Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю

Розроблено новий метод виділення препаратів малих регуляторних si/miRNA високої чистоти та проведено перевірку їх функціональної (сайленсової) активності в безклітинній системі білкового синтезу. Встановлено, що регулятор росту Радостим-супер значно підвищує стійкість рослин до нематод шляхом стимул...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:
Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:Доповіді НАН України
Datum:2011
Hauptverfasser: Циганкова, В.А., Андрусевіч, Я.В., Блюм, Я.Б.
Format: Artikel
Sprache:Ukrainian
Veröffentlicht: Видавничий дім "Академперіодика" НАН України 2011
Schlagworte:
Online Zugang:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38704
Tags: Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевіч, Я.Б. Блюм // Доп. НАН України. — 2011. — № 9. — С. 159-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-38704
record_format dspace
spelling Циганкова, В.А.
Андрусевіч, Я.В.
Блюм, Я.Б.
2012-11-19T16:28:21Z
2012-11-19T16:28:21Z
2011
Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевіч, Я.Б. Блюм // Доп. НАН України. — 2011. — № 9. — С. 159-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
1025-6415
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38704
631.811.98 75.117.2.577.2.08
Розроблено новий метод виділення препаратів малих регуляторних si/miRNA високої чистоти та проведено перевірку їх функціональної (сайленсової) активності в безклітинній системі білкового синтезу. Встановлено, що регулятор росту Радостим-супер значно підвищує стійкість рослин до нематод шляхом стимуляції синтезу si/miRNA.
A new method of small regulatory si/miRNAs' isolation is elaborated, and their functional (silence) activity in a cell-free system of protein synthesis is testified. It is found that the plant growth regulator Radostim-super enhances the plant resistance against nematode by stimulating the synthesis of si/miRNAs.
uk
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
Доповіді НАН України
Біохімія
Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
Isolation of small regulatory si/miRNA with antinematode activity from plant cells
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
spellingShingle Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
Циганкова, В.А.
Андрусевіч, Я.В.
Блюм, Я.Б.
Біохімія
title_short Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
title_full Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
title_fullStr Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
title_full_unstemmed Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю
title_sort виділення з клітин рослин малих регуляторних si/mirna з антинематодною активністю
author Циганкова, В.А.
Андрусевіч, Я.В.
Блюм, Я.Б.
author_facet Циганкова, В.А.
Андрусевіч, Я.В.
Блюм, Я.Б.
topic Біохімія
topic_facet Біохімія
publishDate 2011
language Ukrainian
container_title Доповіді НАН України
publisher Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
format Article
title_alt Isolation of small regulatory si/miRNA with antinematode activity from plant cells
description Розроблено новий метод виділення препаратів малих регуляторних si/miRNA високої чистоти та проведено перевірку їх функціональної (сайленсової) активності в безклітинній системі білкового синтезу. Встановлено, що регулятор росту Радостим-супер значно підвищує стійкість рослин до нематод шляхом стимуляції синтезу si/miRNA. A new method of small regulatory si/miRNAs' isolation is elaborated, and their functional (silence) activity in a cell-free system of protein synthesis is testified. It is found that the plant growth regulator Radostim-super enhances the plant resistance against nematode by stimulating the synthesis of si/miRNAs.
issn 1025-6415
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/38704
citation_txt Виділення з клітин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активністю / В.А. Циганкова, Я.В. Андрусевіч, Я.Б. Блюм // Доп. НАН України. — 2011. — № 9. — С. 159-164. — Бібліогр.: 15 назв. — укр.
