Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят

Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят

Исследовали влияние способа криоконсервирования биологического материала (состав криозащитной среды, скорость охлаждения, криоконсервирование фрагментов ткани или первичной культуры) на жизнеспособность клеток надпочечников новорожденных поросят, а также их поведение при дальнейшем культивировании...

Повний опис

Збережено в:
Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :Проблемы криобиологии
Дата:2011
Автори: Сидоренко, О.С., Божок, Г.А., Легач, Е.И., Гурина, Т.М.
Формат: Стаття
Мова:Russian
Опубліковано: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2011
Теми:
Криоконсервирование биообъектов
Онлайн доступ:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44886
Теги: Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят / О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 58-67. — Бібліогр.: 24 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44886
record_format dspace
spelling Сидоренко, О.С.
Божок, Г.А.
Легач, Е.И.
Гурина, Т.М.
2013-06-06T15:49:07Z
2013-06-06T15:49:07Z
2011
Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят / О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 58-67. — Бібліогр.: 24 назв. — рос., англ.
0233-7673
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44886
57.086.833:615.361.451.014.41
Исследовали влияние способа криоконсервирования биологического материала (состав криозащитной среды, скорость охлаждения, криоконсервирование фрагментов ткани или первичной культуры) на жизнеспособность клеток надпочечников новорожденных поросят, а также их поведение при дальнейшем культивировании. Разработали способ криоконсервирования, позволяющий достичь высокой сохранности и жизнеспособности клеток, а также сохранить способность к адгезии и распластыванию при последующем культивировании.
Досліджували вплив способу кріоконсервування біологічного матеріалу (склад кріозахисного середовища, швидкість охолодження, кріоконсервування фрагментів тканини або первинної клітинної культури) на життєздатність клітин наднирників новонароджених поросят, а також їх поведінку при подальшому культивуванні. Розробили спосіб кріоконсервування, який дозволяє досягти високого рівня збереження та життєздатності клітин, а також зберегти здатність до адгезії та розпластування при наступному культивуванні.
There was investigated the effect of method of biological material cryopreservation (composition of cryoprotective medium, cooling rate, cryopreservation of tissue fragments or primary cell culture) on viability of newborn piglets adrenal cells as well as their behavior during further culturing. The cryopreservation method, enabling to achieve a high survival and viability of cells as well as to preserve their ability to adhesion and flattening during further culturing was developed.
ru
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Проблемы криобиологии
Криоконсервирование биообъектов
Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
Study of Possibility to Obtain and Cryopreserve Adrenal Cell Primary Culture of Newborn Piglets
Article
published earlier
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection DSpace DC
title Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
spellingShingle Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
Сидоренко, О.С.
Божок, Г.А.
Легач, Е.И.
Гурина, Т.М.
Криоконсервирование биообъектов
title_short Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
title_full Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
title_fullStr Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
title_full_unstemmed Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
title_sort изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят
author Сидоренко, О.С.
Божок, Г.А.
Легач, Е.И.
Гурина, Т.М.
author_facet Сидоренко, О.С.
Божок, Г.А.
Легач, Е.И.
Гурина, Т.М.
topic Криоконсервирование биообъектов
topic_facet Криоконсервирование биообъектов
publishDate 2011
language Russian
container_title Проблемы криобиологии
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
format Article
title_alt Study of Possibility to Obtain and Cryopreserve Adrenal Cell Primary Culture of Newborn Piglets
description Исследовали влияние способа криоконсервирования биологического материала (состав криозащитной среды, скорость охлаждения, криоконсервирование фрагментов ткани или первичной культуры) на жизнеспособность клеток надпочечников новорожденных поросят, а также их поведение при дальнейшем культивировании. Разработали способ криоконсервирования, позволяющий достичь высокой сохранности и жизнеспособности клеток, а также сохранить способность к адгезии и распластыванию при последующем культивировании. Досліджували вплив способу кріоконсервування біологічного матеріалу (склад кріозахисного середовища, швидкість охолодження, кріоконсервування фрагментів тканини або первинної клітинної культури) на життєздатність клітин наднирників новонароджених поросят, а також їх поведінку при подальшому культивуванні. Розробили спосіб кріоконсервування, який дозволяє досягти високого рівня збереження та життєздатності клітин, а також зберегти здатність до адгезії та розпластування при наступному культивуванні. There was investigated the effect of method of biological material cryopreservation (composition of cryoprotective medium, cooling rate, cryopreservation of tissue fragments or primary cell culture) on viability of newborn piglets adrenal cells as well as their behavior during further culturing. The cryopreservation method, enabling to achieve a high survival and viability of cells as well as to preserve their ability to adhesion and flattening during further culturing was developed.
issn 0233-7673
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44886
citation_txt Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят / О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 1. — С. 58-67. — Бібліогр.: 24 назв. — рос., англ.
