Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами
Исследовали осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
 полимерные непроникающие (декстран, ПЭГ) и проникающие (ДМСО, глюкоза) криопротекторы. Эритроциты, замороженные
 с полимерами, в интервале концентраций NaCl 0,45–0,9% имеют осмо...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44458 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 47-58. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860203945872326656 |
|---|---|
| author | Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| author_facet | Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. |
| citation_txt | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 47-58. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Исследовали осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
полимерные непроникающие (декстран, ПЭГ) и проникающие (ДМСО, глюкоза) криопротекторы. Эритроциты, замороженные
с полимерами, в интервале концентраций NaCl 0,45–0,9% имеют осмотическую устойчивость ниже, чем интактные клетки, а
при концентрации NaCl 0,09–0,4% – выше. Устойчивость тем выше, чем больше концентрация полимера в среде замораживания.
Комбинирование в криоконсерванте непроникающих и проникающих криопротекторов сохраняет нормальную осмотическую
устойчивость замороженных эритроцитов. Полученные результаты позволяют предположить, что рост осмотической
устойчивости замороженных эритроцитов в интервале концентраций NaCl 0,09–0,4% связан с нарастанием градиента
концентрации полимеров на мембранах клеток при охлаждении. Комбинирование в среде замораживания проникающего
криопротектора с полимером способствует положительной коррекции криопротекторной эффективности последнего вследствие
ослабления осмотического стресса при замораживании, который налагается концентрированием непроникающего полимерного
криопротектора.
Досліджували осмотичний гемоліз еритроцитів, заморожених у комбінованих кріоконсервантах, які містять полімерні
непроникаючі (декстран, ПЕГ) і проникаючі (ДМСО, глюкоза) кріопротектори. Еритроцити, заморожені з полімерами, в
інтервалі концентрацій NaCl 0,45–0,9% мають осмотичну стійкість нижчу, ніж інтактні клітини, а при концентрації NaCl 0,09–
0,4% – вищу. Стійкість тим вища, чим більша концентрація полімеру в середовищі заморожування. Комбінування в
кріоконсерванті непроникаючих та проникаючих кріопротекторів забезпечує підтримку нормальної осмотичної стійкості
заморожених еритроцитів. Отримані результати дозволяють припустити, що зростання осмотичної стійкості заморожених
еритроцитів в інтервалі концентрацій NaCl 0,09–0,4% пов’язано зі збільшенням градієнта концентрації полімерів на мембранах
клітин при охолодженні. Комбінування в середовищі заморожування проникаючого кріопротектора з полімером сприяє
позитивній корекції кріопротекторної ефективності останнього внаслідок послаблення осмотичного стресу при заморожуванні,
який накладається концентруванням непроникаючого полімерного кріопротектора.
Osmotic hemolysis of erythrocytes frozen in combined crypreservatives containing polymer non-penetrating (dextran, PEG) and
penetrating (DMSO, glucose) cryoprotectants was studied. Erythrocytes frozen with the polymers within the range of NaCl concentrations
0.45–0.9% are characterized by lower osmotic resistance than intact cells and by higher osmotic resistance within the range of
NaCl concentrations 0.09–0.4%. The higher the polymer concentration in the freezing medium is, the higher resistance is. Combination
of non-penetrating and penetrating cryoprotectants in cryopreservatives maintains normal osmotic resistance of frozen erythrocytes.
The results obtained allow presuming that enhancement in osmotic resistance of erythrocytes frozen within the range of NaCl
concentrations 0.09–0.4% is associated with a growth in polymer concentration gradient on cell membranes in the process of cooling.
Combination a penetrating cryoprotectant with a polymer in freezing media promotes a positive correction of cryoprotective efficiency
of the latter owing to weakening osmotic stress during freezing, which is caused by concentration of the non-penetrating
polymer cryoprotectant.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:11:16Z |
| format | Article |
| fulltext |
47
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
УДК 57.043:612.111:547.422
В.В. РАМАЗАНОВ*, В.А. БОНДАРЕНКО
Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах
с непроникающими и проникающими криопротекторами
UDC 57.043:612.111:547.422
V.V. RAMAZANOV*, V.A. BONDARENKO
Osmotic Properties of Erythrocytes Frozen in Media Containing
Non-Penetrating and Penetrating Cryoprotectants
Исследовали осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
полимерные непроникающие (декстран, ПЭГ) и проникающие (ДМСО, глюкоза) криопротекторы. Эритроциты, замороженные
с полимерами, в интервале концентраций NaCl 0,45–0,9% имеют осмотическую устойчивость ниже, чем интактные клетки, а
при концентрации NaCl 0,09–0,4% – выше. Устойчивость тем выше, чем больше концентрация полимера в среде замораживания.
Комбинирование в криоконсерванте непроникающих и проникающих криопротекторов сохраняет нормальную осмотическую
устойчивость замороженных эритроцитов. Полученные результаты позволяют предположить, что рост осмотической
устойчивости замороженных эритроцитов в интервале концентраций NaCl 0,09–0,4% связан с нарастанием градиента
концентрации полимеров на мембранах клеток при охлаждении. Комбинирование в среде замораживания проникающего
криопротектора с полимером способствует положительной коррекции криопротекторной эффективности последнего вследствие
ослабления осмотического стресса при замораживании, который налагается концентрированием непроникающего полимерного
криопротектора.
Ключевые слова: эритроциты, комбинированные криоконсерванты, осмотический гемолиз.
Досліджували осмотичний гемоліз еритроцитів, заморожених у комбінованих кріоконсервантах, які містять полімерні
непроникаючі (декстран, ПЕГ) і проникаючі (ДМСО, глюкоза) кріопротектори. Еритроцити, заморожені з полімерами, в
інтервалі концентрацій NaCl 0,45–0,9% мають осмотичну стійкість нижчу, ніж інтактні клітини, а при концентрації NaCl 0,09–
0,4% – вищу. Стійкість тим вища, чим більша концентрація полімеру в середовищі заморожування. Комбінування в
кріоконсерванті непроникаючих та проникаючих кріопротекторів забезпечує підтримку нормальної осмотичної стійкості
заморожених еритроцитів. Отримані результати дозволяють припустити, що зростання осмотичної стійкості заморожених
еритроцитів в інтервалі концентрацій NaCl 0,09–0,4% пов’язано зі збільшенням градієнта концентрації полімерів на мембранах
клітин при охолодженні. Комбінування в середовищі заморожування проникаючого кріопротектора з полімером сприяє
позитивній корекції кріопротекторної ефективності останнього внаслідок послаблення осмотичного стресу при заморожуванні,
який накладається концентруванням непроникаючого полімерного кріопротектора.
Ключові слова: еритроцити, комбіновані кріоконсерванти, осмотичний гемоліз.
Osmotic hemolysis of erythrocytes frozen in combined crypreservatives containing polymer non-penetrating (dextran, PEG) and
penetrating (DMSO, glucose) cryoprotectants was studied. Erythrocytes frozen with the polymers within the range of NaCl concen-
trations 0.45–0.9% are characterized by lower osmotic resistance than intact cells and by higher osmotic resistance within the range of
NaCl concentrations 0.09–0.4%. The higher the polymer concentration in the freezing medium is, the higher resistance is. Combination
of non-penetrating and penetrating cryoprotectants in cryopreservatives maintains normal osmotic resistance of frozen erythrocytes.
The results obtained allow presuming that enhancement in osmotic resistance of erythrocytes frozen within the range of NaCl
concentrations 0.09–0.4% is associated with a growth in polymer concentration gradient on cell membranes in the process of cooling.
