Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора

Проаналізовано ефективність іммобілізації антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні перетворювача, вкритій різними хімічними агентами (додекантіолаом, поліелектролітами і похідними декстрану) для створення функціонально стабільних уніфікованих чутливих елементів оптичного імунного б...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2008
Main Authors:	Пирогова, Л.В., Стародуб, М.Ф.
Format:	Article
Language:	Ukrainian
Published:	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України 2008
Subjects:	Експериментальні статті
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4055
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора / Л. В. Пирогова, М. Ф. Стародуб // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 52-58. — Бібліогр.: 10 назв. — укр.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860068152512086016
author	Пирогова, Л.В. Стародуб, М.Ф.
author_facet	Пирогова, Л.В. Стародуб, М.Ф.
citation_txt	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора / Л. В. Пирогова, М. Ф. Стародуб // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 52-58. — Бібліогр.: 10 назв. — укр.
collection	DSpace DC
description	Проаналізовано ефективність іммобілізації антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні перетворювача, вкритій різними хімічними агентами (додекантіолаом, поліелектролітами і похідними декстрану) для створення функціонально стабільних уніфікованих чутливих елементів оптичного імунного біосенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу. Показано, що використання поліелектролітів поліаліламіну гідрохлориду і полістиренсульфонату для модифікації поверхні перетворювача біосенсора є найбільш доцільним, дешевим і простим під час проведення скринінгових досліджень. Змінні пластинки, що їх використовують як перетворювач, можуть бути підготовлені завчасно і використані в разі потреби. Проанализирована эффективность иммобилизации антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота на поверхности преобразователя, покрытой различными химическими агентами (додекантиолом, полиэлектролитами и производными декстрана) для создания функционально стабильных унифицированных чувствительных элементов оптического иммунного биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса. Показано, что использование полиэлектролитов полиалиламина гидрохлорида и полистиренсульфоната для модификации поверхности преобразователя указанного биосенсора является наиболее целесообразным, дешевым и простым при проведении скрининговых исследований. Сменные пластинки, применяемые в качестве преобразователя, могут быть подготовлены заблаговременно и использованы по мере надобности. Efficiency of immobilization of bovine leukaemia virus (BLV) antigen on the transducer surface of SPR biosensor by using of various agents (polyelectrolyte selfassembly, dodecantiol, dextran sulphate) was investigated. This technique was compared with direct immobilisation of the immune components on the bare gold. It was shown that modification of sensor surface with polyelectrolytes is most expedient and chip for screening of bovine leukosis.
first_indexed	2025-12-07T17:09:21Z
format	Article
fulltext	52 ня стада потребує проводити його обстежен� ня принаймні через кожні 10 днів у разі ви� явлення в ньому хворих тварин. Існуючими методами це неможливо здійснити через до� сить значну вартість аналізу і необхідність частого взяття проб крові. Ці проблеми успішно вирішуються із застосуванням за� пропонованого нами імунного біосенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу (ППР) [1, 2]. Такий біосенсор може забезпе� чити прямий (без використання додаткових реагентів), експресний (здійснюваний про� тягом 3–5 хвилин), дешевий (вартістю мен� ше 1 долара США) аналіз і навіть без взяття крові, а використовуючи лише краплину молока. У попередніх дослідженнях була показа� на ефективність імунного біосенсора на осно� ві ППР для реєстрації специфічної взаємодії антиген–антитіло, а також доведена мож� ливість його використання для експресного визначення рівня антитіл, індукованих вірусом лейкозу (ВЛ) великої рогатої худо� би, у крові тварин [3]. Для цього на поверх� ню перетворювача іммобілізували