Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха
С использованием флуоресцентного зонда ФМЕ исследовано взаимодействие с липосомами, сформированными из
 суммарных липидов сперматозоидов петуха (СЛСП), криопротекторов: этиленгликоля (ЭГ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), N,N-
 диметилформамида (ДМФА), N,N-диметилацетамида (ДМАЦ), глицерина...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44428 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Взаимодействие криопротекторов с липосомами
 из суммарных липидов спермиев петуха / Т.П. Линник, Т.С. Дюбко, И.Н. Мартынюк, А.В. Терещенко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 34-46. — Бібліогр.: 22 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860191465778446336 |
|---|---|
| author | Линник, Т.П. Дюбко, Т.С. Мартынюк, И.Н. Терещенко, А.В. |
| author_facet | Линник, Т.П. Дюбко, Т.С. Мартынюк, И.Н. Терещенко, А.В. |
| citation_txt | Взаимодействие криопротекторов с липосомами
 из суммарных липидов спермиев петуха / Т.П. Линник, Т.С. Дюбко, И.Н. Мартынюк, А.В. Терещенко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 34-46. — Бібліогр.: 22 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | С использованием флуоресцентного зонда ФМЕ исследовано взаимодействие с липосомами, сформированными из
суммарных липидов сперматозоидов петуха (СЛСП), криопротекторов: этиленгликоля (ЭГ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), N,N-
диметилформамида (ДМФА), N,N-диметилацетамида (ДМАЦ), глицерина и диметисульфоксида (ДМСО).Установлено, что
уровень воздействия криопротекторов на бислой определяется гидрофильно-гидрофобным балансом их молекул и имеет
концентрационно-зависимый характер. По степени увеличения влияния на спектральные параметры флуоресценции ФМЕ в
липосомах из СЛСП криопротекторы располагаются в ряд: глицерин ≤ ЭГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, что
согласуется с ростом их коэффициента распределения в системе “вода-неполярная фаза”. Рассматривается механизм влияния
криопротекторов на связи, формирующие бислой.
З використанням флуоресцентного зонда ФМЕ досліджено взаємодію з ліпосомами, які сформовані із сумарних ліпідів
сперматозоїдів півня (СЛСП), кріопротекторів: етиленгліколю (ЕГ), 1,2–пропандіолу (1,2–ПД), N,N-диметилформаміду
(ДМФА), N,N-диметилацетаміду (ДМАЦ), гліцерину і диметисульфоксиду (ДМСО). Встановлено, що рівень впливу кріо-
протекторів на бішар визначається гідрофільно-гідрофобним балансом їх молекул та має концентраційно-залежний характер.
За ступенем збільшення впливу на спектральні параметри флуоресценції ФМЕ в ліпосомах із СЛСП кріопротектори
розташовуються в ряд: гліцерин ≤ ЕГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, що погоджується зі збільшення їх коефіцієнта
розподілу в системі “вода-неполярна фаза”. Обговорюється механізм впливу кріопротекторів на зв’язки, які формують
бішар.
Using the fluorescent probe FME we studied interactions of the cryoprotectants: ethylene glycol (EG), 1,2-propane diol (1,2-
PD), N,N-dimethyl formamide (DMFA), N,N-dimethyl acetamide (DMAc), glycerol and dimethyl sulfoxide (DMSO) with liposomes
made from the fowl spermatozoa total lipid (FSTL). It was established that the level of CP impacts on bilayer is determined by
hydrophilic-hydrophobic balance of their molecules and showed a concentration dependence. The cryoprotectants are ranked by their
increasing influence on FME fluorescence spectral parameters in RSTL liposomes as follows: glycerol ≤ EG < 1,2-PD < DMSO <
DMAc ≤ DMFA, that corresponds the growth in their distribution coefficients in the system “water – non-polar phase”. A mechanism
of the cryoprotectant impacts on bonds forming bilayer is discussed.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:06:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
34
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-30-07, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Institute of Domestic Bird Husbandry of Ukrainian Academy of
Agricultural Sciences, Village Borki, Kharkov Region
1Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
2Институт птицеводства УААН, с. Борки, Харьковская обл.
УДК 577.352.2:57.043:636.5.082.453:66.095.11
Т.П. ЛИННИК1*,Т.С. ДЮБКО1, И.Н. МАРТЫНЮК1, А.В. ТЕРЕЩЕНКО2
Взаимодействие криопротекторов с липосомами
из суммарных липидов спермиев петуха
UDC 577.352.2:57.043:636.5.082.453:66.095.11
T.P. LINNIK1*, T.S. DYUBKO1, I.N. MARTYNYUK1, A.V. TERESCHENKO2
Interactions of Cryoprotectants with Liposomes
from Total Lipids of the Fowl Spermatozoa
С использованием флуоресцентного зонда ФМЕ исследовано взаимодействие с липосомами, сформированными из
суммарных липидов сперматозоидов петуха (СЛСП), криопротекторов: этиленгликоля (ЭГ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), N,N-
диметилформамида (ДМФА), N,N-диметилацетамида (ДМАЦ), глицерина и диметисульфоксида (ДМСО).Установлено, что
уровень воздействия криопротекторов на бислой определяется гидрофильно-гидрофобным балансом их молекул и имеет
концентрационно-зависимый характер. По степени увеличения влияния на спектральные параметры флуоресценции ФМЕ в
липосомах из СЛСП криопротекторы располагаются в ряд: глицерин ≤ ЭГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, что
согласуется с ростом их коэффициента распределения в системе “вода-неполярная фаза”. Рассматривается механизм влияния
криопротекторов на связи, формирующие бислой.
Ключевые слова: петух, сперматозоиды, липиды, липосомы, криопротекторы, флуоресцентный зонд.
З використанням флуоресцентного зонда ФМЕ досліджено взаємодію з ліпосомами, які сформовані із сумарних ліпідів
сперматозоїдів півня (СЛСП), кріопротекторів: етиленгліколю (ЕГ), 1,2–пропандіолу (1,2–ПД), N,N-диметилформаміду
(ДМФА), N,N-диметилацетаміду (ДМАЦ), гліцерину і диметисульфоксиду (ДМСО). Встановлено, що рівень впливу кріо-
протекторів на бішар визначається гідрофільно-гідрофобним балансом їх молекул та має концентраційно-залежний характер.
За ступенем збільшення впливу на спектральні параметри флуоресценції ФМЕ в ліпосомах із СЛСП кріопротектори
розташовуються в ряд: гліцерин ≤ ЕГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, що погоджується зі збільшення їх коефіцієнта
розподілу в системі “вода-неполярна фаза”. Обговорюється механізм впливу кріопротекторів на зв’язки, які формують
бішар.
Ключові слова: півень, сперматозоїди, ліпіди, ліпосоми, кріопротектори, флуоресцентний зонд.
Using the fluorescent probe FME we studied interactions of the cryoprotectants: ethylene glycol (EG), 1,2-propane diol (1,2-
PD), N,N-dimethyl formamide (DMFA), N,N-dimethyl acetamide (DMAc), glycerol and dimethyl sulfoxide (DMSO) with liposomes
made from the fowl spermatozoa total lipid (FSTL). It was established that the level of CP impacts on bilayer is determined by
hydrophilic-hydrophobic balance of their molecules and showed a concentration dependence. The cryoprotectants are ranked by their
increasing influence on FME fluorescence spectral parameters in RSTL liposomes as follows: glycerol ≤ EG < 1,2-PD < DMSO <
DMAc ≤ DMFA, that corresponds the growth in their distribution coefficients in the system “water – non-polar phase”. A mechanism
of the cryoprotectant impacts on bonds forming bilayer is discussed.
Key words: fowl spermatozoa, lipids, liposomes, cryoprotectants, fluorescent probe.
Для криоконсервирования спермы петухов
разработаны альтернативные методы, основанные
на использовании различных криопротекторов
(КП): глицерина, этиленгликоля (ЭГ), N,N-ди-
метилформамида (ДМФА), N,N-диметилацетами-
да (ДМАЦ) и диметилсульфоксида (ДМСО) [11],
однако все они имеют определенные недостатки.
Одной из причин этого является цитотоксическое
действие КП, основная мишень которого – клеточ-
ные мембраны сперматозоидов петуха [5, 10–13].
