Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер
Трехмерное культивирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК), инкапсулированных в альгинатные микросферы,
 является перспективным направлением клеточной биологии и тканевой инженерии, что определяет необходимость разработки
 методов их низкотемпературного консервирования. В раб...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44475 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток
 в составе альгинатных микросфер / А.И. Правдюк, Ю.А. Петренко, В.С. Холодный, В.П. Грищук, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 235-245. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860025115525251072 |
|---|---|
| author | Правдюк, А.И. Петренко, Ю.А. Холодный, В.С. Грищук, В.П. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Правдюк, А.И. Петренко, Ю.А. Холодный, В.С. Грищук, В.П. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток
 в составе альгинатных микросфер / А.И. Правдюк, Ю.А. Петренко, В.С. Холодный, В.П. Грищук, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 235-245. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Трехмерное культивирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК), инкапсулированных в альгинатные микросферы,
является перспективным направлением клеточной биологии и тканевой инженерии, что определяет необходимость разработки
методов их низкотемпературного консервирования. В работе показана возможность криоконсервирования МСК в составе
альгинатных микросфер путем медленного замораживания под защитой ДМСО. Сравнительное изучение МСК в составе
альгинатных микросфер и в виде суспензии одиночных неинкапсулированных клеток при криоконсервировании под защитой
10% ДМСО не выявило существенных различий их криочувствительности, а в присутствии 5% они имели более низкие
показатели жизнеспособности. Значения сохранности и метаболической активности после криоконсервирования МСК в составе
альгинатных микросфер увеличивались при повышении концентрации ДМСО с 5 до 10%. Инициация кристаллизации в ходе
медленного программного замораживания МСК в составе альгинатных микросфер в присутствии 10% ДМСО позволяла
добиться максимальных значений сохранности и метаболической активности инкапсулированных клеток. Результаты работы
могут быть использованы для создания банка МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы.
Тривимірне культивування мезенхімальних стромальних клітин (МСК), які інкапсульовані у альгінатні мікросфери, є
перспективним напрямком клітинної біології та тканинної інженерії, що визначає необхідність розробки методів їхнього
низькотемпературного консервування. У роботі показана можливість кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер
шляхом повільного заморожування під захистом ДМСО. Порівняльне вивчення МСК у складі альгінатних мікросфер і у
вигляді суспензії поодиноких неінкапсульованих клітин при кріоконсервуванні під захистом 10% ДМСО не виявило значних
розбіжностей їх кріочутливості, а у присутності 5% ДМСО вони мали більш низькі показники життєздатності. Показники
збереженості і метаболічної активності після кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер збільшувались при
підвищенні концентрації ДМСО з 5 до 10%. Ініціація кристалізації при повільному програмному заморожуванні МСК у
складі альгінатних мікросфер у присутності 10% ДМСО дозволила отримати максимальні показники збереженості і метаболічної
активності інкапсульованих клітин. Результати роботи можуть бути використані для створення банку МСК, які інкапсульовані
у альгінатні мікросфери.
Three-dimensional culture of mesenchymal stromal cells (MSC), encapsulated in alginate microbeads is a perspective direction of
cell biology and tissue engineering, indicating the need of the development of their low temperature preservation methods. The study
describes the possibility of cryopreservation of MSC within alginate microbeads by slow cooling under protection of DMSO.
Comparison study of MSC within alginate microbeads and as non-encapsulated cell suspension during cryopreservation under
protection of 10% DMSO did not show significant differences in cells’ cryosensitivity, while during cryopreservation with 5%
DMSO encapsulated MSC had lower viability values. Survival and metabolic activity of MSC after cryopreservation within alginate
microbeads depended on DMSO concentration in cryoprotective medium and rised with increase of DMSO concentration from 5% to
10%. Initiation of crystallization during slow program cooling under protection of 10% DMSO allowed to achieve maximal values of
survival and metabolic activity of encapsulated cells. The results of this study could be used for the banking of MSC encapsulated into
alginate microbeads.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:49:13Z |
| format | Article |
| fulltext |
235
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-30-34, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
pravduke@yandex.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3034, fax: +380 57 373 3084, e-mail: pravduke@yandex.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
УДК 576.371:612.419:57.085.23:57.043
А.И. ПРАВДЮК*, Ю.А. ПЕТРЕНКО, В.С. ХОЛОДНЫЙ, В.П. ГРИЩУК, А.Ю. ПЕТРЕНКО
Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток
в составе альгинатных микросфер
UDC 576.371:612.419:57.085.23:57.043
A.I. PRAVDYUK*, YU.A. PETRENKO, V.S. KHOLODNYY, V.P. GRISCHUK, A.YU. PETRENKO
Cryosensitivity of Mesenchymal Stromal Cells
Encapsulated in Alginate Microbeads
Трехмерное культивирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК), инкапсулированных в альгинатные микросферы,
является перспективным направлением клеточной биологии и тканевой инженерии, что определяет необходимость разработки
методов их низкотемпературного консервирования. В работе показана возможность криоконсервирования МСК в составе
альгинатных микросфер путем медленного замораживания под защитой ДМСО. Сравнительное изучение МСК в составе
альгинатных микросфер и в виде суспензии одиночных неинкапсулированных клеток при криоконсервировании под защитой
10% ДМСО не выявило существенных различий их криочувствительности, а в присутствии 5% они имели более низкие
показатели жизнеспособности. Значения сохранности и метаболической активности после криоконсервирования МСК в составе
альгинатных микросфер увеличивались при повышении концентрации ДМСО с 5 до 10%. Инициация кристаллизации в ходе
медленного программного замораживания МСК в составе альгинатных микросфер в присутствии 10% ДМСО позволяла
добиться максимальных значений сохранности и метаболической активности инкапсулированных клеток. Результаты работы
могут быть использованы для создания банка МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы.
Ключевые слова: альгинатные микросферы, мезенхимальные стромальные клетки, инкапсуляция, криоконсервирование.
Тривимірне культивування мезенхімальних стромальних клітин (МСК), які інкапсульовані у альгінатні мікросфери, є
перспективним напрямком клітинної біології та тканинної інженерії, що визначає необхідність розробки методів їхнього
низькотемпературного консервування. У роботі показана можливість кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер
шляхом повільного заморожування під захистом ДМСО. Порівняльне вивчення МСК у складі альгінатних мікросфер і у
вигляді суспензії поодиноких неінкапсульованих клітин при кріоконсервуванні під захистом 10% ДМСО не виявило значних
розбіжностей їх кріочутливості, а у присутності 5% ДМСО вони мали більш низькі показники життєздатності. Показники
збереженості і метаболічної активності після кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер збільшувались при
підвищенні концентрації ДМСО з 5 до 10%. Ініціація кристалізації при повільному програмному заморожуванні МСК у
складі альгінатних мікросфер у присутності 10% ДМСО дозволила отримати максимальні показники збереженості і метаболічної
активності інкапсульованих клітин. Результати роботи можуть бути використані для створення банку МСК, які інкапсульовані
у альгінатні мікросфери.
Ключові слова: альгінатні мікросфери, мезенхімальні стромальні клітини, інкапсуляція, кріоконсервування.
Three-dimensional culture of mesenchymal stromal cells (MSC), encapsulated in alginate microbeads is a perspective direction of
cell biology and tissue engineering, indicating the need of the development of their low temperature preservation methods. The study
describes the possibility of cryopreservation of MSC within alginate microbeads by slow cooling under protection of DMSO.
Comparison study of MSC within alginate microbeads and as non-encapsulated cell suspension during cryopreservation under
protection of 10% DMSO did not show significant differences in cells’ cryosensitivity, while during cryopreservation with 5%
DMSO encapsulated MSC had lower viability values. Survival and metabolic activity of MSC after cryopreservation within alginate
microbeads depended on DMSO concentration in cryoprotective medium and rised with increase of DMSO concentration from 5% to
10%. Initiation of crystallization during slow program cooling under protection of 10% DMSO allowed to achieve maximal values of
survival and metabolic activity of encapsulated cells. The results of this study could be used for the banking of MSC encapsulated into
alginate microbeads.
Key words: alginate microbeads, mesenchymal stromal cells, encapsulation, cryopreservation.