Combination a penetrating cryoprotectant with a polymer in freezing media promotes a positive correction of cryoprotective effi-
ciency of the latter owing to weakening osmotic stress during freezing, which is caused by concentration of the non-penetrating
polymer cryoprotectant.
Key words: erythrocytes, combined cryopreservatives, osmotic hemolysis.
Сочетание непроникающих и проникающих
криопротекторов эффективно при замораживании
разных клеток, включая стволовые клетки перифе-
рической крови [5, 27, 28], нефракционированные
клетки костного мозга [30, 31], гранулоциты [11],
лимфоциты [29], гемопоэтические клетки кордовой
крови [13] и клетки поджелудочной железы чело-
века [15]. Эти данные указывают на общие причи-
Combination of non-penetrating and penetrating
cryoprotectants is efficient for freezing different cells
including peripheral blood stem cells [5, 27, 28], bone
marrow non-fractionated cells [30, 31], granulocytes
[11], lymphocytes [29], cord blood hemopoietic cells
[13] and human pancreatic cells [15]. These data
indicate to common causes of injuries in different cells,
which can be eliminated by combined cryoprotectants.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
48
ны повреждения разных клеток, которые устраня-
ются комбинированными криоконсервантами.
Предполагается, что дополнительные повреж-
дения эритроцитов при замораживании с высоким
гематокритом (эффект “упаковки”) возникают вследст-
вие механических воздействий в промерзающих
каналах льда [17] и осмотических эффектов при
плавлении внеклеточного и внутриклеточного льда
[9, 10, 23, 24].
При медленном замораживании плотных сус-
пензий эритроциты под влиянием растущих крис-
таллов льда концентрируются в каналах, подверга-
ются сдвиговому стрессу, сдавливаются и разру-
шаются [17, 21, 22]. При быстром замораживании
клетки дисперсно распределяются во льду, тем не
менее отрицательное влияние высокой концент-
рации клеток выявляется и в таких условиях. По-
этому авторы [21] заключили, что механизм допол-
нительного “прироста” повреждений клеток при
быстром замораживании отличается от такового
при медленном замораживании. Быстрое охлаж-
дение повышает вероятность образования внутри-
клеточных кристаллов льда, “прирост” которых
будет иметь место при замораживании эритро-
цитов с высоким гематокритом [23]. Предпола-
гается, что повреждение внутриклеточными крис-
таллами льда может быть осмотическим вследст-
вие их плавления при медленном размораживании
[9]. При быстром размораживании увеличение сте-
пени повреждения в суспензии с высокой кон-
центрацией клеток происходит за счет большего
разведения внешней среды вследствие быстрого
плавления внеклеточного льда, основная часть
которого была образована из внутриклеточной
воды [10]. Таким образом, при быстром заморажи-
вании-отогреве суспензий с высокой концентрацией
клеток будет иметь место “прирост” осмотических
повреждений на стадии отогрева.
Эффект “упаковки” устраняется не только при
повышении концентрации глицерина в среде за-
мораживания, но и при включении в криоконсервант
стабилизаторов мембраны. В обоих случаях эрит-
роциты, отмытые после замораживания, имеют нор-
мальную осмотическую хрупкость [33].
Показано [2], что при замораживании в саха-
розо-солевой среде эритроцитов с высоким гема-
токритом уровень их повреждения больше по срав-
нению с клетками, замороженными с низким гема-
токритом. Сочетание указанной среды с непро-
никающими криопротекторами не устраняет эф-
фект “упаковки”, в отличие от ее комбинирования
с глюкозой или проникающим криопротектором.
Предполагается, что устранение повреждений,
связанных с высокой концентрацией клеток в среде
замораживания, определяется осмотической про-
текцией эритроцитов в ходе быстрого заморажива-
Additional injuries in erythrocytes, when they are
frozen with high hematocrit (“packing” effect), are
considered to occur owing to mechanical impacts in
ice frozen canals [17] and osmotic effects during mel-
ting extracellular and intracellular ice [9, 10, 23, 24].
When dense suspensions are frozen slowly erythro-
cytes affected by growing ice crystals condense in
canals, undergo shear stress, become compressed and
disintegrate [17, 21, 22]. When cells are frozen quickly
they are spread dispersively in ice, nevertheless nega-
tive influence of high concentrations of cells manifests
itself under these conditions, too. That is why the
authors [21] concluded that the mechanism of additio-
nal “gain” in cell injuries during quick freezing differed
from that during slow freezing. Rapid chilling enhanced
probability of emergence of intracellular ice crystals,
the growth of which will occur when erythrocytes being
frozen with high hematocrit [23]. Injuries by intracel-
lular ice crystals are regarded to be osmotic ones due
to their thawing during slow thawing [9]. During the
rapid thawing the gain in injury severity in suspensions
with high cell concentration occurs because of the quick
of melting extracellular ice, the essential portion of
which was formed from intracellular water [10]. Thus,
in the process of rapid freeze-thawing of suspensions
with high cell concentrations a gain in osmotic injuries
at the thawing stage will take place.
The “packing” effect is eliminated not only by in-
creasing the concentrations of glycerol in a freezing
medium, but also by inclusion of membrane stabilisers
to cryopreservatives. In both cases erythrocytes wash-
ed after freezing have normal osmotic fragility [33].
It was shown [2] that when erythrocytes were fro-
zen in sucrose-salt medium with high hematocrit the
level of their injuries was bigger in comparison with
cells frozen with low hematocrit. Combination of the
medium above-mentioned with non-penetrating cryo-
protectants does not eliminate “packing” effect unlike
its combination with glucose or with a penetrating
cryoprotectant. Elimination of injuries associated with
high concentrations of cells in freezing media is assu-
med to be determined by osmotic protection of erythro-
cytes in the process of rapid freezing-thawing, which
is provided by combination of sucrose with glucose or
sucrose with a penetrating cryoprotectant [2].
The aim of the work is studying the osmotic lysis
of erythrocytes washed after freezing in sucrose-salt
medium with non-penetrating and penetrating cryopro-
tectants.
Materials and methods
NaCl (chemically pure), Na2SO4 (chemically pure),
sucrose (analytically pure), glucose (analytically pure),
polyethylene glycols with molecular weigths 1500
(PEG-1500) and 2,000 (PEG-2000) produced by
Merck, dextrans with molecular weigths of 10,000
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
49
ния-отогрева, которая обеспечивается сочетанием
сахарозы с глюкозой или сахарозы с проникающим
криопротектором [2].
Цель работы – исследование осмотического ли-
зиса эритроцитов, отмытых после замораживания
в сахарозо-солевой среде с непроникающими и
проникающими криопротекторами.
Материалы и методы
В работе использовали NaCl (“х. ч.”), Na2SO4
(“х. ч.”), сахарозу (“ч. д. а.”), глюкозу (“ч. д. а.”),
по-лиэтиленгликоли с молекулярной массой 1500
(ПЭГ-1500) и 2000 (ПЭГ-2000) производства
Merck, декстраны с молекулярной массой 10000
(Д-10000) и 35000 (Д-35000) производства Serva,
диметилсульфоксид (ДМСО) производства Sigma.
Среды замораживания готовили на растворе, со-
держащем 0,3% NaCl и 6,85 % сахарозы. Криокон-
сервант содержал 20% полимера или 20% поли-
мера и 5% проникающего криопротектора.