work_keys_str_mv AT sidorenkoos izučenievozmožnostipolučeniâikriokonservirovaniâpervičnoikulʹturykletoknadpočečnikovnovoroždennyhporosât
AT božokga izučenievozmožnostipolučeniâikriokonservirovaniâpervičnoikulʹturykletoknadpočečnikovnovoroždennyhporosât
AT legačei izučenievozmožnostipolučeniâikriokonservirovaniâpervičnoikulʹturykletoknadpočečnikovnovoroždennyhporosât
AT gurinatm izučenievozmožnostipolučeniâikriokonservirovaniâpervičnoikulʹturykletoknadpočečnikovnovoroždennyhporosât
AT sidorenkoos studyofpossibilitytoobtainandcryopreserveadrenalcellprimarycultureofnewbornpiglets
AT božokga studyofpossibilitytoobtainandcryopreserveadrenalcellprimarycultureofnewbornpiglets
AT legačei studyofpossibilitytoobtainandcryopreserveadrenalcellprimarycultureofnewbornpiglets
AT gurinatm studyofpossibilitytoobtainandcryopreserveadrenalcellprimarycultureofnewbornpiglets
first_indexed 2025-11-25T13:49:06Z
last_indexed 2025-11-25T13:49:06Z
_version_ 1850516072647622656
fulltext 58 * Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: bozhokgaru@mail.ru * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: bozhokgaru@mail.ru Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков УДК 57.086.833:615.361.451.014.41 О.С. СИДОРЕНКО, Г.А. БОЖОК*, Е.И. ЛЕГАЧ, Т.М. ГУРИНА Изучение возможности получения и криоконсервирования первичной культуры клеток надпочечников новорожденных поросят UDC 57.086.833:615.361.451.014.41 O.S. SIDORENKO, G.A. BOZHOK*, E.I. LEGACH, T.M. GURINA Study of Possibility to Obtain and Cryopreserve Adrenal Cell Primary Culture of Newborn Piglets Исследовали влияние способа криоконсервирования биологического материала (состав криозащитной среды, скорость охлаждения, криоконсервирование фрагментов ткани или первичной культуры) на жизнеспособность клеток надпочечников новорожденных поросят, а также их поведение при дальнейшем культивировании. Разработали способ криоконсервирования, позволяющий достичь высокой сохранности и жизнеспособности клеток, а также сохранить способность к адгезии и распластыванию при последующем культивировании. Ключевые слова: фрагменты надпочечников, первичная культура клеток надпочечников, криоконсервирование, жизнеспособность, адгезия. Досліджували вплив способу кріоконсервування біологічного матеріалу (склад кріозахисного середовища, швидкість охолодження, кріоконсервування фрагментів тканини або первинної клітинної культури) на життєздатність клітин наднирників новонароджених поросят, а також їх поведінку при подальшому культивуванні. Розробили спосіб кріоконсервування, який дозволяє досягти високого рівня збереження та життєздатності клітин, а також зберегти здатність до адгезії та розпластування при наступному культивуванні. Ключові слова: фрагменти наднирників, первинна культура клітин наднирників, кріоконсервування, життєздатність, адгезія. There was investigated the effect of method of biological material cryopreservation (composition of cryoprotective medium, cooling rate, cryopreservation of tissue fragments or primary cell culture) on viability of newborn piglets adrenal cells as well as their behavior during further culturing. The cryopreservation method, enabling to achieve a high survival and viability of cells as well as to preserve their ability to adhesion and flattening during further culturing was developed. Key words: adrenal fragments, primary culture of adrenal cells, cryopreservation, viability, adhesion. Клеточная и тканевая трансплантация все чаще применяется для лечения заболеваний эндокринной системы, сопровождающихся недостаточной выработкой гормонов [11]. При лечении первичной и вторичной гормональной надпочечниковой недостаточности доказана эффективность транс- плантации клеточных и органотипических культур надпочечников [6, 18, 21]. Для получения биологи- ческого материала в экспериментальных целях и для клинического применения в перспективе донорами клеток и тканей для ксенотрансплан- тации человеку могут быть свиньи. Криоконсервирование – наиболее приемлемый способ долгосрочного хранения биологического материала до трансплантации. На современном этапе развития криобиологии разработаны режи- мы замораживания фрагментов и органотипичес- ких культур ткани надпочечников, позволяющие со- хранить гормонопродуцирующую функцию клеток Cell and tissue transplantation is mostly used for treatment of endocrine system diseases accompanied by insufficient hormone production [11]. During treat- ment of primary and secondary hormonal adrenal de- ficiency there was established the efficiency of cell and organotypic adrenal cultures’ transplantation [6, 18, 21]. For obtaining the biological material for ex- perimental purposes and clinical use the pigs could be perspective donors of cells and tissues for xenotrans- plantation in human. Cryopreservation is the most reasonable method for long-term storage of biological material prior to trans- plantation. The freezing regimens for fragments and organotypic cultures of adrenal tissue, enabling to pre- serve hormone-producing cell function [4, 6] have been designed at the present stage of cryobiology develop- ment. However, organotypic culture does not manifest a proliferative activity under long-term culturing. Its trophic support is impaired during culturing, and there problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 59 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 [4, 6]. Однако органотипическая культура при дол- госрочном культивировании не проявляет пролифе- ративной активности. В процессе культивирования нарушается ее трофическая поддержка, накапли- ваются вредные продукты обмена веществ, что приводит к деградации такой культуры на 5–7-е сутки культивирования [17]. Альтернативным источником биологического материала для транс- плантации является первичная культура клеток (ПКК) надпочечников. Для получения ПКК натив- ная ткань подвергается измельчению на фрагмен- ты и последующей ферментативной обработке (рис. 1). Полученные одиночные клетки поме- щаются в питательную среду для культивирования. Криоконсервирование позволяет хранить ПКК длительное время до момента трансплантации. Криоконсервирование биологического материала в виде фрагментов ткани более быстрый и эконо- мически выгодный процесс по сравнению с крио- консервированием первичной культуры. Запас криоконсервированной ткани позволяет в любое время получить ПКК. При сохранении морфоло- гических и функциональных особенностей, ПКК, полученные из криоконсервированных фрагментов ткани, могут быть использованы для дальнейших исследований или трансплантаций. Криоконсервирование должно обеспечивать сохранность максимального количества жизне- способных клеток. Кроме того, клетки, полученные из криоконсервированного материала и предназна- ченные для культивирования, должны обладать способностью к адгезии и распластыванию. В