Mesenchymal stromal cells (MSC) have unique
capacity to self-renewal and multilineage differentia-
tion into cells of bone, cartilage, muscle, fat and other
tissues in vivo and in vitro [2, 7, 19]. They have a
high proliferative potential, adhere well to cultural
plastic, and demonstrate fibroblast-like morphology
when culturing in monolayer. These properties make
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Мезенхимальные стромальные клетки (МСК)
обладают уникальной способностью к самообнов-
лению и мультилинейной дифференцировке в
клетки костной, хрящевой, мышечной, жировой и
других тканей in vivo и in vitro [2, 7, 19]. Они имеют
высокий пролиферативный потенциал, хорошо
адгезируют на культуральный пластик, демон-
236 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
стрируют фибробластоподобную морфологию при
культивировании в монослое. Эти свойства делают
МСК привлекательным объектом для тканевой
инженерии и регенеративной медицины [29].
Монослойное культивирование является класси-
ческим методом изучения клеток животных, в том
числе и МСК. Однако в этой системе ряд условий
отличается от тех, в которых клетки находятся в
организме. Так, в монослое для МСК доступно
только двухмерное пространство, тогда как в ес-
тественных условиях – трехмерное. Альтернатив-
ный подход основан на культивировании клеток в
трехмерном пространстве, что позволяет выявить
такие их свойства, которые не проявляются в
монослое [8, 9]. Это объясняется тем, что форма
клеток определяет их функциональное состояние
и поведение, в том числе способность определен-
ным образом реагировать на сигнальные воздейст-
вия [22]. Например, установлено, что форма МСК –
один из триггеров, определяющих их способность
дифференцироваться в клетки хряща либо гладкой
мускулатуры [10].
Одним из перспективных методов объемного
культивирования является инкапсуляция клеток в
микросферы, состоящие из различных гидрогелей,
среди которых наибольшее распространение полу-
чили альгинатные микросферы (АМС). Благодаря
своей структуре альгинатные гидрогели позво-
ляют диффундировать кислороду, питательным
веществам, сигнальным молекулам, что обеспе-
чивает жизнеспособность и функциональную ак-
тивность инкапсулированных клеток [11]. При этом
альгинатный гель обладает барьерными функция-
ми по отношению к иммуноглобулинам и молеку-
лам с массой свыше 100 кДа. Это позволяет ис-
пользовать данный биоматериал для иммуноизоля-
ции клеток [17]. Кроме того, биоинертность альги-
ната и возможность модификации его структуры
биологически активными молекулами делают его
привлекательным для изучения взаимосвязи меж-
ду адгезией МСК и их способностью к пролифера-
ции и дифференцировке [4, 30]. Существенным пре-
имуществом альгината перед другими биомате-
риалами для инкапсуляции является возможность
его деполимеризации, что позволяет легко извле-
кать инкапсулированные клетки [16, 28].
Благодаря совокупности свойств система
“МСК – альгинатный гидрогель” представляет
большой интерес как для теоретических исследо-
ваний по клеточной биологии, так и для практичес-
кого использования в тканевой инженерии и
регенеративной медицине.
Для изучения свойств МСК, инкапсулированных
в АМС, необходимы создание банка этих культур
и разработка эффективных методов их криоконсер-
вирования.
MSC the attractive object for tissue engineering and
regenerative medicine [29].
Monolayer culture is the classic method to study
animal cells, including MSC. However in this system
several conditions are different from those the cells
are in an organism. For example, monolayer culture
presents only 2D space for MSC, while under natural
conditions the 3D is affordable. Alternative approach
is based on cell culturing in 3D space that enables to
reveal the properties, being not manifested in mono-
layer culture [8, 9]. This comes from the fact that
shape determines cells’ functional state and behavior,
including ability to respond the signals in a certain way
[22]. Among other things, the shape of MSC was
found to trigger their ability to differentiate into carti-
lage or smooth muscle cells [10].
One of the perspective methods of 3D culturing is
cell encapsulation into microbeads, composed of va-
rious hydrogels among which the most widespread
are the alginate microbeads (AMB). Due to their
structure the alginate hydrogels enable oxygen, nut-
rients as well as signal molecules to diffuse, providing
viability and functional activity of the encapsulated
cells [11]. Herewith the alginate gel possesses the
barrier functions in relation to immunoglobulins and
molecules with mass more than 100 kDa. This enables
the use of this biomaterial for cell immune isolation
[17]. Furthermore alginate is bioinert and can be
modified with bioactive molecules that makes it attrac-
tive for study of the interaction between adhesion of
MSC and their capacity to proliferate and differen-
tiate [4, 30]. Alginate’s essential advantage among
other biomaterials for encapsulation is the ability to
depolymerize, enabling to release the encapsulated
cells easily [16, 28].
Due to the sum total of properties the ‘MSC –
alginate hydrogel’ system is of great interest not only
for theoretical researches in cell biology, but also for
practical application in tissue engineering and regene-
rative medicine.
To study the properties of MSC, encapsulated in
AMB it is necessary to bank these cultures and deve-
lop the effective methods of their cryopreservation.
Technologies developed for cell suspension cryo-
preservation might be not applicable for cells encap-
sulated in AMB. Probably this is caused by changes
in the rate of water and cryoprotectants’ distribution
between cells and medium under freeze-thawing con-
ditions. During cryopreservation of cells within AMB
it should be taken into account that the protocols have
to provide both preservation of morphofunctional
properties of cells, and structure integrity of the carrier,
which mechanical damage unavoidably results in a
death of encapsulated cells.
For cryopreservation of MSC the slow freezing in
the presence of dimethyl sulfoxide (DMSO) cryo-
237 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Технологии, разработанные для криоконсерви-
рования клеточных суспензий, могут оказаться не
применимыми для клеток в составе АМС. Воз-
можно, это обусловлено изменением скорости рас-
пределения воды и криопротекторов между клет-
ками, а также средой при замораживании-отогреве.
В процессе криоконсервирования клеток в составе
АМС необходимо учитывать, что протоколы долж-
ны обеспечивать не только сохранение морфо-
функциональных свойств клеток, но и структурную
целостность носителя, механическое повреждение
которого неизбежно приводит к гибели инкапсули-
рованных в них клеток.
Для криоконсервирования МСК обычно приме-
няют медленное замораживание в присутствии
криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) в
концентрациях 5–10% [12, 18, 20, 31]. Однако во-
прос об эффективности такого протокола для крио-
консервирования МСК в составе АМС остается
малоизученным. Кроме того, показано, что альги-
натный гидрогель обладает криозащитными свой-
ствами при быстром замораживании инкапсулиро-
ванных гепатоцитов [5, 15]. В связи с этим также
представляет интерес изучение криочувствитель-
ности МСК в составе АМС при использовании
высоких скоростей замораживания.
Цель работы – сравнительное изучение влияния
быстрого и медленного замораживания под защи-
той ДМСО на сохранность и метаболическую
активность МСК, инкапсулированных в АМС, и в
виде суспензии одиночных клеток.
Материалы и методы
В работе использовали МСК, выделенные из
мезодермально-мезенхимальных тканей плодов
человека по [1], после экспансии в селективной
среде в течение 6–8 пассажей.
Клетки культивировали в монослое в культу-
ральных сосудах с площадью поверхности 25 см2
(“Nunc”, США) в среде α-MEM (“Sigma”, США),
дополненной 15% эмбриональной сыворотки (ЭС)
крупного рогатого скота (“Биолот”, Россия), 100 ед.
пенициллина, 100 мкг стрептомицина, при 37°С и
95%-й влажности в атмосфере с 5% СО2.
При достижении 60–70% конфлуента клетки
снимали с субстрата при помощи смеси трипсин-
версена (1:4) по стандартной методике [24] и
пересевали с коэффициентом 1:2. Питательную
среду меняли каждые 3-е суток.
Перед инкапсуляцией клетки снимали, как опи-
сано выше, осаждали путем центрифугирования
при 700 об/мин в течение 5 мин, промывали средой
с 0,15 М NaCl и 25 мМ HEPES (рН 7,4) и ресуспен-
дировали в 1,2%-м растворе альгината натрия.