антиген ВЛ, отриманий від науково�виробничого ТОВ «Лейкопол» (м. Полтава). Іммобіліза� Експресний контроль за розповсюджен� ням ретровірусної інфекції серед людей та тварин — важлива світова проблема. Як ві� домо, ретровіруси є збудниками набутого імунодефіциту в людей, що кваліфіковано як захворювання на СНІД; вони, зокрема, є також збудниками вірусного лейкозу ве� ликої рогатої худоби (ВРХ), вірусних хвороб риб, наприклад карциноми в щуки, тощо. Основним заходом для подолання захворю� вань, зумовлених ретровірусною інфекцією, є своєчасна діагностика їх. Хворих тварин вилучають з гурту та знищують. Загально� прийнятим засобом виявлення лейкозу ВРХ є традиційний імуноферментний аналіз, ві� домий як ELISA�метод. Для цього викорис� товують, як правило, проби крові із шийної вени. Однак цей метод є довготривалим (аналіз триває близько 6 год), високовартіс� ним (вартість одного аналізу — близько 5 до� ларів США), досить складним, вимагає ви� сокої професійної підготовки виконавців та спеціального обладнання і реагентів (різних кон’югат, хімічних компонентів). В Україні застосовують дешевший, але менш чутли� вий і ще більш рутинний метод — реакцію імунодифузії (РІД). Ефективне оздоровлен� ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ УДК: 577.112.087:577.150.87:577.352.52 57:66:5773 ІММОБІЛІЗАЦІЯ АНТИГЕНУ РЕТРОВІРУСУІММОБІЛІЗАЦІЯ АНТИГЕНУ РЕТРОВІРУСУ ЛЕЙКОЗУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ ЛЕЙКОЗУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ НА ПОВЕРХНІ ІМУННОГО БІОСЕНСОРА НА ПОВЕРХНІ ІМУННОГО БІОСЕНСОРА Л. В. Пирогова Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ М. Ф. Стародуб E)mail: lyudmilasy@ukr.net Ключові слова: велика рогата худоба, вірусний лейкоз, діагностика, імунобіосенсорний аналіз, поверх� невий плазмонний резонанс, додекантіол, поліелектроліти, декстран. Проаналізовано ефективність іммобілізації антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні пе� ретворювача, вкритій різними хімічними агентами (додекантіолаом, поліелектролітами і похідними декстрану) для створення функціонально стабільних уніфікованих чутливих елементів оптичного імунного біосенсора на ос� нові поверхневого плазмонного резонансу. Показано, що використання поліелектролітів поліаліламіну гідрохло� риду і полістиренсульфонату для модифікації поверхні перетворювача біосенсора є найбільш доцільним, деше� вим і простим під час проведення скринінгових досліджень. Змінні пластинки, що їх використовують як перетворювач, можуть бути підготовлені завчасно і використані в разі потреби. Експериментальні статті 53 сироватки попередньо перевіряли у РІД. Для досліджень імунним біосенсором на ос� нові ППР готували різні розведення сирова� ток у 1 мМ�трис�HCl�буфері, рН 7,4, що містив 140 мМ хлористого натрію (ЗФР). 1%�й розчин бичачого сироваткового аль� буміну (БСА), отриманого від фірми Sigma (США), готували, використовуючи ЗФР. Для модифікації поверхні перетворювача застосовували додекантіол та поліелектроліти. Хімічну сорбцію додекантіолу НS (СН2)11СН3 здійснювали, занурючи виготовлену плас� тинку з нанесеним шаром золота в 1 мМ роз� чин етанолу при кімнатній температурі на 15 год, після чого промивали чистим етано� лом і висушували у потоці повітря. Поліелектролітна нерозчинна плівка на поверхні золота формувалась за допомогою поліаліламіну гідрохлориду (ПАА). Полі� електроліт використовували в концентрації 1 мг/мл, час експозиції 30 хв, при кімнатній температурі. Поверхню промивали дисти� льованою водою. У разі застосування декстрану сульфату (5 kDа) його розчин в 1 мМ трис�HCl�буфері, рН 4,0, концентрація 2 мг/мл, наносили на поверхню і витримували там 25 хв, а потім поверхню промивали буфером. Тестування сироваток на наявність у них антитіл, специфічних до білків ретровірусу, проводили, як описано раніше [3]. Результати та обговорення Важливою вимогою до роботи біосенсора є стабільність і відтворюваність результатів досліджень. Тому одним з основних завдань, які мають бути вирішені на шляху впровад� ження у практику розробленого нами рані� ше [10 ] біосенсорного методу діагностики ретровірусного лейкозу ВРХ, є забезпечення ефективної стандартизованої іммобілізації біологічного матеріалу та оптимізація функ� ціональних параметрів ППР�біосенсора. У