Эритроциты человека получали из донорской
крови четырехкратным отмыванием раствором,
содержащим 0,9% NaCl. Полиэтиленовые ампулы
с образцами эритроцитов в средах замораживания
(объемом 1мл) с гематокритом 40% инкубировали
40 мин при 25°С, затем погружали на 30 мин в жид-
кий азот и размораживали на водяной бане при 40°С
в течение 3 мин. Затем содержимое ампул при
перемешивании разводили теплым (37°С) физио-
логическим раствором NaCl (0,9%) в 10 раз в тече-
ние не менее 30 с, центрифугировали 5 мин при
3000 об/мин и удаляли надосадочную жидкость.
Всего процедуру повторяли дважды. После этого
эритроциты трижды отмывали теплым физиоло-
гическим раствором NaCl, при этом скорость
разведения осадка эритроцитов не учитывали.
Осмотический лизис эритроцитов исследовали
в среде, содержащей 10 мМ трис-буфер с рН 7,4 и
0,09–0,9% NaCl. Суспензию эритроцитов (1 мл) в
среде с гематокритом 0,6% инкубировали 15 мин
при 23°С, далее центрифугировали при 3000 об/мин
в течение 3 мин.
В специальном эксперименте эритроциты с ге-
матокритом 40% инкубировали 30 мин при 25°С в
солевой среде (0,9% NaCl), содержащей 20–40%
ПЭГ-1500, с последующим отмыванием физиоло-
гическим раствором NaCl при 37°С.
Степень гемолиза вычисляли после спектрофо-
тометрического определения количества гемогло-
бина в супернатанте образцов, измеряя оптичес-
кую плотность при длине волны 543 нм [18]:
Степень гемолиза = [А1/А2] × 100%,
где А1 – оптическая плотность супернатанта
экспериментального образца; А2 – оптическая
(D-10000) and 35,000 (D-35000) produced by Serva,
dimethyl sulfoxide (DMSO) produced by Sigma were
used in the work. Freezing media were prepared on
solution containing 0.3% NaCl and 6.85% sucrose.
Cryopreservatives comprised 20% of a polymer or
20% of a polymer and 5% of a penetrating cryoprotec-
tant.
Human erythrocytes were isolated from donors’
blood by four-time-washing with 0.9% NaCl solution.
Polyethylene ampoules with erythrocyte samples in
freezing media (volume of 1 ml) with 40% hematocrit
were incubated at 25°C for 40 min, submerged in liquid
nitrogen for 30 min and then thawed in a water bath at
40°C for 3 min. Afterwards samples were dilu-ted ten-
fold with warm (37°C) physiological solution (0.9%
NaCl) with stirring for not less than 30 sec, centrifuged
at 3,000 rpm for 5 min, and supernatants were removed.
The whole procedure was repeated twice. Afterwards
erythrocytes were washed three times with warm phy-
siological solution; the rate of erythrocyte pellet diluting
was disregarded.
Osmotic lysis of erythrocytes was studied in media
containing 10 mM Tris buffer, pH 7.4, and 0.09–0.9%
NaCl. Erythrocyte suspension (1 ml) in medium with
hematocrit 0.6% was incubated at 23°C for 15 min
and centrifuged at 3000 rpm for 3 min.
In a special experiment the erythrocytes with 40%
hematocrit were incubated in salt media (0.9% NaCl)
containing 20–40% PEG-1500 at 25°C for 30 min with
the following washing with physiological solution at
37°C.
Hemolysis level was calculated after spectropho-
tometric determination of haemoglobin amount in
sample supernatants by measuring absorbancy at the
wavelength 543 nm [18]:
Hemolysis level = [A1/A2] × 100%,
where A1 is absorbancy of an experimental sample
supernatant; A2 is absorbancy after complete hemolysis
of the control sample.
Mean values and variances of random variates were
computed from the results on erythrocytes obtained
from 5 donors. The data are presented as mean value ±
standard error. To estimate statistical significance of
the results the non-parametric Mann-Whitney test with
p < 0.05 was used [1].
Results and discussion
Hemolysis level changes after cryopreservation
depending on polymer concentrations in freezing media
are presented in Fig. 1. Usage of dextrans and PEGs
yielded different results. Increasing dextran concent-
ration up to 20% in media was accompanied by a
reduction in hemolysis level. When PEGs being used
hemolysis level changes are of different pattern. The
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
50
плотность при полном гемолизе контрольного
образца.
Среднее значение и дисперсию случайной ве-
личины рассчитывали по результатам, получен-
ным на эритроцитах от 5 доноров. Данные представ-
лены как среднее значение ± стандартная ошибка.
Для определения статистической достоверности
результатов использовали непараметрический
метод Манна-Уитни при р < 0,05 [1].
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлено изменение степени ге-
молиза эритроцитов после замораживания в зави-
симости от концентрации полимеров в среде замо-
раживания. При использовании декстранов и ПЭГ
получены разные результаты. Увеличение концент-
рации декстранов в среде до 20% сопровождается
снижением степени гемолиза. При использовании
ПЭГ зависимости имеют другой характер. Мини-
мальный гемолиз для ПЭГ-1500 отмечается при
концентрации 5%, тогда как для ПЭГ-2000 – при
10%. Увеличение концентрации этих полимеров
приводит к повышению гемолиза, однако в боль-
шей степени при использовании ПЭГ-1500. Такие
результаты указывают на то, что применение
данных полимеров имеет количественное огра-
ничение, что свидетельствует о слабых криопро-
текторных свойствах ПЭГ по сравнению с декстра-
нами. При 20%-й концентрации ПЭГ-1500 выяв-
ляет слабое криопротекторное действие (рис. 1).
Результаты исследования осмотического гемо-
лиза замороженных эритроцитов представлены на
рис. 2. Практически во всех случаях выявлено по-
добное поведение кривых осмотического лизиса в
зависимости от концентрации полимеров в среде
замораживания. В солевой среде с концентрацией
NaCl 0,45–0,9% наблюдается рост осмотической
хрупкости эритроцитов, тогда как при 0,09–0,4% –
повышение их осмотической устойчивости. Кроме
того, в последнем случае отмечается зависимость
поведения кривых от концентрации полимеров в
среде замораживания: чем больше концентрация,
тем выше осмотическая устойчивость в этом ин-
тервале концентраций NaCl. Это указывает на то,
что данный эффект связан с ростом концентра-
ционного градиента полимеров на мембране клеток
при замораживании. Такое предположение подт-
верждается экспериментом с исключением этапа
замораживания, в котором эритроциты инкубиро-
вали в средах с высокой концентрацией ПЭГ-1500
и последующим отмыванием изотоническим раст-
вором NaCl. Результаты, представленные на рис. 3,
показывают, что кривые осмотического гемолиза
таких эритроцитов подобны тем, которые получены
для замороженных клеток (см. рис. 2), т. е. имеет
место рост осмотической устойчивости при кон-
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20
Рис. 1. Степень повреждения эритроцитов после замо-
раживания-отогрева-отмывания в зависимости от кон-
центрации полимеров в среде замораживания: 1 –
Д-35000; 2 – Д-10000; 3 – ПЭГ-2000; 4 – ПЭГ-1500.
Fig. 1. Erythrocyte injury level after freezing-thawing-wash-
ing out depending on the polymers concentrations in the
freezing media: 1 – D-35000; 2 – D-10000; 3 – PEG-2000;
PEG-1500.
Концентрация полимера, %
Polymer concentration, %
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
minimal hemolysis for PEG-1500 was registered at the
concentration 5%, while the most efficient concent-
ration for PEG-2000 is 10%. Increasing concentrations
of these polymers led to a rise in hemolysis level,
however this showed to a greater extent in the case of
PEG-1500. Such results indicate that the application
of these polymers is limited quantitatively, which attests
to PEGs poor cryoprotective properties in comparison
with dextrans. At the concentration of 20% PEG-1500
showed a slight cryoprotective effect (Fig. 1).