Полученную суспензию с концентрацией 1,2–
1,6×106 клеток/мл помещали в стерильный шприц
protectant in 5–10% concentration is usually applied
[12, 18, 20, 31]. However the question whether this
protocol is effective enough to cryopreserve the MSC
within AMB remains open. In addition it has been
shown that alginate hydrogel has cryoprotective
properties during rapid freezing of encapsulated
hepatocytes [5, 15]. That is why the cryosensitivity
of MSC within AMB during application of high
freezing rates is also of interest.
The research aim is to study the effect of rapid
and slow freezing under DMSO protection on viability
and metabolic activity of MSC, encapsulated in AMB
as well as in the form of single cell suspension.
Materials and methods
For this study the MSC were isolated from meso-
dermal-mesenchymal tissues of human fetuses as
reported previously [1] and expanded in selective
medium during 6–8 passages.
The cells were cultured in monolayer in culture
tubes (Nunc) with 25 cm2 surface in α-MEM (Sigma)
medium, enriched with 15% fetal bovine serum (FS,
Biolot), 100 IU of penicillin, 100 mg of streptomycin,
at 37°C and 95% humidity in 5% CO2 atmosphere.
When reaching the 60–70% confluent the cells
were detached from the substrate by trypsin-versene
mixture (1:4) according to the standard method [24]
and replated in 1:2 ratio. The nutrient medium was
changed each 3rd day.
Prior to encapsulation the cells were detached, as
described above, sedimented at 700 rpm for 5 min,
washed by medium with 0.15 M NaCl and 25 mM
HEPES (pH 7,4) and resuspended in 1.2% sodium
alginate solution. The obtained suspension in concent-
ration 1.2–1.6×106 cells/ml was placed into sterile
2 ml syringe and sprayed with specially designed
nozzle into the solution, containing 100 mM CaCl2.
Alginate microbeads with cells were kept in CaCl2
for 10 min for polymerization, and then stepwise
washed from excessive calcium ions by the medium
with 0.15 M NaCl and 25 mM HEPES. The described
method enabled to obtain microbeads with the dimen-
sions of 500 to 1,000 µm.
Cryoprotective medium consisted of medium 199
with 10% FS and DMSO of 5 or 10% final concent-
rations. The medium, containing double concentration
of DMSO and FS was slowly dropwise added into
the equal volume of culture medium with MSC, and
after 15 min equilibration at 4°C the samples were
frozen in 1 ml cryotubes (Corning). The freezing was
carried out by three regimens: 1 – one step rapid
freezing by direct plunging into liquid nitrogen; 2 –
two step slow freezing with 1°C/min rate down to
–80°C with further plunging into liquid nitrogen; 3 –
three step slow freezing with 1°C/min rate from 0
down to –40°C with initiation of crystallization at
238 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
объемом 2 мл и с помощью специально сконструи-
рованной насадки распыляли в раствор, содержа-
щий 100 мМ CaCl2. Альгинатные микросферы с
клетками оставляли в растворе CaCl2 на 10 мин
для полимеризации, после чего проводили ступен-
чатую отмывку от избытка ионов кальция раст-
вором 0,15 М NaCl и 25 мМ HEPES. Описанный
способ позволял получать микросферы с раз-
мерами в диапазоне 500–1000 мкм.
В качестве криозащитной среды использовали
среду 199 с 10% ЭС и ДМСО в конечной кон-
центрации 5 или 10%. Cреду, содержащую двойную
концентрацию ДМСО и ЭС, медленно по каплям
добавляли в равный объем культуральной среды,
содержащей МСК, и после эквилибрации в течение
15 мин при температуре 4°С замораживали в
криопробирках (“Corning”, США) объемом 1 мл.
Замораживание проводили по трем режимам:
режим 1 – быстрое одноэтапное замораживание
путем прямого погружения в жидкий азот; ре-
жим 2 – медленное двухэтапное замораживание со
скоростью 1 С°/мин до –80°С с последующим
погружением в жидкий азот; режим 3 – медленное
трехэтапное замораживание со скоростью 1°С/мин
от 0 до –40°С с инициацией кристаллизации при
–6,3°С, затем со скоростью 10°С/мин от –40 до
–80°С с последующим погружением в жидкий азот.
Образцы хранили при –196°С, отогревали на
водяной бане при 37°С. Криопротектор удаляли
медленным разведением деконсервированной
суспензии средой 199 с 10% ЭС в соотношении
1:10, затем центрифугировали при 200 g в течение
10 мин.
Жизнеспособность клеток оценивали с помо-
щью комбинированного окрашивания флуоресцент-
ными красителями флуоресцеин диацетатом
(ФДА) и этидиум бромидом (ЭБ) [6]. Включение
флуоресцентного красителя в клетки (в составе
АМС и суспензии) определяли с помощью инвер-
тированного конфокального лазерного сканирую-
щего микроскопа LSM 510 META (Carl Zeiss,
Германия) и программного обеспечения LSM 510
ver. 4.2 (Carl Zeiss, Германия). Изображения полу-
чали при длине волны возбуждения 488 нм
(аргоновый лазер, рабочая мощность 5,4 мВт) с
использованием объектива ЕС Plan Neofluar ×10 и
фильтра HFT 405/488/543/633 в трех каналах: в
первом регистрировали эмиссию в диапазоне 508–
550 нм, во втором – эмиссию в диапазоне 593–
646 нм, в третьем – видимое изображение в прохо-
дящем свете. Величина лазерной апертуры (pinho-
le) составляла 150 нм. Конфокальные изображения
АМС с шагом по оси z получали с интервалом
10 мкм. Для подсчета количества окрашенных
клеток строили с помощью программного обеспе-
чения LSM 510 ver. 4.2 трехмерные проекции и
–6.3°C, then with 10°C/min rate from –40 down to
–80°C with further plunging into liquid nitrogen.
The samples were stored at –196°C, thawed in
water bath at 37°C. Cryoprotectant was removed by
slow dilution of frozen-thawed suspension with me-
dium 199 contained 10% FS in the 1:10 ratio, then
centrifuged at 200 g for 10 min.
Cell viability was estimated by combined staining
by fluorescent dyes, fluorescein diacetate (FDA) and
etidium bromide (EB) [6]. Inclusion of fluorescent dye
into cells (within AMB and in suspension) was inves-
tigated by inverted confocal laser scanning micro-
scope LSM 510 META (Carl Zeiss, Germany) and
LSM 510 ver. 4.2 (Carl Zeiss, Germany) software.
Images were obtained at excitation wave length of
488 nm (argon laser, operating power 5.4 mW) with
EC Plan Neofluar ×10 objective and HFT 405/488/
543/633 filter in three channels: in the first one the
emission within the range of 508–550 nm was
detected; the emission within the range of 593–646 nm
in the second channel and in the third one the
transmitted light image was recorded. The pinhole was
150 nm. The z stacks of confocal images of AMB
were obtained with 10 µm step. 3D rendering and
sum projections of all obtained layers along the z axis
were obtained by LSM 510 ver. 4.2 (Carl Zeiss,
Germany) software and used to calculate the quantity
of stained cells.
The Alamar blue (AB) test was used to estimate
the metabolic and proliferative activity in MSC [25].
Cells in single cell suspension or within the alginate
microbeads were cultured in the medium, containing
10% of redox indicator AB (Serotec) for 12 hrs in 24
well plates (Nunc). Thereafter the fluorescence inten-
sity of reduced redox-indicator in culturing medium
was measured using Tecan plate spectrophotofluoro-
meter. Background was the cell free medium with in-
dicator. The reduction level of AB (X) was expressed
in relative fluorescence units (RFU) and estimated
by the formula:
X = (cell fluorescence – background fluore-
scence) / background fluorescence.
The two-tailed t-test was used to analyse the diffe-
rences in indices of viability and metabolic activity
between various experimental groups.
Results and discussion
At the first stage of the research the MSC within
alginate microbeads, as well as non-encapsulated cell
suspension were cryopreserved using the one-step
rapid freezing (regimen 1) in the presence of 10%
DMSO. Viability of encapsulated MSC before frezing
comprized 90 ± 3% (Fig. 1, a). Viability of cells in
microspheres (Fig.1, b) and in suspension after thaw-
ing, evaluated by FDA/EB staining was 6 ± 2 and 3 ±
2%, correspondingly. After further 12 hrs culturing
239 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
плоские проекции всех полученных слоев вдоль
оси z.
