Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека
Изучали влияние гипотермического хранения до криоконсервирования и самого процесса криоконсервирования на сохранность, жизнеспособность и свойства мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности и самоподдержки, а также некроветворных клеток лейкоконцентрата...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2010 |
| Main Authors: | , , , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44500 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, Л.В. Сокол, М.В. Останков, К.А. Гольцев, С.С. Черноусова, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 303-308. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.,англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859803028263010304 |
|---|---|
| author | Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Сокол, Л.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Черноусова, С.С. Кожина, О.Ю. |
| author_facet | Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Сокол, Л.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Черноусова, С.С. Кожина, О.Ю. |
| citation_txt | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, Л.В. Сокол, М.В. Останков, К.А. Гольцев, С.С. Черноусова, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 303-308. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.,англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Изучали влияние гипотермического хранения до криоконсервирования и самого процесса криоконсервирования на
сохранность, жизнеспособность и свойства мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной
активности и самоподдержки, а также некроветворных клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека (ЛККЧ). Полученные
результаты позволили экспериментально обосновать максимально допустимый срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой
крови до изготовления из нее ЛККЧ. Показано повышение проницаемости плазматических мембран стволовых кроветворных
клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности после их криоконсервирования, которая растет со сроком
предварительного гипотермического хранения и под влиянием процесса криоконсервирования.
Вивчали вплив гіпотермічного зберігання до кріоконсервування та самого процесу кріоконсервування на збереженість,
життєздатність та властивості мембран стовбурових кровотворних клітин з високим потенціалом проліферативної активності
та самопідтримки, а також некровотворних клітин лейкоконцентрату кордової крові людини (ЛККЛ). Отримані результати
дозволили експериментально обґрунтувати максимально допустимий строк (24 години) гіпотермічного зберігання кордової
крові до виготовлення з неї ЛККЛ. Показано підвищення проникності плазматичних мембран стовбурових кровотворних
клітин з високим потенціалом проліферативної активності після їх кріоконсервування, яке зростає зі строком попереднього
гіпотермічного зберігання та під впливом процесу кріоконсервування.
Pre-cryopreservation hypothermic storage and cryopreservation process itself effects on integrity, viability and membrane properties
of hemopoietic stem cells with high proliferative activity and self-support potentials as well as of non-hemopoietic human cord blood
leucoconcentrate (HCBL) cells were investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition
of these cells was assessed. The data obtained allowed experimental substantiating the maximally acceptable term of hypothermic
storage (24 hrs) of cord blood prior to production of HCBL. A rise in plasmatic membrane permeability of stem hemopoietic cells with
a high proliferative activity potential after their cryopreservation was shown. The permeability also increased, as the term of
preliminary hypothermic storage was prolonged.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:14:02Z |
| format | Article |
| fulltext |
303
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-31-26, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3126, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
УДК 615.361.018.5.013.8.014.41
А.Н. ГОЛЬЦЕВ*, В.В. ВОЛИНА, Л.В. СОКОЛ,
М.В. ОСТАНКОВ, К.А. ГОЛЬЦЕВ, С.С. ЧЕРНОУСОВА, О.Ю. КОЖИНА
Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования
на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека
UDC 615.361.018.5.013.8.014.41
A.N. GOLTSEV*, V.V. VOLINA, L.V. SOKOL,
M.V. OSTANKOV, K.A. GOLTSEV, S.S. CHERNOUSOVA, O.YU. KOZHINA
Effect of Hypothermic Storage and Cryopreservation
on Human Cord Blood Leucoconcentrate Cells
Изучали влияние гипотермического хранения до криоконсервирования и самого процесса криоконсервирования на
сохранность, жизнеспособность и свойства мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной
активности и самоподдержки, а также некроветворных клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека (ЛККЧ). Полученные
результаты позволили экспериментально обосновать максимально допустимый срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой
крови до изготовления из нее ЛККЧ. Показано повышение проницаемости плазматических мембран стволовых кроветворных
клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности после их криоконсервирования, которая растет со сроком
предварительного гипотермического хранения и под влиянием процесса криоконсервирования.
Ключевые слова: кордовая кровь человека, стволовые кроветворные и некроветворные клетки, гипотермическое хранение,
криоконсервирование.