Несмотря на то, что явление цитотоксичности КП
давно общепризнано [11], тем не менее изучено
недостаточно, молекулярные основы действия КП
Alternative methods for cryopreservation of the
fowl sperm based on usage of different cryopro-
tectants (CPs): glycerol, ethylene glycol (EG), N,N-
dimethyl formamide (DMFA), N,N-dimethyl acetamide
(DMAc) and dimethyl sulfoxide (DMSO) [11] have
been developed, however they all have certain dis-
advantages. One cause of this lies in CP cytotoxicity,
the main target of which is the poultry spermatozoa
cellular membranes [5, 10–13]. Despite the phenome-
non of CP cytotoxicity is universally acknowledged [11],
it is not studied enough; molecular principles of CP
impact on membranes are still unclarified. Cryo-
protectants are able to modify lipid-lipid and lipid-protein
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
35
на мембраны до сих пор не выяснены. Криопротек-
торы способны модифицировать липид-липидные
и липид-белковые взаимодействия, изменять по-
верхностный потенциал, влиять на активность
мембранных ферментов [11]. Одним из перспек-
тивных подходов, позволяющих оценить степень
влияния внешних факторов на состояние липидного
бислоя, является использование флуоресцентных
зондов, молекулы которых прочно, но нековалентно
связываются с мембранами, в том числе и мо-
дельными, и быстро реагируют на микроокруже-
ние.
Цель работы – исследование влияния прони-
кающих КП различных химических классов: дио-
лов – ЭГ, 1,2-пропандиола (1,2-ПД); амидов –
ДМФА, ДМАЦ; триолов – глицерин и сульфокси-
дов – ДМСО на искусственные мембраны (липо-
сомы), сформированные из суммарных липидов
сперматозоидов петухов (СЛСП) с использовани-
ем флуоресцентного зонда ФМЕ.
Материалы и методы
Для исследований использовали сперму петухов
породы род-айланд (предоставлены Институтом
птицеводства УААН), которую получали масса-
жем абдоминальной области. Концентрацию спер-
матозоидов определяли спектрофотометрически
[10].
Для получения СЛСП сперму от 25 петухов
объединяли и отмывали от спермальной плазмы
3-кратным центрифугированием при 3000 об/мин
в течение 10 мин. Липиды из сперматозоидов экс-
трагировали по модифицированной методике Блайя
и Дайэра [8] и хранили в хлороформе при –20°С
[9].
Однослойные липосомы со средним диаметром
80–100 нм получали из предварительно растворен-
ных в 1 мл спирта СЛСП инжекционным методом
с последующим диализом при 4°С против физиоло-
гического раствора, приготовленного на 5 мМ нат-
рий-фосфатном буфере, рН 7,4 [6].
Все КП марки “х. ч.” или “ч. д. а.” (Реахим,
Россия) дополнительно очищали 2-кратной ва-
куумной перегонкой, предварительно выдерживая
24 ч над окисью алюминия или активированным
углем марки “А” [1,14]. Концентрацию КП выража-
ли в массовых процентах.
В качестве флуоресцентного зонда использова-
ли краситель класса гидроксифлавонолов – 3-гид-
рокси-4‘-(N,N-диметиламино)флавон (ФМЕ),
предоставленный В. Г. Пивоваренко (КНУ им.
Т.Г. Шевченко). Для экспериментов ФМЕ готовили
в виде спиртового раствора (5×10–3 М) и добавляли
в суспензию липосом до конечной концентрации
2,5–5×10–6 М за 15 мин до начала измерений.
Спектры флуоресценции регистрировали при
interactions, to change surface potential, to affect
membrane enzymes activities [11]. One of the promising
approaches allowing evaluation of gravity of environ-
mental factors influence on lipid bilayer state is appli-
cation of fluorescent probes, molecules of which bind
with membranes (including model ones) tightly, but non-
covalently, and respond quickly to microenvironment.
The aim of the work is the investigation of influence
of penetrating CPs of different chemical nature: diols –
EG, 1,2-propane diol (1,2-PD); amides – DMFA,
DMAc; triols – glycerol and sulfoxides – DMSO on
artificial membranes (liposomes) formed from the fowl
spermatozoa total lipids (FSTL) with the usage of the
fluorescent probe FME.
Materials and methods
Sperm of fowls of the breed Rod Island (granted
by Institute of Domestic Bird Husbandry of Ukrainian
Academy of Agricultural Sciences), which was obtai-
ned by massaging the abdominal region, was used in
the research [10].
To get FSTL we mixed sperm from 25 fowls and
washed it out from spermal plasma by 3-time centri-
fuging at 3,000 rpm for 10 min. Lipids from sperma-
tozoa were extracted by the modified Blay and Dayer’s
technique [8] and stored in chloroform at –9°C [9].
Monolayer liposomes with the average diameter
of 80–100 nm were obtained from FSTL pre-soluted
in 1 ml of ethanol by the injection method with the fol-
lowing dialysis at 4°C against physiological solution pre-
pared on 5 mM sodium-phosphate buffer, pH 7.4 [6].
All the CPs of grade “chemically pure” or “analy-
tically pure” (Reakhim, Russia) were additionally puri-
fied by twice repeated vacuum distillation after prelimi-
nary exposure above aluminium oxide or activated car-
bon of grade “A” for 24 hours [1, 14]. The CPs’ con-
centrations are presented as mass percents.
A dye from the hydroxyflavone class, 3-hydroxy-
4′-(N,N-dimethylamino) flavone (FME) granted by
V.G. Pivovarenko (T.G. Shevchenko Kiev National
University), was used as a fluorescent probe. FME
was prepared as ethanol solution (5×10–3 M) and added
to liposome suspension to the final concentration of
2.5–5×10–6 M 15 min prior the start of measuring.
Fluorescence spectra were registered at room tempe-
rature (20°C) on a spectrofluorimeter Cary Eclipse
(Varian, USA) with automatic correction. The width
of the monochromator inlet and outlet slits was 5 nm.
FME fluorescence spectra were excited by light with
wavelength of 405 nm and registered in the diapason
of 410–650 nm. The probe excitation spectra were
registered at the fluorescence wavelength of 570 nm.
FME fluorescence synchronic spectra were deter-
mined by scanning the excitation and fluorescence
monochromators from 200 to 550 nm with the shift
value of the monochromators ∆λ = 40 nm. To eliminate
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
36
комнатной температуре (20°С) на спектрофлуо-
риметре Cary Eclipse (Varian, США) с автомати-
ческой коррекцией. Ширина входной и выходной
щелей монохроматоров составляла 5 нм. Спектры
флуоресценции ФМЕ возбуждали светом с длиной
волны 405 нм и регистрировали в области 410–
650 нм. Спектры возбуждения зонда регистри-
ровали на длине волны флуоресценции 570 нм.
Синхронные спектры флуоресценции ФМЕ получа-
ли сканированием монохроматоров возбуждения
и флуоресценции от 200 до 550 нм при величине
сдвига монохроматоров ∆λ = 40 нм. Для устране-
ния концентрационного тушения при флуоримет-
рических измерениях образцы разводили так,
чтобы их оптическая плотность на длине волны
возбуждения флуоресценции не превышала 0,1 [6].
Все спектральные измерения выполняли при 20°С
в стандартных кварцевых кюветах размером
1×1×3 см.
Спектральные кривые анализировали с по-
мощью программы “Microcal Origin 6.0”. Положе-
ние N*- и T*-полос флуоресценции ФМЕ уточняли
по вторым производным спектров флуоресценции.
Результаты исследований
При электронном возбуждении ФМЕ способен
изомеризоваться, образуя нормальную (N*) и
таутомерную (T*) формы (рис. 1). Данная реакция
обусловлена внутримолекулярным фотопереносом
протона. Каждая из форм обладает флуоресцент-
ными свойствами, вследствие чего в спектре
ФМЕ, как и других флавонолов, можно наблюдать
полосы зелено-голубой (форма N*) и желтой
(форма T*) эмиссии, на положение и интенсивность
которых влияют параметры микроокружения зонда
в мембранах (вязкость, полярность, способность
к образованию межмолекулярных водородных
связей и др.). В липидном бислое ФМЕ распола-
гается в области “полярных головок” липидов, час-
тично погружаясь в гидрофобную зону углеводо-
родных цепей [18, 21].
В физиологическом растворе и водных раство-
рах КП флуоресценция ФМЕ тушится водой, а
спектр флуоресценции представлен одной полосой.