доступной литературе отсутствуют сведения о получении ПКК из криоконсервированных фраг- ментов надпочечников. Также не разработана методика криоконсервирования ПКК надпочеч- ников новорожденных поросят, полученных из нативных фрагментов ткани. В нашей работе мы исследовали в сравнитель- ном аспекте жизнеспособность и адгезию клеток надпочечников новорожденных поросят, получен- ных из криоконсервированных фрагментов ткани, а также из криоконсервированной ПКК. Цель работы – разработка способа криоконсер- вирования биологического материала в виде фраг- ментов ткани и ПКК надпочечников новорожден- ных поросят, позволяющего сохранить максималь- ное количество жизнеспособных клеток для дальнейшего культивирования. Материалы и методы Эксперименты проведены в соответствии с "Общими принципами экспериментов на живот- ных", одобренными III Национальным конгрессом по биоэтике (2007, Киев) и согласованными с поло- жениями "Европейской Конвенции о защите позво- is an accumulation of toxic products of metabolism, that results in degradation of the culture by the 5–7th day of culturing [17]. Primary cell culture (PCC) of adrenal glands is the alternative source of biological material for transplantation. For obtaining the PCC the tissue is fragmented and then treated with enzymes (Fig. 1). Obtained single cells are placed into nutrition medium for culturing. Cryopreservation enables to pre- serve PCC during long period prior to transplantation. Cryopreservation of biological material in the form of tissue fragments is more rapid and cost-effective proc- ess unlike the primary culture cryopreservation. The stock of cryopreserved tissue enables to obtain PCC when required. If morphology and functional peculi- arities are preserved, the PCC, obtained from cryo- preserved tissue fragments may be used for further research and transplantation. Cryopreservation must provide the preservation of maximum number of viable cells. Moreover, the cells obtained from cryopreserved material and suitable for culturing should have the ability to adhesion and flat- tening. The available literarture does not contain the infor- mation on obtaining the PCC from cryopreserved frag- ments of adrenal glands. There is also no descibed method of cryopreservation of newborn piglet adrenal PCC obtained from native tissue fragments. In this paper we compared the viability and adhe- sive ability of newborn piglet adrenal cells obtained from cryopreserved fragments of tissue and from cryopreser- ved PCC. Механическое измельчение Mechanical blending Криоконсер- вирование Cryopreser- vation Нативная ткань Native tissue Фрагменты Fragments Ферментативная обработка Enzymatic treatment Одиночные клетки Single cells ПКК PCC Криоконсерви- рованные фрагменты Cryopreserved fragments Одиночные клетки Single cells ПКК PCC Рис. 1. Схема получения ПКК из нативных и криоконсер- вированных фрагментов ткани. Fig. 1. Diagram of PCC derivation from native and cryopre- served tissue fragments 60 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 ночных животных, используемых для эксперимен- тальных и других научных целей" (Страсбург, 1985). Источником биологического материала слу- жили новорожденные поросята первого поколения пород крупная белая и украинская мясная. После экстирпации железы измельчали на фрагменты размером около 1 мм3, отмывали от крови 3–4 раза средой 199 (“Sigma”, США) с антибио- тиками (пенициллин, стрептомицин). Фрагменты надпочечников криоконсервировали под защитой диметилсульфоксида (ДМСО) в конечной концент- рации 10% с использованием двух режимов замо- раживания: в режиме 1 фрагменты охлаждали со скоростью 5°С/мин до –70°С на программном замораживателе "Cryoson" (Германия) с последую- щим погружением в жидкий азот, в режиме 2 – со скоростью 100–150°С/мин по методу [14] трехэтап- ным погружением в жидкий азот. Клетки надпочечников новорожденных поросят получали из нативных и криоконсервированных фрагментов ткани ферментативным способом. Замороженные фрагменты надпочечников отогре- вали на водяной бане при температуре 40°С, затем пятикратно отмывали от ДМСО средой 199 с антибиотиками. Фрагменты подвергали фермента- тивной обработке коллагеназой (тип IA, 1 мг/мл, “Sigma”, США) и деоксирибонуклеазой (0,1– 0,15 мг/мл, “Sigma”, США) на среде 199 при 37°С и постоянном помешивании в три этапа (30, 10 и 10 мин). После отмывки от коллагеназы и деокси- рибонуклеазы полученную суспензию клеток для удаления клеточного дебриса пропускали через нейлоновое сито с диаметром пор 125 мкм. Клетки, полученные из нативных и криокон- сервированных фрагментов ткани, культивировали на питательной среде 199 с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, “Sigma”, США) и антибиотиков (пенициллин, канамицин) при 37°С в атмосфере с 5% СО2. На 3–7-е сутки культивирования образовав- шийся клеточный монослой открепляли от поверх- ности культивирования с использованием смеси растворов трипсина (“Sigma”, США) и Версена (“Биолот”, Россия) в соотношении 1:1 (конечная концентрация трипсина составляла 0,25%) при 37°С в течение 3 мин. К открепившимся клеткам добав- ляли среду 199 с 5% ЭТС, пипетировали, собирая их в отдельную пробирку. От трипсина клетки отмывали средой 199 с 5% ЭТС двукратным цент- рифугированием. Для оценки возможного токсического влияния криопротектора ДМСО к суспензии клеток, полу- ченной после открепления клеточного монослоя и отмывки от трипсина, добавляли раствор ДМСО, конечная концентрация которого составляла 10 и The research aim was to develop the cryopreser- vation method for biological material in the form of tissue fragments and PCC of newborn piglet adrenal glands, enabling to preserve maximum number of vi- able cells for further culturing. Materials and methods The experiments in animals were performed ac- cording to the General ethical principles of experiments in animals, approved by the 3rd National congress on bioethics (Kiev, 2007) and agreed with the statements of the European Convention for the Protection of Ver- tebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1985). The newborn piglets of first generation of Large White and Ukrainian Meat breeds were the source of biological material. After extirpation the glands were fragmented into pieces of about 1 mm3, washed from blood thrice or four times with the medium 199 (Sigma, USA) supple- mented with antibiotics (penicillin, streptomycin). The fragments of adrenal glands were cryopreserved un- der protection of dimethylsulfoxide (DMSO) in 10% final concentration using two freezing regimens: in the regimen 1 the fragments were cooled with the rate of 5°C/min down to –70°C in the programmable freezer "Cryoson" (Germany) and further plunging into liquid nitrogen; regimen 2 comprised three step plunging into liquid nitrogen with average cooling rate of 100– 