Вивчали вплив гіпотермічного зберігання до кріоконсервування та самого процесу кріоконсервування на збереженість,
життєздатність та властивості мембран стовбурових кровотворних клітин з високим потенціалом проліферативної активності
та самопідтримки, а також некровотворних клітин лейкоконцентрату кордової крові людини (ЛККЛ). Отримані результати
дозволили експериментально обґрунтувати максимально допустимий строк (24 години) гіпотермічного зберігання кордової
крові до виготовлення з неї ЛККЛ. Показано підвищення проникності плазматичних мембран стовбурових кровотворних
клітин з високим потенціалом проліферативної активності після їх кріоконсервування, яке зростає зі строком попереднього
гіпотермічного зберігання та під впливом процесу кріоконсервування.
Ключові слова: кордова кров людини, стовбурові кровотворні та некровотворні клітини, гіпотермічне зберігання,
кріоконсервування.
Pre-cryopreservation hypothermic storage and cryopreservation process itself effects on integrity, viability and membrane properties
of hemopoietic stem cells with high proliferative activity and self-support potentials as well as of non-hemopoietic human cord blood
leucoconcentrate (HCBL) cells were investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition
of these cells was assessed. The data obtained allowed experimental substantiating the maximally acceptable term of hypothermic
storage (24 hrs) of cord blood prior to production of HCBL. A rise in plasmatic membrane permeability of stem hemopoietic cells with
a high proliferative activity potential after their cryopreservation was shown. The permeability also increased, as the term of
preliminary hypothermic storage was prolonged.
Key words: human cord blood, stem hemopoietic and non-hemopoietic cells, hypothermic storage, cryopreservation.
Определение температурных условий и дли-
тельности хранения образцов кордовой крови чело-
века (ККЧ) до замораживания остается сущест-
венной проблемой, так как кровь необходимо
транспортировать в специализированные лабора-
тории для работы, связанной с выделением ядро-
содержащих клеток ККЧ, их тестированием и
криоконсервированием. Также не решена пробле-
ма длительности хранения образцов препаратов,
The selection of temperature conditions and stor-
age duration of human cord blood (HCB) samples be-
fore freezing has presented a great challenge, since
the blood is supposed to be transported to specialized
laboratories for isolation of HCB nuclear cells, their
testing and cryopreservation. The problem of storage
duration for samples of HCB preparations in case of
impossibility of cryopreservation right after their ob-
tainment, was not solved either.
криоконсервирование
биологических объектов
cryopreservation
of biological systems
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
304
A lot of scientific works gave coverage to issues of
storage duration of cord blood samples prior to pro-
duction of preparations from it and to hemopoietic cell
cryopreservation [6, 7, 13]. The results of researches
confirm that storage conditions of HCB before freez-
ing are important for providing quality maintenance of
cell material. Nevertheless the data on storage dura-
tion before freezing HCB preparations are insufficient,
consequently this matter requires further investigations.
The aim of the work is to study the effect of pre-
cryopreservation hypothermic storage and cryopreser-
vation process itself on integrity and viability of
hemopoietic stem cells with high proliferative activity
and self-maintainance potentials as well as of non-
hemopoietic HCB cells.
Materials and methods
The subject of inquiry was HCB samples, which
were obtained from maternal end of umbilical cord af-
ter separating neonates, who were born in time by
healthy obstetric patients, as well as HCB leukocon-
centrate (HCBL) suspended in autologous plasma and
obtained by sedimentation [2].
Blood was collected in sterile flasks with CPD
(citrate-phosphate-dextrose solution) anticoagulant.
Cord blood was stored prior to HCBL production in a
domestic fridge at 4°C.
HCB and HCBL were frozen in disposable plastic
containers according to the two-stage program with-
out traditional cryoprotectants [3]. Cryopreserved sam-
ples were stored in liquid nitrogen at –196°C.
Containers were immerged in a water bath at the
temperature 40–41°C for thawing suspensions.
Depending on hypothermic storage conditions HCB
samples were divided into the groups:
HCB1 was stored at 4°C for 24 hrs after delivering
from a maternity hospital prior to cryopreservation (con-
trol for the groups HCB2 and HCB3);
HCB2 was stored at 4°C for 48 hrs prior to cryopre-
servation (control for the group HCB4);
HCB3 was cryopreserved after 24 hour preliminary
hypothermic storage (control for the group HCB4);
HCB4 was cryopreserved after preliminary 48-hour
hypothermic storage.
HCBL was divided into the groups:
HCBL1 was native leukoconcentrate obtained from
HCB1 (control for HCBL2);
HCBL2 was frozen-thawed HCBL1 right after
thawing.
