Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов
Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих полимерные непроникающие (декстран, полиэтиленгликоль) и проникающие (глицерин, 1,2-пропандиол) криопротекторы. Установлено, что в эритроцитах, замороженных-отогретых в среде с полимерами, от...
Saved in:
| Date: | 2011 |
|---|---|
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44893 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов / В.В. Рамазанов// Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 125-136. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859685833713385472 |
|---|---|
| author | Рамазанов, В.В. |
| author_facet | Рамазанов, В.В. |
| citation_txt | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов / В.В. Рамазанов// Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 125-136. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| description | Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
полимерные непроникающие (декстран, полиэтиленгликоль) и проникающие (глицерин, 1,2-пропандиол) криопротекторы.
Установлено, что в эритроцитах, замороженных-отогретых в среде с полимерами, отмечается повышение скорости потока
ионов Н+ и осмотической хрупкости в среде, содержащей 0,45–0,9% NaCl. Для сохранения осмотических свойств замороженных-
отогретых клеток достаточно включить в среду глицерин или 1,2-пропандиол (1,2-ПД) в концентрации 5%. Полученные
результаты позволяют предположить, что криопротекторная эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих
непроникающие и проникающие криопротекторы, определяется вкладом различных по механизму действия криозащитных
компонентов в суммарную защитную эффективность при замораживании и ослаблением постгипертонического стресса на
клетки при размораживании.
Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених-відігрітих у комбінованих кріоконсервантах, які містять
полімерні непроникаючі (декстран, поліетиленгліколь) і проникаючі (гліцерин, 1,2-пропандіол) кріопротектори. Встановлено,
що в еритроцитах, заморожених-відігрітих у середовищі з полімерами, визначається зростання швидкості потоку іонів Н+ і
осмотичної крихкості в середовищі, яке містить 0,45–0,9% NaCl. Для збереження осмотичних властивостей заморожених-
відігрітих клітин достатньо включити в середовище гліцерин або 1,2-пропандіол в концентрації 5%. Отримані результати
дозволяють припустити, що кріопротекторна ефективність комбінованих кріоконсервантів, які містять непроникаючі і
проникаючі кріопротектори, визначається внеском різноманітних за механізмом дії кріозахисних компонентів у сумарну захисну
ефективність при заморожуванні та послабленням постгіпертонічного стресу на клітини при розморожуванні.
The osmotic properties of erythrocytes frozen-thawed in combined cryopreservatives, containing polymeric non-penetrating
(dextran, polyethylene glycol) and penetrating (glycerol, 1,2-propane diol) cryoprotectants were studied. It was established that in
erythrocytes frozen-thawed in the presence of polymers the increasing of H+ ion flow rate and osmotic fragility in the environment
with 0.45–0.9% NaCl was observed. It is sufficient to add 5% glycerol or 1,2-propane diol (1,2-PD) to the medium to preserve
osmotic properties of frozen-thawed cells. The obtained results enable to suggest that cryoprotective efficiency of combined
cryopreservatives, containing non-penetrating and penetrating cryoprotectants is determined both by the contribution of cryoprotective
components differing by action mechanism into the
|
| first_indexed | 2025-11-30T22:26:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
125
* Адрес для корреспонденции : ул. Переяславская, 23,
г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-41-35, факс: (+38
057) 373-30-84, электронная почта: ramazanov.viktor@mail.ru
* Address for correspondence: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov,
Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: ramazanov.viktor@mail.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
Выбор оптимальной программы заморажива-
ния обусловлен осмотическим поведением клеток
в процессе замораживания. При этом величина пере-
охлаждения клеточных образцов не должна превы-
шать определенной величины (~2°С) для предуп-
реждения образования внутриклеточных кристал-
лов льда и ограничения осмотического градиента
и градиента криопротекторов, которые являются
движущей силой для выхода-входа воды в клетки.
Оптимальная скорость охлаждения определяется
коэффициентом проницаемости для воды и крио-
протектора, энергией активации, осмотически ак-
тивным объемом воды в клетках и площадью их
поверхности [30]. Температура начала нуклеации
Osmotic behavior of cells during freezing deter-
mines the selection of optimal freezing program . Here-
with supercooling of cell samples must not exceed the
certain value (~2°C) to prevent formation of intracel-
lular ice crystals and limit the osmotic gradient being
the mover for in- and outflux of water into and out of
the cells. Optimal cooling rate is determined by pen-
etration coefficient for water and cryoprotectant, acti-
vation energy, osmotically active volume of liquid in
cells and their surface area [30]. Temperature of in-
tracellular ice nucleation initiation is associated with
supercooling rate of cell cytoplasm [21], concentration
of penetrating cryoprotectant and cell dehydration rate
[28].
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
УДК 57.043:612.111:547.42/43
В.В. РАМАЗАНОВ
Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих
глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов
UDC 57.043:612.111:547.42/43
V.V. RAMAZANOV
Efficiency of Combined Cryopreservatives Containing Glycerol
or 1,2-Propanediol During Freezing of Erythrocytes
Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих
полимерные непроникающие (декстран, полиэтиленгликоль) и проникающие (глицерин, 1,2-пропандиол) криопротекторы.