При связывании с липосомами, образованными из
СЛСП, многократно возрастает интенсивность
флуоресценции, изменяется форма спектра, в
котором отчетливо проявляются полосы: длинно-
волновая с максимумом при 570 ± 2 нм (T*-полоса)
и коротковолновая (N*-полоса) в виде плеча с
максимумом около 515 ± 3 нм (рис. 2). Сравнитель-
но низкая величина отношения интенсивностей N*-
и T*-полос флуоресценции ФМЕ (F515/F570) в
липосомах из СЛСП составляет 0,41 ± 0,03, что
свидетельствует о высокой гидрофобности его
микроокружения [18].
Рис. 1. Химическая структура основного и возбужден-
ного состояний зонда ФМЕ [18, 19] (ВМПП – внутримо-
лекулярный фотоперенос протона).
Fig. 1. Chemical structure of the basic and excited states of
the probe FME [18, 19] (IMPT – intramolecular photon
phototransfer).
concentration quench during fluorimetric measu-
rements we diluted samples so that their absorbancy
at the fluorescence excitation wavelength did not
exceed 0.1 [6]. All the spectral measurements were
performed at 20°C in standard quartz cuvettes of the
size of 1×1×3 cm.
Spectral curves were analysed with the Microcal
Origin 6.0 software. The positions of N* and T* FME
fluorescence bands were specified by the second
derivatives of the fluorescence spectra.
Results and discussion
When being electron-excited FME can isomerize
yielding normal (N*) and tautomeric (T*) forms (Fig. 1).
This reaction is attributed to proton intramolecular
phototransfer. Each of the forms has its fluorescence
characteristics, thereupon in FME spectrum as well
as in spectra of other flavones one can observe emis-
sion in green-blue (N* form) and yellow (T* form)
bands, positions and intensities of which are influenced
by parameters of the probe microenvironment in memb-
ranes (viscosity, polarity, capacity for forming inter-
molecular hydrogen bonds etc.). In lipid bilayer FME
settles in the lipid polar head region partially sub-
merging in hydrophobic zone of hydrocarbon chains
[18, 21].
In physiological solution and in CP aqueous solutions
FME fluorescence is quenched by water, and the fluo-
rescence spectrum is presented as a single band. When
binding with liposomes produced from FSTL FME is
characterised by manyfold increased intensity of fluo-
rescence and changed spectrum shape, in which the
long wavelength band with the maximum at 570 ± 5 nm
(T* band) and the short wavelenght one with the ma-
ximum at about 515 ± 3 nm become apparent (Fig. 2).
A comparatively low ratio of the FME fluorescence
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
ВМПП / IMPT
б ba a
37
Установлено, что все исследованные КП сни-
жают квантовый выход флуоресценции ФМЕ, свя-
занного с липидным бислоем, однако степень их
влияния на интенсивность и положение N*- и T*-
полос флуоресценции разная. На рис. 3 (и далее)
представлены примеры влияния глицерин и ДМФА,
наиболее отличающихся по своей структуре и
физико-химическим свойствам в ряду изученных
КП, на форму спектров флуоресценции ФМЕ,
встроенного в липосомы из СЛСП.
Как видно из рис. 3, в исследованной области
концентраций глицерин наиболее гидрофильное из
изученных веществ оказывает наименьшее влия-
ние на форму спектра флуоресценции ФМЕ, а зна-
чит – и на липосомы. Спектр сохраняет свою двух-
полосную структуру даже при содержании глице-
рина в среде 20%. Практически такие же измене-
ния наблюдаются под действием ЭГ.
В то же время диполярный апротонный ДМФА,
более гидрофобный по сравнению с глицерином,
начинает заметно влиять на форму спектра ФМЕ
уже при концентрации около 10%, при дальнейшем
повышении концентрации этого КП исчезает
коротковолновая N*- полоса и наблюдается сдвиг
положения максимума длинноволновой T*- полосы
в коротковолновую область к 554 нм. Подобные
форма и положение полосы близки к нормальному
спектру флуоресценции ФМЕ, который наблюдает-
ся в водных растворах КП. Аналогичные измене-
ния формы спектра флуоресценции ФМЕ в суспен-
зии липосом наблюдаются в присутствии ДМСО
и ДМАЦ, которые также относятся к дифильным
апротонным растворителям. В суспензиях липо-
сом, содержащих 1,2-ПД, форму спектра ФМЕ
400 500 600 700
0
50
100
150
200
250
1 2
Рис. 2. Спектры возбуждения (1) и флуоресценции (2)
зонда ФМЕ в липосомах из СЛСП.
Fig. 2. FME excitation (1) and fluorescence (2) spectra FSTL
liposomes.
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0%
22%
Рис. 3. Влияние глицерина (а) и ДМФА (б) на нормированные спектры флуоресценции ФМЕ в липосомах из СЛСП
(концентрация криопротекторов указана рядом с соответствующими кривыми).
Fig. 3. Glycerol (a) and DMFA (b) impacts on FME fluorescence normalized spectra in FSTL liposomes (cryoprotectant
concentration is shown at appropriate curves).
400 450 500 550 600 650 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0%19,4%
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
N* and T* bands intensities (F515/F570) in FSTL liposo-
mes is 0.41 ± 0.03, that attests to high hydrophobicity of
the probe microenvironment [18].
All the CPs studied were revealed to decrease
quantum yield of fluorescence of FME bound with lipid
bilayer, however the extents of their influence on fluo-
rescence N* and T* bands intensity and position are
different. In Fig. 3 (and further) examples of impacts
of glycerol and DMFA, which mostly differ by their
structures and physico-chemical properties among the
CPs studied, on spectra of fluorescence of FME em-
bedded in FSTL liposomes are presented.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
a a
38
можно рассматривать как промежуточную: вплоть
до 20 %-й концентрации 1,2-ПД спектр сохраняет
двухполосную структуру, но изменения интенсив-
ности и положения коротковолновой составляющей
более выражены, чем в присутствии глицерина и
ЭГ.
Дополнительную информацию о влиянии КП на
липидный бислой можно получить из спектров
возбуждения (рис. 4), а также из синхронных спект-
ров флуоресценции (ССФ) ФМЕ (рис. 5). Слабые
изменения положения и полуширины спектров воз-
буждения ФМЕ в присутствии глицерина (незначи-
тельное уменьшение полуширины при более высо-
ких концентрациях глицерина) свидетельствуют о
том, что микроокружение зонда практически не
изменяется и более однородно. В то же время в
присутствии ДМФА наблюдается не только длин-
новолновое смещение спектров возбуждения, но и
их уширение, свидетельствующее об увеличении
гетерогенности в бислое липосом в области распре-
деления ФМЕ.
Две полосы, которые обнаруживаются в син-
хронных спектрах флуоресценции ФМЕ при разнице
сдвигов монохроматоров возбуждения и флуорес-
ценции (∆λ = 40 нм), относятся, по-видимому, к
спектральным разновидностям нормальной N*-
формы ФМЕ. Можно утверждать, что максимумы
полос ССФ при 420–430 и 470–472 нм принадлежат
ФМЕ, связанному с мембранами, так как вклад
флуоресценции зонда, находящегося в воде, мини-
мален (менее 10%). Кроме того, максимум флуо-
ресценции ФМЕ в водных растворах NaCI и КП
наблюдается около 440 нм. В присутствии глице-
рина в синхронных спектрах флуоресценции ФМЕ
350 400 450
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
406
19,4%
0%
350 400 450
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
408
0%
19,4%
Рис. 4. Влияние глицерина (а) и ДМФА (б) на нормированные спектры возбуждения ФМЕ в липосомах из СЛСП (λрег =
406 нм, концентрация криопротекторов указана рядом с соответствующими кривыми).
Fig. 4. Glycerol (a) and DMFA (b) impacts on FME excitation normalized spectra in FSTL liposomes (λreg= 406 nm,
cryoprotectant concentration is shown at appropriate curves).
With reference to Fig. 3 it can be seen that within
the concentration range investigated glycerol, which
is the most hydrophilic among the substances studied,
exerts the least impact on FME fluorescence spectrum,
consequently, on the liposomes, too. The spectrum
maintains its two-band pattern even with 20% glycerol
in medium. Practically the same changes are observed
in the case of EG.
At the same time dipolar aprotonic DMFA, which
is more hydrophobic than glycerol, exerts a conspicuous
impact on FME spectrum even at the concentration of
about 10%, and when this CP concentration being in-
creased further, the short wavelength N* band dis-
appears and the long wavelength T* band maximum
shifts to the short wavelength diapason to 554 nm. Such
pattern and band position are close to FME fluores-
cence normal spectrum in CP water solutions. Analo-
gous changes of FME fluorescence spectra in liposome
suspension are observed in the presence of DMSO
and DMAc, which also belong to diphilic aprotonic
solvents. In the liposome suspension containing 1,2-PD
the FME spectrum pattern can be considered as inter-
mediate: up to 20% concentration of 1,2-PD the spect-
rum maintains its two-band pattern, but changes of
the short wavelength component intensity and position
are more conspicuous than those in the case of glycerol
and EG.