Numbers of nucleated cells in the control and ex-
perimental samples were counted in Goryaev’s cham-
ber by the standard method, and integrity of nuclear
cell was assessed by supravital staining with trypan
blue [10].
Quantity of colony forming units in culture (CFUc)
was determined by numbers of clusters and colonies,
formed in semiliquid agar, by the method [8, 12] with
изготовленных из ККЧ, при невозможности их
криоконсервирования сразу после получения.
Вопросы длительности хранения образцов кор-
довой крови до изготовления из нее препаратов и
криоконсервирования гемопоэтических клеток ос-
вещены во многих научных работах [6, 7, 13].
Результаты исследований подтверждают, что ус-
ловия хранения ККЧ перед замораживанием важны
для обеспечения сохранности качества клеточного
материала. Однако данных о длительности хране-
ния перед низкотемпературным замораживанием
препаратов, изготовленных из ККЧ, недостаточно,
следовательно, эта проблема требует детального
изучения.
Цель работы – изучение влияния гипотерми-
ческого хранения до криоконсервирования и самого
процесса криоконсервирования на сохранность и
жизнеспособность стволовых кроветворных кле-
ток с высоким потенциалом пролиферативной ак-
тивности и самоподдержки, а также некроветвор-
ных клеток ККЧ.
Материалы и методы
Объектом исследования служили образцы
ККЧ, которые получали из материнского конца
пуповины после отделения новорожденных, родив-
шихся в срок у здоровых рожениц, а также лейко-
концентрат ККЧ (ЛККЧ), взвешенный в аутологич-
ной плазме и полученный из ККЧ седиментацион-
ным методом [2].
Кровь отбирали в стерильные флаконы с добав-
лением антикоагулянта CPD (цитратно-фосфатно-
декстрозный раствор). Перед получением ЛККЧ
кордовую кровь хранили в бытовом холодильнике
при 4°С.
Замораживали ККЧ и ЛККЧ в одноразовых
пластиковых контейнерах по двухэтапной програм-
ме без использования традиционных криопротек-
торов [3]. Криоконсервированные образцы хранили
в жидком азоте при температуре –196°С.
Для отогрева суспензий контейнеры погружали
в водяную баню при температуре 40–41°С.
В зависимости от условий гипотермического
хранения образцы ККЧ были разделены на группы:
ККЧ1, хранившаяся при 4°С в течение 24 ч
после получения из родильного дома до криокон-
сервирования (контроль для групп ККЧ2 и ККЧ3);
ККЧ2, хранившаяся при 4°С в течение 48 ч до
криоконсервирования (контроль для группы ККЧ4);
ККЧ3, криоконсервированная после 24 ч пред-
варительного гипотермического хранения (конт-
роль для группы ККЧ4);
ККЧ4, криоконсервированная после 48 ч предва-
рительного гипотермического хранения.
ЛККЧ также был разделен на группы:
ЛККЧ1 – нативный лейкоконцентрат, получен-
ный из ККЧ1 (контроль для группы ЛККЧ2);
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
305
ЛККЧ2 – криоконсервированный ЛККЧ1 сразу
после отогрева.
В опытных и контрольных образцах препарата
по общепринятой методике определяли количество
ядросодержащих клеток в камере Горяева и коли-
чество сохранных клеток методом суправиталь-
ного окрашивания трипановым синим [10].
Количество КОЕк (колониеобразующие едини-
цы в культуре) определяли по числу кластеров и
колоний, сформировавшихся в полужидком агаре,
по методу [8, 12] в нашей модификации. Типы
колоний оценивали на 8-е сутки культивирования с
помощью инвертированного микроскопа на гисто-
логических препаратах, изготовленных из агаровых
блоков и окрашенных гематоксилином и эозином
[5]. Сохранность ядерных гемопоэтических клеток
ККЧ определяли с помощью окрашивания пропи-
диум йодидом, проточного цитофлуориметра FACS
Calibur (BD, США) и программного обеспечения
Win MDI [9].
Полученные результаты обрабатывали по ме-
тоду Стьюдента с учетом коэффициента Фишера.
Достоверность отличий оценивали с помощью t-
критерия с уровнем значимости 5% [1].
