Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека
Изучали влияние криоконсервирования на функциональные свойства более дифференцированных кроветворных предшественников зрелых клеточных типов в кордовой крови человека, а также выявляли степень корреляции изменения экспрессии фенотипических маркеров с функциональным состоянием этих клеток. Отмечено...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44460 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, М.В. Останков, К.А. Гольцев, Л.В. Сокол, Е.В. Бровко, Л.Г. Чернышенко, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 66-72. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44460 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Сокол, Л.В. Бровко, В.Е. Чернышенко, Л.Г. Кожина, О.Ю. 2013-06-01T20:12:01Z 2013-06-01T20:12:01Z 2010 Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, М.В. Останков, К.А. Гольцев, Л.В. Сокол, Е.В. Бровко, Л.Г. Чернышенко, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 66-72. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44460 615.361.018.5.013.8.014.41 Изучали влияние криоконсервирования на функциональные свойства более дифференцированных кроветворных предшественников зрелых клеточных типов в кордовой крови человека, а также выявляли степень корреляции изменения экспрессии фенотипических маркеров с функциональным состоянием этих клеток. Отмечено наличие корреляции функцио- нального состояния гемопоэтических клеток c изменением экспрессии фенотипических маркеров. Установлена сохранность функциональных свойств компонентов лейкоконцентрата кордовой крови человека при использовании предложенного способа его получения и криоконсервирования. Вивчали вплив кріоконсервування на функціональні властивості більш диференційованих кровотворних попередників зрілих клітинних типів у кордовій крові людини, а також виявляли ступінь кореляції зміни експресії фенотипових маркерів з функціональним станом цих клітин. Виявлена наявність кореляції функціонального стану гемопоетичних клітин зі зміною експресії фенотипових маркерів. Встановлено збереження функціональних властивостей компонентів лейкоконцентрату кордової крові людини при використанні запропонованого способу його отримання і кріоконсервування. Cryopreservation effect on functional properties of more differentiated hemopoietic precursors of mature cells in human cord blood was investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition of these cells was assessed. Correlation between functional state of hemopoietic cells and phenotypic marker expression was noted. Maintenance of functional properties of human cord blood leukoconcentrate components was proved when the suggested method for its obtainment and cryopreservation being applied. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека Effect of Cryopreservation on Functional Properties of Human Cord Blood Leukoconcentrate Nucleated Cells Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| spellingShingle |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Сокол, Л.В. Бровко, В.Е. Чернышенко, Л.Г. Кожина, О.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_full |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_fullStr |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_full_unstemmed |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_sort |
влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| author |
Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Сокол, Л.В. Бровко, В.Е. Чернышенко, Л.Г. Кожина, О.Ю. |
| author_facet |
Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Сокол, Л.В. Бровко, В.Е. Чернышенко, Л.Г. Кожина, О.Ю. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2010 |
| language |
Russian |
| container_title |
Проблемы криобиологии |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Effect of Cryopreservation on Functional Properties of Human Cord Blood Leukoconcentrate Nucleated Cells |
| description |
Изучали влияние криоконсервирования на функциональные свойства более дифференцированных кроветворных
предшественников зрелых клеточных типов в кордовой крови человека, а также выявляли степень корреляции изменения
экспрессии фенотипических маркеров с функциональным состоянием этих клеток. Отмечено наличие корреляции функцио-
нального состояния гемопоэтических клеток c изменением экспрессии фенотипических маркеров. Установлена сохранность
функциональных свойств компонентов лейкоконцентрата кордовой крови человека при использовании предложенного способа
его получения и криоконсервирования.
Вивчали вплив кріоконсервування на функціональні властивості більш диференційованих кровотворних попередників
зрілих клітинних типів у кордовій крові людини, а також виявляли ступінь кореляції зміни експресії фенотипових маркерів з
функціональним станом цих клітин. Виявлена наявність кореляції функціонального стану гемопоетичних клітин зі зміною
експресії фенотипових маркерів. Встановлено збереження функціональних властивостей компонентів лейкоконцентрату кордової
крові людини при використанні запропонованого способу його отримання і кріоконсервування.