work_keys_str_mv AT cigankovava vidílennâzklítinroslinmalihregulâtornihsimirnazantinematodnoûaktivnístû
AT andrusevíčâv vidílennâzklítinroslinmalihregulâtornihsimirnazantinematodnoûaktivnístû
AT blûmâb vidílennâzklítinroslinmalihregulâtornihsimirnazantinematodnoûaktivnístû
AT cigankovava isolationofsmallregulatorysimirnawithantinematodeactivityfromplantcells
AT andrusevíčâv isolationofsmallregulatorysimirnawithantinematodeactivityfromplantcells
AT blûmâb isolationofsmallregulatorysimirnawithantinematodeactivityfromplantcells
first_indexed 2025-11-26T09:11:34Z
last_indexed 2025-11-26T09:11:34Z
_version_ 1850619287234936832
fulltext оповiдi НАЦIОНАЛЬНОЇ АКАДЕМIЇ НАУК УКРАЇНИ 9 • 2011 БIОХIМIЯ УДК 631.811.98 75.117.2.577.2.08 © 2011 В.А. Циганкова, Я. В. Андрусевiч, академiк НАН України Я. Б. Блюм Видiлення з клiтин рослин малих регуляторних si/miRNA з антинематодною активнiстю Розроблено новий метод видiлення препаратiв малих регуляторних si/miRNA високої чистоти та проведено перевiрку їх функцiональної (сайленсової) активностi в безклi- тиннiй системi бiлкового синтезу. Встановлено, що регулятор росту Радостим-супер значно пiдвищує стiйкiсть рослин до нематод шляхом стимуляцiї синтезу si/miRNA. В останнi 15 рокiв велика увага придiляється видiленню з клiтин еукарiотiв та визначен- ню бiологiчної ролi малих регуляторних si/miRNA, за вiдкриття яких вченим Andrew Fire та Craig Mello у 2006 р. було присуджено Нобелiвську премiю в галузi фiзiологiї та меди- цини [1–3]. До цiєї гетерогенної популяцiї низькомолекулярних RNA належать microRNA (miRNA) та siRNA (small interfering RNA). miRNA (завдовжки 21–22 нт) утворюються iз “шпилькоподiбних” первинних, подовжених транскриптiв з одноланцюгових окремих геном- них локусiв шляхом двох раундiв ендонуклеазного розщеплення за допомогою RNase-III аналогiчних ферментiв. Другий тип малих RNA — siRNA розмiром 22–24 нт, якi утво- рюються за допомогою рибонуклеази III-Dicer з дволанцюгових RNA попередникiв-dsRNA (double-stranded RNA), представленi транскриптами з обох ланцюгiв dsRNA. Один лан- цюг використовується для “сайленсiювання” mRNA, iнший — для вiдтворення dsRNA за перебiгом реакцiї полiмеразного копiювання. Припускається, що siRNA є похiдними вiд подовжених послiдовностей, що повторюються, транспозонiв й трансгенiв. Встановлено, що si/miRNA близькi за структурою i функцiєю (характеризуються антисенсовою компле- ментарною структурою до mRNA) та вiдiграють двояку роль у рослин [1–8]: 1) разом iз сайт-специфiчними ендо- й екзонуклеазами, якi є компонентами RISC комплексу (RNA- induced silencing complex), si/miRNA визначають перiод життя кожної з молекул mRNA, насамперед знищують шляхом блокування (сайленсiнгу) трансляцiї аберантнi та недоско- налi за структурою mRNA, якi можуть з’являтися помилково в клiтинах; 2) виконують захиснi (антипатогеннi й антипаразитичнi) функцiї. В обох випадках цi бiологiчнi ефекти досягаються шляхом зв’язування з комплементар- ною полiнуклеотидною ланкою mRNA власних клiтин або mRNA хвороботворних вiрусiв, ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №9 159 або mRNA паразитичних органiзмiв, наприклад нематод. Але у випадках iнфiкування вели- кої маси клiтин у тканинах рослин шкiдниками синтезується недостатньо молекул si/miRNA проти тих або iнших паразитiв i тому, вiдповiдно, не досягається захисний ефект. Вченi про- понують два пiдходи пiдвищення кiлькостi si/miRNA у вiдповiдь на патогенез [1, 2, 5–7]: 1) методом введення у клiтини додаткового числа копiй генiв si/miRNA шляхом генетичної трансформацiї; 2) активацiєю експресiї власних клiтинних генiв синтезу si/miRNA якимись специфiчними iндукторами. Ранiше нами було отримано експериментальнi данi в лабораторних i польових дослi- дах, якi демонструють, що створений в Iнститутi бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України разом iз Державним пiдприємством “Мiжвiдомчий науково-технологiчний центр “Агробiотех” НАН i МОН України” регулятор росту рослин Радостим-супер значно пiдси- лює iмунозахиснi