попередніх експериментах на моделі взаємодії антиген–антитіло досліджено й проаналізовано ефективність іммобілізації біологічного матеріалу на поверхні перетво� рювача ППР, укритій різними біологічними та хімічними агентами (лектинами, доде� кантіолом, поліелектролітами та похідними декстрину), що було застосовано для ство� рення функціонально стабільних уніфікова� них чутливих елементів біосенсора [7]. Оскіль� ки чутливість ППР біосенсора досить висока й достатня для проведення скринінгових експресних досліджень на лейкоз [3], то для інтеграції антигену на поверхні біосенсора ція антигену на поверхні забезпечувала се� лективне зв’язування специфічних антитіл із сироватки крові тварин. Виявилось, що результати аналізу істотно залежать від то� го, яким чином підготовлено шар золота на скляній поверхні, у який спосіб цю поверх� ню попередньо обробляли та який стан іммо� білізованого біологічного матеріалу на по� верхні трансдюсера. Нанесення на поверхню золота різних покриттів дозволяє збільшити чутливість біосенсора. Зокрема, модифіка� ція сенсорної поверхні додекантіолом збіль� шує її в 1,3 раза [4]. Окрім того, у разі іммо� білізації біологічних молекул звичайною фізичною адсорбцією на чистій поверхні зо� лота або ж попередньо обробленій доде� кантіолом чи поліелектролітами [4, 5] до� сить значна частина їх може бути блокована внаслідок контакту активних центрів (на� приклад, антигензв’язувальних сайтів) з по� верхнею. Аби уникнути цього недоліку, ви� користовують різні підходи, серед яких найпоширенішими є орієнтоване включення біологічних молекул у плівки Ленгмюр� Блоджет різного складу [6] або попередня іммобілізація на поверхні білка А із Staphy) lococcus aureus [5] та лектинів [7, 8], що ма� ють спорідненість до Fc�фрагмента IgG або ж до його карбогідратного компонента [9]. У наших дослідженнях особливу увагу приділяли саме оптимізації умов іммобілі� зації селективного біологічного матеріалу. В цій статті наведено експериментальні дані щодо порівняльного використання полі� електролітів, тіолів та похідних декстрану для іммобілізації антигену ВЛ з метою за� безпечення ефективності процесу та функ� ціональної стабільності підготовленої по� верхні трансдюсера. Матеріали і методи Вимірювальний пристрій і принцип його роботи детально розглянуто раніше [1, 2]. Перетворювач імунного біосенсора у вигляді попередньо хромованої (3–5 нм шару Cr) скляної пластинки з напиленим шаром золо� та товщиною 45 нм поєднується з призмою оптичного приладу за допомогою імерсійної рідини (поліфенілового ефіру) з коефіцієн� том заломлення 1,6. Антиген вірусу лейкозу отримано від нау� ково�виробничого ТОВ «Лейкопол» (м. Пол� тава). В експерименті використовували роз� чин такого антигену в концентрації 1 мг/мл в 1 мМ трис�HCl�буфері, рН 8,2, що містив 140 мМ хлористого натрію. Сироватки крові корів було взято в різ� них господарствах Полтавської області. Усі БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 54 пенем її розведення. Таким чином, іммобілі� зація антигену забезпечує селективне зв’я� зування специфічних антитіл із сироватки крові тварин. Утворення на поверхні біосен� сора імунних комплексів спричинює зсув резонансного кута, пропорційний кількості антитіл у пробі. Показано, що нанесення антигену на по� верхню позитивно зарядженої поліелект� ролітної плівки підвищує відгук біосенсора на 15–20% порівняно з тим випадком, коли використовували необроблену поверхню біосенсорного перетворювача (рис. 2). Встановлено також, що модифікація трансдюсерної поверхні тіолами майже не впливає на чутливість аналізу, тобто відгук біосенсора під час визначення інтенсивності його специфічної імунної взаємодії з антитіла� ми, що містились у сироватці крові, є приб� лизно таким, як і без попереднього застосу� вання тіолів. Це зумовлено лише тим, що іммобілізується більше антигену на поверх� ні, однак орієнтація антигенних детермінант на поверхні не є такою, що сприяє їх макси� мальній експозиції, як у разі, коли поперед� ньо наносили поліелектролітний шар. Разом з тим, така модифікація стабілізує адсорб� цію антигену, підвищуючи також відтворю� ваність результатів аналізів. Розбіжність результатів під час вимірювання однієї проби значно менша порівняно з випадком, коли антиген