150°C/min according to the method [14]. The adrenal cells of newborn piglets were obtained from native and cryopreserved tissue fragments by enzymatic method. The frozen fragments of adrenal glands were thawed in water bath at 40°C, then five- times washed from DMSO by medium 199 supple- mented with antibiotics. The fragments were enzy- matically treated with collagenase (type IA, 1 mg/ml, Sigma, USA) and deoxyribonuclease (0.1–0.15 mg/ml, Sigma, USA) in medium 199 at 37°C and constant mixing during three cycles (30, 10 and 10 min). After washing from collagenase and deoxyribonuclease the cell debris was removed by filtering the obtained cell suspension through nylon sieve with pore diameter of 125 mm. The cells obtained from native and cryopreserved tissue fragments were cultured in nutrition medium 199 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma, USA) and antibiotics (penicillin, kanamycin) at 37°C in the 5% CO2 atmosphere. By the 3–7th culturing day the formed cell mono- layer was detached from a culturing surface by trypsin (Sigma, USA) and Versene (Biolot, Russia) solutions’ mixture in 1:1 ratio (final concentration of trypsin made 0.25%) at 37°C for 3 min. Medium 199 supplemented with 5% FBS was added to detached cells, then the 61 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 15%, и оставляли на 20 мин при комнатной температуре. Затем клетки отмывали от ДМСО средой 199 путем постепенного снижения концент- рации ДМСО и центрифугирования. После этого подсчитывали количество клеток в камере Горяе- ва и оценивали их жизнеспособность. После открепления клеточного монослоя и от- мывки от трипсина клетки осаждали центрифугиро- ванием, сливали надосадочную жидкость и добав- ляли равный объем соответствующей криозащит- ной среды двойной концентрации. В работе приме- няли несколько вариантов криозащитных сред: среда 199 с 5; 7; 10 и 15% ДМСО (конечная концен- трация), а также среда 199 с 5; 7; 10 и 15% ДМСО в сочетании с 25% ЭТС (конечная концентрация). Образцы ПКК замораживали со скоростью 1°С/мин до –70°С на программном заморажива- теле "Cryoson" (Германия) с последующим погру- жением в жидкий азот. Замороженные образцы ПКК отогревали на водяной бане при температуре 40°С. Затем клетки отмывали от ДМСО средой 199 постепенным сни- жением концентрации ДМСО и центрифугирова- нием. Жизнеспособность клеток определяли методом суправитального окрашивания трипановым синим [8] и выражали в процентах как отношение коли- чества живых клеток к их общему количеству. Со- хранность клеток в суспензии после криоконсерви- рования рассчитывали как количество клеток в суспензии после отогрева по отношению к коли- честву клеток до замораживания, выраженное в процентах. После отогрева ПКК и отмывки от ДМСО клет- ки помещали в питательную среду и культивирова- ли 6 ч 30 мин. После этого собирали культуральную среду, содержащую неприкрепившиеся клетки, и подсчитывали их количество. Процент адгезии вычисляли по формуле: %1001 ⋅    −= ПК НКА , где НК – количество неприкрепившихся клеток; ПК – количество клеток, посаженных на культиви- рование. При статистической обработке результатов ис- пользовали однофакторный дисперсионный анализ и t-критерий Стьюдента [2]. Достоверными счита- лись различия при р < 0,05. Данные представляли как среднее значений, полученных в серии анало- гичных экспериментов (n = 10), ± стандартное отклонение. suspension was pipetted, and collected into separate tube. The cells were twice washed (with centrifuga- tion) from trypsin by medium 199 supplemented with 5% FBS. To estimate a possible toxic effect of DMSO cryo- protectant it’s solution in final concentration of 10 and 15% was added to cell suspension obtained after de- taching of cell monolayer and washing from trypsin and kept for 20 min at room temperature. Later the cells were washed from DMSO with medium 199 by a gradual reduction of DMSO concentration and cen- trifugation. Afterwards a number of cells was calcu- lated in Goryaev's chamber and their viability was evalu- ated. After detaching of cell monolayer and washing from trypsin the cells were sedimented by centrifugation, supernatant fluid was removed and an equal volume of certain cryoprotective medium of double concen- tration was added. During study we used the following variants of cryoprotective media: medium 199 with 5; 7; 10 and 15% DMSO (final concentration) as well as medium 199 with 5;7;10 and 15% DMSO in combina- tion with 25% FBS (final concentration). The samples of PCCs were frozen with the rate of 1°C/min down to –70°C in the programmable freezer "Cryoson" (Germany) with further plunging into liquid nitrogen. The frozen samples of PCCs were thawed in wa- ter bath at 40°C. Then the cells were washed from DMSO with medium 199 by gradual reduction of DMSO concentration and centrifugation. The cell viability was determined by the method of supravital staining with trypan blue [8] and expressed in percents as the ratio of viable cell number and their total number. The post-thaw cell survival in suspen- sion was evaluated as a number of cells in suspension after thawing in respect of cell number prior to freez- ing, and expressed in percents. After thawing of PCC and washing from DMSO the cells were placed into nutrition medium and cul- tured during 6 hrs 30 min. Afterthat the culture me- dium containing non-attached cells was collected and their number was calculated. Adhesion percentage was calculated by the formula: % PC NCA 1001 ⋅    −= , where NC is the number of non-attached cells; PC is the number of cells placed for culturing. The results were statistically processed using the single-factor dispersion analysis and Student's t-crite- rion [2]. The differences were considered as statisti- 62 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 Результаты и обсуждение Известно, что криопротекторы могут оказывать токсическое действие на клетку [5, 13]. Исследова- ли влияние наибольших концентраций ДМСО (как отдельно, так и в сочетании с 25% ЭТС), применяе- мых для криоконсервирования фрагментов и ПКК надпочечников, на жизнеспособность клеток. Объектом исследования являлась ПКК 7 суток культивирования. Контролем служили клетки той же культуры, прошедшие все этапы эксперимен- тальной обработки, кроме добавления ДМСО (рис. 2). Жизнеспособность клеток в контрольной пробе составляла 78,0 ± 11,9%. Жизнеспособность кле- ток, обработанных ДМСО разной концентрации, колебалась от 68 ± 13,3 до 81,4 ± 3,9%. Статисти- чески достоверных различий между данными по жизнеспособности клеток представленных групп обнаружено не было. Это позволило сделать выво- ды, что ДМСО в концентрации до 15% не снижает этот показатель. Следующим этапом работы было криоконсер- вирование фрагментов ткани надпочечников для получения из них ПКК. Для этого был выбран криопротектор