Cryopreservation effect on functional properties of more differentiated hemopoietic precursors of mature cells in human cord
blood was investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition of these cells was
assessed. Correlation between functional state of hemopoietic cells and phenotypic marker expression was noted. Maintenance of
functional properties of human cord blood leukoconcentrate components was proved when the suggested method for its obtainment
and cryopreservation being applied.
|
| issn |
0233-7673 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44460 |
| citation_txt |
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, М.В. Останков, К.А. Гольцев, Л.В. Сокол, Е.В. Бровко, Л.Г. Чернышенко, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 1. — С. 66-72. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
| work_keys_str_mv |
AT golʹcevan vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT volinavv vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT ostankovmv vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT golʹcevka vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT sokollv vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT brovkove vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT černyšenkolg vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT kožinaoû vliâniekriokonservirovaniânafunkcionalʹnyesvoistvaâdrosoderžaŝihkletokleikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT golʹcevan effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT volinavv effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT ostankovmv effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT golʹcevka effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT sokollv effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT brovkove effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT černyšenkolg effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells AT kožinaoû effectofcryopreservationonfunctionalpropertiesofhumancordbloodleukoconcentratenucleatedcells |
| first_indexed |
2025-11-25T13:48:09Z |
| last_indexed |
2025-11-25T13:48:09Z |
| _version_ |
1850516053318172672 |
| fulltext |
66
УДК 615.361.018.5.013.8.014.41
А.Н. ГОЛЬЦЕВ*, В.В. ВОЛИНА, М.В. ОСТАНКОВ, К.А. ГОЛЬЦЕВ,
Л.В. СОКОЛ, Е.В. БРОВКО, Л.Г. ЧЕРНЫШЕНКО, О.Ю. КОЖИНА
Влияние криоконсервирования на функциональные свойства
ядросодержащих клеток лейкоконцентрата кордовой
крови человека
UDC 615.361.018.5.013.8.014.41
A.N. GOLTSEV*, V.V. VOLINA, M.V. OSTANKOV, K.A. GOLTSEV,
L.V. SOKOL, YE.V. BROVKO, L.G. CHERNYSHENKO,O.YU. KOZHINA
Effect of Cryopreservation on Functional Properties
of Human Cord Blood Leukoconcentrate Nucleated Cells
Изучали влияние криоконсервирования на функциональные свойства более дифференцированных кроветворных
предшественников зрелых клеточных типов в кордовой крови человека, а также выявляли степень корреляции изменения
экспрессии фенотипических маркеров с функциональным состоянием этих клеток. Отмечено наличие корреляции функцио-
нального состояния гемопоэтических клеток c изменением экспрессии фенотипических маркеров. Установлена сохранность
функциональных свойств компонентов лейкоконцентрата кордовой крови человека при использовании предложенного способа
его получения и криоконсервирования.
Ключевые слова: кордовая кровь человека, ядросодержащие клетки крови, функциональные свойства, криоконсер-
вирование.
Вивчали вплив кріоконсервування на функціональні властивості більш диференційованих кровотворних попередників
зрілих клітинних типів у кордовій крові людини, а також виявляли ступінь кореляції зміни експресії фенотипових маркерів з
функціональним станом цих клітин. Виявлена наявність кореляції функціонального стану гемопоетичних клітин зі зміною
експресії фенотипових маркерів. Встановлено збереження функціональних властивостей компонентів лейкоконцентрату кордової
крові людини при використанні запропонованого способу його отримання і кріоконсервування.
Ключові слова: кордова кров людини, ядровмісні клітини крові, функціональні властивості, кріоконсервування.
Cryopreservation effect on functional properties of more differentiated hemopoietic precursors of mature cells in human cord
blood was investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition of these cells was
assessed. Correlation between functional state of hemopoietic cells and phenotypic marker expression was noted. Maintenance of
functional properties of human cord blood leukoconcentrate components was proved when the suggested method for its obtainment
and cryopreservation being applied.
Key words: human cord blood, blood nucleated cells, functional properties, cryopreservation.
В клинической практике широко применяется
кордовая (пуповинная) кровь, в единице объема ко-
торой содержится больше гемопоэтических ство-
ловых клеток и предшественников зрелых клеточ-
ных типов по сравнению с периферической кровью
взрослого человека и примерно столько же как в
его костном мозге [9, 10, 21]. Плазма пуповинной
крови содержит комплекс биологически активных
компонентов: гормонов, интерлейкинов, интерфе-
ронов, ростовых факторов, ферментов и профер-
ментов, витаминов и микроэлементов, гемопоэти-
нов и адаптогенов, эндорфинов и энкефалинов в
физиологически сбалансированном соотношении
[7, 8, 12, 15, 19].
Криоконсервирование является безальтернатив-
ным методом хранения ядросодержащих клеток,
в том числе и кордовой крови [9, 16, 17].
Cord (umbilical) blood, the volume unit of which
contains more hemopoietic stem cells and mature cell
precursors as compared to adult human peripheric
blood, and approximately the same quantity as adult
human bone marrow does, is widely used in clinical
practice [9, 10, 21]. Umbilical blood plasma comprises
a complex of biologically active components: hormones,
interleukines, interferons, growth factors, enzymes and
pro-enzymes, vitamins and microelements, hemopoie-
tins and adaptogens, endorphins and enkephalins in
physiologically balanced ratios [7, 8, 12, 15, 19].