Результаты и обсуждение
Установлено, что количество сохранных ядро-
содержащих клеток (по окрашиванию трипановым
синим) во всех образцах оставалось на достаточно
our modification. Colony types were assessed to the
8th day of culture on an inverted microscope in histo-
logical preparations obtained from agar blocks and
stained with hematoxylin and eosin [5]. HCB nuclear
hemopoietic cell integrity was determined using propi-
dium iodide staining and FACS Calibur flow cytofluori-
meter (BD Biosciences, USA), the data were proces-
sed with Win MDI software [9].
The data obtained were processed by Student’s test
with Fisher’s correction. The difference significance
was assessed by the t-test with the significance level
of 5% [1].
Results and discussion
The integrity of nuclear cell in all the samples (asses-
sed by trypan blue staining) was established to remain
considerably high (Table). This can be attributed to the
fact that hypothermic storage and cryopreservation
caused no injuries of HCB nucleated cell membranes.
The number of hemopoietic stem cells correlating
with CFUc did not change during hypothermic storage
and after cryopreservation, either (Table).
During culturing of cord blood nucleated cells stored
for 24 and 48 hrs at 4°C prior to cryopreservation as
well as in thawed HCB3 samples the number and types
of the formed colonies did not change significantly (Ta-
ble). The relative quantity of viable cells and the quan-
tity of formed colonies tended to decline in the thawed
HCB4 samples after 48 hrs.
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
Количество ядросодержащих клеток, относительное количество
сохранных клеток и КОЕк ЛККЧ в зависимости от сроков
гипотермического хранения и последующего
криоконсервирования (n = 6)
Quantity of nucleated cells, relative quantities ofviable cells and
CFUc in HCBL depending on hypothermic storage terms and
following cryopreservation (n = 6).
ыцзарбО
selpmaS
овтсечилоK
хищажредосордя
,котелк × 01 7 лм/
forebmuN
,sllecraelcun
× 01 7 lm/
еоньлетисонтО
овтсечилок
хыннархос
%,котелк
ytitnauqevitaleR
%,sllecefasfo
овтсечилоK
%,кЕОK
%,ytitnauqcUFC
ЧKK
1
BCH
1
13,0±51,1 1±79 59,0±05,2
ЧKK
2
BCH
2
78,0±01,1 1±69 7,0±0,3
ЧKK
3
BCH
3
33,0±51,1 1±38 6,0±2,3
ЧKK
4
BCH
4
66,0±86,0 2,1 4,1±0,73 2,1 7,0±0,2
ЧKKЛ
1
LBCH
1
83,0±05,1 1±79 68,0±07,2
ЧKKЛ
2
LBCH
2
23,0±53,1 6,1±0,68 34,0±05,2
Примечание: 1 – отличия достоверны (p < 0,05) в сравнении с ККЧ2;
2 – отличия достоверны (p < 0,05) в сравнении с ККЧ3.
Note: * – significant differences (p < 0.05) as compared to data of HCB2;
2 – significant differences (p < 0.05) as compared to data of HCB3.
высоком уровне (таблица). Этот факт мо-
жет быть объяснен тем, что гипотерми-
ческое хранение и криоконсервирование не
приводили к повреждению мембран ядросо-
держащих клеток ККЧ.
Количество стволовых кроветворных
клеток, коррелирующее с количеством
КОЕк, также не изменялось на этапах гипо-
термического хранения и после криокон-
сервирования (таблица).
В процессе культивирования ядросодер-
жащих клеток кордовой крови, хранившейся
24 и 48 ч при температуре 4°С до криокон-
сервирования, а также в отогретых образ-
цах ККЧ3 количество и типы образованных
колоний достоверно не изменялись (табли-
ца). После 48 ч в отогретых образцах ККЧ4
относительное количество сохранных кле-
ток и количество образованных колоний
имели тенденцию к снижению.
Приведенные результаты свидетельст-
вуют о том, что на этапах гипотермичес-
кого хранения через 48 ч возникают неле-
тальные повреждения ядросодержащих
клеток, проявляющиеся в снижении их
криоустойчивости. В связи с этим для по-
следующего криоконсервирования ЛККЧ
306 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
влияют на функциональную активность клеток,
образующих в агаровых культурах кластеры и
микроколонии. Клетки ЛККЧ2 образовывали те же
самые колонии, что и клетки ЛККЧ1 , находящиеся
на разных стадиях дифференцирования (миело-
бласты, миелоциты, палочко- и сегментоядерные
клетки). Однако чаще всего отмечали макроко-
лонии миелоидно-моноцитарного типа (рис. 1).
Кроме того, встречались колонии, которые были
сформированы фибробластоподобными клетками.