ДМСО в конечной концентрации 10%. Ранее была показана эффективность криокон- сервирования органотипических культур надпочеч- ников [14], а также кластеров хромаффинной ткани [22] именно с такой концентрацией ДМСО. Жизнеспособность клеток, полученных из крио- консервированных фрагментов надпочечников, замороженных в режимах 1 и 2, была достоверно ниже по сравнению с жизнеспособностью клеток, полученных из нативных фрагментов ткани (рис.3), и составляла 46,2 ± 20,6 и 37,6 ± 12,7% соответ- ственно. Жизнеспособность клеток, полученных из нативных фрагментов ткани, составляла 76,1 ± 6,2%. Таким образом, жизнеспособность клеток, полученных из криоконсервированных фрагментов надпочечников, значительно снижается вне зависи- мости от выбранных режимов замораживания фрагментов. Возможно, это связано с разрушитель- ным действием криоповреждающих факторов и последующей ферментативной обработкой фраг- ментов ткани. Как известно, большинство нетрансформиро- ванных клеток млекопитающих (за исключением лимфоцитов) для роста в культуре нуждаются в прикреплении к поверхности культивирования. Неприкрепившиеся к поверхности клетки быстро дегенерируют [1]. Для получения ПКК из криокон- сервированных фрагментов ткани необходимо со- хранить свойства клеток прикрепляться к поверх- ности культивирования и способность к пролифе- рации. Однако мы обнаружили, что при культивиро- вании клеток, полученных из криоконсервирован- cally significant at p < 0.05. The data were presented as an mean of values, obtained in the series of analo- gous experiments (n = 10) ± standard deviation. Results and discussion Cryoprotectants are known to affect toxically the cell [5, 13]. We studied the effect of the highest con- centrations of DMSO (both separately and in combi- nation with 25% of FBS) used for cryopreservation of fragments and adrenal PCCs on cell viability. The re- search object was PCC after 7 days of culturing. As the control served the cells of the same culture speci- men, underwent all the stages of experimental treat- ment, except addition of DMSO (Fig. 2). Viability of cells in the control sample made 78.0 ± 11.9%. Viability of cells, treated with DMSO of differ- ent concentration varied from 68 ± 13.3 to 81.4 ± 3.9%. No statistically significant differences were found be- tween the data on cell viability of presented groups. This enabled to conclude that 15% DMSO did not re- duce this index. The following research stage was cryopreservation of the fragments of adrenal tissue for deriving the PCCs from them. For this aim we selected DMSO cryopro- tectant in 10% final concentration. Earlier this con- centration was shown as the efficient one during cryo- preservation of adrenal organotypic cultures [14] as well as clusters of chromaffin tissue [22]. Рис. 2. Зависимость жизнеспособности клеток надпочеч- ников новорожденных поросят от концентрации ДМСО в среде инкубации: 1 – без ДМСО; 2 – 10% ДМСО; 3 – 15% ДМСО; 4 – 10% ДМСО + 25% ЭТС; 5 – 15% ДМСО + 25% ЭТС. Fig. 2. Dependence of adrenal cell viability of newborn piglets vs. DMSO concentration in incubation medium: 1 – without DMSO (the control); 2 – 10% DMSO; 3 – 15% DMSO; 4 – 10% DMSO + 25% FBS; 5 – 15% DMSO + 25% FBS. 81,480,878,578 68 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 Ж из не сп ос об но ст ь кл ет ок , % C el l v ia bi lit y, % Условия инкубации Incubation conditions 63 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 ных фрагментов, замороженных в режимах 1 и 2, к 3-м суткам видны одиночные живые клетки, плавающие в среде, а также прикрепившиеся, но не распластанные. В таких культурах не происходи- ли пролиферация клеток и формирование монослоя в течение 12 суток культивирования. Вероятно, это связано с повреждением белков цитоскелета [3], принимающих участие в распластывании и дви- жении клеток на поверхности культивирования [24]. Криоконсервирование фрагментов надпочечни- ков новорожденных поросят с использованием описанных скоростей охлаждения не позволяет получить ПКК, поскольку такие клетки не расплас- тываются на поверхности культивирования, что исключает возможность формирования монослоя. Вероятно, желаемого результата удастся достиг- нуть, изменяя режим криоконсервирования так, чтобы нивелировать повреждения клеток во время замораживания фрагментов ткани. В связи с тем, что нам не удалось получить ПКК из криоконсервированных фрагментов ткани надпочечников, была предпринята попытка крио- консервировать ПКК, полученную из нативных фрагментов ткани. После 1-х суток культивирова- ния клетки, полученные из нативных надпочечных желез, прикреплялись к поверхности и распласты- вались. К 3–4-м суткам образовывался монослой из крупных фибробластоподобных и веретено- Viability of cells obtained from cryopreserved ad- renal fragments frozen-thawed using regimens 1 and 2 was significantly lower if compared with viability of cells obtained from native tissue fragments (Fig. 3) and made 46.2 ± 20.6 and 37.6 ± 12.7%, correspondingly (Fig. 3). The viability of cells obtained from native tis- sue fragments made 76.1 ± 6.2%. Thus, viability of cells obtained from cryopreserved adrenal fragments significantly decreases independent- ly on chosen regimens for the fragments’ freezing. Probably this is caused by destructive effects of cryoda- maging factors and following enzymatic treatment of tissue fragments. Most non-transformed mammalian cells (except lymphocytes) are known to require the attachment onto culturing surface for growth in culture. The non-at- tached cells rapidly degenerate [1]. To obtain PCC from cryopreserved tissue fragments it is necessary to pre- serve the properties of cells to attach to culturing sur- face as well as the proliferation ability. However, dur- ing culturing of cells, obtained from cryopreserved frag- ments, frozen-thawed according to regimens 1 and 2 we observed by the 3rd day only the single viable cells, floating in the medium, as well as attached, but not flattened cells. In these cultures no cell proliferation and monolayer formation occured during 12 days of culturing. Probably it is associated with impairments in cytoskeleton proteins [3], participating in cell spread- ing and movement on culturing surface [24]. Freeze-thawing of adrenal fragments of newborn piglets using the described cooling rates did not allow to obtain PCC: the frozen-thawed cells did not flatten on culturing surface, making the monolayer formation not possible. Probably, the better result could be achie- ved by changing the freeze-thawing regimen param- eters in a manner to neutralize cell damaging when freezing tissue fragments. Unsuccessful attempts of obtaining the PCC from the cryopreserved fragments of adrenal tissue led us to check if cryopreservation of PCC obtained from native tissue fragments is possible. After