The results on osmotic hemolysis of frozen erythro-
cytes are presented in Fig. 2. Virtually in all the cases
similar profiles of osmotic lysis curves depending on
the polymers concentrations in freezing media were
disclosed. A rise in erythrocyte osmotic fragility was
observed in the salt media with 0.45–0.9% NaCl, while
the media with 0.09–0.4% NaCl an enhancement in
erythrocyte osmotic resistance was registered. Besides
in the latter case osmotic hemolysis depended on the
polymers concentrations in the freezing media: the
higher their concentrations are, the higher osmotic
resistance within this range of NaCl concentrations is.
This denotes that the given effect is associated with a
growth of the polymers concentration gradient on cell
membranes during freezing. Such assumption is con-
firmed by the experiment excluding the freezing stage,
in which erythrocytes were incubated in the media with
high concentrations of PEG-1500 with subsequent
washing with isotonic NaCl solution. The results pre-
sented in Fig. 3 show that osmotic hemolysis curves
1
2
3
4
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
51
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Рис. 2. Осмотический гемолиз эритроцитов, отмытых после замораживания в среде с полимерами: а – Д-35000; б –
Д-10000; в – ПЭГ-2000; г – ПЭГ-1500; – интактные клетки; , , ×, – клетки, замороженные в средах с
различными концентрациями полимеров: – 5%; – 10%; × – 15%; – 20%.
Fig. 2. Osmotic hemolysis of erythrocytes washed out after freezing in the media containing the polymers: a – D-35000; b –
D-10000; c – PEG-2000; d – PEG-1500; – intact cells; , , ×, – cells frozen in the media with different concentrations
of the polymers: – 5; – 10%; × – 15%; – 20%.
центрации соли 0,09–0,4%. Такое поведение кривых
осмотического лизиса замороженных эритроцитов
указывает на структурные нарушения мембран,
связанные с нарастанием концентрации полимеров
при замораживании: чем больше концентрация по-
лимера, тем выше осмотическая устойчивость
размороженных эритроцитов при концентрации
NaCl 0,09–0,4% (см. рис. 2).
Подобное поведение кривых осмотического ге-
молиза было выявлено для эритроцитов, заморо-
женных в среде с трегалозой или декстраном [25],
но не с глицерином [25, 33]. Это подтверждает то,
что полученный эффект выявляется только после
замораживания эритроцитов в средах с непроника-
ющими криопротекторами.
for these erythrocytes are similar to those for frozen
cells (see Fig. 2), i. e. there is an enhancement in osmo-
tic resistance at the salt concentrations 0.09–0.4%.
Such behavior of osmotic lysis curves for frozen
erythrocytes indicates structural injuries in membranes
connected with the polymers increasing concentrations
during freezing. The higher the polymer concentration
is, the higher osmotic resistance of thawed erythrocytes
at 0.09–0.4% concentrations of NaCl is (see Fig. 2).
A similar behavior of osmotic hemolysis curves was
revealed for erythrocytes frozen in media with treha-
lose or with dextran [25], but not with glycerol [25,
33]. This confirms the fact that the effect revealed
manifests itself only after freezing erythrocytes in
media with non-penetrating cryoprotectants.
а а б b
в c г d
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
52
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Замораживание эритроцитов с декстранами
обеспечивает значительно меньшую степень пов-
реждения по сравнению с ПЭГ (таблица). Вклю-
чение в среды замораживания проникающих
криопротекторов (особенно ДМСО или глюкозы в
комбинации с декстранами) снижает степень
гемолиза эритроцитов (таблица). Однако анализ
полученных результатов показывает, что степень
снижения повреждения после включения в крио-
консервант проникающих криопротекторов в
присутствии ПЭГ выше, чем декстранов. Такие
результаты указывают на то, что сочетание прони-
кающих криопротекторов с непроникающими мо-
жет, во-первых, давать аддитивный эффект крио-
протекции, во-вторых, возможно, что проникающие
криопротекторы нейтрализуют “токсический” эф-
фект ПЭГ, который проявляется в снижении сох-
ранности эритроцитов при повышении концент-
рации данных полимеров (см. рис.1).
Осмотическая устойчивость эритроцитов, от-
мытых после замораживания в средах с непрони-
кающими и проникающими криопротекторами,
незначительно отличается от интактных клеток
(рис. 4).
Из анализа результатов исследования осмоти-
ческого гемолиза следует, что включение в среды
с полимерами проникающих криопротекторов пре-
дупреждает изменение осмотических свойств
замороженных эритроцитов. Предположительно,
рост осмотической устойчивости в верхней части
кривой осмотического лизиса (0,09–0,4% NaCl)
Рис. 3. Осмотический гемолиз эритроцитов, отмытых
после инкубации в среде, содержащей ПЭГ-1500: –
интактные клетки; – 20%, – 40%.
Fig. 3. Osmotic hemolysis of erythrocytes washed out after
incubation in the medium containing PEG-1500: – intact
cells; – 20%; – 40%.
Freezing erythrocytes with dextrans provides a
conspicuously lesser injury level in comparison with
PEGs (Table). Inclusion of penetrating cryoprotectors
(espe-cially DMSO or glucose in combination with dex-
trans) to freezing media reduces hemolysis level (Tab-
le). However the analysis of the data obtained indicates
that the extent of reduction in injuries after inclusion
of penetrating cryoprotectants to cryopreservatives is
higher with PEGs that with dextrans. Such results de-
note that combination of penetrating cryoprotectants
with non-penetrating ones firstly can yield an additive
cryprotective effect; secondly penetrating cryopro-
tectants may neutralize “toxic” effects of PEGs, which
is manifested as a decline in erythrocyte safety as these
polymers concentrations grow (see Fig. 1).
Osmotic resistance of erythrocytes washed after
freezing in media with non-penetrating and penetrating
cryoprotectans differs insignificantly from that of intact
cells (Fig. 4)
The analysis of the results on osmotic lysis proves
that inclusion of penetrating cryoprotectants to media
with polymers prevents changing osmotic characte-
ristics of frozen erythrocytes. Hypothetically the en-
hancement in osmotic resistance in the upper part of
the osmotic lysis curve (0.09%–0.4%) is associated
with a growing gradient of the polymers concentrations
on cell membranes in the process of freezing, that is
why the intensity of osmotic stress declines as penetra-
ting cryoprotectants enter the cells, and normal osmotic
characteristics of membranes are maintained.
Efficiency of combined cryoprotectants can be due
to a reduction in a principal cryoprotectant “toxicity”
in the presence of additional ones. Freezing cells with
DMSO usually leads to its negative impact at high con-
centrations, however freezing medium efficiency in the
presence of amides increases significantly [8]. Glucose
is also an efficient neutralizer of DMSO “toxicity” [6].
PEG-6000 was not shown to have any cryoprotective
activity, however its combination with DMSO-glucose
mixture had a good cryoprotective effect [32]. Presu-
mably protective efficiency of non-polar cryoprotec-
tants is associated with their exclusion from the protein
hydration shell at low temperature [4]. Sucrose and
glycerol cryoprotective efficiencies are determined by
their interactions with membrane lipid bilayer [3].
Glycerol and DMSO at the concentration of 5% proved
to be efficient when erythrocytes were chilled down
to –30°C, however their cryoprotective activity decrea-
sed drastically under chilling down to –130°C. Glucose
and sucrose are efficient when erythrocytes are frozen
to –40 and –130°C. At the same time polyvinyl pyrro-
lidone mediates between penetrating cryoprotectants
and sugars [26].
