbuminusingthefluorescentprobesbasedon2and44dimethylaminophenyl1ethenyl1alkylpyridiniumtosylatesdsp AT dûbkots investigationoftheozoneimpactonserumalbuminusingthefluorescentprobesbasedon2and44dimethylaminophenyl1ethenyl1alkylpyridiniumtosylatesdsp AT kozinûi investigationoftheozoneimpactonserumalbuminusingthefluorescentprobesbasedon2and44dimethylaminophenyl1ethenyl1alkylpyridiniumtosylatesdsp AT fedûnâevaia investigationoftheozoneimpactonserumalbuminusingthefluorescentprobesbasedon2and44dimethylaminophenyl1ethenyl1alkylpyridiniumtosylatesdsp AT pacenkerld investigationoftheozoneimpactonserumalbuminusingthefluorescentprobesbasedon2and44dimethylaminophenyl1ethenyl1alkylpyridiniumtosylatesdsp |