Для оценки активности пролиферативно-
метаболических процессов в МСК применяли тест
Alamar blue (AB) [25]. Клетки в виде суспензии и
в составе альгинатных микросфер культивировали
в течение 12 ч в среде, содержащей 10% раствора
редокс-индикатора AB (“Serotec”, Великобри-
тания) в 24-луночном планшете (“Nunc”, США).
После чего измеряли интенсивность флуорес-
ценции восстановленной формы редокс-индикатора
в среде культивирования на планшетном спектро-
фотофлуориметре “Tecan” (Австрия). Фоном слу-
жила среда с индикатором без клеток. Степень
восстановленности АВ (Х) выражали в относи-
тельных единицах флуоресценции (ОЕФ) и опре-
деляли по формуле:
Х = (значение флуоресценции клеток –
значение флуоресценции фона) / значение
флуоресценции фона.
Для анализа различий показателей сохранности
и метаболической активности между различными
экспериментальными группами использовали
двухвыборочный t-тест.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы МСК в составе
альгинатных микросфер, а также в виде суспензии
одиночных клеток криоконсервировали с использо-
ванием быстрого одноэтапного замораживания
(режим 1) в присутствии 10%-го ДМСО. Жизнеспо-
собность инкапсулированных МСК перед замора-
живанием составляла 90 ± 3% (рис. 1, а). Жизнеспо-
собность клеток в микросферах (рис. 1, б) и суспен-
зии после отогрева, оцененная по окрашиванию
ФДА/ЭБ, составила 6 ± 2 и 3 ± 2% соответственно.
После последующего 12-часового культивирования
инкапсулированных клеток с AB значения флуорес-
ценции редокс-индикатора достоверно не отлича-
лись от фона, что подтверждало гибель клеток.
При микроскопии отогретых микросфер выявили,
что гель микросфер приобрел мелкоячеистую
структуру и в результате утратил прозрачность.
Очевидно, структура альгинатного гидрогеля нару-
шается вследствие образования и роста в нем
кристаллов льда.
Описанные результаты свидетельствуют о том,
что использование быстрого замораживания даже
в присутствии 10%-го ДМСО вызывает гибель
практически всех МСК как в составе АМС, так и
в виде суспензии одиночных клеток. Показано [15],
что альгинатный гидрогель обладает криозащит-
ными свойствами при быстром замораживании
инкапсулированных гепатоцитов. Результаты на-
стоящей работы свидетельствуют о том, что при
быстром замораживании криозащитный эффект не
of encapsulated cells with AB the values of redox-
indicator fluorescence did not significantly differ from
the background, that confirmed the cell death. The
microscopy of thawed microbeads showed that the
gel gained a fine sponged structure and as result lost
the transparency. Obviously, the structure of alginate
hydrogel was affected due to the formation and
growth of ice crystals inside.
The described results testify to that fact that ap-
plication of rapid freezing even in the presence of 10%
DMSO leads to the death of almost all MSC, both
within AMB, or in the non-encapsulated cell sus-
pension. It has been shown recently [15] that alginate
hydrogel has cryoprotective properties during rapid
freezing of encapsulated hepatocytes. The results of
present work indicate that no cryoprotective effect
was manifested during rapid freezing, and changed
AMB structure can additionally affect the cells. Fur-
ther increase of DMSO concentration and exposure
time, would obviously not prevent MSC death, since
it was shown [13] that rapid freezing in presence of
32% DMSO and icreased duration of exposure with
cryoprotectant up to 30 min led to similar reduction of
viability of encapsulated cells of African green mon-
key kidneys.
In several studies dealing with cryopreservation
of different cell types within alginate microbeads using
slow cooling rates [3, 14, 23] DMSO was applied in
concentration of 5 to 20%. Considering that DMSO
has a toxic effect on the cells in concentrations above
12% [21, 27] it is necessary to use the lower concen-
tration.
In this respect at the next stage of the study the
MSC in non-encapsulated suspension and within the
microbeads were frozen by slow cooling (regimen 2)
with 1°C/min rate in the presence of 5 and 10%
DMSO.
Viability of encapsulated MSC before freezing was
90 ± 3% (Fig.1, a). Freeze-thawing of cells within
microbeads in presence of 5 and 10% DMSO accor-
ding to the 2nd regimen decreased the viability down
to 61 ± 4 and 79 ± 3%, correspondingly (Fig.1, c, d;
Fig. 2). Freeze-thawing of non-encapsulated cells was
performed in the same conditions. Viability of non-
encapsulated cells before freeze-thawing was 93 ±
3, and thereafter decreased to 73 ± 5 and 84 ± 2% in
the presence of 5 and 10% DMSO, correspondingly
(Fig. 2).
The viability of non-encapsulated cell suspension
after freeze-thawing in presence of 5% DMSO was
significantly higher than of MSC within alginate
microbeads. When increasing DMSO concentration
up to 10% the viability of cells after freeze-thawing
as suspension and within AMB did not differ and was
significantly higher than that in the presence of 5%
DMSO.
240 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Рис 1. МСК в составе альгинатных микросфер, окрашенные ФДА/ЭБ: а – до замора-
живания; б – после криоконсервирования по режиму 1 с 10% ДМСО; в – после крио-
консервирования по режиму 2 с 5% ДМСО; г – после криоконсервирования по
режиму 2 с 10% ДМСО; д – после криоконсервирования по режиму 3 с 10% ДМСО.
Конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, каждое изображение получено
суммированием конфокальных изображений вдоль оси z.
Fig. 1. MSCs within alginate microbeads, stained with FDA/EB, confocal scanning laser
microscopy: prior to freezing (a), after cryopreservation according to the 1st regimen with
10% DMSO (b), according to the 2nd regimen with 5% DMSO (c), according to the 2nd
regimen with 10% DMSO (d), according to the 3rd regimen with 10% DMSO (e). Confocal
scanning laser microscopy, the images are the projection of confocal planes along the z
axis.
а a б b в c г d
д e
проявляется, а нарушение структуры АМС может
оказывать дополнительное повреждающее дейст-
вие на клетки. Последующее увеличение концент-
рации ДМСО и времени экспозиции с ним клеток,
очевидно, не предотвратит гибель МСК, поскольку
ранее наблюдали [13] сходное с полученным в
нашей работе снижение жизнеспособности инкап-
сулированных клеток почек африканской зеленой
мартышки при быстром замораживании под
защитой 32%-го ДМСО и увеличении времени
экспозиции с криопротектором до 30 мин.
В немногочисленных исследованиях, посвящен-
ных криоконсервированию различных типов клеток
в составе альгинатных микросфер при медленных
скоростях охлаждения [3, 14, 23], применяли ДМСО
в концентрации от 5 до 20%. Учитывая, что ДМСО
обладает токсическим действием на клетки, кото-
рое проявляется при концентрации выше 12% [21,
27], целесообразно использовать концентрацию
ниже этих значений.
В связи с этим на следующем этапе работы
МСК в суспензии и микросферах криоконсерви-
ровали с применением медленного замораживания
(режим 2) со скоростью 1°С/мин в присутствии 5
и 10%-го ДМСО.
Жизнеспособность инкапсулированных МСК до
замораживания составляла 90 ± 3% (рис. 1, а), а
после замораживания-отогрева в присутствии 5 и
10% ДМСО по режиму 2 – 61 ± 4 и 79 ± 3% соответ-
ственно (рис. 1, в, г; рис. 2). Одновременно в тех
же условиях замораживали суспензию МСК,
неинкапсулированных в АМС. Жизнеспособность
неинкапсулированных клеток до замораживания
составляла 93 ± 3, а после замораживания-отогрева
Encapsulated MSC reduced AB to the value of
2.27 ± 0.17 RFU prior to freeze-thawing. After free-
ze-thawing in the presence of 5 and 10% DMSO this
value decreased down to 0.83 ± 0.10 and 1.44 ± 0.18
of RFU, accordingly (Fig. 3).