Possibly the combination of penetrating and non-
penetrating cryoprotectants influences cryoprotection
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
53
связан с нарастанием градиента концентрации по-
лимеров на мембранах клеток при заморажива-
нии, поэтому с поступлением в клетки проника-
ющих криопротекторов снижается интенсивность
осмотического стресса и поддерживаются нормаль-
ные осмотические свойства мембран.
Эффективность комбинированных криоконсер-
вантов может быть обусловлена уменьшением
“токсичности” основного криопротектора в при-
сутствии дополнительных. Обычно замораживание
клеток с ДМСО ведет к отрицательному воздейст-
вию его высоких концентраций, однако в присутст-
вии амидов эффективность среды замораживания
существенно повышается [8]. Глюкоза также
efficiency at the account of additivity or neutralization
of a principal cryoprotectant “toxicity”. Indeed, appli-
cation of such cryoprotectants is quite promising [5,
11, 13–15, 27–29, 32–34]. Thus, usage of combined
cryopreservatives is logically relevant, however mecha-
nisms of cryoprotective efficiency remain unexamined.
Combinations of glucose or a penetrating cryopro-
tectant with sucrose in cryopreservatives were sug-
gested to eliminate “packing” effect at the account of
osmotic stabilization of membranes in the process of
rapid freezing-thawing [2]. In literature there are data
that “packing” effect elimination is accompanied by
maintenance of erythrocyte osmotic fragility both as
glycerol concentration in freezing medium increases
Рис. 4. Влияние на осмотический гемолиз замороженных эритроцитов ДМСО или глюкозы в среде замораживания: а –
Д-35000; б – Д-10000; в – ПЭГ-2000; г – ПЭГ-1500; – интактные клетки; – клетки, замороженные с ДМСО; × – с
глюкозой; – без проникающих криопротекторов.
Fig. 4. DMSO or glucose influence on frozen erythrocyte osmotic hemolysis: a – D-35000; b – D-10000; c – PEG-2000; d –
PEG-1500; – intact cells; – cells frozen with DMSO; × – cells frozen with glucose; – cells frozen without
penetrating cryoprotectants.
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
а а б b
в c г dКонцентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
54
является эффективным нейтрализатором “токсич-
ности” ДМСО [6]. Показано, что ПЭГ-6000 не
выявляет криопротекторного воздействия, однако
его комбинирование со смесью ДМСО и глюкозы
имеет хороший криопротекторный эффект [32].
Предполагается, что защитная эффективность
неполярных криопротекторов связана с их исклю-
чением из гидратной оболочки белков при низкой
температуре [4]. Криопротекторная эффективность
сахарозы и глицерина определяется их взаимо-
действием с липидным бислоем мембраны [3].
Глицерин и ДМСО в концентрации 5% оказались
эффективными при замораживании эритроцитов до
–30°С, однако при замораживании до –130°С их
криопротекторная активность резко снижается.
Глюкоза и сахароза эффективны при заморажи-
вании эритроцитов до температуры –40 и –130°С.
При этом поливинилпирролидон по защитной актив-
ности занимает промежуточное положение между
проникающими криопротекторами и сахарами [26].
Вероятно, сочетание проникающих и непрони-
кающих криопротекторов влияет на эффектив-
ность криопротекции за счет аддитивности или
нейтрализации “токсичности” основного криопро-
тектора. Действительно, применение подобных
криоконсервантов перспективно [5, 11, 13–15, 27–
29, 32–34]. Таким образом, использование комбини-
рованных криоконсервантов логически обосновано,
однако механизмы криопротекторной эффектив-
ности остаются не исследованными.
Предполагалось, что сочетание в криоконсер-
ванте глюкозы или проникающего криопротектора
с сахарозой устраняет эффект “упаковки” за счет
осмотической стабилизации мембран при быстром
замораживании-отогреве [2]. В литературе име-
ются данные, что устранение эффекта “упаковки”
сопровождается сохранением осмотической хруп-
кости эритроцитов как при повышении концент-
рации глицерина в среде замораживания (от 20 до
40%), так и при включении в криоконсервант мемб-
ранотропных реагентов [33]. Кроме того, показана
криопротекторная эффективность комбинирован-
ного состава, содержащего стабилизаторы мемб-
ран и невысокие концентрации проникающих и
непроникающих криопротекторов, замораживание
в котором существенно не изменяет осмотическую
хрупкость эритроцитов [34]. Полученные резуль-
таты относительно осмотического гемолиза эрит-
роцитов, замороженных в комбинированных средах
(рис. 4), согласуются с этими данными литературы
и подтверждают положение о том, что устранение
эффекта “упаковки” сопровождается осмотической
стабилизацией мембран клеток в ходе заморажи-
вания-отогрева.
Анализ степени гемолиза эритроцитов после за-
мораживания показывает, что лучшие результаты
from 20 to 40% and as membrane-tropic agents are
included to cryopreservatives [33]. Besides cryo-
protective efficiency of a combined composition contai-
ning membrane stabilizers and low concentrations of
penetrating and non-penetrating cryoprotectants was
shown. Freezing in this composition did not change
significantly erythrocyte osmotic fragility [34]. The
results obtained on osmotic lysis of erythrocytes frozen
in combined media (Fig. 4) are consistent with these
literature data and confirm the assumption that
“packing” effect elimination is accompanied by cell
membrane osmotic stabilisation in the course of freeze-
thawing.
The analysis of erythrocyte hemolysis level after
freezing shows that the best results were obtained when
cryopreservatives containing D-35000 and DMSO or
D-35000 and glucose were used (Table). A peculiarity
of the data obtained lies in the fact that adding a penet-
rating cryoprotectant at relatively low concentrations
to the cryopreservative reduces considerably the seve-
rity of erythrocyte injuries (Table).
In this respect it should be noted that the penetrating
cryoprotectants (glycerol and DMSO) are unable to
protect cells during rapid freezing [16], however using
their combinations with non-penetrating cryoprotectants
one can get a novel feature of a combined composition,
which counteracts damaging factors under rapid free-
ze-thawing. It was shown that freezing the granulocytes
with hydroxyethyl starch with low rates is inefficient,
but its combination with DMSO has a significant cryo-
protective activity [12]. A similar result was obtained
with freezing bone marrow cells [31]. In most cases
usage of combined cryopreservatives simplifies freez-
ing procedure [13–15, 30, 31]. It may be associated
with the fact that usage of combined cryopreservatives
allows avoiding considerable supercooling of cell samp-
les at the moment of initial crystallisation [14, 31].
Presumably cryoprotective activity of polymer non-
penetrating cryoprotectants is associated with their abi-
lity to maintain reparative properties of cell membranes
in the course of freezing. After thawing cells maintain
capacity for restoring their cationic balance [19]. Po-
lymer protective activity is also associated with water
structuring and maintaining it in liquid state at rather
low temperatures in the process of freezing (–35°C)
[7]. Nevertheless along with positive effects the
polymers’ concentrating in the course of freezing con-
tribute considerably to a growth of osmotic gradient
on cell membranes [7, 20], as a result the osmotic pro-
perties of frozen cells will be different from those of
normal ones. As for penetrating cryoprotectants their
cryoprotective activity is associated with a retardation
of the solution concentration and a decline in cell hydra-
tion [19]. In medium containing sucrose and a polymer
the cells undergo osmotic stress because of conside-
rable dehydration during freezing [20]. If a penetrating
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
55
получены при использовании криоконсервантов,
содержащих Д-35000 и ДМСО или Д-35000 и
глюкозу (таблица). Особенностью полученных
данных является то, что добавление в криокон-
сервант проникающего криопротектора в относи-
тельно небольшом количестве (5%) существенно
уменьшает степень повреждения эритроцитов
(таблица).