іммобілізували безпосередньо на поверхні золота. Таким чином, показано, що застосуван� ня додекантіолу та поліелектроліту ПАА для покриття шару золота на поверхні пе� ретворювача дозволяє, передусім, підвищи� ти відтворюваність роботи чутливих елемен� тів оптичного імунного біосенсора на базі ППР. Проте кількість біологічних молекул, послуговувались лише такими способами, які в інших випадках [10] були найпрості� шими і виявляли високу ефективність. Модифікація поверхні перетворювача тіолами та поліелектролітами У спеціальній серії досліджень доведено, що адсорбція антигену на поверхні перетво� рювача, вкритій шаром додекантіолу або поліелектроліту ПАА, є стабільною в часі й не руйнується під час промивання вимірю� вальної комірки ЗФР. Іммобілізація антиге� ну супроводжується зміною резонансного кута в межах 1 200–1 500 кут. с. Разом з тим показано, що в разі використання поліелект� роліту кількість сорбованого на поверхні ан� тигену була дещо більшою, а відгук біосен� сора за іммобілізації антигену був більш стабільним і відтворюваним порівняно з не� обробленою поверхнею, хоча достовірного підвищення концентрації антигену ВЛ на поверхні не відзначалось (рис. 1). Застосу� вання додекантіолу також сприяє стабіліза� ції моношару антигену ВЛ. Іммобілізований у такий спосіб антиген зберігав майже стовід� соткову активність упродовж 3 місяців, тоді як антиген, нанесений на невкриту поверх� ню, втрачав активність вже через 2–3 тижні. Оброблення поверхні 1%�м розчином БСА після сорбції антигену не вносить сут� тєвих змін у величину резонансного кута, що реєструється. Це, на нашу думку, озна� чає, що на поверхні практично не залишає� ться вільних місць зв’язування, а концент� рація антигену є достатньою для створення максимально щільного шару. Зі введенням у вимірювальну комірку специфічної анти� сироватки корів, клінічно хворих на лейкоз, величина відгуку біосенсора корелює зі сту� Рис. 1. Відгук ППР біосенсора на внесення антигену ВЛ з використанням різних типів поверхні Рис. 2. Величина відхилення резонансного кута імунного сенсора на основі ППР під час дослідження сироваток корів: 1 — модифікована ПАА поверхня; 2 — невкрита золота поверхня Додекантіол ЗолотоПоліелектроліти 1 2 Розведення сироватки Експериментальні статті 55 трис�HCl�буфером, змінюючи рН від 4,0 до 8,0 і руйнуючи електростатичні зв’язки між IgG та поліелектролітами. Таким чином, на поверхні перетворювача формується не мо� ношар, а подвійний шар антитіл за рахунок ковалентних зв’язків між молекулами IgG, утворених за допомогою глутарового аль� дегіду (рис. 4). Насамкінець у комірку вно� сили розчин IgG людини в діапазоні конце� нтрацій від 1 нг/мл до 100 мкг/мл у ЗФР та фіксували відгук імуносенсора. Зміщення резонансного кута було пропорційне конце� нтрації IgG людини у розчині. Показано, що підготовка чутливої по� верхні у такий спосіб дозволяє значно підви� щити чутливість аналізу, яка в даному разі становила 20 нг/мл, причому лінійний від� різок графіка залежності ППР сигналу від кількості IgG людини у розчині знаходиться в діапазоні концентрацій від 100 нг/мл до 100 мкг/мл. Чутливість імуносенсора з ви� користанням моношару антитіл, сформова� ного на невкритій поверхні золота, станови� ла 100 нг/мл, лінійна ділянка графіка лежить у межах 1–10 мкг/мл (рис. 5). Вста� новлено, що формування на поверхні пере� творювача багатошарової (тривимірної) роз� галуженої структури з антитіл за допомогою поліелектролітів та глутарового альдегіду дозволяє значно підвищити чутливість ППР імуносенсора. Аналогічну схему було використано і для іммобілізації антигену ВЛ. Розчин анти� гену ВЛ у концентрації 0,5 мг/мл в 1 мМ трис� HCl�буфері, рН 8,2, вносили у вимірювальну фіксованих на поверхні фізичною сорбцією або за допомогою проміжних шарів зазначе� них вище сполук, обмежена площиною по� верхні перетворювача. Цьому обмеженню можна запобігти за допомогою сполук, які здатні формувати на поверхні розгалужені структури і в такий спосіб забезпечувати розташування біологічного матеріалу у три� вимірному просторі. Таким чином кількість іммобілізованого матеріалу можна збільши� ти, підвищивши тим самим чутливість біосенсора. У даній роботі запропоновано ще одну схему застосування поліелектролітів, коли полікатіони та поліаніони