властивостi рослин до широкого кола патогенiв та паразитичних орга- нiзмiв. Мета авторiв даного повiдомлення — з’ясувати можливостi пiдвищення стiйкостi рослин за рахунок посилення синтезу si/miRNA цим регулятором. У дослiдах використовували рос- лини цукрового буряка та рiпака, iнфiкованих цистоутворювальною коренепаразитуючою нематодою Heterodera shcachtii та оброблених регулятором росту рослин Радостим-супер. Можливiсть iндукцiї регулятором росту рослин синтезу si/miRNA з антинематодною актив- нiстю перевiряли за допомогою молекулярно-бiологiчних методiв. Для цього насiння цукро- вого буряка та рiпака з високою схожiстю пророщували у чашках Петрi на безнематодному водному середовищi (контроль) та iз суспензiєю цист нематод, з яких у процесi iнкубацiї при 23 ◦С з’являлись личинки (приблизно на 5–7 добу). У паралельних пробах додавали також регулятор росту Радостим-супер високої активностi. На сьогоднi iснує багато методiв видiлення si/miRNA з клiтин рослин [9–12]. Однак бiль- шiсть з них є трудомiсткими i дорогими у вжитку. Тому, виходячи з багаторiчного досвiду нашої роботи з нуклеїновими кислотами, нами розроблено оригiнальний метод видiлення si/miRNA, що складається з таких етапiв: 1) видiлення сумарного препарату RNA з клiтин рослин [13–15]; 2) роздiлення poly(A)+RNA (тобто mRNA) та poly(A)−RNA на олiго(dT)-целюлознiй колонцi з метою подальшого використання poly(A)+RNA для тестування функцiональної активностi si/miRNA у безклiтинних системах бiлкового синтезу; 3) осадження високомолекулярної poly(A)−RNA з елюату за допомогою 10%-го розчину полiетиленглiколю (ММ 8000) з 0,5 моль/л NaCl, а si/miRNA — рiвним об’ємом 96%-го етанолу при −22 ◦C впродовж доби; 4) осадження poly(A)+RNA пiсля елюцiї з колонки етанолом; 5) молекулярна гiбридизацiя в розчинi низькомолекулярних si/miRNA з фракцiєю poly(A)+RNA; 6) температурна денатурацiя (95 ◦C) гiбридних молекул poly(A)+RNA з si/miRNA та вiдокремлення poly(A)+RNA вiд si/miRNA на олiго(dT)-целюлознiй колонцi; 7) повторне осадження si/miRNA 96%-м етанолом, перевiрка чистоти видiлених si/miRNA за допомогою електрофорезу у 15%-му полiакриламiдному гелi (ПААГ-електро- форез) та сайленсової активностi si/miRNA у безклiтинних системах бiлкового синтезу з проросткiв пшеницi. Для дослiдiв по гiбридизацiї si/miRNA з mRNA перед отриманням si/miRNA її iнтен- сивно мiтили in vivo за допомогою Na2HP33O4 [14]. Для дослiдiв по перевiрцi її iнгiбiруючої активностi у безклiтинних системах бiлкового синтезу з проросткiв пшеницi використовува- 160 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №9 Рис. 1. ПААГ-електрофорез si/miRNA з проросткiв рiпака. Маркернi полiнуклеотиди (в цифрах наведено довжину в нуклеотидах) та препарат si/miRNA на дорiжках гелю (вiдповiдно 1 й 2) були насиченi етидiум бромiдом; радiоавтограф 33P мiчених si/miRNA з гелю (дорiжка 3) ли немiчену si/miRNA [15]. Дисперсiйний статистичний аналiз даних проводили за Стью- дентом. За результами ПААГ-електрофорезу (рис. 1), нами отримано препарати si/miRNA ви- сокої чистоти розмiром вiд 21 до 25 нуклеотидiв, що вiдповiдає класичним параметрам цих типiв RNA. В табл. 1 наведено данi стосовно рiвня синтезу si/miRNA у рослин у контролi, в дослi- дах з рослинами, обробленими регулятором росту Радостим-супер, у рослин при iнкубацiї з нематодами, а також у рослин в умовах дiї регулятора росту Радостим-супер на фонi iнфiкування нематодами. Як свiдчать отриманi результати, пiд впливом регулятора росту Радостим-супер рiзко пiдвищується синтез клiтинних si/miRNA, а iнфiкування рослин не- матодами, навпаки, рiзко знижує синтез цього класу RNA. Стимулятор росту Радостим-су- Таблиця 1. Вплив регулятора росту Радостим-супер на включення Na2HP33O4 у si/miRNA в клiтинах 5-добових проросткiв цукрового буряка, iнкубованих i неiнкубованих з нематодами Варiанти дослiдiв si/miRNA, iмп/хв/мг Контроль (проростки рослин, що iнкубованi на водному середовищi) 2680 ± 98,0 Проростки, що отриманi на водному середовищi з Радостим-супер (4309 ± 121)∗ Проростки, що вирощенi на водному середовищi з личинками нематод (1970 ± 83)∗ Проростки, що вирощенi на водному середовищi з Радостим-супер (3760 ± 112)∗ i личинками нематод Пр и м i т ка . 