Они имели волокнистые структуры, образующие
соединительно-тканный каркас вокруг клеточных
элементов колоний (рис. 2).
Количество, пролиферативная активность и
направленность дифференцирования стволовых
кроветворных клеток лейкоконцентрата после
криоконсервирования не изменялись (таблица). На
8-е сутки культивирования деконсервированные
кроветворные клетки формировали такое же коли-
чество и тот же тип колоний, как и клетки суспензии
до замораживания-отогрева (эритроидные, моно-
цитарно-макрофагальные, миелоидные колонии, а
также колонии, сформированные фибробласто-
подобными и недифференцированными клетками).
Результаты экспериментов свидетельствуют,
что гипотермическое хранение при 4°С в течение
These results show the appearance of non-lethal
injuries in nuclear cells after 48-hour hypothermic stor-
age leading to a decrease in their cryoresistance. Due
to this fact HCBL for further cryopreservation was
isolated from human cord blood stored under hypo-
thermic conditions not longer than 24 hrs.
Post-thaw number of nucleated cells and the rela-
tive integrity of HCBL2 cells were not changed signifi-
cantly as compared to the data of HCBL1 (Table).
Population of HCB hemopoietic cells is heteroge-
neous: along with HC of different differentiation stages
HCB contains mature cells. Stem cells and early pre-
cursor cells of mature cell types are known to have ra-
ther high tolerance to hypothermic conditions in com-
parison with other cells [4]. Hypothermic storage and
following low temperature preservation were not shown
to affect the functional activity of cells forming clus-
ters and microcolonies in agar cultures. HCBL2 cells
formed the same colonies as cells of the HCBL1, rep-
resented by cells of different differentiation stages
(myeloblasts, myelocytes, rod nucleated and segmen-
tated cells) did. However macrocolonies of myeloid-
monocytic type were the most frequent (Fig. 1).
Additionally the colonies formed by fibroblast-like
cells were noted. They had fibroid structures forming
connective-tissue network around colony cells (Fig. 2).
получали из кордовой крови
человека, хранившейся в
условиях гипотермии не
более 24 ч.
После отогрева криокон-
сервированного ЛККЧ2 ко-
личество ядросодержащих и
относительное количество
сохранных клеток досто-
верно не изменялись по
сравнению с их содержани-
ем в образцах ЛККЧ1 (таб-
лица).
Популяция гемопоэти-
ческих клеток ККЧ являет-
ся гетерогенной, в ней наря-
ду с ГК разной степени
дифференциации присут-
ствуют и зрелые клеточные
элементы. Известно, что
стволовые и ранние клетки-
предшественники зрелых
клеточных типов имеют
достаточно высокую устой-
чивость к условиям гипо-
термии по сравнению с дру-
гими клетками [4]. Показа-
но, что процессы гипотер-
мического хранения и по-
следующего низкотемпера-
турного консервирования не
а a б b
Рис. 1. Колонии миелоидно-моноцитарного типа на 8-е сутки культивирования
клеток ЛККЧ: а – свежевыделенный образец; б – образец, хранившийся в условиях
гипотермии в течение 24 ч; в – образец, криоконсервированный непосредственно
после получения; г – образец, криоконсервированный после 24 ч предвари-
тельного гипотермического хранения. Окраска гематоксилином и эозином, ×900.
Fig. 1. Myeloid-monocyte colonies to the 8th day of culture of the HCBL cells: a –
freshly isolated; b – stored under hypothermic conditions for 24 hrs; c – frozen-
thawed immediately after isolation; d – frozen-thawed after the preliminary 24-hour
hypothermic storage. Hematoxylin and eosin staining. ×900.
в c г d
307 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
крови по оптимальной программе, что свидетельст-
вует о развитии нелетальных повреждений ядросо-
держащих клеток в условиях гипотермии, которые
на этапах криоконсервирования переходят в ле-
тальные и являются причиной снижения их
криоустойчивости. Как было показано на других
биообъектах, причинами развития нелетальных
повреждений являются длительная гипоксия,
изменения физико-химических свойств клеточных
мембран и их проницаемости, а также нарушение
последовательности течения метаболических про-
цессов в клетках, в результате чего происходит
накопление промежуточных продуктов метаболиз-
ма [11].
Таким образом, установлено, что оптимальный
срок гипотермического хранения ККЧ до начала
получения из нее ЛККЧ равен 24 ч.