Cryopreservation is the only method for storage of
nuclear cells including cord blood ones [9, 16, 17].
An original method for obtaining and cryopre-
servation of cord blood nucleated components suspen-
ded in autologous plasma without any traditional cryo-
protectants has been elaborated [6].
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-57-89, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
5789, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
67
Разработан оригинальный способ получения и
криоконсервирования ядросодержащих компонен-
тов кордовой крови, взвешенных в аутологичной
плазме без использования традиционных криопро-
текторов [6].
Влияние временных и температурных парамет-
ров хранения кордовой крови человека (ККЧ) пе-
ред криоконсервированием, а также самого процес-
са криоконсервирования на функциональные
свойства стволовых кроветворных клеток описано
в работах [11, 13]. Однако полученные данные про-
тиворечивы и требуют дальнейшего изучения.
Цель работы – изучение влияния криоконсерви-
рования на функциональные свойства более диф-
ференцированных кроветворных предшественников
зрелых клеточных типов в кордовой крови человека
(ККЧ), а также выявление степени корреляции
изменения экспрессии фенотипических маркеров
с функциональным состоянием этих клеток.
Материалы и методы
Объектом исследования был лейкоконцентрат
кордовой крови человека (ЛККЧ), взвешенный в
аутологичной плазме и полученный седимента-
ционным методом [5].
Для исследования ЛККЧ был разделен на груп-
пы: ЛККЧ1 – нативный лейкоконцентрат, получен-
ный из ККЧ (контроль для группы ЛККЧ2);
ЛККЧ2 – криоконсервированный ЛККЧ1 сразу пос-
ле отогрева.
Клеточный спектр ЛККЧ до и после криокон-
сервирования определяли в мазках, фиксированных
в метиловом спирте и окрашенных азур ІІ – эозином.
Ядросодержащие клетки лейкоконцентрата вы-
деляли центрифугированием при 1500 об/мин в те-
чение 40 мин. Супернатант удаляли, а клеточный
осадок ресуспендировали в Рингер-фосфатном
буфере до необходимой концентрации клеток.
Количество популяций, субпопуляций лимфо-
цитов, моноцитов и предшественников зрелых
клеточных типов в клеточных суспензиях ЛККЧ
определяли с помощью моноклональных антител
(МАТ) (ООО “Сорбент”, Россия) [3] на флюорес-
центном микроскопе (Inverso Epi Fluor, Ceti, Бель-
гия).
Фагоцитарную активность ядросодержащих
клеток ЛККЧ оценивали после их инкубации с 18-
часовой культурой Staphyococcus aureus, убитой
нагреванием, смешанных в соотношении 1:2 соот-
ветственно [2]. В окрашенных азур II-эозином маз-
ках определяли количество фагоцитирующих и
нефагоцитирующих клеток среди 200 подсчитан-
ных. Из числа фагоцитирующих клеток устанавли-
вали относительное количество клеток в стадиях
аттракции и поглощения, а также фагоцитарное
Influence of duration and temperature of human
cord blood (HCB) storage before cryopreservation as
well as influence of cryopreservation procedure per
se on functional properties of hemopoietic stem cells
are described in [11, 13]. Nevertheless the data obtained
are contradictory and require further studies.
The aim of the work is the study of cryopreserva-
tion influence on functional properties of more differen-
tiated hemopoietic precursors of mature cells in human
cord blood (HCB) as well as assessing correlation bet-
ween phenotypic marker expression and functional
condition of these cells.
Materials and methods
The subject of investigation was human cord blood
leukoconcentrate (HCBL) suspended in autologous
plasma and obtained by the sedimentation technique
[5].
For the investigation the HCBL was divided into
the following groups: HCBL1 – native leukoconcentrate
obtained from HCB (control for HCBL2); HCBL2 –
frozen-thawed HCBL1 right after thawing.
HCBL cell composition before and after cryopre-
servation was determined in smears fixed in methanol
and dyed with azure II – eosin.
Leukoconcentrate nucleated cells were isolated by
centrifugation at 1,500 rpm for 40 min. Supernatant
was removed, and cell pellet was resuspended in
Ringer’s phosphate buffer until a required cell concen-
tration was achieved.
Quantities of populations, subpopulations of lym-
phocytes, monocytes and hemopoietic precursors of
mature cells in HCBL cell suspensions were deter-
mined by means of monoclonal antibodies (MAB) (Ltd
Sorbent, Russia) [3] on a fluorescent microscope
(Inverso Epi Fluor, Ceti, Belgium).
Phagocytic activity of HCBL nucleated cells was
estimated after their incubation with 18-hour Staphylo-
coccus aureus culture, heat-killed and mixed in the
ratio 1:2, respectively [2]. In azure II – eosin stained
smears the quantities of phagocyting and non-phago-
cyting cells were determined per 200 counted ones.