Additional information about CPs influence on lipid
bilayer can be derived from excitation spectra (Fig. 4)
as well as from FME fluorescence synchronic spectra
(FSS) (Fig. 5). Slight changes of the position and half-
width of FME excitation spectra in the presence of
glycerol (unessential decline in the half-width at higher
concentrations of glycerol) attest to the fact that the
б b
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
39
почти равномерно снижается интенсивность обоих
полос (рис. 5, а). Это свидетельствует о том, что
глицерин в исследованной области концентраций
практически не оказывает возмущающего влияния
на структуру бислоя липосом, сформированных из
СЛСП, а незначительное снижение интенсивности
полос может быть связано с частичным конку-
рентным замещением поверхностно локализо-
ванного зонда при образовании водородных связей
глицерина с полярными головками липидов. При
введении в суспензию липосом ДМФА и увели-
чении его концентрации (рис. 5, б) форма ССФ зон-
да резко изменяется. Снижение интенсивности
коротковолнового пика, вероятно, отражает не
только активное вытеснение из мембран ФМЕ,
нарушая его водородные связи с фосфатными и
карбонильными группами липидов, но и значитель-
ное изменение свойств микроокружения зонда,
возможно, за счет более “глубокого” внедрения
ДМФА в бислой.
Информативным параметром, отражающим из-
менение состояния ближайшего окружения ФМЕ,
связанного с мембраной, является отношение
интенсивностей флуоресценции его нормальной и
таутомерной форм (FN*/FT*) [16]. Дополнительную
информацию предоставляет совместный анализ
отношения FN*/FT* и изменения положения макси-
мумов N*- и T*-полос флуоресценции зонда. Влия-
ние глицерина и ДМФА на отношение FN*/FT*, а
также на положение максимумов λN* и λT* пред-
ставлено на рис. 6 и 7.
В присутствии глицерина (рис. 6, а) отношение
FN*/FT* практически не изменяется по сравнению с
контролем (0,41 ± 0,03), что формально можно рас-
сматривать как отсутствие модифицирующего
350 400 450 500 550
0
10
20
30
40
50
0%
19,4%
432
470
350 400 450 500 550
0
10
20
30
0%
19,4%
423
472
Рис. 5. Влияние глицерина (а) и ДМФА (б) на синхронные спектры флуоресценции ФМЕ в липосомах из СЛСП (∆λ=
40 нм) (концентрация криопротекторов указана рядом с соответствующими кривыми).
Fig. 5. Glycerol (a) and DMFA (b) impacts on FME fluorescence synchronic spectra in FSTL liposomes (∆λ=40 nm,
cryoprotectant concentration is shown at appropriate curves).
probe microenvironment practically does not change
and is more homogeneous. At the same time in the
presence of DMFA not only long wavelength shift of
the excitation spectra, but also their widening attesting
to a rise in heterogeneity in lipid bilayer in FME
distribution zone are observed.
Two bands, which are discovered in FME fluores-
cence synchronic spectra at the difference between
excitation and fluorescence monochromators shifts
(∆λ = 40 nm), seem to belong to spectral varieties of
normal N* form of FME. One can affirm that SSF
bands maxima at 420–430 and 470–472 nm appertain
to FME bound with membranes, since the contribution
of the probe fluorescence in water is minimal (less
than 10%). Besides, FME fluorescence maxima in
NaCl and CP aqueous solutions are observed at about
440 nm. In the presence of glycerol the intensities of
both bands decrease almost uniformly in FME fluo-
rescence synchronic spectra (Fig. 5, a). This attests
to the fact that within the concentration range studied
glycerol practically does not exert perturbation influence
on FSTL liposome bilayer structure, and a slight decline
in the bands intensities can be attributed to a partial
competitive substitution of the surface-localized probe,
when hydrogen bonds between glycerol and lipid polar
heads form. The SSF configuration of the probe chan-
ges drastically, when DMFA is added to liposome sus-
pension and its concentration increases (Fig. 5, b). Ap-
parently a decline in the short wavelength peak intensity
reflects not only active displacement of FME from
membranes, which impairs its hydrogen bonds with li-
pid phosphate and carbonyl groups, but also significant
changes of the probe microenvironment charac-
teristics, possibly, at the account of a deeper embedding
of DMFA in bilayer.
a a б b
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
сл
. е
д.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, a
. u
.
Длина волны, нм
Wavelength, nm
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
б b
a a
40
влияния этого КП на микроокружение связанного
с липосомами зонда, а, следовательно – и на
бислой. Однако при концентрациях глицерина 5 –
15% (рис. 6, а) наблюдается некоторое уменьше-
ние отношения FN*/FT*, указывающее на снижение
полярности и повышение гидрофобности микро-
окружения зонда. Изменения положения максиму-
мов λN* и λT* (рис. 6, б) незначительны. Глицерин и
ЭГ способны дегидратировать липосомы, умень-
шая их размеры, а также сольватировать полярные
головки липидов мембран, что приводит к умень-
шению толщины и упорядочиванию бислоя [2].
Напротив, при повышении концентрации ДМФА
в суспензии липосом отношение FN*/FT* значительно
увеличивается по сравнению с контролем, наб-
людается резкий перелом при его концентрации
около 10% (рис. 7, а). По данным [2], максималь-
ное количество ДМФА, которое может связаться
с бислоем липосом из яичного лецитина путем
сольватации его полярных головок приблизительно
соответствует концентрации 10%. При содержании
ДМФА в суспензии 20% отношение FN*/FT* дости-
гает величины 0,91. При этом наблюдается зна-
чительное сближение положения N*- и T*-полос
флуоресценции ФМЕ (рис. 7, б).
Характер изменения и значения спектральных
характеристик флуоресценции ФМЕ в липосомах
из СЛСП под воздействием остальных изученных
КП либо мало отличаются (глицерин и ЭГ), либо
повторяют ту же закономерность (ДМСО и ДМАЦ,
как ДМФА), но переломы наблюдаются при разных
концентрациях. Изменения в спектрах флуорес-
ценции ФМЕ, связанного с бислоем, в присутствии
1,2-ПД имеют промежуточный характер. По сте-
пени увеличения влияния на параметры спектра
флуоресценции ФМЕ в липосомах КП распола-
гаются в ряд: глицерин ≤ ЭГ < 1,2-ПД < ДМСО <
ДМАЦ ≤ ДМФА.
Наблюдаемые снижение квантового выхода и
изменение формы спектров флуоресценции ФМЕ
в присутствии возрастающих концентраций КП
может быть следствием: 1 – перераспределения
молекул зонда из мембран в растворитель вслед-
ствие замещения или вытеснения молекул зонда
из центров сорбции в бислое молекулами КП по
конкурентному механизму; 2 – тушения флуорес-
ценции зонда молекулами воды или КП, происхо-
дящего в результате изменения нативной струк-
туры бислоя и, как следствие, повышения его дос-
тупности за счет нарушения липид-липидных
взаимодействий вплоть до полного разрушения
липосом. Бислойная структура липидных мембран
поддерживается балансом электростатических и
ван-дер-ваальсовых взаимодействий полярных
головок липида и воды, а также гидрофобных
взаимодействий в области углеводородных цепей.
0 5 10 15 20 25
0,40
0,45
0,50
0 5 10 15 20 25
520
540
560
λT*
λN*
Рис. 6. Влияние глицерина на отношение интенсивностей
FN*/FT* (а) и положение (б) полос флуоресценции ФМЕ в
липосомах из СЛСП.
Fig. 6. Glycerol impact on the intensities ratio FN*/FT* (a)
and FME fluorescence bands positions (b) in FSTL
liposomes.
The ratio of fluorescence intensities of FME normal
and tautomeric forms (FN*/FT*) is an informative
parameter reflecting changes of the nearest environ-
ment of FME bound with membrane [16]. Coupled
analysis of the ratio FN*/FT* and the probe fluorescence
N* and T* bands maxima shifts gives additional
information. Glycerol and DMFA impacts on FN*/FT*
and the λN* and λT* maxima positions are presented in
Fig. 6 and 7.