In the same conditions the non-encapsulated MSC
suspension reduced AB to the value of 2.45 ± 0.04 RFU
prior to freezing, and to 1.37 ± 0.07 and 1.54 ± 0.03
after freezing in the presence of 5 and 10% DMSO,
correspondingly.
Thus, the ability of encapsulated cells to reduce
AB after freeze-thawing in the presence of 5%
DMSO was significantly lower than that of non-
encapsulated MSC. However in the presence of 10%
DMSO the AB reduction levels for AMB encap-
sulated and non-encapsulated cells after freeze-
thawing not differ from each other and were signifi-
cantly higher than in the case of application of 5%
DMSO. Generally the changes in AB reduction level
and viability of MSC both within AMB and in non-
encapsulated suspension after freeze-thawing in the
presence of 5 and 10% DMSO were similar, though
the changes, found with AB test were more significant
that testify to a higher sensitivity of the metabolic
test.
The results obtained at this stage testify that slow
freezing in the presence of 5% DMSO affect MSC
within AMB more significantly than the cells in non-
encapsulated suspension. These differences in cryo-
sensitivity disappear when using DMSO in 10% con-
centration, and the viability of frozen-thawed MSC in
both groups significantly increased. Therefore in
further experiments the 10% DMSO concentration
was used.
241 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
в присутствии 5 и 10%-го ДМСО – 73 ± 5 и 84 ±
2% соответственно (рис. 2).
Значение жизнеспособности суспензии неинкап-
сулированных клеток после замораживания-
отогрева под защитой 5%-го ДМСО была досто-
верно выше, чем МСК в составе альгинатных
микросфер. При увеличении концентрации ДМСО
до 10% жизнеспособность клеток после замора-
живания-отогрева в виде суспензии и в составе
АМС не отличалась и была значительно выше,
чем в присутствии 5%-го ДМСО.
До замораживания инкапсулированные МСК
восстанавливали AB до значения 2,27 ± 0,17 ОЕФ.
После замораживания-отогрева в присутствии 5 и
10%-го ДМСО этот показатель снижался до 0,83 ±
0,10 и 1,44 ± 0,18 ОЕФ соответственно (рис. 3).
Одновременно с этим МСК в форме суспензии
одиночных клеток до замораживания восстанавли-
вали AB до значения 2,45 ± 0,04, а после заморажи-
вания-отогрева в присутствии 5 и 10%-го ДМСО
соответственно до 1,37 ± 0,07 и 1,54 ± 0,03 ОЕФ.
Таким образом, после замораживания-отогрева
под защитой 5%-го ДМСО способность инкапсули-
рованных клеток восстанавливать AB была досто-
верно ниже, чем у МСК в виде суспензии. Вместе
с тем, после замораживания-отогрева в присутствии
10%-го ДМСО уровни восстановленности редокс-
индикатора для клеток в составе АМС и в виде
суспензии не отличались и были достоверно выше,
чем в группе с 5%-м ДМСО. В целом изменения
степени восстановленности АВ и жизнеспособнос-
ти МСК в АМС и суспензии после замораживания-
отогрева в присутствии 5 и 10%-го ДМСО имели
сходный характер, хотя различия, выявленные с
помощью АВ-теста, были значительнее, что сви-
детельствует о более высокой чувствительности
метаболического теста.
Полученные на данном этапе результаты свиде-
тельствуют, что МСК в составе АМС при медлен-
ном замораживании под защитой 5%-го ДМСО
повреждаются в большей мере, чем клетки в виде
суспензии. Эти различия криочувствительности
исчезают при концентрации ДМСО 10%, в резуль-
тате чего значительно повышается сохранность
криоконсервированных МСК в обеих группах. Поэ-
тому в дальнейших экспериментах использовали
концентрацию ДМСО 10%.
Для минимизации криоповреждений суспензий
клеток успешно применяется программное замора-
живание с инициацией кристаллизации. Возмож-
ность устранения критического переохлаждения
цитоплазмы МСК, инкапсулированных в альгинат-
ные микросферы, путем инициации кристаллизации
при медленном замораживании практически не
изучена. Поэтому в ходе дальнейших эксперимен-
тов инкапсулированные клетки замораживали под
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Контроль
Control
Режим 2
5% ДМСО
Regimen 2
5% DMSO
Режим 2
10% ДМСО
Regimen 2
10% DMSO
Режим 3
10% ДМСО
Regimen 3
10% DMSO
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь,
%
Vi
ab
ilit
y,
%
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Контроль
Control
Режим 2
5% ДМСО
Regimen 2
5% DMSO
Режим 2
10% ДМСО
Regimen 2
10% DMSO
Режим 3
10% ДМСО
Regimen 3
10% DMSO
Рис. 2. Жизнеспособность МСК (%) в составе АМС ( )
и в виде неинкапсулированной суспензии ( ) после
замораживания-отогрева по различным режимам.
Fig. 2. Viability of MSCs (%) within AMBs ( ) and in non-
encapsulated suspension ( ) after freeze-thawing accord-
ing to various regimens.
Рис. 3. Способность МСК в составе АМС ( ) и в виде
неинкапсулированной суспензии ( ) восстанавливать
редокс-индикатор АВ после замораживания-отогрева
по различным режимам. Данные приведены в ОЕФ в
пересчете на 20000 клеток.
Fig. 3. Ability of MSCs encapsulated in AMBs ( ) and in
non-encapsulated suspension ( ) to reduce the AB redox-
indicator after freeze-thawing according to the various regi-
mens. The data are shown in RFU per 20,000 of cells.
С
те
пе
нь
в
ос
ст
ан
ов
ле
нн
ос
ти
А
В,
О
ЕФ
AB
re
du
ct
io
n
ra
te
, R
FU
242 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
защитой 10%-го ДМСО по медленному двухэтап-
ному протоколу (режим 2) или по трехэтапному
режиму с инициацией кристаллизации (режим 3).
Сохранность инкапсулированных МСК после
замораживания-отогрева по режиму 3 достоверно
не отличалась от значений контроля (до заморажи-
вания) и составила 87 ± 2% (см. рис. 1, д). При
этом она была достоверно выше, чем после
использования режима 2 (79 ± 3%) (рис. 2). Анало-
гичные показатели сохранности были получены и
после криоконсервирования МСК в виде суспензии:
по режиму 3 – 88 ± 2% и режиму 2 – 84 ± 2%.
Инкапсулированные МСК после заморажива-
ния-отогрева по режиму 3 восстанавливали AB до
значения 1,57 ± 0,17 ОЕФ, которое было достоверно
ниже, чем до замораживания (2,27 ± 0,22), и не
отличалось от результатов после замораживания
по режиму 2 (1,44 ± 0,18) (рис. 3). Схожая динамика
наблюдалась в неинкапсулированных клетках.
После замораживания-отогрева МСК в виде
суспензии по режиму 3 степень восстановленности
АВ (1,74 ± 0,07) была достоверно ниже, чем до
замораживания (2,45 ± 0,04), и не отличалась от
результатов после замораживания по режиму 2
(1,54 ± 0,03).
Полученные данные свидетельствуют о том,
что инициация кристаллизации устраняет критичес-
кое переохлаждение МСК в альгинатных микро-
сферах при медленном замораживании. Ранее
сообщалось, что инициацию кристаллизации с
успехом применяли при криоконсервировании хонд-
роцитов [3] и трансформированных эмбриональных
клеток почки [26], инкапсулированных в АМС, что
позволило обеспечить высокую сохранность декон-
сервированных клеток в пределах 80–86%.