В связи с этим необходимо отметить, что про-
никающие криопротекторы (глицерин и ДМСО)
не способны протектировать клетки при быстром
замораживании [16], однако при их сочетании с
непроникающими криопротекторами можно полу-
чить новое качество комбинированного состава,
которое противодействует повреждающим факто-
рам при быстром замораживании-отогреве. Пока-
зано, что замораживание гранулоцитов с гидрокси-
этилированным крахмалом при низкой скорости не
эффективно, однако его сочетание с ДМСО имеет
значительный криопротекторный эффект [12]. По-
добный результат получен при замораживании кле-
ток костного мозга [31]. В большинстве случаев
использование комбинированных криоконсервантов
упрощает процедуру замораживания [13–15, 30, 31].
Вероятно, это связано с тем, что использование
комбинированных криоконсервантов позволяет из-
бежать значительного переохлаждения клеточного
образца в момент начальной кристаллизации [14,
31].
Предполагается, что криозащитное действие
непроникающих полимерных криопротекторов
связано с их способностью сохранять репаратив-
ные свойства клеточных мембран в процессе
замораживания. После размораживания клетки
сохраняют способность восстанавливать свой ка-
тионный баланс [19]. Кроме того, защитное дейст-
вие полимеров связано со структурированием воды
и поддержанием ее в жидком состоянии при доста-
точно низких температурах в ходе замораживания
(–35°С) [7]. Однако полимеры, концентрируясь в
ходе замораживания наряду с положительными
эффектами, вносят значительный вклад в нарас-
тание осмотического градиента на мембранах кле-
ток [7, 20], вследствие чего осмотические свойства
замороженных клеток будут отличаться от нор-
мальных. Для проникающих криопротекторов
криозащитный эффект связан с замедлением кон-
центрирования раствора и уменьшением степени
дегидратации клеток [19]. В среде, содержащей
сахарозу и полимер, клетки при замораживании ис-
пытывают осмотический стресс из-за значитель-
ной дегидратации [20]. Если в такую среду допол-
нительно включить проникающий криопротектор,
то уменьшится степень дегидратации клеток и
соответственно осмотический стресс при замора-
живании. Уменьшение степени дегидратации кле-
cryoprotectant is added to such medium, cell dehydra-
tion will decrease and, consequently, osmotic stress
will weaken in the course of freezing. A decrease in
cell dehydration provides conditions for weakening
impact of osmotic mechanisms of injuries in the process
of thawing. These mechanisms are associated with
water influx and outflux from the cells during slow
thawing [9] or with dilution of external medium on the
final stage of rapid thawing owing to the melting of
extracellular ice, a considerable portion of which was
formed from intracellular water [10].
Thus, inclusion of penetrating cryoprotectants to
cryopreservatives can be an efficient approach to
redu-cing osmotic stress occurring in the course of
freezing with non-penetrating cryoprotectants. Preven-
tion of considerable dehydration of cells during freezing
will result in weakening osmotic mechanisms of cell
injuries in the process of thawing cell suspensions.
Combination of non-penetrating and penetrating cryo-
protectants in cryopreservatives will create a novel
cryoprotective feature of the combined composition,
which will counteract damaging factors in the process
of freeze-thawing and provide high safety and satis-
Степень повреждения эритроцитов, замороженных в
средах с непроникающими и проникающими
криопротекторами
Erythrocyte injury level after freezing in media with non-
penetrating and penetrating cryoprotectants
яинавижаромазыдерС
aidemgnizeerF
яинавижаромазелсопзиломеГ -
авергото - %,яинавымто
gnizeerfretfasisylomeH - gniwaht -
%,tuognihsaw
Д- )%02(00053
D- )%02(00053 0,4±7,63
Д- )%5(ОСМД+)%02(00053
D- )%5(OSMD+)%02(00053 1,4±8,51
Д- )%5(азокюлг+)%02(00053
D- )%5(esoculg+)%02(00053 2,4±71
Д- )%02(00001
D- )%02(00001 6,5±4,04
Д- )%5(ОСМД+)%02(00001
D- )%5(OSMD+)%02(00001 2,4±4,71
Д- )%5(азокюлг+)%02(00001
D- )%5(esoculg+)%02(00001 4,5±7,71
ГЭП - )%02(0002
GEP - )%02(0002 7,4±0,55
ГЭП - )%5(ОСМД+)%02(0002
GEP - )%5(OSMD+)%02(0002 3,4±2,92
ГЭП - )%5(азокюлг+)%02(0002
GEP - )%5(esoculg+)%02(0002 8,4±0,72
ГЭП - )%02(0051
GEP - )%02(005,1 0,3±0,46
ГЭП - )%5(ОСМД+)%02(0051
GEP - )%5(OSMD+)%02(0051 2,4±8,33
ГЭП - )%5(азокюлг+)%02(0051
GEP - )%5(esoculg+)%02(0051 6,5±6,73
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
56
ток создает условия для ослабления влияния
осмотических механизмов повреждения при раз-
мораживании. Эти механизмы связаны с входом
и выходом воды из клеток при медленном размо-
раживании [9] или разведением внешней среды на
конечном этапе быстрого размораживания вслед-
ствие плавления внеклеточного льда, значительная
часть которого образована из внутриклеточной
воды [10].
Таким образом, включение в криоконсервант
проникающего криопротектора может быть эффек-
тивным для уменьшения осмотического стресса,
создаваемого в ходе замораживания с непроника-
ющими криопротекторами. Предупреждение значи-
тельной дегидратации клеток в ходе заморажи-
вания приведет к ослаблению осмотических меха-
низмов повреждения клеток при отогреве клеточ-
ных суспензий. Сочетание в криоконсерванте не-
проникающих и проникающих криопротекторов
создает новое криозащитное свойство комбини-
рованного состава, которое противодействует пов-
реждающим факторам при замораживании-отог-
реве, обеспечивает высокую сохранность и удов-
летворительные осмотические свойства клеток
после отмывания от криоконсерванта.
Выводы
В эритроцитах, замороженных в сахарозо-
солевой среде с непроникающими полимерными
криопротекторами (ПЭГ-1500, ПЭГ-2000, Д-10000,
Д-35000), отмечены значительные изменения
осмотических свойств по сравнению с интактными
клетками: снижение осмотической устойчивости
в интервале концентраций NaCl 0,45–0,9%; повы-
шение осмотической устойчивости в интервале
0,09–0,4%. При включении в криоконсервант про-
никающего криопротектора (ДМСО, глюкоза)
существенных отклонений осмотических свойств
замороженных клеток не наблюдается.
Литература
Ашмарин И.П., Васильев И.П., Амбросов В.А. Быстрые
методы статистической обработки и планирование экс-
периментов.– Л., 1975.–76 с.
Рамазанов В.В. Влияние комбинированных сред на пов-
реждение эритроцитов, замороженных с различным ге-
матокритом // Пробл. криобиологии.– 2006.– Т. 16, №2.–
С. 155–163.
Anchordoguy T.J., Rudolph A.S., Carpenter J.F., Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phos-
pholipids during freezing// Cryobiology.– 1987.–Vol. 24, N4.–
P. 324–331.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A., Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis // Cryo-
biology.– 1990.– Vol. 27, N4.– P. 401–415.
Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
References
Ashmarin I.P., Vasilyev I.P., Ambrosov B.A. Quick methods
for statistical processing and experiment designing. –
Leningrad, 1985.– 76 p.