From the number of phagocyting cells the relative
quantity of cells at attraction and consumption stages
as well as the phagocytic number as the average value
of mic-roorganisms phagocyted by one phagocyte
were found.
Cell oxidation-reduction potential was estimated by
means of nitro blue tetrazolium reduction test (NBTR-
test) [19]; metabolic activity providing intracellular
production of H2O2 (one of the main bactericide
substances) was estimated by the quantity of intra-
cellular diformazan dark granules.
Lisosomal enzyme activities were determined by
the quantity of cells, in lisosomes of which non-specific
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
68
число как среднее количество фагоцитированных
микроорганизмов одним фагоцитом.
Окислительно-восстановительный потенциал
клеток оценивали с помощью НСТ-теста [19],
активность метаболического процесса, обеспечи-
вающего внутриклеточную выработку Н2О2 (одной
из главных бактерицидных субстанций), – по коли-
честву темно-окрашенных гранул внутриклеточ-
ного диформазана.
Активность лизосомальных ферментов устана-
вливали по количеству клеток, в лизосомах которых
неспецифическая эстераза (НЭ) и кислая фосфа-
таза (КФ) положительно реагировали на субстрат
[21]. При этом активность КФ коррелировала с об-
разованием мелких гранул синего цвета, а актив-
ность НЭ-гранул – темно-фиолетового цвета.
Полученные результаты обрабатывали по ме-
тоду Стьюдента с учетом коэффициента Фишера.
Достоверность различий оценивали с помощью t-
критерия с уровнем значимости 5% [1].
Результаты и обсуждение
В нативных суспензиях лейкоконцентрата основ-
ными клеточными популяциями являлись лимфо-
циты, выявлено небольшое количество нейтрофи-
лов, моноцитов и крупных клеток с большим гипо-
хромным ядром и гипохромной цитоплазмой, кото-
рые относятся к недифференцированным. После
отогрева в клеточном спектре лейкоконцентрата
также преобладали лимфоциты, достоверно увели-
чивалось относительное количество недифферен-
цированных клеток и определялись фибробласто-
подобные клетки, которые в нативном лейкокон-
центрате не выявлялись; относительное количество
нейтрофилов уменьшалось (рис. 1).
Было установлено, что относительное коли-
чество CD4+- и NK 1.1+ – клеток достоверно воз-
растало, а относительное содержание CD8+-клеток
снижалось в деконсервированных образцах лейко-
концентрата по сравнению с нативными клеточ-
ными суспензиями (таблица).
Количество стволовых кроветворных клеток
лейкоконцентрата после криоконсервирования не
изменялось.
При использовании меченых антител на мемб-
ране большинства лимфоцитов после криоконсер-
вирования флюоресцентная метка определялась на
одном из полюсов клетки по типу “сap formation”,
в то время как на нативных клетках она распреде-
лялась равномерно по всей клеточной мембране.
После криоконсервирования ЛККЧ достоверно
уменьшались количество фагоцитирующих клеток
и относительное количество фагоцитов на стадии
поглощения по сравнению с их содержанием в на-
тивном образце. Относительное количество клеток
на стадии аттракции после криоконсервирования
достоверно увеличивалось (рис. 2).
esterase (NE) and acid phosphatase (AP) responded
to the substrate positively [20]. Herewith AP activity
correlated with formation of small blue granules, and
NE activity – with dark violet granules.
The data obtained were processed by the Student
test with the Fisher correction. The difference signi-
ficance was assessed by the t-test with the significance
level of 5% [1].
Results and discussion
Lymphocytes were predominant cell populations in
native leukoconcentrate suspensions; a few neutrophils,
monocytes and large cells with big hypochromic nuclei
and hypochromic cytoplasm, which belong to non-
differentiated cells, were found. After thawing leuko-
cytes were also predominant in leukoconcentrate cell
composition; the relative quantity of non-differentiated
cells increased significantly; fibroblast-like cells, none
of which was revealed in native leukoconcentrate,
were observed; the relative quantity of neutrophils de-
creased (Fig. 1).
It was established that the relative quantities of
CD4+ and NK 1.1+ cells increased significantly, and
the relative content of CD8+ cells decreased in thawed
samples of leukoconcentrate in comparison with native
cell suspensions (Table).
The quantity of leukoconcentrate hemopoietic stem
cells did not change after cryopreservation.
When labeled antibodies were used, the fluorescent
label was observed on one of the cell poles by “cap
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
�������
������
������
������
�������
�������
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Рис. 1. Клеточный состав ЛККЧ до и после криокон-
сервирования: – ЛККЧ1; – ЛККЧ2; 1 – лимфоциты;
2 – нейтрофилы; 3 – моноциты; 4 – недифференциро-
ванные клетки; 5 – фибробласты; * – достоверные
отличия ЛККЧ2 по сравнению с ЛККЧ1 (Р < 0,05).