Использование специфического для ДНК
флуоресцентного красителя пропидия йодида (РІ)
позволило визуализировать потерю целостности
плазматических мембран клеток ЛККЧ после за-
мораживания-отогрева. В образцах ЛККЧ2 коли-
чество PI–-клеток (с неповрежденной мембраной)
и PI+-клеток составило соответственно 50,0 ± 10,8
и 49,9 ± 10,8.
Большой разброс показателей сохранности
клеток ЛККЧ в образцах можно объяснить неодно-
родностью исходного материала (ККЧ) и чувстви-
тельностью криоконсервированного материала к
физико-химическим факторам и условиям получе-
ния данных на цитофлуориметре.
Выводы
Полученные результаты позволили экспери-
ментально обосновать максимально допустимый
срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой
крови до получения из нее ЛККЧ.
Было показано уменьшение сохранности плаз-
матических мембран стволовых кроветворных
The number, proliferative activity as well as direc-
tion of differentiation in leukoconcentrate hemopoietic
stem cells was not changed after freeze-thawing (Ta-
ble). On the 8th day of culture the post-thaw hemo-
poietic cells formed the same quantity and the same
types of colonies as cells not subjected to freeze-thaw-
ing (erythroid, monocytic-macrophage, myeloid colo-
nies as well as colonies formed by fibroblast-like and
non-differentiated cells).
The results testify the fact that 24-hour hypother-
mic storage at 4°C did not influence the safety, func-
tional activity and cryotolerance of hemopoietic and
non-hemopoietic stem cells in HCB. After 48-hour hy-
pothermic storage the number of nucleated cells and
cell integrity tended to decline in HCB. A significant
decrease in the quantity of nucleated cells and their
integrity was observed after cryopreservation accord-
ing to the optimal program of these cord blood sam-
ples, that attests to non-lethal injuries development in
nuclear cells under hypothermic conditions, turning into
lethal ones during freeze-thawing and are responsible
for a decline in the cell cryoresistance. As it was shown
in other bioobjects, prolonged hypoxia, physico-chemi-
cal changes in cell membrane properties and their per-
meability as well as distortions of metabolic processes
succession in cells accounted for development of non-
lethal injuries in cells, which led to accumulation of in-
termediate metabolic products [11].
Thus it was found that the optimal term of HCB
hypothermic storage prior to HCBL isolation is 24 hrs.
The usage of the DNA-specific fluorescent dye
propidium iodide (PI) allowed to reveal the loss of plas-
matic membrane integrity in HCBL cells after freeze-
thawing. In HCBL2 samples the number of PI– cells
(with non-affected membrane) and PI+ cells made
50.0 ± 10.8 and 49.9 ± 10.8, correspondingly.
A great variability of HCBL cell safety indices in
the samples can be attributed to heterogeneity of the
original material (HCB) and to sensitivity of the cryo-
24 ч не влияло на сохран-
ность, функциональную ак-
тивность и криоустойчи-
вость стволовых крове-
творных и некроветворных
клеток в составе ККЧ. Пос-
ле 48 ч гипотермического
хранения в ККЧ количество
ядросодержащих клеток и
их сохранность имели тен-
денцию к снижению. Досто-
верное снижение количества
ядросодержащих и сохран-
ных клеток выявляется пос-
ле криоконсервирования
данных образцов кордовой
а a б b
Рис. 2. Колонии фибробластоподобных клеток на 8-е сутки культивирования клеток
ЛККЧ: а – ЛККЧ1; б – ЛККЧ2. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.
Fig. 2. Colonies of fibroblast-like cells to the 8th culture day in HCBL: a – HCBL1; b –
HCBL2. Hematoxylin and eosin staining, ×400.
308 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №3
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №3
preserved material to physico-chemical factors and
conditions of the data collection with cytofluorimeter.
Conclusions
The data obtained allowed experimental substanti-
ating the maximally acceptable term (24 hrs) of hypo-
termic storage of cord blood prior to production of
HCBL.
A decrease in plasmatic membrane integrity of
hemopoietic stem cells with high proliferative activity
potential was noted after their cryopreservation. This
index was affected by the term of preliminary hypo-
thermic storage.
клеток с высоким потенциалом пролиферативной
активности после их криоконсервирования. Этот
показатель зависел также от сроков предваритель-
ного гипотермического хранения.
Литература
Лакин Г.Ф. Биометрия.– М.: Высш. школа, 1980.– 293 с.