the 1st day of culturing the cells obtained from native adrenal glands attached to the surface and flattened. By the 3rd–4th day there was formed the monolayer of large fibroblast- like and spindle-shaped cells. By the 3rd–7th day of cul- turing the monolayer was detached from the cultural surface and the cell suspension was frozen. To cryopreserve mammalian PCC the most widely applied methods include the regimens providing slow cooling rates [1] with 10% DMSO solution as cryopro- tectant [13, 20]. In our experiments on PCC cryopre- servation we tested DMSO concentrations from 5 to 15%. In parallel series of experiments the FBS was added into the cryoprotective media with the same DMSO concentrations. Рис.3. Жизнеспособность клеток, полученных из фраг- ментов ткани надпочечников, криоконсервированных в режимах 1 и 2; * – отличия достоверны по сравнению с контролем, р < 0,05. Контролем служили клетки, получен- ные из нативных фрагментов ткани. Fig. 3. Viability of cells derived from adrenal tissue frag- ments cryopreserved with regimens 1 and 2; * – differences were significant if compared with the control, p < 0.05. The cells derived from native tissue fragments were the control. �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� �������������� 37,6 46,2 76,1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Контроль Режим 1 Режим 2 * * Control Ж из не сп ос об но ст ь кл ет ок , % C el l v ia bi lit y, % Regimen 1 Regimen 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 * # # # # 64 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 It has been known that FBS assists to balance os- motic pressure during cryopreservation of cell cultures, therefore it is often used as a component of cryopro- tective medium [12, 15, 20]. However, the data on ef- fect of the serum on survival of frozen-thawed cells are contradictory. For example, it was shown recently [15] that FBS addition into cryoprotective medium re- sulted in increased viability of brain tumor stem cells. Other authors reported [20] the absence of FBS ef- fect on fibroblasts' viability during freezing-thawing of vessels. It should be also considered that many researchers decline the application of the serum to decrease the risk of contamination of cell culture and to standardize the experimental conditions [10, 16, 21]. The effect of FBS as a supplement of cryoprotec- tive medium on adrenal cell number preservation rate and viability after freeze-thawing of PCCs was stud- ied. The content of FBS in composition of cryoprotec- tive medium made 25%. The cell survival and viability образных клеток. На 3–7-е сутки культивирования монослой открепляли от поверхности культураль- ных сосудов, полученные клетки замораживали. Для криоконсервирования ПКК млекопитающих наиболее широко применяются режимы, предус- матривающие медленные скорости охлаждения [1], с использованием 10%-го раствора ДМСО в качестве криопротектора [13, 20]. В наших экспери- ментах по криоконсервированию ПКК были опро- бованы концентрации ДМСО от 5 до 15%. В парал- лельной серии экспериментов к криозащитным средам с аналогичными концентрациями ДМСО добавлялась ЭТС. Известно, что ЭТС помогает сбалансировать осмотическое давление при криоконсервировании клеточных культур, поэтому она часто применяется как компонент криозащитной среды [12, 15, 20]. Однако данные о влиянии сыворотки на жизнеспо- собность криоконсервированных клеток проти- воречивы. Так, в работе [15] показано, что добавле- ние ЭТС в криозащитную среду способствует по- вышению жизнеспособности стволовых клеток опухоли мозга. В [20] отмечено отсутствие влия- ния ЭТС на жизнеспособность фибробластов при криоконсервировании сосудов. Необходимо учитывать, что многие исследова- тели отказываются от применения сыворотки для снижения риска контаминации клеточной культуры и стандартизации условий эксперимента [10, 16, 21]. Исследовали влияние ЭТС как добавочного компонента криозащитной среды на сохранность и жизнеспособность клеток надпочечников при криоконсервировании ПКК. Содержание ЭТС в составе криозащитной среды составляло 25%. Оценивали сохранность и жизнеспособность кле- ток, криоконсервированных в криозащитных сре- дах, содержащих различные концентрации ДМСО (5; 7; 10; 15%) без ЭТС и с добавлением 25% ЭТС (рис. 4). Сохранность клеток, криоконсервирован- ных в описанных средах, колебалась от 62,4 ± 17,1 до 89,0 ± 17,6%. При добавлении в криозащитную среду ЭТС жизнеспособность клеток достоверно увеличивалась. Так, жизнеспособность клеток в каждой пробе с ЭТС была выше по сравнению с пробами, содержащими ту же концентрацию ДМСО, но без ЭТС. Наибольшие показатели жиз- неспособности выявлялись в образцах, криокон- сервированных в средах с 5; 7; 10% ДМСО в соче- тании с 25% ЭТС. В этих пробах жизнеспособность составляла от 87,1 ± 8,4 до 91,0 ± 6,2%. Жизнеспо- собность клеток, криоконсервированных в среде с 15% ДМСО и 25% ЭТС, оказалась ниже по срав- нению с остальными пробами с ЭТС. Вероятно, это связано с тем, что ДМСО в концентрации 15% является токсичным для клеток при криоконсер- вировании. Рис. 4. Сохранность ( ) и жизнеспособность ( ) клеток надпочечников, криоконсервированных в виде ПКК в различных криозащитных средах; : 1 – 5% ДМСО; 2 – 7% ДМСО; 3 – 10% ДМСО; 4 – 15% ДМСО; 5 – 5% ДМСО + 25% ЭТС; 6 – 7% ДМСО + 25% ЭТС; 7 – 10% ДМСО + 25% ЭТС; 8 – 15% ДМСО+25% ЭТС; * – отличия досто- верны по сравнению с данным показателем в средах других составов, р < 0,05; # – отличия достоверны по сравнению с данным показателем в средах, содержащих те же концентрации ДМСО, но без ЭТС, р < 0,05. Fig. 4. Cell survival rate ( ) and viability ( ) of adrenal cells cryopreserved as PCCs in different cryoprotective media: 1 – 5% DMSO; 2 – 7% DMSO; 3 – 10% DMSO; 4 – 15% DMSO; 5 – 5% DMSO + 25% FBS; 6 – 7% DMSO + 25% FBS; 7 – 10% DMSO + 25% FBS; 8 – 15% DMSO + 25% FBS.; * – differences are significant if compared with given index in the media containing the same DMSO concentrations, but without FBS, p < 0.05. Криозащитная среда Cryoprotective media Ко ли че ст во к ле то к, % C el l a m ou nt , % 65 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 При культивировании клеток, полученных из криоконсервированных ПКК, большая часть из них прикреплялась и распластывалась на поверхности культуральных сосудов уже через 6 ч 30 мин куль- тивирования. Мы оценивали отношение прикрепившихся клеток к общему количеству клеток, посаженных на культивирование, а также долю распластанных клеток среди всех прикрепившихся. Полученные результаты, выраженные в процентах, отражены на диаграмме (рис. 5). После 6 ч 30 мин культивирования большая часть клеток, полученных из нативных фрагментов надпочечников и криоконсервированных в виде ПКК, прикрепилась к поверхности культивиро- вания. Статистически достоверной разницы по степени