При анализе результатов не выявлено досто-
верных отличий в показателях сохранности и мета-
болической активности между МСК, криоконсер-
вированными под защитой 10%-го ДМСО, в
составе АМС и в виде суспензии. Это доказывает,
что инкапсуляция в альгинатный гидрогель не
влияет на криочувствительность МСК при замо-
раживании при данной концентрации криопро-
тектора. Вместе с тем МСК в составе АМС после
криоконсервирования под защитой 5%-го ДМСО
имели более низкие показатели сохранности и
метаболической активности, чем неинкапсулиро-
ванные клетки. Возможно, этот факт связан с тем,
что альгинатный гидрогель замедляет распределе-
ние криопротектора внутри микросфер, что прояв-
ляется при его концентрации ниже оптимального
уровня. В пользу этого предположения свидетель-
ствуют результаты работы [3], в которой высокие
показатели жизнеспособности клеток после замо-
раживания-отогрева в присутствии 5%-го ДМСО
For minimization of cryodamages of cell suspen-
sions the controlled rate freezing with initiation of
crystallization is successfully used. The possibility to
eliminate the critical overcooling of cytoplasm in the
MSC, encapsulated in alginate microbeads by initia-
tion of crystallization during slow freezing have not
been excessively studied. Thus, the further experi-
ments were performed in encapsulated cells under
protection of 10% DMSO using the two step slow
freezing (regimen 2) or three-step freezing with
initiation of crystallization (regimen 3).
Viability of encapsulated MSC after freeze-thaw-
ing according to the regimen 3 did not significantly
differ from the control values (before the cryopreser-
vation) and comprised 87 ± 2% (see Fig. 1, e). It was
significantly higher, than after freezing according to
the regimen 2 (79 ± 3%, Fig. 2). The similar viability
values were obtained after freeze-thawing of non-
encapsulated MSC suspension according to the
regimen 3 (88 ± 2%) and regimen 2 (84 ± 2%).
Encapsulated MSC after freeze-thawing accor-
ding to the regimen 3 reduced AB to the value of
1.57 ± 0.17 RFU, that was significantly lower compa-
ring to pre-freezing level (2.27 ± 0.22) and did not
differ from the values after freeze-thawing according
to the regimen 2 (1.44 ± 0.18, Fig. 3). The same
dynamics was observed in non-encapsulated group.
After freeze-thawing of non-encapsulated MSC
suspension according to the regimen 3 the level of
AB reduction (1.74 ± 0.07) was significantly lower
than pre-freezing one (2.45±0.04) and did not differ
from the value obtained after freeze-thawing accord-
ing to the regimen 2 (1.54 ± 0.03).
The obtained data testify to the fact that initiation
of crystallization eliminates the critical overcooling in
encapsulated MSC during slow freezing. It has been
reported recently that initiation of crystallization was
successfully applied during cryopreservation of chond-
rocytes [3] and transformed fetal kidney cell [26], encap-
sulated in AMB, that enabled to provide a high viability
of frozen-thawed cells within the range of 80–86%.
When analyzing the results no significant diffe-
rences were found in viability indices and metabolic
activity between both encapsulated and non-encapsu-
lated MSC, frozen-thawed in the presence of 10%
DMSO. So it is no evidence that encapsulation in algi-
nate hydrogel affect MSC cryosensitivity during
freeze-thawing in the presence of cryoprotectant in
this concentration. Herewith the encapsulated MSC
had lower viability and metabolic activity indices after
cryopreservation in the presence of 5% DMSO than
non-encapsulated cells. Probably this fact is associa-
ted with slower diffusion of cryoprotectant inside the
alginate hydrogel microbeads and the resulted con-
centration appeared to be lower than optimal level.
243 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
достигались при длительной эквилибрации с крио-
протектором. Результаты настоящего исследова-
ния не подтверждают криозащитное действие аль-
гината, показанное в работе [15].
Следует отметить, что гидрогель в АМС не
утрачивал прозрачность, оцененную визуально пос-
ле медленного замораживания (режимы 2 и 3), в
отличие от быстрого замораживания (режим 1).
Это свидетельствует о сохранении структурной це-
лостности альгинатного геля при медленном замо-
раживании в описанных условиях, что является
важным критерием для разработки адекватного
протокола криоконсервирования клеток в составе
альгинатных микросфер.
Выводы
1. Криоконсервирование МСК, инкапсулирован-
ных в альгинатные микросферы, с использованием
быстрого охлаждения сопровождается изменением
оптических свойств гидрогеля и приводит к гибели
клеток.
2. Использование медленного замораживания
при криоконсервировании МСК, инкапсулированных
в альгинатные микросферы, под защитой 5 и
10%-го ДМСО позволяет в значительной степени
сохранить жизнеспособность клеток. При этом по-
казатели сохранности и метаболической активнос-
ти клеток зависят от концентрации ДМСО в криоза-
щитной среде. При повышении концентрации
ДМСО с 5 до 10% сохранность инкапсулированных
клеток после криоконсервирования возрастает по-
чти на 20%, а показатели AB-теста – на 70%.
3. Сравнительное изучение МСК в составе аль-
гинатных микросфер и в виде суспензии одиночных
неинкапсулированных клеток при криоконсервиро-
вании под защитой 10% ДМСО не выявило су-
щественных различий в их криочувствительности,
а в присутствии 5% ДМСО МСК в составе альги-
натных микросфер имели более низкие показатели
жизнеспособности.
4. Контроль критического переохлаждения вну-
триклеточного содержимого путем инициации
кристаллизации в ходе медленного программного
замораживания при криоконсервировании МСК в
составе альгинатных микросфер в присутствии
10% ДМСО позволяет добиться максимальных
значений сохранности и метаболической актив-
ности инкапсулированных клеток.
Литература
Петренко А.Ю., Мазур С.П., Петренко Ю.А. и др. Выделе-
ние и дифференцировка стромальных клеток из тканей
плодов и взрослого человека // Трансплантология.–
2007.– Т. 9, №1.– С. 218–220.
This suggestion is confirmed by the data of Almqvist
et al. [3] showed the higher cell viability after freeze-
thawing in the presence of 5% DMSO achieved after
prolonged equilibration with cryoprotectant. The re-
sults of this research do not confirm cryoprotective
effect of alginate, shown by Kusano et al. [15].
It should be noted that the AMB hydrogel did not
lose the transparency visually assessed after slow
freezing (regimens 2 and 3 ) in contrast to the rapid
freezing (regimen 1). This testifies to preservation of
structural integrity of alginate hydrogel during slow
freezing in described conditions, and this is an impor-
tant criterion for development of adequate cryopreser-
vation protocol for cells encapsulated in alginate miro-
beads.
Conclusions
1. Cryopreservation of MSC, encapsulated in algi-
nate microbeads, using rapid cooling is accompanied
by changes in hydrogel optical properties and results
in cell death.
2. Application of slow freezing in the presence of
5 and 10% DMSO during cryopreservation of MSC,
encapsulated in alginate microbeads, enables to pre-
serve significantly the cell viability. Herewith the indi-
ces of viability and cell metabolic activity depend on
DMSO concentration in cryoprotective medium. When
increasing DMSO concentration from 5 up to 10%
the viability of encapsulated cells after freeze-thawing
rises by approximately 20%, and AB test indices do
by 70%.
3. Comparative study of MSC encapsulated in
alginate microbeads and in non-encapsulated suspen-
sion during freeze-thawing in the presence of 10%
DMSO did not reveal significant differences in their
cryosensitivity, and in the presence of 5% DMSO the
post-thaw viability of MSC encapsulated in alginate
microbeads was lower.
4. The elimination of critical overcooling of intra-
cellular content by initiation of crystallization during
slow controlled rate freezing during cryopreservation
of MSC within alginate microbeads in the presence
of 10% DMSO enables to obtain the maximal values
of viability and metabolic activity of encapsulated cells.
References
Petrenko A.Yu., Mazur S.P., Petrenko Yu.A. et al. Isolation
and differentiation of stromal cells from fetal and adult human
tissues // Transplantologiya.– 2007.– Vol. 9, N1.– P. 218–220.
Abdallah B.M., Kassem M. Human mesenchymal stem cells:
from basic biology to clinical applications // Gene Ther.– 2008.–
Vol. 15, N2.– P. 109–116.
Almqvist K.F., Wang L., Broddelez C. et al. Biological freezing
of human articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.–
2001.– Vol. 9, N4.– P. 341–350.
1.
1.
2.
3.
244 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Abdallah B.M., Kassem M. Human mesenchymal stem cells:
from basic biology to clinical applications // Gene Ther.– 2008.–
Vol. 15, N2.– P. 109–116.