використовува� лись для формування подвійного розгалу� женого шару біомолекул. Така схема іммобілізації біологічного матеріалу була спочатку відпрацьована на традиційній для наших досліджень моделі антиген–антитіло: IgG людини та полікло� нальні антитіла кролика до імуноглобулінів людини. Антитіла кролика у концентрації 200 мкг/мл в ЗФР, рН 8,0, адсорбували спонтанною фізичною сорбцією на поверхні перетворю� вача, інкубували 30 хв при кімнатній темпе� ратурі, після чого комірку промивали ЗФР. Потім у комірку вносили розчин поліелект� ролітів у послідовності ПАА — ПСС — ПАА. Концентрація кожного поліелектроліту ста� новила 1 мг/мл, час інкубації — 20 хв. Далі у комірку знову вносили антитіла кроля до імуноглобулінів людини в такій самій кон� центрації, витримували 20 хв і промивали ЗФР. Потім у комірку додавали 0,5% глута� рового альдегіду. Після інкубації протягом 10 хв поліелектроліти вимивали 0,01 М Рис. 3. Відгук ППР біосенсора на внесення антисироватки (1:500) з використанням різних типів поверхні Рис. 4. Відгук ППР імуносенсора на внесення біологічних та хімічних компонентів: 1 — дистильована вода; 2 — поліклональні антитіла кролів до IgG людини; 3 — ЗФР; 4, 5, 6, — ПАА, ПСС, ПАА, відповідно; 7 — поліклональні антитіла кролів до IgG людини; 8 — ЗФР; 9 — глутаровий альдегід; 10 — 0,05 М трис�НCl�буфер, рН 4 та рН 8; 11 — IgG людини, 100 мкг/мл ДодекантіолЗолото Поліелектроліти 1 111098 76543 2 БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 56 ча істотно підвищує чутливість сенсора до специфічних антитіл. Це має особливе зна� чення під час дослідження тварин на ранніх етапах захворювання, коли титр специфіч� них антитіл невисокий. Оскільки поверхню готують заздалегідь, то на експресність ана� лізу це не впливає. Модифікація поверхні за допомогою декстранів Антиген ВЛ іммобілізували на поверхню, вкриту сульфатом декстрану. Похідні декст� рану мають розгалужену структуру і ство� рюють на поверхні більшу кількість сайтів зв’язування порівняно з чистою (необробле� ною) поверхнею [5]. Розчин антигену ВЛ у концентрації 0,5 мг/мл в 1 мМ трис�HCl� буфері, рН 6,0, вносили у вимірювальну комірку й інкубували протягом 20 хв при кімнатній температурі. Потім комірку про� мивали зазначеним буфером і після блоку� вання вільних місць зв’язування вносили зразки сироватки та фіксували зміщення ре� зонансного кута. Іммобілізація антигену супроводжує� ться зміною резонансного кута в межах 1 600 –1700 кут. с, що на 200–250 кут. с більше порівняно з невкритою поверхнею. Відгук сенсора був більш стабільним і від� творюваним, ніж тоді, коли використовува� ли необроблену поверхню золота, — розбіжність у значенні зсуву резонансного кута в разі іммобілізації одного й того само� го зразка антигену була мінімальною, у ме� жах 30–60 кут. с. Разом з тим, у разі вико� комірку та інкубували протягом 20 хв при кімнатній температурі. Потім комірку про� мивали зазначеним буфером і послідовно вносили поліелектроліти ПАА — ПСС — ПАА в концентрації 1 мг/мл в 1 мМ трис�HCl�бу� фері з відповідним рН. Комірку промивали буфером і вносили розчин антигену ВЛ. Інкубували 20 хв і промивали буфером. Далі додавали 0,5%�й розчин глутарового альдегі� ду, витримували 15 хв, після чого видаляли поліелектроліти 50 мМ трис�HCl буфером, змінюючи рН від 4,0 до 8,0. Сформовану таким чином двошарову чутливу поверхню викорис� товували для дослідження антисироваток. В експерименті досліджено 3 групи сиро� ваток крові ВРХ. Перша група — це сиро� ватки, позитивні за даними РІД та методу ELISA. Титр таких сироваток у РІД стано� вив від 1:64 до 1:256. Для проведення мето� ду ELISA використовували тест�систему IDEX (США). Друга група — це сироватки, негативні за результатами РІД, але пози� тивні за даними методу ELISA. І нарешті, третя група — це сироватки, негативні за ре� зультатами РІД та ELISA. Кожну пробу си� роватки у розведенні 1:200 в 1 мМ трис�HCl� буфері, рН 7,4, вносили у вимірювальну комірку і фіксували специфічний сигнал. Утворення на поверхні біосенсора імунних комплексів супроводжувалось зміною резо� нансного кута. На рис. 6 наведено середні значення одержаних даних тестування пер� ших двох груп. У пробах третьої групи сиро� ваток, негативних за результатами двох традиційних методів РІД та ELISA, за допо� могою