адгезии и количеству распластанных кле- ток между исследуемыми образцами не наблюда- лось. Степень адгезии составляла в среднем от 95,3 до 98,8%, при этом 78,6–92,7% всех прикрепив- шихся клеток распластывались. Таким образом, криоконсервирование ПКК надпочечников с ис- пользованием всех выбранных нами составов криозащитных сред позволяет сохранить адгезив- ную способность клеток на высоком уровне, что является необходимым условием для их пролифе- рации и формирования клеточного монослоя при дальнейшем культивировании. Выводы 1. Клетки, полученные из фрагментов надпо- чечников новорожденных поросят, криоконсерви- рованных согласно двум режимам: со скоростью 1°С/мин до –70°С и последующим погружением в жидкий азот и со скоростью 100–150°С/мин путем погружения в жидкий азот; характеризуются низ- after freeze-thawing in cryoprotective media contain- ing various DMSO concentrations (5; 7; 10 and 15%) without FBS and with 25% FBS were evaluated (Fig. 4). The cell survival rate after freeze-thawing in the described media varied from 62.4 ± 17.1 to 89.0 ± 17.6%. The addition of FBS into cryoprotective me- dium significantly increased the cell viability. For ex- ample the cell viability in each sample with FBS was higher if compared with the samples containing the same DMSO concentration, but without FBS. The high- est indices of viability were revealed in the samples cryopreserved in the media with 5; 7 and 10% DMSO in combination with 25% FBS. In these samples the viability made from 87.1 ± 8.4 to 91.0 ± 6.2%. The viability of cells frozen-thawed in the medium with 15% DMSO and 25% FBS was lower if compared with the other samples with FBS. Maybe it is due to the toxic effect of 15% concentration of DMSO on the cells during freeze-thawing. When culturing the cells obtained from frozen-tha- wed PCCs their major part had attached and flattened on the culturing surface already in 6 hrs and 30 min of culturing. We evaluated the ratio of the attached cells to total number of cells subjected to culturing as well as the part of flattened cells among all the attached ones. The obtained results expressed in percents were shown in the diagram (Fig. 5). After 6 hrs and 30 min of culturing we observed the attachment to culturing surface of the major part of the cells obtained from the native adrenal fragments and frozen-thawed in the form of PCCs. There was no statistically significant difference of adhesion rate and a number of flattened cells between the studied samples. The adhesion rate made in average from 95.3 to 98.8%, herewith 78.6–92.7% of all the attached cells were flattened. Thus, freeze-thawing of adrenal PCCs using all the chosen compositions of cryoprotective me- dia enabled to preserve high adhesive ability of cells, that is the essential condition for their proliferation and formation of cell monolayer during further culturing. Рис. 5. Относительное количество прикрепившихся ( ) и распластанных ( ) клеток, полученных из нативных фрагментов надпочечников и криоконсервированных в виде ПКК в различных криозащитных средах: 1– 5% ДМСО; 2 – 7% ДМСО; 3 – 10% ДМСО; 4 – 15% ДМСО; 5 – 5% ДМСО + 25% ЭТС; 6 – 7% ДМСО + 25% ЭТС; 7 – 10% ДМСО + 25% ЭТС; 8 – 15% ДМСО + 25% ЭТС. Fig. 5. Relative number of attached ( ) and flattened ( )cells derived from native fragments of adrenal glands and cryo- preserved as PCCs in different cryoprotective media: 1 – 5% DMSO; 2 – 7% DMSO; 3 – 10% DMSO; 4 – 15% DMSO; 5 – 5% DMSO + 25% FBS; 6 – 7% DMSO + 25% FBS; 7 – 10% DMSO + 25% FBS; 8 – 15% DMSO + 25% FBS. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1 2 3 4 5 6 7 8 Криозащитная среда Cryoprotective media Ко ли че ст во к ле то к, % C el l a m ou nt , % 66 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 кой жизнеспособностью, при культивировании не распластываются и не образуют монослоя. 2. Криоконсервирование ПКК надпочечников новорожденных поросят со скоростью 1°С/мин до –70 °С и последующим погружением в жидкий азот обеспечивает высокую сохранность и жизнеспо- собность клеток, а также позволяет сохранить их адгезивные свойства. Для криоконсервирования ПКК можно рекомендовать криозащитные среды, содержащие 5; 7; 10% ДМСО с добавлением 25% ЭТС. Такой состав сред обеспечивает максималь- ную сохранность и жизнеспособность клеток после отогрева. 3. Сравнительный анализ жизнеспособности и адгезивных свойств клеток, полученных из крио- консервированных фрагментов, а также из криокон- сервированной ПКК надпочечников новорожден- ных поросят, показал, что наиболее успешным способом сохранения клеток надпочечников для дальнейшего культивирования является криокон- сервирование первичной культуры. Литература Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков.– М.: Мир, 1983.– 263 с. Атраментова Л.А., Утевская О.М. Статистические ме- тоды в биологии.– Горловка, 2008.– 248 с. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук. думка, 1994.– 430 с. Бондаренко Т.П., Алабедалькарим Н.М., Божок Г.А. и др. Трансплантация криоконсервированного эндокринного материала как метод коррекции различных патологий у экспериментальных животных // Проблемы криобиоло- гии.– 2005.– Т. 15, №3.– С. 393–397. Глушко Т.А. Особенности пролиферации клеточных куль- тур после контакта с криопротекторами: Автореф. дис. ... канд. биол. наук.– Харьков, 1983.– 22 с. Легач Е.И. Опыт клинического использования криоконсер- вированной адренокортикальной ткани // Проблемы криобиологии.– 2000.– №3.– С. 85–90. Легач Е.И. Комбинированная трансплантация криоконсер- вированных органотипических культур эндокринных желез: Автореф. дис. ... докт. мед. наук.– Харьков, 2009.– 37 с. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования. Справочник.– М.: Медицина, 1987.– 398 с. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы.– Киев: Наук. думка, 1978.– 204 с. Трошкова Г.П., Мартынец Л.Д., Кирова Е.В. и др. Бессы- вороточная питательная среда для культивирования клеток VERO // Фундаментальные исследования.– 2005.– №5.– С. 94. Турчин І.С. Проблема трансплантації культур клітин і тканин залоз внутрішньої секреції хворим з різними фор- мами ендокринопатії // Ендокринологія.– 1996.– Т. 1, №2.– С. 6–13. Цуцаева А.А., Аграненко В.А., Федорова Л.И. и др. Крио- консервирование клеточных суспензий.– Киев: Наук. думка, 1983.– 240 с. Юрченко Т.Н., Козлова В.Ф., Скорняков Б.А. и др. Влияние криопротекторов на биологические системы.– Киев: Наук. думка, 1989.– 240 с. References Adams R. Methods of cell culture for biochemists.– Moscow: Mir, 1983.– 263 p. Atramentova L.A., Utevskaya O.M. Statistical methods in biology.– Gorlovka, 2008.– 248 p. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Nauk. Dumka, 1994.– 430 p. Bondarenko T.P., Alabedal'karim N.M., Bozhok G.A. et al. Transplantation of cryopreserved endocrine material as correction method of different pathologies in experimental animals // Problems of Cryobiology.