Fig. 1. HCBL cell composition before and after cryopreserva-
tion: – HCBL1; – HCBL2; 1 – lymphocytes; 2 – neutro-
phils; 3 – monocytes; 4 – non-differentiated cells; 5 – fibro-
blasts; * – significant difference between HCBL2 and HCBL1
(P < 0.05).
1 2 3 4 5
Ко
ли
че
ст
во
к
ле
то
к,
%
C
el
l q
ua
nt
ity
, %
*
*
*
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
69
Наибольшей фагоцитарной активностью обла-
дали моноциты и нейтрофилы в нативной и криокон-
сервированной суспензиях; недифференцированные
клетки имели слабую фагоцитарную активность.
Также обнаружена активная аттракция стафило-
кокков на мембранах лимфоцитов, однако послед-
ние не обладали способностью поглощать микроб-
ные тела.
Фагоцитарное число в клетках суспензии ЛККЧ2
достоверно снижалось по сравнению с таковым в
клетках суспензии ЛККЧ1.
Относительное количество клеток, положитель-
но реагирующих в НСТ-тесте, и клеток, в лизосо-
мах которых НЭ положительно реагировала на
субстрат, после криоконсервирования достоверно
formation” type on membranes of most of leukocytes
after cryopreservation, whereas it was distributed
uniformly all along cellular membranes of native cells.
After cryopreservation of HCBL the quantity of
phagocyting cells and the relative quantity of pha-
gocytes at consumption stage decreased significantly
in comparison with their numbers in the native samples.
The relative quantity of cells at attraction stage increa-
sed significantly after cryopreservation (Fig. 2).
Monocytes and neutrophils had the highest phago-
cytic activities in native and cryopreserved suspen-
sions; non-differentiated cells had low phagocytic acti-
vity. An active attraction of staphylococci on lympho-
cytes membranes was also observed, though the latter
were unable to consume microbial bodies.
Влияние криоконсервирования на количество популяций, субпопуляций лимфоцитов,
моноцитов и кроветворных клеток ЛККЧ, %
Cryopreservation influence on the quantities of populations, subpopulations of lymphocytes,
monocytes and hemopoietic cells in HCBL, %
Примечание: * – достоверные отличия данных для ЛККЧ2 по сравнению с ЛККЧ1 (Р < 0,05).
Note: * – significant differences between HCBL2 and HCBL1 (P < 0.05).
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������
��������������0
20
40
60
80
100
120
0
1
2
3
4
5
6
Рис. 2. Фагоцитарная активность ядерных клеток и гистохимические показатели фагоцитов ЛККЧ до и после
криоконсервирования: – процент фагоцитирующих клеток; – стадия поглощения; – стадия аттракции;
12
12 –
НСТ-положительные клетки;
123
123
123 – НЭ-положительные клетки;
123
123
123 – КФ-положительные клетки; – количество
микробов, поглощенных клеткой; * – достоверные различия по сравнению с ЛККЧ1 (Р < 0,05)
Fig. 2. Phagocytic activity of nucleated cells and histochemical indices of HCBL phagocytes before and after
cryopreservation: 1 – HCBL1; 2 – HCBL2. – percentage of phagocyting cells; – consumption stage; – attraction
stage;
123
123
123 – NBT-positive cells;
12
12
12 – NE-positive cells;
12
12
12 – AP-positive cells; – quantity of microbes consumed by one
cell; * – significant difference in comparison with HCBL1 (P < 0.05).
ЛККЧ1 HCBL1
Ко
ли
че
ст
во
к
ле
то
к,
%
C
el
l q
ua
nt
ity
, %
С
ре
дн
ее
к
ол
ич
ес
тв
о
по
гл
ощ
ен
ны
х
м
ик
ро
бн
ы
х
те
л
M
ea
n
qu
an
tit
y
of
c
on
su
m
ed
m
ic
ro
bi
al
bo
di
es*
*
* *
*
ЛККЧ2 HCBL2
ТАМссалК
BAM
3DС +
Т- иктелк
sllecT
4DС +
Т- ыреплех
sreplehT
DС
8
+
Т- ыроссерпус
srosserppusT
41DС +
ытицоном
setyconom
91DC +
В- иктелк
sllecB
43DС +
еыволовтс
иктелк
sllecmets
1.1KN +-
иктелк
1.1KN + sllec
ЧККЛ
1
LBCH
1
50,0±6,71 70,0±5,21 40,0±8,52 80,0±8,11 31,0±8,01 50,0±9,3 40,0±6,3
ЧККЛ
2
LBCH
2
80,0±5,61 90,0±0,91 * 01,0±0,71 * 11,0±5,31 51,0±5,31 20,0±5,4 90,0±9,6 *
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
70
снижалось, а относительное количество клеток, в
лизосомах которых КФ положительно реагировала
на субстрат, не изменялось.