Almqvist K.F., Wang L., Broddelez C. et al. Biological freezing
of human articular chondrocytes // Osteoarthritis Cartilage.–
2001.– Vol. 9, N4.– P. 341–350.
Alsberg E., Anderson K.W., Albeiruti A. et al. Cell-interactive
alginate hydrogels for bone tissue engineering // J. Dent.
Res.– 2001.– Vol. 80, N11.– P. 2025–2029.
Aoki T., Koizumi T., Kobayashi Y. et al. A novel method of
cryopreservation of rat and human hepatocytes by using
encapsulation technique and possible use for cell trans-
plantation // Cell Transplant.– 2005.– Vol. 14, N9.– P. 609–
620.
Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity
and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N4.–
P. 430–432.
Dezawa M., Kanno H., Hoshino M. et al. Specific induction of
neuronal cells from bone marrow stromal cells and application
for autologous transplantation // J. Clin. Invest.– 2004.–
Vol. 113, N12.– P. 1701–1710.
Duggal S., Frønsdal K.B., Szöke K. et al. Phenotype and
gene expression of human mesenchymal stem cells in alginate
scaffolds // Tissue Eng. A.– 2009.– Vol. 15, N7.– P. 1763–1773
Frith J.E., Thomson B., Genever P. Dynamic three-dimen-
sional culture methods enhance mesenchymal stem cell pro-
perties and increase therapeutic potential // Tissue Eng. C.–
2010.– Vol. 16, N4.– P. 735–749.
Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a
chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N-
cadherin // Stem Cells.– 2010.– Vol. 28, N3.– P. 564–572.
Ghidoni I., Chlapanidas T., Bucco M. et al. Alginate cell
encapsulation: new advances in reproduction and cartilage
regenerative medicine // Cytotechnology.– 2008.– Vol. 58,
N1.– P. 49–56.
Goh B.C., Thirumala S., Kilroy G. et al. Cryopreservation
characteristics of adipose-derived stem cells: maintenance
of differentiation potential and viability // J. Tissue Eng. Regen.
Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– P. 322–324.
Heng B.C., Yu H., Ng S.C. Strategies for the cryopreservation
of microencapsulated cells // Biotechnol. Bioeng.– 2004.–
Vol. 85, N2.– P. 202–213.
Jiang Q., Zhang S.Z., Peng J.P., Wang X.L. Preparation and
in vitro studies of microencapsulated cells releasing human
tissue inhibitor of metalloproteinase-2 // J. Zhejiang Univ. Sci.
B.– 2005.– Vol. 6, N9.– P. 859–864.
Kusano T., Aoki T., Yasuda D. et al. Microencapsule technique
protects hepatocytes from cryoinjury // Hepatol. Res.– 2008.–
Vol. 38, N6.– P. 593–600.
Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes
for tissue engineering in alginate beads enhances chondro-
cytic phenotype compared to conventional monolayer techni-
ques // Acta Orthop. Scand.– 2003.– Vol. 74, N1.– P. 6–15.
Lim F., Sun A.M. Microencapsulated islets as bioartificial
endocrine pancreas // Science.– 1980.– Vol. 210, N4472.–
P. 908–910.
Liu G., Shu C., Cui L. et al. Tissue-engineered bone formation
with cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem
cells // Cryobiology.– 2008.– Vol. 56, N3.– P. 209–215
Luk J.M.,Wang P.P., Lee C.K. et al. Hepatic potential of bone
marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and
intra-portal transplantation models // J. Immunol. Methods.–
2005.– Vol. 305, N1.– P. 39–47.
Majore I., Moretti P., Hass R., Kasper C. Identification of sub-
populations in mesenchymal stem cell-like cultures from human
umbilical cord // Cell Commun. Signal.– 2009.–- Vol. 7.– 6.
Malinin T.I., Perry Vol.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on
HeLa cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell shape,
cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage
commitment // Dev. Cell.– 2004.– Vol. 6, N4.– P. 483–495.
Murua A., Orive G., Hernandez R.M., Pedraz J.L. Cryopre-
servation based on freezing protocols for the long-term
Alsberg E., Anderson K.W., Albeiruti A. et al. Cell-interactive
alginate hydrogels for bone tissue engineering // J. Dent.
Res.– 2001.– Vol. 80, N11.– P. 2025–2029.
Aoki T., Koizumi T., Kobayashi Y. et al. A novel method of
cryopreservation of rat and human hepatocytes by using
encapsulation technique and possible use for cell trans-
plantation // Cell Transplant.– 2005.– Vol. 14, N9.– P. 609–
620.
Dankberg F., Persidsky M.D. A test of granulocyte integrity
and phagocytic function // Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N4.–
P. 430–432.
Dezawa M., Kanno H., Hoshino M. et al. Specific induction of
neuronal cells from bone marrow stromal cells and application
for autologous transplantation // J. Clin. Invest.– 2004.–
Vol. 113, N12.– P. 1701–1710.
Duggal S., Frønsdal K.B., Szöke K. et al. Phenotype and
gene expression of human mesenchymal stem cells in alginate
scaffolds // Tissue Eng. A.– 2009.– Vol. 15, N7.– P. 1763–
1773
Frith J.E., Thomson B., Genever P. Dynamic three-dimen-
sional culture methods enhance mesenchymal stem cell pro-
perties and increase therapeutic potential // Tissue Eng. C.–
2010.– Vol. 16, N4.– P. 735–749.
Gao L., McBeath R., Chen C.S. Stem cell shape regulates a
chondrogenic versus myogenic fate through Rac1 and N-
cadherin // Stem Cells.– 2010.– Vol. 28, N3.– P. 564–572.
Ghidoni I., Chlapanidas T., Bucco M. et al. Alginate cell
encapsulation: new advances in reproduction and cartilage
regenerative medicine // Cytotechnology.– 2008.– Vol. 58,
N1.– P. 49–56.
Goh B.C., Thirumala S., Kilroy G. et al. Cryopreservation
characteristics of adipose-derived stem cells: maintenance
of differentiation potential and viability // J. Tissue Eng. Regen.
Med.– 2007.– Vol. 1, N4.– P. 322–324.
Heng B.C., Yu H., Ng S.C. Strategies for the cryopreservation
of microencapsulated cells // Biotechnol. Bioeng.– 2004.–
Vol. 85, N2.– P. 202–213.
Jiang Q., Zhang S.Z., Peng J.P., Wang X.L. Preparation and
in vitro studies of microencapsulated cells releasing human
tissue inhibitor of metalloproteinase-2 // J. Zhejiang Univ. Sci.
B.– 2005.– Vol. 6, N9.– P. 859–864.
Kusano T., Aoki T., Yasuda D. et al. Microencapsule technique
protects hepatocytes from cryoinjury // Hepatol. Res.– 2008.–
Vol. 38, N6.– P. 593–600.
Lee D.A., Reisler T., Bader D.L. Expansion of chondrocytes
for tissue engineering in alginate beads enhances chondro-
cytic phenotype compared to conventional monolayer techni-
ques // Acta Orthop. Scand.– 2003.– Vol. 74, N1.– P. 6–15.
Lim F., Sun A.M. Microencapsulated islets as bioartificial
endocrine pancreas // Science.– 1980.– Vol. 210, N4472.–
P. 908–910.
Liu G., Shu C., Cui L. et al. Tissue-engineered bone formation
with cryopreserved human bone marrow mesenchymal stem
cells // Cryobiology.– 2008.– Vol. 56, N3.– P. 209–215
Luk J.M.,Wang P.P., Lee C.K. et al. Hepatic potential of bone
marrow stromal cells: development of in vitro co-culture and
intra-portal transplantation models // J. Immunol. Methods.–
2005.– Vol. 305, N1.– P. 39–47.
Majore I., Moretti P., Hass R., Kasper C. Identification of sub-
populations in mesenchymal stem cell-like cultures from human
umbilical cord // Cell Commun. Signal.– 2009.–- Vol. 7.– 6.
Malinin T.I., Perry Vol.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on
HeLa cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell shape,
cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage
commitment // Dev. Cell.– 2004.– Vol. 6, N4.– P. 483–495.