імуносенсорного аналізу специфіч� них антитіл до ВЛ також не виявлено. Встановлено, що формування подвійного шару антигену ВЛ на поверхні перетворюва� Рис. 5. Відгук ППР біосенсора на внесення розчину IgG людини у діапазоні концентрацій від 10 нг/мл до 500 мкг/мл за різних варіантів чутливої поверхні: 1 — подвійний шар антитіл, створений за допомо� гою поліелектролітів; 2 — моношар антитіл, сформований на невкритій золотій поверхні Рис. 6. Відгук ППР біосенсора на внесення розчину сироватки крові ВРХ у розведенні 1:500 за різних варіантів чутливої поверхні: 1 — подвійний шар антигену ВЛ, створений за до� помогою поліелектролітів; 2 — моношар антигену ВЛ, сформований на не� вкритій золотій поверхні 2 1 Експериментальні статті 57 чутливих елементів оптичного імунного біосенсора на базі ППР та оптимізації функ� ціональних параметрів ППР біосенсора. Оскільки чутливість та специфічність ППР біосенсора є достатньо високою для проведення експресного аналізу проб з ме� тою виявлення хворих на лейкоз тварин, то нема потреби застосовувати високовартісні сполуки та ускладнювати алгоритм прове� дення аналізу. Використання поліелект� ролітів для модифікації поверхні перетво� рювача імунного біосенсора на базі ППР є найбільш доцільним, дешевим і простим. Також слід додати, що загальна трива� лість аналізу розробленим імунним біосен� сором становить лише понад 40 хв, включаючи час, витрачений на іммобілізацію антигену на поверхні трансдюсера, блокування віль� них місць зв’язування та промивання вимірювальної комірки. Сама ж процедура тестування сироваток не перевищує 10 хв, і це робить аналіз експресним, особливо зва� жаючи на те, що поверхня трансдюсера обладнана змінними пластинками, які мо� жуть бути попередньо підготовлені і вико� ристані в разі потреби. У наших дослідах вже одержано результати, які демонструють стабільність таких поверхонь протягом трьох і більше місяців. Спостереження тривають і далі, а отже є надія, що зазначений термін може бути значно довшим. Імунобіосенсор� ний аналіз можна проводити і в польових умовах, а приладова частина для його здійс� нення може мати портативний вигляд. Усе це створює умови для простого, швидкого та дешевого скринінгу лейкозу безпосередньо в господарствах або ж на карантинних стан� ціях. ристання попередньо необробленої поверхні розбіжність результатів від пластинки до пластинки перетворювача становить 15–20%. Збільшення кількості адсорбованого антигену на поверхні сприяє підвищенню чутливості біосенсора до виявлення антитіл у розчині. Після внесення антисироватки спостерігали на 20% більший відгук біосенсора порівня� но з необробленою поверхнею (рис. 7). Не� доліком такого способу модифікації є висо� ка вартість декстранів. Щоб зробити підсумок, ми порівняли ре� зультати наших досліджень, одержані за різних способів підготовки поверхні пере� творювача біосенсора. Було відібрано 8 си� роваток крові корів, для яких рівень екс� тинкції за даними методу ELISA становив 2,0–2,5 опт. од. Проби розводили ЗФР у спів� відношенні 1:500 і вносили їх у вимірюваль� ну комірку після іммобілізації антигену відповідним чином на підготовленій по� верхні перетворювача. Далі реєстрували відгук біосенсора. На рис. 8 подано середні значення одержаних даних. Підтверджено, що найбільша чутливість притаманна біосенсору, на поверхні перетворювача яко� го сформовано подвійний шар антигену за допомогою поліелектролітів. В інших ви� падках, зокрема в разі застосування тіоло� вих та декстранових покриттів, суттєвого підвищення чутливості не спостерігалось. Таким чином, було проаналізовано ефек� тивність іммобілізації селективного біоло� гічного матеріалу на поверхні перетворювача ППР, попередньо вкритій різними хімічни� ми агентами (додекантіолом, поліелектролі� тами та похідними декстрану), для створен� ня функціонально стабільних уніфікованих Рис. 7. Величина відхилення резонансного кута імунного сенсора на основі ППР під час дослідження сироваток корів: 1 — модифікована декстраном поверхня; 2 —невкрита золота поверхня Рис. 8. Відгук ППР біосенсора на внесення розчину сироватки крові ВРХ у розведенні 1:500 за різних варіантів чутливої поверхні: 1 — невкрите золото; 2 — додекантіол; 3 — золото, вкрите шаром ПАА; 4 — подвійний шар антигену; 5 — декстран Розведення сироватки 2 1 2 1 Розведення сироватки БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №2, 2008 58 5. Starodub N. F., Nabok A. V., Starodub V. M. et al. Immobilization of biocomponens for immune optical sensor // Ukr. Biochem. Zhurn. — 2001. — V. 73, N4. — Р. 55–64. 