In the presence of glycerol (Fig. 6, a) the ratio FN*/
FT* practically does not change in comparison with the
control (0.41 ± 0.03), that can be considered pro forma
as lack of any modifying influence of this CP on
microenvironment of the probe bound with lipo-somes,
and, consequently, on bilayer, too. Nevertheless at 5–
15% concentrations of glycerol (Fig. 6, a) a certain
F N
*/F
T*
Концентрация глицерина, %
Glycerol concentration, %
П
ол
ож
ен
ие
п
ол
ос
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
,
нм
Fl
uo
re
sc
en
ce
b
an
d
po
si
tio
n,
n
m
Концентрация глицерина, %
Glycerol concentration, %
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
41
Очевидно, что изменение или нарушение этого
баланса в присутствии КП зависит от их физико-
химических свойств.
Диэлектрическая проницаемость среды (ε)
является одним из важных параметров, опреде-
ляющих формирование бислойных структур моле-
кулами липидов в смешанных растворителях [2].
Согласно расчетам по уравнению Шахпоронова
[15], увеличение концентрации КП в суспензии ли-
посом до 20% приводит к уменьшению величины
ε в среднем на 10–12% от диэлектрической про-
ницаемости воды 78,5. Эти значения согласуются
с экспериментальными результатами работы [7].
Даже при 20%-й концентрации всех изученных КП
величина диэлектрической проницаемости среды
не достигает критического значения (ε ≈ 34), ниже
которого в растворах неэлектролитов не могут
возникнуть и существовать бислойные структуры
[2]. Следовательно, изменение диэлектрической
проницаемости окружающей липосомы среды при
изученных концентрациях КП не является основной
причиной нарушения бислойной организации
мембран.
Методом дифракции рентгеновских лучей уста-
новлено, что ДМСО в концентрации > 10% иниции-
рует образование новой фазы в бислое, которая
сосуществует с нативной, и только при концент-
рации > 40% нативная фаза исчезает [20], что сви-
детельствует о нарушении структуры бислоя. Под
влиянием ДМСО наблюдалось также уменьшение
толщины мембраны в липосомах из яичного леци-
тина с 37,4 до 35,9 D [2]. Таким образом, в диа-
пазоне исследуемых концентраций КП, по-видимо-
му, полного разрушения липосом не происходит.
Однако повышение в суспензии липосом концент-
рации изученных веществ, кроме ЭГ и глицерина,
0 5 10 15 20
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 5 10 15 20
520
540
560
λT*
λN*
Рис. 7. Влияние ДМФА на отношение интенсивностей FN*/FT* (а) и положение (б) полос флуоресценции ФМЕ в
липосомах из СЛСП.
Fig. 7. DMFA impact on the intensities ratio FN*/FT* (a) and FME fluorescence bands positions (b) in RSTL liposomes.
drop in the ratio FN*/FT* is observed, which indicates
to a reduction in polarity and increase in hydro-
phobicity of the probe microenvironment. The changes
of the λN* and λT* maxima positions (Fig. 6b) are
negligible. Glycerol and EG are able to dehydrate lipo-
somes decreasing their sizes as well as to solvate
membrane lipid polar heads, which leads to a decrea-
se in bilayer thickness and regularity [2].
Contrariwise, as DMFA concentration grows in
liposome suspension, the ratio FN*/FT* increases consi-
derably in comparison with the control; a kink is obser-
ved at its concentration of about 10%. According to
[2] the maximal DMFA percentage, which can be
bound with egg lecithin liposome bilayer by solvating
lecithin polar heads is also approximately 10%. If sus-
pension contains 20% DMFA, the ratio FN*/FT* rea-
ches 0.91. Thereat a considerable contingence of FME
fluorescence N* and T* bands is apparent (Fig. 7, b).
The changes in FME fluorescence spectral charac-
teristics in FSTL liposomes under the influence of the
other studied CPs either differ little (glycerol and EG)
or demonstrate the same regularities (DMSO, DMAc)
as those for DMFA, but with kinks at different con-
centrations. The bilayer-bound FME fluorescence
changes in the presence of 1,2-PD are of intermediate
pattern. By ascending influence on FME fluorescence
spectra parameters the CPs are ranked in the following
way: glycerol ≤ EG < 1,2-PD < DMSO < DMAc ≤
DMFA.
The observed decrease in quantum yield and FME
fluorescence spectra configuration changes in the pre-
sence of the CPs increaing concentrations can be a
consequence of: 1 – redistribution of the probe mole-
cules from membranes into solvent because of substi-
tution or displacement of the probe molecules with the
CPs molecules from sorption sites in bilayer by the
б ba a
F N
*/F
T*
Концентрация ДМФА, %
DMFA concentration, %
П
ол
ож
ен
ие
п
ол
ос
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
,
нм
Fl
uo
re
sc
en
ce
b
an
d
po
si
tio
n,
n
m
Концентрация ДМФА, %
DMFA concentration, %
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
42
может оказывать возмущающее действие на
нативную “упаковку” мембран, нарушать липид-
липидные взаимодействия, и в силу этого способст-
вовать возникновению липидных пор. При этом
мембрана более доступна как для КП, так и для
молекул воды.
Способность КП внедряться в гидрофобную
область липидного бислоя коррелирует с их коэф-
фициентом распределения (Кр) в системе “вода –
неполярная фаза”. Чем выше Кр для конкретного
вещества, тем оно более гидрофобно, следователь-
но, легче взаимодействует с бислоем по гидрофоб-
ному механизму, проникая глубоко в зону углеводо-
родных цепей. По мере увеличения коэффициента
распределения в системе “вода – н-октанол” изу-
ченные криопротекторы расположены в порядке
[11]: глицерин < ЭГ < 1,2-ПД < ДМФА < ДМСО <
ДМАЦ.
Наблюдаемые изменения спектральных харак-
теристик флуоресценции ФМЕ под влиянием изу-
ченных веществ согласуются с ростом их коэффи-
циента распределения в системе “вода – неполяр-
ная фаза”, т. е. с их способностью к гидрофобным
взаимодействиям. Существенных отклонений
формы спектров зонда в присутствии ЭГ и глице-
рина не наблюдается, следовательно, эти КП не
способны нарушать липид-липидные взаимодейст-
вия липосом. Более того, замещая молекулы воды
в сольватной оболочке полярных головок вплоть
до зоны карбонильных групп, напротив, способст-
вуют укреплению гидрофобных связей углеводо-
родных звеньев липидов. Имея в структуре две
протоно-донорные гидроксильные группы, 1,2-ПД
до определенной концентрации (≈ 10%) влияет на
липосомы практически как ЭГ и глицерин. Но
наличие СН3- группы в α-положении обеспечивает
его способность встраиваться в гидрофобную
область бислоя и вносить вклад в нарушения
липид-липидных взаимодействий, подобно ДМСО
и ДМФА.
Дифильные ДМСО, ДМФА и ДМАЦ также
образуют прочные Н–связи, но с протонодонорны-
ми функциональными группами (–ОН, –СООН,
=NН, –NН2) полярных головок липидов или моле-
кулами воды. Значит они могут сольватировать
полярную область липидов. Однако наличие в
структуре этих веществ 2-х метильных групп (в
ДМАЦ – 3-х) обусловливают их гидрофобные
свойства: способность растворять жиры (липиды)
и самим растворяться в липидах. Эти вещества
способны глубоко внедряться в зону углеводород-
ных цепей бислоя, нарушать липид-липидные
взаимодействия в липосомах, тем самым сущест-
венно изменять микроокружение зонда, конкуриро-
вать за места его связывания. Подтверждением
competitive mechanism; 2 – the probe fluorescence
quench by water or the CPs molecules occurring due
to changes of bilayer native structure and, as a result,
an increase in its accessibility at the account of disrup-
tion of lipid-lipid interactions up to complete disinteg-
ration of liposomes. Lipid membrane bilayer structure
is provided by balance between electrostatic and van
der Waals interactions of lipid polar heads and water
as well as hydrophobic interactions in hydrocarbon
chain zone. Evidently changes or aberrations of this
balance in the CPs presence depend on their physico-
chemical properties.
Medium dielectric permittivity (ε) is one of the
important parameters determining formation of bilayer
structures from lipid molecules in hybrid solvents [2].
According to the calculations by the Shakhporonov’s
equation [15] an increase in CP concentration in liposo-
me suspension up to 20% results in the drop in the ε
value at the average by 10–12% related to water
permittivity 78.5. These values are consistent with the
experimental data in [7]. Even with 20% concentration
of all the CPs studied the medium dielectric permittivity
does not reaches the crucial value (ε ≈ 34), below
which bilayer structures cannot emerge and exist in
non-electrolyte solutions [2]. Consequently, changes
of permittivity of surrounding liposomes medium at the
CPs concentrations studied are not the main cause of
disruption of membrane bilayer organisation.