Ramazanov V.V. Effect of combined media on damage of
erythrocytes, frozen with different hematocrit values //
Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N2.– P. 155–163.
Anchordoguy T.J., Rudolph A.S., Carpenter J.F., Crowe J.H.
Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phos-
pholipids during freezing // Cryobiology.– 1987.–Vol. 24, N4.–
P. 324–331.
Arakawa T., Carpenter J.F., Kita Y.A., Crowe J.H. The basis
for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis // Cryo-
biology.– 1990.– Vol. 27, N4.– P. 401–415.
Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
gives better results than DMSO alone // Bull. Cancer.– 2004.–
Vol. 91, N4.– P. E97–102.
Clark P., Hawkins H.E., Karow A.M. The influence of vehicle
solutions on the toxicity of dimethyl sulfoxide to renal cortex //
Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N6.– P. 701.
Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mammalian
cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms //
Cryobiology.– 1973.– Vol. 10, N6.– P. 488–496.
Fahy G.M. Cryoprotectant toxicity neutralizers reduce freezing
domage // Cryoletters.– 1983.– Vol. 4.– P. 309–314.
Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two–
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.– Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on
the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //
Cryobiology.– 1982.– Vol. 19, N6.– P. 669.
Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-
vation of human granulocytes // Cryobiology.– 1975.– Vol. 2,
N3.– P. 181–191.
Lionetti F.J., Luscinskas F.W., Hant S.M. et al. Factors
affecting the stability of cryogenically preserved granulo-
cytes // Cryobiology.– 1980.– Vol. 17, N3.– P. 297–310.
Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-
programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyl-
ethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord
blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue
Za Zhi.– 2004.– Vol. 12, N5.– P. 670–673.
Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated
human marrow cells// Cryobiology. – 1994. – Vol. 31, N 4.–
P. 349–354.
1.
2.
3.
4.
5.
factory osmotic properties of cells after washing them
from the cryopreservant.
Conclusions
Considerable changes of osmotic characteristics
were registered in erythrocytes frozen in sucrose-salt
media with the non-penetrating polymer cryopro-
tectants (PEG-1500, PEG-200, D-10000, D-35000) in
comparison with intact cells: a decline in osmotic
resistance within the range of NaCl concentrations
0.45–0.9%; a rise in osmotic resistance within the
range of NaCl concentrations 0.09–0.4%. When a
penetrating cryoprotectant (DMSO, glucose) is added
to cryopreservatives, there are no significant diver-
gences in osmotic characteristics of frozen cells.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
57
gives better results than DMSO alone // Bull. Cancer.– 2004.–
Vol. 91, N4.– P. E97–102.
Clark P., Hawkins H.E., Karow A.M. The influence of vehicle
solutions on the toxicity of dimethyl sulfoxide to renal cortex //
Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N6.– P. 701.
Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mammalian
cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms //
Cryobiology.– 1973.– Vol. 10, N6.– P. 488–496.
Fahy G.M. Cryoprotectant toxicity neutralizers reduce freezing
domage // Cryoletters.– 1983.– Vol. 4.– P. 309–314.
Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two–
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.– Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on
the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //
Cryobiology.– 1982.– Vol. 19, N6.– P. 669.
Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-
vation of human granulocytes // Cryobiology.– 1975.– Vol. 2,
N3.– P. 181–191.
Lionetti F.J., Luscinskas F.W., Hant S.M. et al. Factors
affecting the stability of cryogenically preserved granulo-
cytes // Cryobiology.– 1980.– Vol. 17, N3.– P. 297–310.
Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-
programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyl-
ethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord
blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue
Za Zhi.– 2004.– Vol. 12, N5.– P. 670–673.
Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated
human marrow cells// Cryobiology. – 1994. – Vol. 31, N 4.–
P. 349–354.
Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified
method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl
starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Trans-
plant. Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.
Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14,
N3.– P. 251–272.
Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the
contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the
survival of slowly frozen human erythrocytes // Cryobiology.–
1985.– Vol. 22, N6.– P. 509–536.
Mazur P., Miller R.H. Survival of frozen-thawed human red
cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose //
Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N5.– P. 523–536.
Meryman H.T. Cryoprotective agents // Cryobiology.– 1971.–
Vol. 8, N2.– P. 173–183.
Meryman H.T., Williams R.J., Douglas M.S. Freezing injury from
“solution effects” and its prevention by natural or artificial
cryoprotection // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14, N3.– P. 287–
302.
Nei T. Effect of initial of cell concentration of the post-thaw
hemolysis of frozen erythrocytes // Cryobiology.– 1976.–
Vol. 13, N6.– P. 651.
Nei T. Mechanism of freezing injury to erythrocytes: effect
of initial cell concentration on the post-thaw hemolysis //
Cryobiology.– 1981.– Vol. 18, N3.– P. 229–237.
Pegg D.E. The effect of cell concentration on the recovery
of human erythrocytes after freezing and thawing in the pre-
sence of glycerol // Cryobiology.– 1981.– Vol. 18, N3.– P. 221–
228.
Pegg D.E., Diaper M.P., Skaer H.L., Hunt C.J. The effect of
cooling rate and warming rate on the packing effect in human
erythrocytes frozen and thawed in the presence of 2 M
glycerol // Cryobiology.– 1984.– Vol. 21, N5.– P. 491–502.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran du-
ring freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173–186.
Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified
method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl
starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Trans-
plant. Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.
Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14,
N3.– P. 251–272.
Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the
contribution of unfrozen fraction and salt concentration to the
survival of slowly frozen human erythrocytes // Cryobiology.–
1985.– Vol. 22, N6.– P. 509–536.
Mazur P., Miller R.H. Survival of frozen-thawed human red
cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose //
Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N5.– P. 523–536.
Meryman H.T. Cryoprotective agents // Cryobiology.– 1971.–
Vol. 8, N2.– P. 173–183.
Meryman H.T., Williams R.J., Douglas M.S. Freezing injury from
“solution effects” and its prevention by natural or artificial
cryoprotection // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14, N3.– P. 287–
302.
Nei T. Effect of initial of cell concentration of the post-thaw
hemolysis of frozen erythrocytes // Cryobiology.– 1976.–
Vol. 13, N6.– P. 651.
Nei T. Mechanism of freezing injury to erythrocytes: effect
of initial cell concentration on the post-thaw hemolysis //
Cryobiology.– 1981.– Vol. 18, N3.– P. 229–237.
Pegg D.E. The effect of cell concentration on the recovery
of human erythrocytes after freezing and thawing in the pre-
sence of glycerol // Cryobiology.– 1981.– Vol. 18, N3.– P. 221–
228.
Pegg D.E., Diaper M.P., Skaer H.L., Hunt C.J. The effect of
cooling rate and warming rate on the packing effect in human
erythrocytes frozen and thawed in the presence of 2 M
glycerol // Cryobiology.– 1984.– Vol. 21, N5.– P. 491–502.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran du-
ring freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173–186.
Rapatz G., Luyet B. Combined effects of freezing rates and of
various protective agents on the preservation of human eryth-
rocytes // Cryobiology.– 1968.– Vol. 4, N5.– P. 215–222.
Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an
additional cryoprotective agent in freeze preservation of
hematopoietic stem cells// Folia Haematol. Int. Mag. Klin.
Morphol. Blutforsch.– 1987.– Vol. 114, N2.– P. 264–272.
Rowley S.D., Feng Z., Chen L., et al. A randomized phase III
clinical trial of autologous blood stem celltransplantation com-
paring cryopreservation using dimethylsulfoxide vs dimethyl-
sulfoxide with hydroxyethylstarch// Bone Marrow Transplant.–
2003.– Vol. 31, N11.– P. 1043–1051.