5-добовi проростки рослин iнкубували з Na2HP33O4 впродовж 1 год у чашках Петрi. Регу- ляторнi si/miRNA — антисенсовi, комплементарнi до mRNA, видiляли за розробленою нами методикою отримання високоочищених нативних препаратiв si/miRNA. Алiквоти радiоактивних si/miRNA вмiщували на нiтроцелюлознi основи з подальшим пiдрахунком радiоактивностi. ∗Наявнiсть вiдмiн вiд контролю, p < 0,05, n = 3. ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №9 161 пер дещо вирiвнює синтез si/miRNA, але цей рiвень, хоча й вище показника контролю, але не досягає рiвня синтезу, iндукованого регулятором росту без нематод. У табл. 2 наведено данi, якi розкривають суть результатiв, наведених у табл. 1. Це, як можна бачити, пов’язано з тим, що нематодна iнфекцiя знижує синтез власне клiтинних si/miRNA, який значно пiдвищується при стимуляцiї регулятором росту та розвитку рослин Радостим-супер. Але цей прискорений синтез пригнiчується личинками i в той самий час пiдсилюється синтез захисних антинематодних si/miRNA з комплементарною структурою до mRNA нематод (тобто здiйснюється перепрограмування геному клiтин рослин). Аналогiчнi результати було отримано в наших дослiдах i з рослинами рiпака при iнфi- куваннi їх личинками нематод (табл. 3). Вiдомо, що той самий вид нематод, який вражає рослини буряка, вражає й рiпак (у ентомологiв iснує припущення, що спалах нематодної Таблиця 2. Посилення антинематодних властивостей si/miRNA 5-добових проросткiв цукрового буряка пiд впливом регулятора росту Радостим-супер i личинок нематод Варiанти дослiдiв Ступiнь гомологiї по гiбридизацiї mRNA з Р33 si/miRNA, iмп/хв/20 мкг mRNA Показник iнгiбування бiлкового синтезу в безклiтиннiй системi, iмп/хв/мг бiлка∗ mRNA з рослин + Р33 si/miRNA з рослин mRNA з личинок + Р33 si/miRNA з рослин Гiбриди mRNA з Р33 si/miRNA кон- трольних рослин 8724 ± 146 (100%) 100% 10% Гiбриди mRNA контрольних рослин з Р33 si/miRNA рослин, оброблених Ра- достим-супер 6850 ± 224 (83%)∗∗ 82% 15% Гiбриди mRNA контрольних рослин з Р33 si/miRNA рослин, iнкубованих з личинками нематод 6358 ± 182 (73%)∗∗ 65% 36% Гiбриди mRNA контрольних рослин з Р33 si/miRNA рослин, iнкубованих з Радостим-супер i личинками нематод 5583 ± 164 (64%)∗∗ 46% 58% Пр и м i т ка . Застосовано безклiтинну систему бiлкового синтезу з проросткiв пшеницi; за мiчений попе- редник використовувалась амiнокислота — S35метионiн. ∗У безклiтиннiй системi бiлкового синтезу застосовували тi самi варiанти дослiдiв, що й у дослiдах по гiбридизацiї. ∗∗Наявнiсть вiдмiн вiд контролю, p < 0,05, n = 3. Таблиця 3. Вплив регулятора росту Радостим-супер на включення Na2HP33O4 у si/miRNA в клiтинах 5-добових проросткiв рiпака, iнкубованих i неiнкубованих з нематодами Варiанти дослiдiв si/miRNA, iмп/хв/мг Контроль (проростки рослин, що iнкубованi на водному середовищi) 4760 ± 146 Проростки, що отриманi на водному середовищi з Радостим-супер (6420 ± 208)∗ Проростки, що вирощенi на водному середовищi з личинками нематод (2910 ± 117)∗ Проростки, що вирощенi на водному середовищi з Радостим-супер (5380 ± 185)∗ i личинками нематод Пр и м i т ка . 5-добовi проростки рослин iнкубували з Na2HP33O4 впродовж 1 год у чашках Петрi. Регу- ляторнi si/miRNA — антисенсовi, комплементарнi до mRNA, видiляли за розробленою нами методикою отримання високоочищених нативних препаратiв si/miRNA. Алiквоти радiоактивних si/miRNA вмiщували на нiтроцелюлознi основи з подальшим пiдрахунком радiоактивностi. ∗Наявнiсть вiдмiн вiд контролю, p < 0,05, n = 3. 