Цуцаєва А.О., Грищенко В.І., Кудокоцева О.В., Проко-
пюк О.С. Заготівля, кріоконсервування та клінічне засто-
сування гемопоетичних клітин кордової крові людини:
Метод. рекомендації.– Харків, 2000.– 16 с.
Патент №31847А, МПК А01N1/02. Україна. Спосіб
кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові /
А.О. Цуцаєва, В.І. Грищенко, О.В. Кудокоцева та інш. Заяв-
лено 05.11.1998; Опубл. 15.12.2000. Бюл. №7.– С. 1–10.
Berz D., McCormack E.M., Winer E.S. et al. Cryopreservation
of hemapoietic stem cells // J. Hematol.– 2007.– Vol. 82, N6.–
P. 463–472.
Bol S., Engh G., Visser J. A technique for staining haemo-
poietic colonies in agar cultures // Exp. Hemat.– 1977.–
Vol. 97, N5.– P. 551–553.
Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions
for collection and cryopreservation of umbilical cord hemato-
poietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–515.
Donaldson C., Armitage W.J., Denning-Kendall P.A. et al.
Optimal cryopreservation of human umbilical cord blood //
Bone Marrow Transplantation.– 1996.– Vol. 42, N18.– P. 725–
731.
Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from
circulating cells in human cord blood // Blood.– 1974.– Vol. 43,
N3.– P. 357–361.
Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry:
influence of endogenous endonucleases // Exp. Cell Res.–
2002.– Vol. 277, N1.– P. 1–14.
Malinin T.I., Perry V.P. A review of tissue and organ viability
assay // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N3.– Р. 104.
Meyer T.P., Hofmann B., Zaisserer J. et al. Analysis and
cryopreservation of hemapoietic stem and progenitor cells
from umbilical cord blood // Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N3.–
P. 265–276.
Nakanata T. Hemopoetic colony-forming cells umbilican cord
blood with extensive capability to generate mono- and
multipotential hemopoetic progenitors // J. Clin. Invest.– 1982.–
Vol. 7, N6.– P. 1324–1328.
Rubinstein P., Roserfiels R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.
Stored placental blood for unrelated bone marrow recon-
stitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.
Поступила 16.02.2010
Рецензент Н.Г. Землянских
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
References
Lakin G.F. Biometry.– Moscow: Vysshaya shkola, 1980.–
293 p.
Tsutsayeva A.O., Grischenko V.I., Kudokotseva O.V., Proko-
pyuk O.C. Procurement, cryopreservation and clinical applica-
tion of human cord blood hemopoietic cells: Methodical
recommendations.– Kharkiv, 2000.– 16 p.
Patent of Ukraine N31847A, IPC A01N1/02. Method for
cryopreservation of cord blood hemopoietic cells / A.O. Tsu-
tsayeva, V.I. Grischenko, O.V. Kudokotseva, A.V. et al.– Filed
in: 11.05.98. Published in: 12.15.2000. Bul. N7.– P.1–10.
Berz D., McCormack E.M., Winer E.S. et al. Cryopreservation
of hemapoietic stem cells // J. Hematol.– 2007.– Vol. 82, N6.–
P. 463–472.
Bol S., Engh G., Visser J. A technique for staining haemo-
poietic colonies in agar cultures // Exp. Hemat.– 1977.–
Vol. 97, N5.– P. 551–553.
Campos L., Roubi N., Gyotat D. Definition of optimal conditions
for collection and cryopreservation of umbilical cord hemato-
poietic cells // Cryobiology.– 1995.– Vol. 32, N6.– P. 511–515.
Donaldson C., Armitage W.J., Denning-Kendall P.A. et al.
Optimal cryopreservation of human umbilical cord blood //
Bone Marrow Transplantation.– 1996.– Vol. 42, N18.– P. 725–
731.
Knudtzon S. In vitro growth of granulocytic colonies from
circulating cells in human cord blood // Blood.– 1974.– Vol. 43,
N3.– P. 357–361.
Lecoeur H. Nuclear apoptosis detection by flow cytometry:
influence of endogenous endonucleases // Exp. Cell Res.–
2002.– Vol. 277, N1.– P. 1–14.
Malinin T.I., Perry V.P. A review of tissue and organ viability
assay // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N3.– Р. 104.