– 2005.– Vol. 15, N3.– P. 393–397. Glushko T.A. Proliferation peculiarities of cell cultures after contact with cryoprotectants: Abstract of the thesis of cand. biol. sci.– Kharkov, 1983.– 22 p. Legach E.I. The experience of cryopreserved adrenocortical tissue clinical usage // Problems of Cryobiology.– 2000.– N3.– P. 85–90. Legach E.I. Combined transplantation of cryopreserved organotypical cultures of endocrine glands: Abstract of the thesis of cand. med. sci.– Kharkov, 2009.– 37 p. Men'shikov V.V. Laboratory methods of research. Manual.– Moscow: Meditsina, 1987.– 398 p. Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M. et al. Cryoprotec- tants.– Kiev: Nauk. Dumka, 1978.– 204 p. Troshkova G.P., Martynets L.D., Kirova E.V. et al. Without serum nutrition medium for culturing of VERO cells // Funda- mental'nye issledovaniya.– 2005.– N5.– 94 p. Turchin I.S. Problem of transplantation of tissues and cells cultures of endocrine glands to patients with different forms of endocrinopathies // Endokrinologiya.– 1996.– Vol. 1, N2.– P. 6–13. Tsutsaeva A.A., Agranenko V.A., Fedorova L.I. et al. Cryopre- servation of cell suspensions.– Kiev: Nauk. Dumka, 1983.– 240 p. Conclusions 1. The cells obtained from the newborn piglet adre- nal fragments frozen-thawed according the two regi- mens: with the rate of 1°C/min down to –70°C and further plunging into liquid nitrogen and with the rate of 100–150°C/min by plunging into liquid nitrogen; are characterized by low viability, do not flatten and form monolayer when culturing. 2. Cryopreservation of adrenal PCCs of newborn piglets with the rate of 1°C/min down to –70°C and further plunging into liquid nitrogen provides a high cell survival rate and viability, as well as enables to pre- serve their adhesive properties. For cryopreservation of PCCs the cryoprotective media containing 5; 7; 10% DMSO with addition of 25% FBS could be recom- mended. This composition of media provides maximum preservation of cell number and viability after thaw- ing. 3. The comparative analysis of viability and adhe- sive properties of cells obtained from frozen-thawed fragments as well from frozen-thawed PCCs of new- born piglet adrenal glands showed that cryopreservation of primary culture was the most useful method to pre- serve adrenal cells for further culturing. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 67 problems of cryobiology Vol. 21, 2011, №1 проблемы криобиологии Т. 21, 2011, №1 Патент №4567 (Україна), МПК7, №12N5/08, A01N1/02. Спосіб кріоконсервування органної культури надниркових залоз. Т.М. Гурина, Н.М. Алабедалькарим, В.Д. Устиченко, Т.П. Бондаренко. Заявлено 07.06.2004. Опубл. 17.01.05 // Бюл. №1, 2005. Chong Y.K., Toh T.B., Zaiden N. et al. Cryopreservation of neurospheres derived from human glioblastoma multiforme // Stem Cells.– 2009.– Vol. 27, N1.– P. 29–39. Chu Y., Wu B.M., McCabe E.R., Dunn J.C.Y. Serum-free cultures of murine adrenal cortical cells // J. Pediatr. Surg.– 2006.– Vol. 41, N12.– P. 2008- 2012. Di Blasio A.M., Fujii D.K., Yamamoto M. et al. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings // Biol. Reprod.– 1990.– Vol. 42, N4.– P. 683–691. Dunn J.C.Y., Chu Y., Lam M.M. et al. Adrenal cortical cell transplantation // J. Pediatr. Surg.– 2004.– Vol. 39, N12.– Р. 1856–1858. Lee M.-K., Bae Y.H. Cell transplantation for endocrine dis- orders // Adv. Drug Deliv. Rev.– 2000.– Vol. 42, N 1–2.– P. 103– 120. Nakayama S., Ban T., Okamoto Y. Fetal bovine serum is not necessary for the cryopreservation of aortic valve tissues // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.– 1994.– Vol. 108, N3.– Р. 583– 586. Seeliger H., Hoffmann M.W., Behrend M. et al. Transplanta- tion of H-2Kb-transgenic adrenocortical cells in the mouse having undergone an adrenalectomy: functional and mor- phological aspects // Transplant.– 2000.– Vol. 69, N8.– P. 1561–1566. Silani V., Pizzuti A., Strada O. et al. Cryopreservation of human fetal adrenal medullary cells // Brain Res.– 1988.– Vol. 454, N1–2.– P. 383–386. Valk J., Brunner D., De Smet K. et al. Optimization of che- mically defined cell culture media-replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods // Toxicol. In Vitro.– 2010.– Vol. 24, N4.– P. 1053–1063. Zaidel-Bar R., Ballestrem C., Kam Z., Geiger В. Early molecular events in the assembly of matrix adhesions at the leading edge of migrating cells // J. Cell Sci.– 2003.– Vol. 116, N22.– Р. 4605–4613. Поступила 02.11.2010 Рецензент И.В. Белочкина Yurchenko T.N., Kozlova V.F. Skornyakov B.A. et al. Effect of cryoprotectants on biological systems.– Kiev: Nauk. Dumka, 1989.– 240 p. Patent N4567 (Ukraine), IPC7, N12N5/08, A01N1/02. Cryopreservation method of organ culture of adrenal glands. T.M. Gurina, N.M. Alabedal'karim, V.D. Ustichenko, T.P. Bon- darenko. Applied 07.06.2004, Publ. 17.01.05 // Bull. N1, 2005. Chong Y.K., Toh T.B., Zaiden N. et al. Cryopreservation of neurospheres derived from human glioblastoma multiforme // Stem Cells.– 2009.– Vol. 27, N1.– P. 29–39. Chu Y., Wu B.M., McCabe E.R., Dunn J.C.Y. Serum-free cultures of murine adrenal cortical cells // J. Pediatr. Surg.– 2006.– Vol. 41, N12.– P. 2008- 2012. Di Blasio A.M., Fujii D.K., Yamamoto M. et al. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings // Biol. Reprod.– 1990.– Vol. 42, N4.– P. 683–691. Dunn J.C.Y., Chu Y., Lam M.M. et al. Adrenal cortical cell transplantation // J. Pediatr. Surg.– 2004.– Vol. 39, N12.– Р. 1856–1858. Lee M.-K., Bae Y.H. Cell transplantation for endocrine dis- orders // Adv. Drug Deliv. Rev.– 2000.– Vol. 42, N 1–2.– P. 103– 120. Nakayama S., Ban T., Okamoto Y. Fetal bovine serum is not necessary for the cryopreservation of aortic valve tissues // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.– 1994.– Vol. 108, N3.– Р. 583– 586. Seeliger H., Hoffmann M.W., Behrend M. et al. Transplanta- tion of H-2Kb-transgenic adrenocortical cells in the mouse having undergone an adrenalectomy: functional and mor- phological aspects // Transplant.– 2000.– Vol. 69, N8.– P. 1561–1566. Silani V., Pizzuti A., Strada O. et al. Cryopreservation of human fetal adrenal medullary cells // Brain Res.– 1988.– Vol. 454, N1–2.– P. 383–386. Valk J., Brunner D., De Smet K. et al. Optimization of che- mically defined cell culture media-replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods // Toxicol. In Vitro.– 2010.– Vol. 24, N4.– P. 1053–1063. Zaidel-Bar R., Ballestrem C., Kam Z., Geiger В. Early molecular events in the assembly of matrix adhesions at the leading edge of migrating cells // J. Cell Sci.– 2003.– Vol. 116, N22.– Р. 4605–4613. Accepted in 02.11.2010 14. 15. 16. 17. 18. 19. - 20. 21. 22. 23. 24. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

Схожі ресурси