By X-ray diffraction it was shown that DMSO at
the concentration of > 10% initiated formation a new
phase in bilayer that coexisted with the native one,
and only at the concentration of > 40% the native phase
disappeared [20], which attests to lipid bilayer disrup-
tion. Under DMSO influence the egg lecithin liposome
membrane thickness lessened from 37.4 to 35.9 D [2].
Thus, within the range of the CP concentrations inves-
tigated, apparently, there is no complete disintegration
of liposomes. Nevertheless increasing concentrations
of the substances studied, except EG and glycerol, in
liposome suspension can exert perturbation influence
on membrane native “packing”, disrupt lipid-lipid inter-
actions, and thereby contribute to emergence of lipid
pores. Herewith membrane is more accessible both to
CPs and to water molecules.
CPs’ capacity for being embedded in hydrophobic
zone of lipid bilayer correlates with their distribution
coefficient (Kd) in the system “water – non-polar
phase”. The higher Kd for a concrete substance is, the
more hydrophobic it is, consequently, the easier it
interacts with bilayer by hydrophobic mechanism
penetrating deeply into hydrocarbon chain zone.
According to the growth of the distribution coefficient
in the system “water – n-octanol”, the CPs investigated
are arranged in the following order [11]: glycerol <
EG < 1,2-PD < DMFA < DMSO < DMAc.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
43
этого являются значительные изменения спект-
ральных параметров флуоресценции зонда в при-
сутствии данных КП.
Гипотетическая схема, иллюстрирующая рас-
положение в липидном бислое зонда ФМЕ, а также
глицерина и ДМФА, которые наиболее отличаются
по структуре и гидрофильно-гидрофобным свойст-
вам, представлена на рис. 8.
В состав СЛСП, из которых сформированы
липосомы, входят как “кислые” липиды (фосфати-
дилсерин, фосфатидилинозитол, этаноламин плаз-
малоген, фосфатидилэтаноламин, кардиолипин и
др.), полярные головки которых содержат прото-
нодонорные гидроксильные и аминные группы, так
и “нейтральные” (фосфатидилхолин (39,6%),
сфингомиелин (13,1%) и др.) [17]. При этом
содержание “нейтральных” липидов в спермато-
зоидах петухов составляет более половины от
общего количества фосфолипидов, а их фосфоли-
пидные головки практически не содержат протоно-
донорных групп. Возможно, это еще одна причина,
из-за которой ДМСО и ДМФА, в отличие от глице-
рина, ЭГ и 1,2-ПД, в меньшей степени связываются
с полярной зоной липидного бислоя, а преимущест-
венно встраиваются в начало его неполярной
области путем гидрофобного взаимодействия.
Причем активное влияние ДМСО, ДМФА и ДМАЦ
на липид-липидные взаимодействия проявляется
в диапазоне концентраций 5–8%, при более высо-
ких концентрациях резко усиливается.
Следует отметить, что указанные концентрации
этих КП являются “пороговыми”, применение
более высоких вызывает существенные повреж-
дения мембран сперматозоидов петухов при
гипотермическом хранении и замораживании.
Рис. 8. Гипотетическая схема локализации зонда ФМЕ
(1), ДМФА (3) и глицерина (4) в липидном бислое из
фосфатидилхолина (2) [18, 21].
Fig. 8. The hypothetical scheme of the probe FME (1), DMFA
(3) and glycerol (4) locations in lipid phosphatidyl choline
bilayer [18, 21].
The observed changes of FME fluorescence spect-
ral characteristics under the influence of the substances
studied conform with the growth of their distribution
coefficients (Kd) in the system “water – non-polar pha-
se”, i. e. with their capacity for hydrophobic interac-
tions. No significant aberrations of the probe spectra
patterns were observed for EG and glycerol, consequ-
ently, these CPs are unable to disrupt lipid-lipid inter-
actions in liposomes. Moreover by substituting water
molecules in solvation sphere of polar heads as far as
to carbonyl group zone they even contribute to streng-
thening hydrophobic bonds of lipid hydrocarbon groups.
Possessing two proton-donor hydroxyl groups in its
structure, 1,2-PD up to a certain concentration (≈ 10%)
affects liposomes practically in the same way as EG
and glycerol do. But presence of CH3-group in α-po-
sition provides its capacity for getting embedded into
bilayer hydrophobic zone and for contributing to
disruptions of lipid-lipid interactions like DMSO and
DMFA do.
Diphilic DMSO, DMFA and DMAc also form strong
H-bonds, but with proton-donor functional groups (–OH,
–COOH, =NH, –NH2) of lipid “polar heads” or with
water molecules. So they can solvate lipid polar zone.
Nevertheless presence of 2 methyl groups in these
substances structure (there are 3 methyl groups in
DMAc) determines their hydrophobic properties: ability
to solve fats (lipids) and to be solved in lipids. These
substances are able to become embedded deeply into
bilayer hydrocarbon chain zone, to disrupt lipid-lipid
interactions in liposomes, in that way to change
significantly the probe microenvironment and to com-
pete for the probe-binding sites. The significant chan-
ges of the probe fluorescence spectral parameters in
the presence of the CPs confirm this assumption.
The hypothetical scheme illustrating FME as well
as glycerol and DMFA (which differ the most by their
structures and hydrophilic-hydrophobic properties)
locations in lipid bilayer is presented in Fig. 8.
Both “acid” lipids (phosphatidyl serine, phosphatidyl
inositol, ethanolamine, plasmalogen, phosphatidyl
ethanolamine, cardiolipin etc.), polar heads of which
comprise proton-donor hydroxyl and amine groups, and
“neutral” ones (phosphatidyl choline (39.6%), sphingo-
myelin (13.1%) etc.) are constituents of FSTL liposo-
mes [17]. Herewith “neutral” lipid content in the fowl
spermatozoa is more than a half of the the total phos-
pholipid content, and their phospholipid heads prac-
tically do not contain proton-donor groups. Probably
this is another cause, because of which DMSO and
DMFA, unlike glycerol, EG and 1,2-PD, bind with lipid
bilayer polar zone to a less extent, but preferentially
get embedded into the edge of lipid bilayer non-polar
zone by hydrophobic interactions. Notably DMSO,
DMFA and DMAc active impacts on lipid-lipid
interactions become apparent within the concentration
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
44
Поэтому эти концентрации КП (ДМСО 5%, ДМФА
и ДМАЦ 7,5%), установленные эмпирически, ус-
пешно используются при криоконсервировании
спермы петухов [10–13].
На основании полученных данных можно утвер-
ждать, что значительный вклад в цитотоксический
эффект криопротекторов на сперматозоиды пету-
хов вносит их способность активно воздействовать
на гидрофобные взаимодействия мембран, изме-
нять связи и структурные образования, в которых
участвуют липиды. Сила влияния веществ на ли-
пид-липидные взаимодействия находится в прямой
зависимости от их мембраннотропных свойств,
обусловленных гидрофильно-гидрофобным балан-
сом их молекул. Полученные данные предостав-
ляют также дополнительную информацию о меха-
низме проницаемости веществ в липосомы, а
также в клетки, косвенно указывая на преимущест-
венные пути их диффузии через мембраны, учиты-
вая при этом сложность и многообразие их состава
и структуры. Например, можно предположить, что
для мембраннотропных ДМСО, ДМФА и ДМАЦ
не исключен и даже предпочтителен липидный путь
транспорта в клетку [3, 4, 22].
Выводы
Флуоресцентный зонд ФМЕ является высоко-
чувствительным инструментом исследования
степени влияния КП на липидный бислой, дающий
возможность оценивать их “пороговую” концен-
трацию, выше которой КП оказывают повреждаю-
щее действие на мембраны.
Активность взаимодействия низкомолекуляр-
ных криопротекторов с липосомами из суммарных
липидов сперматозоидов петуха определяется
гидрофильно-гидрофобным балансом их молекул
и имеет концентрационно-зависимый характер.
По степени увеличения влияния на спектраль-
ные параметры флуоресценции ФМЕ в липосомах
из СЛСП изученные вещества располагаются в
ряд: глицерин ≤ ЭГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤
ДМФА, что хорошо согласуется с ростом их коэф-
фициента распределения в системе “вода – непо-
лярная фаза”.