Simon J.D., Albala B.B., Flinton L.J. et al. The cryopreser-
vation of human lymphocytes // Cryobiology.– 1974.– Vol. 11,
N6.– P. 543.
Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-
served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without
controlled-rate freezing // Blood.– 1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–
978.
Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated hu-
man marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch // Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N1.–
P. 17–24.
Ulrich J.M., Finkle B.J., Moore P.H., Ginoza H. Effect of a mix-
ture of cryoprotectants in attaining liquid nitrogen survival of cal-
lus cultures of a tropical plant // Cryobiology.– 1979.– Vol. 16,
N6.– P. 550–556.
Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood
cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery
following cryopreservation // Cryobiology.– 2000.– Vol. 41,
N3.– P. 178–194.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
58
Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J. Bio-
chemical stabilization enhances red blood cell recovery and
stability following cryopreservation // Cryobiology.– 2002.–
Vol. 45, N2.– P. 153–166.
Accepted in 06.10.2009
Rapatz G., Luyet B. Combined effects of freezing rates and of
various protective agents on the preservation of human eryth-
rocytes // Cryobiology.– 1968.– Vol. 4, N5.– P. 215–222.
Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an
additional cryoprotective agent in freeze preservation of
hematopoietic stem cells// Folia Haematol. Int. Mag. Klin.
Morphol. Blutforsch.– 1987.– Vol. 114, N2.– P. 264–272.
Rowley S.D., Feng Z., Chen L., et al. A randomized phase III
clinical trial of autologous blood stem celltransplantation com-
paring cryopreservation using dimethylsulfoxide vs dimethyl-
sulfoxide with hydroxyethylstarch// Bone Marrow Transplant.–
2003.– Vol. 31, N11.– P. 1043–1051.
Simon J.D., Albala B.B., Flinton L.J. et al. The cryopreser-
vation of human lymphocytes // Cryobiology.– 1974.– Vol. 11,
N6.– P. 543.
Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-
served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without
controlled-rate freezing // Blood.– 1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–
978.
Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated hu-
man marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch // Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N1.–
P. 17–24.
Ulrich J.M., Finkle B.J., Moore P.H., Ginoza H. Effect of a mix-
ture of cryoprotectants in attaining liquid nitrogen survival of cal-
lus cultures of a tropical plant // Cryobiology.– 1979.– Vol. 16,
N6.– P. 550–556.
Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood
cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery
following cryopreservation // Cryobiology.– 2000.– Vol. 41,
N3.– P. 178–194.
Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J. Bio-
chemical stabilization enhances red blood cell recovery and
stability following cryopreservation // Cryobiology.– 2002.–
Vol. 45, N2.– P. 153–166.
Поступила 06.10.2009
Рецензент О.И. Гордиенко
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
34.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44458 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:11:16Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. 2013-06-01T18:56:54Z 2013-06-01T18:56:54Z 2010 Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами / В.В. Рамазанов, В.А. Бондаренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 47-58. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44458 57.043:612.111:547.422 Исследовали осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
 полимерные непроникающие (декстран, ПЭГ) и проникающие (ДМСО, глюкоза) криопротекторы. Эритроциты, замороженные
 с полимерами, в интервале концентраций NaCl 0,45–0,9% имеют осмотическую устойчивость ниже, чем интактные клетки, а
 при концентрации NaCl 0,09–0,4% – выше. Устойчивость тем выше, чем больше концентрация полимера в среде замораживания.
 Комбинирование в криоконсерванте непроникающих и проникающих криопротекторов сохраняет нормальную осмотическую
 устойчивость замороженных эритроцитов. Полученные результаты позволяют предположить, что рост осмотической
 устойчивости замороженных эритроцитов в интервале концентраций NaCl 0,09–0,4% связан с нарастанием градиента
 концентрации полимеров на мембранах клеток при охлаждении. Комбинирование в среде замораживания проникающего
 криопротектора с полимером способствует положительной коррекции криопротекторной эффективности последнего вследствие
 ослабления осмотического стресса при замораживании, который налагается концентрированием непроникающего полимерного
 криопротектора. Досліджували осмотичний гемоліз еритроцитів, заморожених у комбінованих кріоконсервантах, які містять полімерні
 непроникаючі (декстран, ПЕГ) і проникаючі (ДМСО, глюкоза) кріопротектори. Еритроцити, заморожені з полімерами, в
 інтервалі концентрацій NaCl 0,45–0,9% мають осмотичну стійкість нижчу, ніж інтактні клітини, а при концентрації NaCl 0,09–
 0,4% – вищу. Стійкість тим вища, чим більша концентрація полімеру в середовищі заморожування. Комбінування в
 кріоконсерванті непроникаючих та проникаючих кріопротекторів забезпечує підтримку нормальної осмотичної стійкості
 заморожених еритроцитів. Отримані результати дозволяють припустити, що зростання осмотичної стійкості заморожених
 еритроцитів в інтервалі концентрацій NaCl 0,09–0,4% пов’язано зі збільшенням градієнта концентрації полімерів на мембранах
 клітин при охолодженні. Комбінування в середовищі заморожування проникаючого кріопротектора з полімером сприяє
 позитивній корекції кріопротекторної ефективності останнього внаслідок послаблення осмотичного стресу при заморожуванні,
 який накладається концентруванням непроникаючого полімерного кріопротектора. Osmotic hemolysis of erythrocytes frozen in combined crypreservatives containing polymer non-penetrating (dextran, PEG) and
 penetrating (DMSO, glucose) cryoprotectants was studied. Erythrocytes frozen with the polymers within the range of NaCl concentrations
 0.45–0.9% are characterized by lower osmotic resistance than intact cells and by higher osmotic resistance within the range of
 NaCl concentrations 0.09–0.4%. The higher the polymer concentration in the freezing medium is, the higher resistance is. Combination
 of non-penetrating and penetrating cryoprotectants in cryopreservatives maintains normal osmotic resistance of frozen erythrocytes.
 The results obtained allow presuming that enhancement in osmotic resistance of erythrocytes frozen within the range of NaCl
 concentrations 0.09–0.4% is associated with a growth in polymer concentration gradient on cell membranes in the process of cooling.
 Combination a penetrating cryoprotectant with a polymer in freezing media promotes a positive correction of cryoprotective efficiency
 of the latter owing to weakening osmotic stress during freezing, which is caused by concentration of the non-penetrating
 polymer cryoprotectant. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами Osmotic Properties of Erythrocytes Frozen in Media Containing Non-Penetrating and Penetrating Cryoprotectants Article published earlier |
| spellingShingle | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами Рамазанов, В.В. Бондаренко, В.А. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| title_alt | Osmotic Properties of Erythrocytes Frozen in Media Containing Non-Penetrating and Penetrating Cryoprotectants |
| title_full | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| title_fullStr | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| title_full_unstemmed | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| title_short | Осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| title_sort | осмотические свойства эритроцитов, замороженных в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44458 |
| work_keys_str_mv | AT ramazanovvv osmotičeskiesvoistvaéritrocitovzamorožennyhvsredahsnepronikaûŝimiipronikaûŝimikrioprotektorami AT bondarenkova osmotičeskiesvoistvaéritrocitovzamorožennyhvsredahsnepronikaûŝimiipronikaûŝimikrioprotektorami AT ramazanovvv osmoticpropertiesoferythrocytesfrozeninmediacontainingnonpenetratingandpenetratingcryoprotectants AT bondarenkova osmoticpropertiesoferythrocytesfrozeninmediacontainingnonpenetratingandpenetratingcryoprotectants |