Murua A., Orive G., Hernandez R.M., Pedraz J.L. Cryopre-
servation based on freezing protocols for the long-term
storage of microencapsulated myoblasts // Biomaterials.–
2009.– Vol. 30, N20.– P. 3495–3501.
Nolan J.S., Packer L. Monolayer culture techniques for normal
human diploid fibroblasts // Methods Enzymol.– 1974.– Vol. 32,
Part B.– P. 561–568.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
245 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
storage of microencapsulated myoblasts // Biomaterials.–
2009.– Vol. 30, N20.– P. 3495–3501.
Nolan J.S., Packer L. Monolayer culture techniques for normal
human diploid fibroblasts // Methods Enzymol.– 1974.– Vol. 32,
Part B.– P. 561–568.
Petrenko Y.A., Gorokhova N.A., Tkachova E.N., Petrenko A.Y.
The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes
and isolated mitochondria // Укр. біохім. журнал.– 2005.–
Т. 77, №5.– C. 100–105.
Stensvaag V., Furmanek T., Lonning K. et al. Cryopreservation
of alginate-encapsulated recombinant cells for antiangiogenic
therapy // Cell Transplant.– 2004.– Vol. 13, N1.– P. 35–44.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.
Tomkoria S., Masuda K., Mao J. Nanomechanical properties
of alginate-recovered chondrocyte matrices for cartilage
regeneration // Proc. Inst. Mech. Eng. H.– 2007.– Vol. 221,
N5.– P. 467–473.
Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells
and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–
2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.
Wu Y.N., Yang Z., Hui J.H. et al. Cartilaginous ECM component-
modification of the micro-bead culture system for chondro-
genic differentiation of mesenchymal stem cells // Biomate-
rials.– 2007.– Vol. 28, N28.– P. 4056–4067.
Xiang Y., Zheng Q., Jia B.B. et al. Ex vivo expansion and
pluripotential differentiation of cryopreserved human bone
marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang Univ. Sci. B.–
2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.
Поступила 16.03.2010
Рецензент Т.Ф. Петренко
Petrenko Y.A., Gorokhova N.A., Tkachova E.N., Petrenko A.Y.
The reduction of Alamar Blue by peripheral blood lymphocytes
and isolated mitochondria // Ukr. Biokhim. Zhurnal.– 2005.–
Vol. 77, N5.– P. 100–105.
Stensvaag V., Furmanek T., Lonning K. et al. Cryopreservation
of alginate-encapsulated recombinant cells for antiangiogenic
therapy // Cell Transplant.– 2004.– Vol. 13, N1.– P. 35–44.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.
Tomkoria S., Masuda K., Mao J. Nanomechanical properties
of alginate-recovered chondrocyte matrices for cartilage
regeneration // Proc. Inst. Mech. Eng. H.– 2007.– Vol. 221,
N5.– P. 467–473.
Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells
and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–
2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.
Wu Y.N., Yang Z., Hui J.H. et al. Cartilaginous ECM component-
modification of the micro-bead culture system for chondro-
genic differentiation of mesenchymal stem cells // Biomate-
rials.– 2007.– Vol. 28, N28.– P. 4056–4067.
Xiang Y., Zheng Q., Jia B.B. et al. Ex vivo expansion and
pluripotential differentiation of cryopreserved human bone
marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang Univ. Sci. B.–
2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.
Accepted in 16.03.2010
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44475 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:49:13Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Правдюк, А.И. Петренко, Ю.А. Холодный, В.С. Грищук, В.П. Петренко, А.Ю. 2013-06-02T07:44:45Z 2013-06-02T07:44:45Z 2010 Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток
 в составе альгинатных микросфер / А.И. Правдюк, Ю.А. Петренко, В.С. Холодный, В.П. Грищук, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 235-245. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44475 576.371:612.419:57.085.23:57.043 Трехмерное культивирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК), инкапсулированных в альгинатные микросферы,
 является перспективным направлением клеточной биологии и тканевой инженерии, что определяет необходимость разработки
 методов их низкотемпературного консервирования. В работе показана возможность криоконсервирования МСК в составе
 альгинатных микросфер путем медленного замораживания под защитой ДМСО. Сравнительное изучение МСК в составе
 альгинатных микросфер и в виде суспензии одиночных неинкапсулированных клеток при криоконсервировании под защитой
 10% ДМСО не выявило существенных различий их криочувствительности, а в присутствии 5% они имели более низкие
 показатели жизнеспособности. Значения сохранности и метаболической активности после криоконсервирования МСК в составе
 альгинатных микросфер увеличивались при повышении концентрации ДМСО с 5 до 10%. Инициация кристаллизации в ходе
 медленного программного замораживания МСК в составе альгинатных микросфер в присутствии 10% ДМСО позволяла
 добиться максимальных значений сохранности и метаболической активности инкапсулированных клеток. Результаты работы
 могут быть использованы для создания банка МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы. Тривимірне культивування мезенхімальних стромальних клітин (МСК), які інкапсульовані у альгінатні мікросфери, є
 перспективним напрямком клітинної біології та тканинної інженерії, що визначає необхідність розробки методів їхнього
 низькотемпературного консервування. У роботі показана можливість кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер
 шляхом повільного заморожування під захистом ДМСО. Порівняльне вивчення МСК у складі альгінатних мікросфер і у
 вигляді суспензії поодиноких неінкапсульованих клітин при кріоконсервуванні під захистом 10% ДМСО не виявило значних
 розбіжностей їх кріочутливості, а у присутності 5% ДМСО вони мали більш низькі показники життєздатності. Показники
 збереженості і метаболічної активності після кріоконсервування МСК у складі альгінатних мікросфер збільшувались при
 підвищенні концентрації ДМСО з 5 до 10%. Ініціація кристалізації при повільному програмному заморожуванні МСК у
 складі альгінатних мікросфер у присутності 10% ДМСО дозволила отримати максимальні показники збереженості і метаболічної
 активності інкапсульованих клітин. Результати роботи можуть бути використані для створення банку МСК, які інкапсульовані
 у альгінатні мікросфери. Three-dimensional culture of mesenchymal stromal cells (MSC), encapsulated in alginate microbeads is a perspective direction of
 cell biology and tissue engineering, indicating the need of the development of their low temperature preservation methods. The study
 describes the possibility of cryopreservation of MSC within alginate microbeads by slow cooling under protection of DMSO.
 Comparison study of MSC within alginate microbeads and as non-encapsulated cell suspension during cryopreservation under
 protection of 10% DMSO did not show significant differences in cells’ cryosensitivity, while during cryopreservation with 5%
 DMSO encapsulated MSC had lower viability values. Survival and metabolic activity of MSC after cryopreservation within alginate
 microbeads depended on DMSO concentration in cryoprotective medium and rised with increase of DMSO concentration from 5% to
 10%. Initiation of crystallization during slow program cooling under protection of 10% DMSO allowed to achieve maximal values of
 survival and metabolic activity of encapsulated cells. The results of this study could be used for the banking of MSC encapsulated into
 alginate microbeads. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер Cryosensitivity of Mesenchymal Stromal Cells Encapsulated in Alginate Microbeads Article published earlier |
| spellingShingle | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер Правдюк, А.И. Петренко, Ю.А. Холодный, В.С. Грищук, В.П. Петренко, А.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_alt | Cryosensitivity of Mesenchymal Stromal Cells Encapsulated in Alginate Microbeads |
| title_full | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_fullStr | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_full_unstemmed | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_short | Изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_sort | изучение криочувствительности мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44475 |
| work_keys_str_mv | AT pravdûkai izučeniekriočuvstvitelʹnostimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT petrenkoûa izučeniekriočuvstvitelʹnostimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT holodnyivs izučeniekriočuvstvitelʹnostimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT griŝukvp izučeniekriočuvstvitelʹnostimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT petrenkoaû izučeniekriočuvstvitelʹnostimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT pravdûkai cryosensitivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedinalginatemicrobeads AT petrenkoûa cryosensitivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedinalginatemicrobeads AT holodnyivs cryosensitivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedinalginatemicrobeads AT griŝukvp cryosensitivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedinalginatemicrobeads AT petrenkoaû cryosensitivityofmesenchymalstromalcellsencapsulatedinalginatemicrobeads |