162 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №9 епiзоотiї на рослинах буряка пов’язаний з привнесенням на поля масової нематодної попу- ляцiї разом з рiпаком, що широко культивується в Українi). Аналiз даних табл. 3 дає пiдставу говорити про ту саму закономiрнiсть у змiнах синтезу si/miRNA у рiпака, яка спостерiгається i у рослин буряка: значне пiдвищення рiвня синтезу si/miRNA пiд впливом регулятора росту Радостим-супер; зниження рiвня синтезу власних клiтинних si/miRNA при iнфiкуваннi рослин личинками нематод; зменшення ураження нематодами пiд впливом регулятора росту завдяки пiдвищенню рiвня синтезу, очевидно, si/miRNA з антинематодною активнiстю. Таким чином, у данiй роботi вперше показано, що пiдвищення iмунiтету рослин про- ти нематодної iнфекцiї досягається шляхом пiдсилення регулятором росту Радостим-су- пер синтезу малих регуляторних si/miRNA, спорiднених (комплементарних) до структури mRNA нематод, що спричинює до блокування (сайленсiнгу) трансляцiї mRNA нематод. Розроблений нами метод видiлення si/miRNA можна використовувати для синтезу cDNA на матрицях si/miRNA та конструювання векторiв на основi cDNA копiй генiв з експресiєю si/miRNA у трансформованих ними рослинах. 1. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21 – and 22-nucleotide RNAs // Genes & Development. – 2001. – 15. – P. 188–200. 2. Fuller V. L., Lilley C. J., Urwin P. E. Nematode resistance // New Phytologist. – 2008. – 180. – P. 27–44. 3. Leung R.K.M., Whittaker P.A. RNA interference: from gene silencing to gene-specific therapeutics // Pharmacology and Therapeutics. – 2005. – No 107. – P. 222–239. 4. Aravin A., Tuschl T. Identification and characterization of small RNAs involved in RNA silencing // FEBS Lett. – 2005. – 579. – P. 5830–5840. 5. Bakhetia M., Charlton W.L., Urwin P. E. RNA interference and plant parasitic nematodes // Trends Plant Sci. – 2005. – 10, No 8. – P. 362–367. 6. Gheysen G., Vanholme B. RNAi from plants to nematodes // Trends Biotechnol. – 2006. – 25, No 3. – P. 89–92. 7. Knox D.P., Geldhof P., Visser A., Britton C. RNA interference in parasitic nematodes of animals: a reality check? // Trends Parasitol. – 2007. – 23, No 3. – P. 105–107. 8. Jian X., Zhang L., Li G. Identification of novel stress-regulated microRNAs from Oryza sativa L // Genomics. – 2010. – 95. – P. 47–55. 9. Chen R., Hu Z., Zhang H. Identification of microRNAs in wild soybean (Glycine soja) // J. Integr. Plant Biol. – 2009. – 51, No 12. – P. 1071–1079. 10. Bakhetia M., Charlton W. L., Urwin P. E. RNA interference and plant parasitic nematodes // Trends Plant Sci. – 2005. – 10, No 8. – P. 362–367. 11. Lu C., Meyers B. C., Green P.G. Construction of small RNA cDNA libraries for deep sequencing // Methods. – 2007. – 43. – P. 110–117. 12. Yoo B.C., Kragler F., Varkonyi-Gasic E. et al. A systemic small RNA signaling system in plants // Plant Cell. – 2004. – 16. – P. 1979. – 2000. 13. Tsygankova V.A., Blume Ya. B. An unusual minor protein appearing in embryonic axis cells of haricot bean seeds following germination process stimulated by 6-methylthiouracil // Biopolymers and Cell. – 1998. – 14, No 5. – P. 438–448. 14. Tsygankova V.A. Concerning the peculiarities of gene expression changes in plant leaf cells during twenty- four-hour period // Бiотехнологiя. – 2010. – 3, № 4. – С. 86–95. 15. Цыганкова В.А., Мусатенко Л.И., Пономаренко С.П. и др. Изменение популяций функционально активных цитоплазматических мРНК в клетках растений под влиянием регуляторов роста и биотех- нологические перспективы бесклеточных систем белкового синтеза // Там само. – 2010. – 3, № 2. – С. 19–32. Надiйшло до редакцiї 02.03.2011Iнститут бiоорганiчної хiмiї та нафтохiмiї НАН України, Київ Iнститут харчової бiотехнологiї та геномiки НАН України, Київ ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2011, №9 163 V.A. Tsygankova, Ya. V. Andrusevich, Academician of the NAS of Ukraine Ya. B. Blume Isolation of small regulatory si/miRNA with antinematode activity from plant cells A new method of small regulatory si/miRNAs’ isolation is elaborated, and their functional (si- lence) activity in a cell-free system of protein synthesis is testified. It is found that the plant growth regulator Radostim-super enhances the plant resistance against nematode by stimulating the synthesis of si/miRNAs. 164 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2011, №9