Установлено, что криоконсервирование натив-
ного ЛККЧ не изменяло количество ядросодер-
жащих и сохранных клеток в суспензии.
Показано, что после криоконсервирования в
цитограмме ЛККЧ увеличивалось процентное со-
держание недифференцированных клеток, а также
обнаруживались фибробластоподобные клетки,
что можно объяснить как количественным пере-
распределением клеточных популяций, так и сни-
жением адгезивной активности фибробластопо-
добных клеток, которые после криоконсервиро-
вания находятся преимущественно во взвешенном
состоянии.
С помощью моноклональных антител показано,
что различные популяции лейкоцитов и субпопу-
ляции лимфоцитов обладали разной криоустой-
чивостью. Криоустойчивы были стволовые кровет-
ворные клетки, Т-хелперы, В-клетки, моноциты и
NK-клетки, а Т-супрессоры – криолабильны.
Установлено, что под влиянием криоконсерви-
рования изменялась топография распределения
маркерных белков и белковых комплексов мемб-
ран клеток ЛККЧ, о чем свидетельствует однопо-
люсное распределение люминесцентной метки при
определении популяций и субпопуляций лимфоцитов
с помощью моноклональных антител [4], а также
снижение поглотительной активности фагоцитов.
Выявлено, что структуры, определяющие бак-
терицидные свойства фагоцитов ЛККЧ и выяв-
ляемые в НСТ-тесте, а также системы, участвую-
щие в синтезе неспецифической эстеразы, крио-
лабильны. Системы, обеспечивающие продукцию
КФ в клетках ЛККЧ, оказались криоустойчивыми.
Это можно объяснить тем, что высокая активность
КФ обнаруживается у лимфоцитов и моноцитов
[14], а их относительное количество после криокон-
сервирования лейкоконцентрата не изменяется.
Возможно, предложенный способ криоконсерви-
рования ЛККЧ оптимален для сохранения в клет-
ках КФ.
Выводы
Установлена сохранность функциональных
свойств компонентов ЛККЧ при использовании
предложенного способа его получения и криокон-
сервирования.
Влияние криоконсервирования на свойства мемб-
ран более дифференцированных кроветворных
предшественников зрелых клеточных типов, про-
центное содержание которых в цитограмме ЛККЧ
уменьшалось после криоконсервирования, прояв-
лялось в изменении топографии распределения
маркерных белков и белковых комплексов мемб-
ран этих клеток, а также в снижении поглотительной
The phagocytic number in HCBL2 cells decreased
significantly in comparison with that in HCBL1.
After cryopreservation the relative quantities of
cells reacting positively in NBTR-test and cells, in
lisosomes of which NE responded positively to the
substrate, decreased significantly; and the relative
quantity of cells, in lisosomes of which AP responded
positively to the substrate, did not change.
Cryopreservation of native HCBL was not establi-
shed to change the quantities of nuclear and safe cells
in suspension.
The percentage of non-differentiated cells in HCBL
cytograms was shown to increase after cryopreser-
vation, besides fibroblast-like cells were found, which
can be explained both by a quantitative redistribution
of cell populations and by a reduction in adhesive
activity of fibroblast-like cells, which are mainly in a
suspended state after cryopreservation.
Using monoclonal antibodies we showed that
leukocyte different populations and lymphocyte subpo-
pulations differed by their cryolability. Hemopoietic
stem cells, T-helpers, B-cells, monocytes and NK-cells
were cryotolerant, and T-suppressers were cryolabile.
The topography of marker protein distribution and
HCBL cell membrane protein complexes was disco-
vered to change under the influence of cryopreser-
vation, which is confirmed by unipole distribution of
the luminescent label, when lymphocyte populations
and subpopulations were determined with monoclonal
antibodies [4], as well as by a decline in phagocyte
consumption activity.
Structures determining bactericide properties of
HCBL phagocytes and revealed by the NBTR-test as
well as systems participating in non-specific esterase
synthesis were established to be cryolabile. Systems
providing AP production in HCBL turned out to be
cryotolerant. This can be explained by the fact that
AP high activity is observed in lymphocytes and
monocytes [14], and their relative quantity does not
change after cryopreservation. The method suggested
for cryopreservation of HCBL is likely to be optimal
for maintenance of AP in cells.
Conclusions
Integrity of functional properties of HCBL compo-
nents was proved when the suggested method for its
obtaining and cryopreservation being used.