Meyer T.P., Hofmann B., Zaisserer J. et al. Analysis and
cryopreservation of hemapoietic stem and progenitor cells
from umbilical cord blood // Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N3.–
P. 265–276.
Nakanata T. Hemopoetic colony-forming cells umbilican cord
blood with extensive capability to generate mono- and
multipotential hemopoetic progenitors // J. Clin. Invest.– 1982.–
Vol. 7, N6.– P. 1324–1328.
Rubinstein P., Roserfiels R.E., Adamson J.W., Stevens C.E.
Stored placental blood for unrelated bone marrow recon-
stitution // Blood.– 1993.– Vol. 81, N7.– P. 1679–1690.
Accepted in 16.02.2010
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44500 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:14:02Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Сокол, Л.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Черноусова, С.С. Кожина, О.Ю. 2013-06-02T10:19:17Z 2013-06-02T10:19:17Z 2010 Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека / А.Н. Гольцев, В.В. Волина, Л.В. Сокол, М.В. Останков, К.А. Гольцев, С.С. Черноусова, О.Ю. Кожина // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 3. — С. 303-308. — Бібліогр.: 13 назв. — рос.,англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44500 615.361.018.5.013.8.014.41 Изучали влияние гипотермического хранения до криоконсервирования и самого процесса криоконсервирования на сохранность, жизнеспособность и свойства мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности и самоподдержки, а также некроветворных клеток лейкоконцентрата кордовой крови человека (ЛККЧ). Полученные результаты позволили экспериментально обосновать максимально допустимый срок (24 ч) гипотермического хранения кордовой крови до изготовления из нее ЛККЧ. Показано повышение проницаемости плазматических мембран стволовых кроветворных клеток с высоким потенциалом пролиферативной активности после их криоконсервирования, которая растет со сроком предварительного гипотермического хранения и под влиянием процесса криоконсервирования. Вивчали вплив гіпотермічного зберігання до кріоконсервування та самого процесу кріоконсервування на збереженість, життєздатність та властивості мембран стовбурових кровотворних клітин з високим потенціалом проліферативної активності та самопідтримки, а також некровотворних клітин лейкоконцентрату кордової крові людини (ЛККЛ). Отримані результати дозволили експериментально обґрунтувати максимально допустимий строк (24 години) гіпотермічного зберігання кордової крові до виготовлення з неї ЛККЛ. Показано підвищення проникності плазматичних мембран стовбурових кровотворних клітин з високим потенціалом проліферативної активності після їх кріоконсервування, яке зростає зі строком попереднього гіпотермічного зберігання та під впливом процесу кріоконсервування. Pre-cryopreservation hypothermic storage and cryopreservation process itself effects on integrity, viability and membrane properties of hemopoietic stem cells with high proliferative activity and self-support potentials as well as of non-hemopoietic human cord blood leucoconcentrate (HCBL) cells were investigated, as well as correlation between phenotypic marker expression and functional condition of these cells was assessed. The data obtained allowed experimental substantiating the maximally acceptable term of hypothermic storage (24 hrs) of cord blood prior to production of HCBL. A rise in plasmatic membrane permeability of stem hemopoietic cells with a high proliferative activity potential after their cryopreservation was shown. The permeability also increased, as the term of preliminary hypothermic storage was prolonged. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Криоконсервирование биообъектов Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека Effect of Hypothermic Storage and Cryopreservation on Human Cord Blood Leucoconcentrate Cells Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека Гольцев, А.Н. Волина, В.В. Сокол, Л.В. Останков, М.В. Гольцев, К.А. Черноусова, С.С. Кожина, О.Ю. Криоконсервирование биообъектов |
| title | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_alt | Effect of Hypothermic Storage and Cryopreservation on Human Cord Blood Leucoconcentrate Cells |
| title_full | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_fullStr | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_full_unstemmed | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_short | Влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| title_sort | влияние гипотермического хранения и криоконсервирования на клетки лейкоконцентрата кордовой крови человека |
| topic | Криоконсервирование биообъектов |
| topic_facet | Криоконсервирование биообъектов |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44500 |
| work_keys_str_mv | AT golʹcevan vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT volinavv vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT sokollv vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT ostankovmv vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT golʹcevka vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT černousovass vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT kožinaoû vliâniegipotermičeskogohraneniâikriokonservirovaniânakletkileikokoncentratakordovoikrovičeloveka AT golʹcevan effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT volinavv effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT sokollv effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT ostankovmv effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT golʹcevka effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT černousovass effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells AT kožinaoû effectofhypothermicstorageandcryopreservationonhumancordbloodleucoconcentratecells |