6. Nakamura R., Muguruma H., Ikebukuro K. et al. A plasma polymerized film for surface plasmon resonance immunosensing // Anal. Chem. — V. 69. — 1997. — P. 4649–4652. 7. Пирогова Л. В. Стародуб М. Ф. Іммобілізація імуноглобулінів за допомогою лектинів при створенні імунних сенсорів на основі поверх� невого плазмонного резонансу // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, № 2. — С. 45–50. 8. Иммунология: В 3 томах / Под. ред. У. По� ла. — 1987. — Т. 1. — C. 255–313. 9. Стародуб М. Ф., Стародуб В. М. Біосенсо� ри: витоки, досягнення і перспективи // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, №4–5. — С. 147–163. 10. Starodub N. F, Pirogova L. V., Demchenko A., Nabok A. V. Antibody immobilization on the metal and silicon surface. The use of self� assemled layers and specific receptors // Bioelectrochemistry. — 2005. — V. 66, N 1–2. — P. 111–115. IMMOBILIZATION OF BOVINE LEUCOSIS ANTIGEN ON THE TRANSDUCER SURFACE OF BIOSENSOR L. V. Pyrogova, M. F. Starodub Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv E)mail: lyudmilasy@ukr. net Efficiency of immobilization of bovine leukaemia virus (BLV) antigen on the transducer surface of SPR biosensor by using of various agents (polyelectrolyte selfassembly, dodecanti� ol, dextran sulphate) was investigated. This technique was compared with direct immobilisa� tion of the immune components on the bare gold. It was shown that modification of sensor surface with polyelectrolytes is most expedient and chip for screening of bovine leukosis. Key words: bovine leucosis, bovine leukaemia virus, diagnostics, immune sensor analysis, surface plasmon resonance, dodecantiol, polyelectrolytes, dextran. 1. Liedberg B., Nylander C., Lundstrom I. Surface plasmons resonance for gas detec� tion and biosensing // Sensors & Actuators B. — 1983. — № 4. — P. 299–304. 2. Kooyman R. P. H., Kolkman H., van Gent J. et al. Surface plasmon resonance immunosen� sors: sensitivity considerations // Anal. Chim. Acta. — V. 213. — 1988. — P. 35–45. 3. Пирогова Л. В., Нагаєва Л. І., Стародуб М. Ф. Експресна діагностика лейкозу великої ро� гатої худоби за допомогою імунного сенсо� ра на основі поверхневого плазмонного ре� зонансу // Укр. біохім. журн. — 2002. — Т. 74, № 3. — С. 88–92. 4. Starodub N. F., Starodub V. M. Ultrathin Multilayer Polyelectrolyte Films on Gold // Novel Processes and Control Technologies in the Food Industry:NATO Proceedings / Ed. F. Bozoglu et al. — Cluver Acad. Publ., 2001. — Р. 63–94. ИММОБИЛИЗАЦИЯ АНТИГЕНА РЕТРОВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА НА ПОВЕРХНОСТИ ИМУННОГО БИОСЕНСОРА Л. В. Пирогова, М. Ф. Стародуб Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев E)mail: lyudmilasy@ukr. net Проанализирована эффективность иммо� билизации антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота на поверхности преобразовате� ля, покрытой различными химическими аген� тами (додекантиолом, полиэлектролитами и производными декстрана) для создания функ� ционально стабильных унифицированных чувствительных элементов оптического им� мунного биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса. Показано, что исполь� зование полиэлектролитов полиалиламина гидрохлорида и полистиренсульфоната для модификации поверхности преобразователя указанного биосенсора является наиболее це� лесообразным, дешевым и простым при прове� дении скрининговых исследований. Сменные пластинки, применяемые в качестве преобра� зователя, могут быть подготовлены заблаго� временно и использованы по мере надобности. Ключевые слова: крупный рогатый скот, вирусный лейкоз, диагностика, иммунобиосенсорный анализ, поверхностный плазмонный резонанс, додеканти� ол, полиэлектролиты, декстран. ЛІТЕРАТУРАЛІТЕРАТУРА
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-4055
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T17:09:21Z
publishDate	2008
publisher	Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України
record_format	dspace