В область углеводородных звеньев бислоя
наиболее активно внедряются ДМФА, ДМАЦ и
ДМСО и вызывают нарушения липид-липидных
взаимодействий, 1,2-ПД занимает промежуточное
положение. В диапазоне изученных концентраций
(до 20%) глицерин и ЭГ не оказывают существен-
ного влияния на состояние липосом, образуя
водородные связи в области полярных головок
липидов, и, вероятно, упорядочивают структуру
бислоя.
range of 5–8%; as the concentrations increase, the
impacts strengthen sharply.
It should be noted that the CPs concentrations
above-mentioned are “threshold”, application of higher
concentrations leads to significant injuries of the fowl
spermatozoa membranes during hypothermic storage
and freezing. That is why these concentrations of the
CPs (5% DMSO, 7.5% DMFA and DMAc) establi-
shed empirically are used successfully for the fowl
sperm cryopreservation [10–13].
Basing on the data obtained one can affirm that
CPs’ capacity for active influencing membrane hydro-
phobic interactions and changing bonds and structural
lipid domains contribute greatly to CPs cytotoxic
effects on the fowl spermatozoa. Strength of the sub-
stances’ influence on lipid-lipid interactions is in a direct
dependence on their membrane tropic properties deter-
mined by hydrophilic-hydrophobic balance of their
molecules. The data obtained also provide additional
information on mechanisms of permeability of substan-
ces in liposomes as well as in cells indicating circum-
stantially to preferable ways of their diffusion through
membranes and at the same time taking into account
complexity and diversity of their compositions and
structures. For example, one can assume that lipid
transport way into cells is not excluded and even
preferable for membrane tropic DMSO, DMFA and
DMAc [3, 4, 22].
Conclusions
The fluorescent probe FME is a highly sensitive
tool for research in CPs’ influence on lipid bilayer pro-
viding possibility of assessing their “threshold” con-
centrations, over which CPs exert a damaging impact
on membranes.
Activity of interactions between low molecular
cryoprotectants and liposomes from the fowl sper-
matozoa total lipids is determined by hydrophilic-hydro-
phobic balance of their molecules and shows a concen-
tration dependence.
The substances studied are ranked by their increas-
ing influence on FME fluorescence spectral parameters
in FSTL liposomes as follows: glycerol ≤ EG < 1,2-PD <
DMSO < DMAc ≤ DMFA, that conforms well with
the growth in their distribution coefficients in the system
“water – non-polar phase”.
DMFA, DMAc and DMSO embed the most
actively in bilayer hydrocarbon group zone and disrupt
lipid-lipid interactions; 1,2-PD holds an intermediate
position. Within the concentration range investigated
(up to 20%) glycerol and EG exert no significant
influence on liposome state forming hydrogen bonds
in lipid polar heads zone and, probably, regularize bilayer
structure.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
45
References
Weissberger A., Proskauer E., Riddik D., Toops E. Organic
solvents.– Moscow: Khimiya, 1968.– 1450 p.
Vasilenko I.A., Tonkonog L.A., Balagurov A.M. et al. Structural
organisation of phospholipids in non-water polar solvents //
Biol. Membrany.– 1988.– Vo. 5, N4.– P. 428–438.
Gordienko O.I., Gordienko E.A., Linnik T.P., Kompa-
niets A.M. Mechanisms of cryoprotectant permeation via
erythrocytes membranes // Problems of Cryobiology.– 2002.–
N4. – P. 9–16.
Gordiyenko O.I., Linnik T.P. Penetration mechanisms of non-
electrolytes of diol nature through erythrocyte membranes //
Biophysical Bulletin.– 2002.– Issue 2 (11).– P. 43–47.
Gulevskiy A.K., Bondarenko V.A., Belous A.M. Membrane
barrier properties of biomembranes at low temperatures.–
Kiev: Nauk. dumka, 1988.– 208 p.
Dobretsov G.Ye. Fluorescent probes in cell, membrane and
lipoprotein researches.– Moscow: Nauka, 1989.– 277 p.
Ivanov L.V., Lyapunov N.A., Tsymbal L.V. et al. Influence of
composition of two-component solvents on biological mem-
branes // Khimiko-Farm. Zhurnal.– 1988.– N1.– P. 1437–1443.
Kates M. Lipidology techniques.– Moscow: Mir, 1975.– 322 p.
Kreps E.M. Lipids of cell membrane.– Leningrad: Nauka,
1981.– P. 195–201.
Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. II.
Amide and diol cryoprotective activity // Problems of Cryobio-
logy.– 2001.– N4.– P. 43–51.
Linnik T.P. Physico-chemical factors of cryoinjuries and
cryoprotection of the fowl spermatozoa during low tempe-
rature preservation cycle: Author’s abstract of the thesis of
Doctor of Biological Sciences.– Kharkov, 2003.– 36 p.
Linnik T.P., Bizikina O.V. Cytotoxicity and cryoprotective
activity of diols, amides and their mixtures during cryopreser-
vation of the fowl sperm // Biofizika Zhivoy Kletki.– 2003.–
Vol. 7.– P. 42–49.
Linnik T.P. Mechanism of cytotoxic and cryoprotective action
of penetrating cryoprotectors – amides and diols – during
cryopreservation of bird sperm // Tsitologiya.– 2004.– Vol. 46,
N9. – P.811–812.
Protiva M. Purification of solvents // In: Laboratory techniques
of organic chemistry.– Mosow: Mir, 1966.– P. 591–615.
Shakhporonov M.I. Introduction to the modern theory of
solutions.– Moscow: Vysshaya shkola, 1976.– 296 p.
Bondar O.P., Pivovarenko V.G., Rowe E.S. Flavonols – new
fluorescent membrane probes for studying the interdigitation
of lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta.– 1998.– Vol. 1369,
N1.– P. 119–130.
Darin-Bennet A., Poulos A., White I.G. The phospholipids
and phospholipids-bound fatty acids and aldehydes of dog
and fowl spermatozoa // J. Reprod. Fert.– 1974.– Vol. 41.–
P. 471–474.
Klymchenko A. S., Duportail G., Demchenko A. P., Mely Y.
Bimodal distribution and fluorescence response of environ-
ment-sensitive probes in lipid bilayers // Biophys. J.– 2004.–
Vol. 86, N5.– Р. 2929–2941.
Ormson S. M., Brown R. G., Vollmer F., Rettig W. Switching
between charge and proton-transfer emission in the excited
state of a substituted 3-hydroxyflavone // J. Photochem.
Photobiol. A: Chem.– 1994.– Vol. 81, N2.– P. 65–72.
Pivovarenko V.G., Wroblewska A., Blazejowski J. The effect
of hydrogen bonding interactions between 2-[4-(dimethyla-
mino)phenyl]-3-hydroxy-4H-chromene-4-one in the ground
and excited states and dimethylsulfoxide or methanol on
electronic absorption and emission transitions // J. Molec.
Struct.– 2004.– Vol. 708, N1–3.– P. 175–181.
Shynkar V.V., Klymchenko A. S., Mely Y. et al. Anion formation
of 4’-(dimethylamino)-3-hydroxyflavone in phosphatidyl-
glycerol vesicles induced by HEPES buffer: a steady-state
and time-resolved fluorescence investigation // J. Phys. Chem.
B.– 2004.– Vol. 108, N48.– P. 18750–18755.
Литература
Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Д., Тупс Э. Органи-
ческие растворители.– М.: Химия, 1968.– 1450 с.
Василенко И.А., Тонконог Л.А., Балагуров А.М. и др.
Структурная организация фосфолипидов в неводных
полярных растворителях // Биол. мембраны.– 1988.– Т. 5,
№4.– С. 428–438.
Гордієнко О.І., Гордієнко Є.О., Ліннік Т.П., Компанієць А.М.
Механізми проникання кріопротекторів крізь мембрани
еритроцитів // Пробл. криобиологии.– 2002.– №4.– С. 9–16.
Гордієнко О.І., Лінник Т.П. Механізм проникання не-
електролітів низки діолів крізь мембрани еритроцитів //
Біофізичний вісник.– 2002.– Вип. 2 (11).– С. 43–47.
Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус А.М. Барьерные
свойства биомембран при низких температурах.– Киев:
Наук.думка, 1988.– 208 с.
Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании
клеток, мембран и липопротеинов.– М.: Наука, 1989.–
277 с.
Иванов Л. В., Ляпунов Н. А., Цымбал Л. В. и др. Влияние
состава двухкомпонентных растворителей на биологи-
ческие мембраны // Химико-фарм. журнал.– 1988.– №1.–
С. 1437–1443.