The influence of cryopreservation on membrane
properties of more differentiated hemopoietic precur-
sors of mature cells, percentage of which decreased
in HCBL cytogram after cryopreservation, was mani-
fested through topographic changes of marker protein
distribution and HCBL cell membrane protein comp-
lexes of these cells as well as through a reduction in
phagocyte consumption activity. This conditioned the
correlation between phenotypic marker expression
changes and functional state of these cells.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
71
References
Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1980.–
293 p.
Lebedev K.A., Ponyakina I.D. Immunogram in clinical
practice.– Moscow: Nauka, 1990.– 224 p.
Filatov A.V., Bagurin P.S., Markova N.A. et al. Investigation
of human lymphocyte subpopulation composition with a
monoclonal antibody panel // Gistologiya i Transfusiologiya.–
1990.– N1.– P. 16–19.
Tsutsayeva A.A., Goltsev A.N., Popov N.N. et al. Cryoimmu-
nology.– Kiev: Naukova dumka, 1988.– 176 p.
Tsutsayeva A.O., Grischenko V.I., Kudokotseva O.V., Proko-
pyuk O.S. Procurement, cryopreservation and clinical
application of human cord blood hemopoietic cells: Methodical
recommendations.– Kharkov, 2000.– 16 p.
Patent of Ukraine N31847A, IPC A01N1/02. A method for
cryopreservation of cord blood hemopoietic cells / A.O. Tsut-
sayeva, V.I. Grischenko, O.V. Kudokotseva et al.– Filed in:
11.05.98. Published in: 12.15.2000. Bul. N7.
Adeyemo O., Jeyakumar H. Plasma progesterone, estradiol-
17 beta- and testosterone in maternal and cord blood, and
maternal human chorionic gonadotropin at parturition // Afr. J.
Med. Med. Sci.– 1993.– Vol. 22, N3.– P. 55–60.
Brooks K.J., Lowy C., Thomas C.R. A comparison of the
metabolic profiles of fetal and maternal plasma and placenta
in normal and diabetic rats by 1H magnetic resonance spectro-
scopy // Diabetes Res.– 1994.– Vol. 26, N3.– P. 117–125.
Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangoc G. et al. Human
umbilical cord blood as a potential source of transplantable
hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.– 1989.– Vol. 86, N10.– P. 3828–3832.
Broxmeyer H.E., Kurtzberg J., Gluckman E. et al. Umbilical
cord blood hematopoietic stem and repopulation cells in human
clinical transplantation // Blood Cells.– 1991.– Vol. 17, N2.–
P. 313–329.
Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions
for collection and cryopreservation of umbilical cord hema-
topoietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–
515.
Debieve F., Beerlandt S., Hubinont C., Thomas K. Gona-
dotropins, prolactin, inhibin A, inhibin B, and activin A in human
fetal serum from midpregnancy and term pregnancy // J. Clin.
Endocrinol. Metab.– 2000.– Vol. 85, N1.– P. 270–274.
Gluckman E., Broxmeyer H.E., Auerbach A.D. et al. Hemato-
poietic recostitution in patient with Fanconi’s anemia by means
of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling // New
Engl. J. Med.– 1989.– Vol. 321, N17.– P. 1174–1189.
Harris D.A. Spectrophotometric assays // In: Spectropho-
tometry and spectrofluorimetry: a practical approach / Eds.:
C.L. Bashford, D.A. Harris.– Washington: IRL Press.– 1987.–
P. 49–90.
Ho Y.B., Philips W.D., Cannon W. et al. Prolactin, estradiol,
and thyroid hormones in umbilical cord blood of neonates
with and without hyaline membrane disease: a study of 405
neonates from midpregnancy to term // Am. J. Obstet.
Gynecol.– 1982. – Vol. 142, N6, Pt. 1.– P. 698–703.
Rubinstein P., Roserfield R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.
Stored placental blood for unrelated bone marrow re-
constitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.
Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E. et al. Processing
and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for
unrelated bone marrow reconstitution // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA.– 1995.– Vol. 92, N22.– Р. 10119–10122.
Takser A., Mergler D., de Grosbois S. et al. Blood manganese
content at birth and cord serum prolactin levels// Neurotoxicol.
Teratol.– 2004.– Vol. 26, N6.– P. 811–815.
Urbanitz D., Fechner T., Grob R. Nitroblau-tetrazolium (NBT)
Test bei isolierten menschlichen Monozyten // Blut.– 1975.–
Vol. 30, N3.– P. 187–198.
Литература
Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высш. школа, 1980.– 293 с.
Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клиничес-
кой практике.– М.: Наука, 1990.– 224 с.
Филатов А.В., Багурин П.С., Маркова Н.А. и др. Исследо-
вание субпопуляционного состава лимфоцитов челове-
ка с помощью панели моноклональных антител // Гистоло-
гия и трансфузиология.– 1990.– №1.– С. 16–19.