spelling	Пирогова, Л.В. Стародуб, М.Ф. 2009-07-15T11:05:02Z 2009-07-15T11:05:02Z 2008 Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора / Л. В. Пирогова, М. Ф. Стародуб // Біотехнологія. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 52-58. — Бібліогр.: 10 назв. — укр. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4055 577.112.087:577.150.87:577.352.52 57:66:5773 Проаналізовано ефективність іммобілізації антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні перетворювача, вкритій різними хімічними агентами (додекантіолаом, поліелектролітами і похідними декстрану) для створення функціонально стабільних уніфікованих чутливих елементів оптичного імунного біосенсора на основі поверхневого плазмонного резонансу. Показано, що використання поліелектролітів поліаліламіну гідрохлориду і полістиренсульфонату для модифікації поверхні перетворювача біосенсора є найбільш доцільним, дешевим і простим під час проведення скринінгових досліджень. Змінні пластинки, що їх використовують як перетворювач, можуть бути підготовлені завчасно і використані в разі потреби. Проанализирована эффективность иммобилизации антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота на поверхности преобразователя, покрытой различными химическими агентами (додекантиолом, полиэлектролитами и производными декстрана) для создания функционально стабильных унифицированных чувствительных элементов оптического иммунного биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса. Показано, что использование полиэлектролитов полиалиламина гидрохлорида и полистиренсульфоната для модификации поверхности преобразователя указанного биосенсора является наиболее целесообразным, дешевым и простым при проведении скрининговых исследований. Сменные пластинки, применяемые в качестве преобразователя, могут быть подготовлены заблаговременно и использованы по мере надобности. Efficiency of immobilization of bovine leukaemia virus (BLV) antigen on the transducer surface of SPR biosensor by using of various agents (polyelectrolyte selfassembly, dodecantiol, dextran sulphate) was investigated. This technique was compared with direct immobilisation of the immune components on the bare gold. It was shown that modification of sensor surface with polyelectrolytes is most expedient and chip for screening of bovine leukosis. uk Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України Експериментальні статті Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора Иммобилизация антигена ретровируса лейкоза крупного рогатого скота на поверхности иммунного биосенсора Immobilization of bovine leocosis antigen on the transducer surface of biosensor Article published earlier
spellingShingle	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора Пирогова, Л.В. Стародуб, М.Ф. Експериментальні статті
title	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
title_alt	Иммобилизация антигена ретровируса лейкоза крупного рогатого скота на поверхности иммунного биосенсора Immobilization of bovine leocosis antigen on the transducer surface of biosensor
title_full	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
title_fullStr	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
title_full_unstemmed	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
title_short	Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
title_sort	іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора
topic	Експериментальні статті
topic_facet	Експериментальні статті
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4055
work_keys_str_mv	AT pirogovalv ímmobílízacíâantigenuretrovírusuleikozuvelikoírogatoíhudobinapoverhníímunnogobíosensora AT starodubmf ímmobílízacíâantigenuretrovírusuleikozuvelikoírogatoíhudobinapoverhníímunnogobíosensora AT pirogovalv immobilizaciâantigenaretrovirusaleikozakrupnogorogatogoskotanapoverhnostiimmunnogobiosensora AT starodubmf immobilizaciâantigenaretrovirusaleikozakrupnogorogatogoskotanapoverhnostiimmunnogobiosensora AT pirogovalv immobilizationofbovineleocosisantigenonthetransducersurfaceofbiosensor AT starodubmf immobilizationofbovineleocosisantigenonthetransducersurfaceofbiosensor

Іммобілізація антигену ретровірусу лейкозу великої рогатої худоби на поверхні імунного біосенсора

Institution

Similar Items