Кейтс М. Техника липидологии.– М.: Мир, 1975.– 322 с.
Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран.– Л.: Наука, 1981.–
С. 195–201.
Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спер-
мы петухов. II. Криопротекторная активность амидов и
диолов // Пробл. криобиологии.– 2001.–№4.– С. 43–51.
Ліннік Т.П. Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і кріо-
захисту сперматозоїдів півнів у циклі низькотемператур-
ного консервування: Автореф. дис. … докт. біол. наук.–
Харків, 2003.– 36 с.
Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопро-
текторная активность диолов, амидов и их смесей при
криоконсервировании спермы петухов // Биофизика
живой клетки.– 2003.– Т. 7.– С. 42–49.
Линник Т.П. Механизм цитотоксического и криозащитного
действия проникающих криопротекторов – амидов и
диолов – при криоконсервировании спермы птиц //
Цитология.– 2004.– Т. 46, №9.– С. 811–812.
Протива М. Очистка растворителей // В кн.: Лаборатор-
ная техника органической химии.– М.: Мир, 1966.– С. 591–
615.
Шахпоронов М.И. Введение в современную теорию раст-
воров.– М.: Высш. шк., 1976.– 296 с.
Bondar O.P., Pivovarenko V.G., Rowe E.S. Flavonols – new
fluorescent membrane probes for studying the interdigitation
of lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta.– 1998.– Vol. 1369,
N1.– P. 119–130.
Darin-Bennet A., Poulos A., White I.G. The phospholipids
and phospholipids-bound fatty acids and aldehydes of dog
and fowl spermatozoa // J. Reprod. Fert.– 1974.– Vol. 41.–
P. 471–474.
Klymchenko A. S., Duportail G., Demchenko A. P., Mely Y.
Bimodal distribution and fluorescence response of environ-
ment-sensitive probes in lipid bilayers // Biophys. J.– 2004.–
Vol. 86, N5.– Р. 2929–2941.
Ormson S. M., Brown R. G., Vollmer F., Rettig W. Switching
between charge and proton-transfer emission in the excited
state of a substituted 3-hydroxyflavone // J. Photochem.
Photobiol. A: Chem.– 1994.– Vol. 81, N2.– P. 65–72.
Pivovarenko V.G., Wroblewska A., Blazejowski J. The effect
of hydrogen bonding interactions between 2-[4-(dimethyla-
mino)phenyl]-3-hydroxy-4H-chromene-4-one in the ground
and excited states and dimethylsulfoxide or methanol on
electronic absorption and emission transitions // J. Molec.
Struct.– 2004.– Vol. 708, N1–3.– P. 175–181.
Shynkar V.V., Klymchenko A. S., Mely Y. et al. Anion formation
of 4’-(dimethylamino)-3-hydroxyflavone in phosphatidyl-
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
46
glycerol vesicles induced by HEPES buffer: a steady-state
and time-resolved fluorescence investigation // J. Phys. Chem.
B.– 2004.– Vol. 108, N48.– P. 18750–18755.
Toon M.R., Solomon A.K. Transport parameters in the human
red cell membrane: solute-membrane interactions of
hydrophilic alcohols and their effect on permeation // Biochim.
Biophys. Acta.– 1990.– Vol. 1022, N1.– Р. 57–71.
Поступила 23.02.2010
Рецензент В.Д. Зинченко
Toon M.R., Solomon A.K. Transport parameters in the human
red cell membrane: solute-membrane interactions of
hydrophilic alcohols and their effect on permeation // Biochim.
Biophys. Acta.– 1990.– Vol. 1022, N1.– Р. 57–71.
Accepted in 23.02.2010
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
22.
22.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44428 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:06:41Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Линник, Т.П. Дюбко, Т.С. Мартынюк, И.Н. Терещенко, А.В. 2013-06-01T10:48:57Z 2013-06-01T10:48:57Z 2010 Взаимодействие криопротекторов с липосомами
 из суммарных липидов спермиев петуха / Т.П. Линник, Т.С. Дюбко, И.Н. Мартынюк, А.В. Терещенко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 34-46. — Бібліогр.: 22 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44428 577.352.2:57.043:636.5.082.453:66.095.11 С использованием флуоресцентного зонда ФМЕ исследовано взаимодействие с липосомами, сформированными из
 суммарных липидов сперматозоидов петуха (СЛСП), криопротекторов: этиленгликоля (ЭГ), 1,2-пропандиола (1,2-ПД), N,N-
 диметилформамида (ДМФА), N,N-диметилацетамида (ДМАЦ), глицерина и диметисульфоксида (ДМСО).Установлено, что
 уровень воздействия криопротекторов на бислой определяется гидрофильно-гидрофобным балансом их молекул и имеет
 концентрационно-зависимый характер. По степени увеличения влияния на спектральные параметры флуоресценции ФМЕ в
 липосомах из СЛСП криопротекторы располагаются в ряд: глицерин ≤ ЭГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, что
 согласуется с ростом их коэффициента распределения в системе “вода-неполярная фаза”. Рассматривается механизм влияния
 криопротекторов на связи, формирующие бислой. З використанням флуоресцентного зонда ФМЕ досліджено взаємодію з ліпосомами, які сформовані із сумарних ліпідів
 сперматозоїдів півня (СЛСП), кріопротекторів: етиленгліколю (ЕГ), 1,2–пропандіолу (1,2–ПД), N,N-диметилформаміду
 (ДМФА), N,N-диметилацетаміду (ДМАЦ), гліцерину і диметисульфоксиду (ДМСО). Встановлено, що рівень впливу кріо-
 протекторів на бішар визначається гідрофільно-гідрофобним балансом їх молекул та має концентраційно-залежний характер.
 За ступенем збільшення впливу на спектральні параметри флуоресценції ФМЕ в ліпосомах із СЛСП кріопротектори
 розташовуються в ряд: гліцерин ≤ ЕГ < 1,2-ПД < ДМСО < ДМАЦ ≤ ДМФА, що погоджується зі збільшення їх коефіцієнта
 розподілу в системі “вода-неполярна фаза”. Обговорюється механізм впливу кріопротекторів на зв’язки, які формують
 бішар. Using the fluorescent probe FME we studied interactions of the cryoprotectants: ethylene glycol (EG), 1,2-propane diol (1,2-
 PD), N,N-dimethyl formamide (DMFA), N,N-dimethyl acetamide (DMAc), glycerol and dimethyl sulfoxide (DMSO) with liposomes
 made from the fowl spermatozoa total lipid (FSTL). It was established that the level of CP impacts on bilayer is determined by
 hydrophilic-hydrophobic balance of their molecules and showed a concentration dependence. The cryoprotectants are ranked by their
 increasing influence on FME fluorescence spectral parameters in RSTL liposomes as follows: glycerol ≤ EG < 1,2-PD < DMSO <
 DMAc ≤ DMFA, that corresponds the growth in their distribution coefficients in the system “water – non-polar phase”. A mechanism
 of the cryoprotectant impacts on bonds forming bilayer is discussed. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха Interactions of Cryoprotectants with Liposomes from Total Lipids of the Fowl Spermatozoa Article published earlier |
| spellingShingle | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха Линник, Т.П. Дюбко, Т.С. Мартынюк, И.Н. Терещенко, А.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| title_alt | Interactions of Cryoprotectants with Liposomes from Total Lipids of the Fowl Spermatozoa |
| title_full | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| title_fullStr | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| title_full_unstemmed | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| title_short | Взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| title_sort | взаимодействие криопротекторов с липосомами из суммарных липидов спермиев петуха |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44428 |
| work_keys_str_mv | AT linniktp vzaimodeistviekrioprotektorovsliposomamiizsummarnyhlipidovspermievpetuha AT dûbkots vzaimodeistviekrioprotektorovsliposomamiizsummarnyhlipidovspermievpetuha AT martynûkin vzaimodeistviekrioprotektorovsliposomamiizsummarnyhlipidovspermievpetuha AT tereŝenkoav vzaimodeistviekrioprotektorovsliposomamiizsummarnyhlipidovspermievpetuha AT linniktp interactionsofcryoprotectantswithliposomesfromtotallipidsofthefowlspermatozoa AT dûbkots interactionsofcryoprotectantswithliposomesfromtotallipidsofthefowlspermatozoa AT martynûkin interactionsofcryoprotectantswithliposomesfromtotallipidsofthefowlspermatozoa AT tereŝenkoav interactionsofcryoprotectantswithliposomesfromtotallipidsofthefowlspermatozoa |