Цуцаева А.А., Гольцев А.Н., Попов Н.Н. и др. Криоиммуно-
логия.– Киев: Наук. думка, 1988.– 176 с.
Цуцаєва А.О., Грищенко В.І., Кудокоцева О.В., Прокопюк О.С.
Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування гемо-
поетичних клітин кордової крові людини: Метод. реко-
мендації.– Харків, 2000.– 16 с.
Патент №31847А, МПК А01N1/02. Україна. Спосіб
кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові /
А.О. Цуцаєва, В.І. Грищенко, О.В. Кудокоцева та інш. Заяв-
лено 05.11.1998; Опубл. 15.12.2000. Бюл. №7.
Adeyemo O., Jeyakumar H. Plasma progesterone, estradiol-
17 beta- and testosterone in maternal and cord blood, and
maternal human chorionic gonadotropin at parturition // Afr. J.
Med. Med. Sci.– 1993.– Vol. 22, N3.– P. 55–60.
Brooks K.J., Lowy C., Thomas C.R. A comparison of the
metabolic profiles of fetal and maternal plasma and placenta
in normal and diabetic rats by 1H magnetic resonance spectro-
scopy // Diabetes Res.– 1994.– Vol. 26, N3.– P. 117–125.
Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangoc G. et al. Human
umbilical cord blood as a potential source of transplantable
hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.– 1989.– Vol. 86, N10.– P. 3828–3832.
Broxmeyer H.E., Kurtzberg J., Gluckman E. et al. Umbilical
cord blood hematopoietic stem and repopulation cells in human
clinical transplantation // Blood Cells.– 1991.– Vol. 17, N2.–
P. 313–329.
Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions
for collection and cryopreservation of umbilical cord hema-
topoietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–
515.
Debieve F., Beerlandt S., Hubinont C., Thomas K. Gona-
dotropins, prolactin, inhibin A, inhibin B, and activin A in human
fetal serum from midpregnancy and term pregnancy // J. Clin.
Endocrinol. Metab.– 2000.– Vol. 85, N1.– P. 270–274.
Gluckman E., Broxmeyer H.E., Auerbach A.D. et al. Hemato-
poietic recostitution in patient with Fanconi’s anemia by means
of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling // New
Engl. J. Med.– 1989.– Vol. 321, N17.– P. 1174–1189.
Harris D.A. Spectrophotometric assays // In: Spectropho-
tometry and spectrofluorimetry: a practical approach / Eds.:
C.L. Bashford, D.A. Harris.– Washington: IRL Press.– 1987.–
P. 49–90.
Ho Y.B., Philips W.D., Cannon W. et al. Prolactin, estradiol,
and thyroid hormones in umbilical cord blood of neonates
with and without hyaline membrane disease: a study of 405
neonates from midpregnancy to term // Am. J. Obstet.
Gynecol.– 1982. – Vol. 142, N6, Pt. 1.– P. 698–703.
Rubinstein P., Roserfield R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.
Stored placental blood for unrelated bone marrow re-
constitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.
Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E. et al. Processing
and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for
unrelated bone marrow reconstitution // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA.– 1995.– Vol. 92, N22.– Р. 10119–10122.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
активности фагоцитов. Это обусловило корреляцию
изменения экспрессии фенотипических маркеров
с функциональным состоянием этих клеток.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
72
Takser A., Mergler D., de Grosbois S. et al. Blood manganese
content at birth and cord serum prolactin levels// Neurotoxicol.
Teratol.– 2004.– Vol. 26, N6.– P. 811–815.
Urbanitz D., Fechner T., Grob R. Nitroblau-tetrazolium (NBT)
Test bei isolierten menschlichen Monozyten // Blut.– 1975.–
Vol. 30, N3.– P. 187–198.
Wachstein M.S. Histochemistry of leucocytes // Ann. N. Y.
Acad. Sci.– 1955.– Vol. 59, N5.– P. 1052–1065.
Watt S., Contreras M. Stem cell medicine: umbilical cord blood
and its stem cell potential // Semin. Fetal. Neonat. Med.– 2005.–
Vol. 10, N3.– Р. 209–220.
Поступила 16.02.2010
Рецензент Н.Г. Землянских
Wachstein M.S. Histochemistry of leucocytes // Ann. N. Y.
Acad. Sci.– 1955.– Vol. 59, N5.– P. 1052–1065.
Watt S., Contreras M. Stem cell medicine: umbilical cord blood
and its stem cell potential // Semin. Fetal. Neonat. Med.– 2005.–
Vol. 10, N3.– Р. 209–220.
Accepted in 16.02.2010
18.
19.
20.
21.
20.
21.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №1
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №1
|