Установлено, что в эритроцитах, замороженных-отогретых в среде с полимерами, отмечается повышение скорости потока
ионов Н+ и осмотической хрупкости в среде, содержащей 0,45–0,9% NaCl. Для сохранения осмотических свойств замороженных-
отогретых клеток достаточно включить в среду глицерин или 1,2-пропандиол (1,2-ПД) в концентрации 5%. Полученные
результаты позволяют предположить, что криопротекторная эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих
непроникающие и проникающие криопротекторы, определяется вкладом различных по механизму действия криозащитных
компонентов в суммарную защитную эффективность при замораживании и ослаблением постгипертонического стресса на
клетки при размораживании.
Ключевые слова: эритроциты, комбинированные криоконсерванты, поток ионов Н+, осмотический гемолиз.
Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених-відігрітих у комбінованих кріоконсервантах, які містять
полімерні непроникаючі (декстран, поліетиленгліколь) і проникаючі (гліцерин, 1,2-пропандіол) кріопротектори. Встановлено,
що в еритроцитах, заморожених-відігрітих у середовищі з полімерами, визначається зростання швидкості потоку іонів Н+ і
осмотичної крихкості в середовищі, яке містить 0,45–0,9% NaCl. Для збереження осмотичних властивостей заморожених-
відігрітих клітин достатньо включити в середовище гліцерин або 1,2-пропандіол в концентрації 5%. Отримані результати
дозволяють припустити, що кріопротекторна ефективність комбінованих кріоконсервантів, які містять непроникаючі і
проникаючі кріопротектори, визначається внеском різноманітних за механізмом дії кріозахисних компонентів у сумарну захисну
ефективність при заморожуванні та послабленням постгіпертонічного стресу на клітини при розморожуванні.
Ключові слова: еритроцити, комбіновані кріоконсерванти, поток іонів Н+, осмотичний гемоліз.
The osmotic properties of erythrocytes frozen-thawed in combined cryopreservatives, containing polymeric non-penetrating
(dextran, polyethylene glycol) and penetrating (glycerol, 1,2-propane diol) cryoprotectants were studied. It was established that in
erythrocytes frozen-thawed in the presence of polymers the increasing of H+ ion flow rate and osmotic fragility in the environment
with 0.45–0.9% NaCl was observed. It is sufficient to add 5% glycerol or 1,2-propane diol (1,2-PD) to the medium to preserve
osmotic properties of frozen-thawed cells. The obtained results enable to suggest that cryoprotective efficiency of combined
cryopreservatives, containing non-penetrating and penetrating cryoprotectants is determined both by the contribution of cryoprotective
components differing by action mechanism into the sum protection efficiency during freezing-thawing and by the weakening of post-
hypertonic stress in cells during freeze-thawing.
Key words: erythrocytes, combined cryopreservatives, H+ ion flow, osmotic hemolysis.
126 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
внутриклеточного льда связана со степенью пере-
охлаждения цитоплазмы клеток [21], с концент-
рацией проникающего криопротектора и степенью
дегидратации клеток [28].
Предполагается, что метод быстрого двухсту-
пенчатого замораживания, по сравнению с замо-
раживанием с оптимальной постоянной скоростью,
дает большую устойчивость клеток к постгипер-
тоническому стрессу при отогреве и отмывании
криопротекторов [2, 6, 13]. Данный метод обеспе-
чивает высокую сохранность основных видов кле-
ток костного мозга и при необходимости позволяет
исключить их фракционирование [6]. Анализ лите-
ратуры показывает, что упрощение ступенчатых
режимов охлаждения, возможность снижения
концентрации проникающего криопротектора в
криоконсерванте и сохранение осмотической ус-
тойчивости клеток после отогрева связаны с ис-
пользованием комбинированных сред, которые
включают проникающие и непроникающие криоза-
щитные компоненты [15–17, 26, 27].
При изучении сохранности эритроцитов после
замораживания в комбинированных средах, содер-
жащих различные полимеры (полиэтиленгликоль с
м.м. 1500, поливинилпирролидон) и проникающий
криопротектор 1,2-пропандиол (1,2-ПД), отмечено,
что такое сочетание позволяет снизить концентра-
цию 1,2-ПД, повысить скорость охлаждения и полу-
чить высокую стабильность размороженных эри-
троцитов в ресуспендирующей среде в течение 3-х
суток после отмывания. Однако необходимо
использовать гипертонические растворы для от-
мывания эритроцитов от криоконсерванта, так как
концентрация 1,2-ПД в среде замораживания все
же остается высокой (20%) [3, 4]. Если среда, в
которой находятся эритроциты, содержит не более
6% глицерина, то клетки, перенесенные в изотони-
ческий раствор NaCl, остаются осмотически ус-
тойчивыми [5]. Это указывает на то, что для иск-
лючения гипертонических растворов из процедуры
отмывания необходимо, чтобы криоконсервант
содержал невысокую концентрацию проникающего
криопротектора. Степень повреждения эритроци-
тов при постгипертоническом стрессе существен-
но зависит от температуры ресуспендирующей
среды. При температуре 35–37°С клетки наиболее
устойчивы к данному повреждающему фактору
[31].
Таким образом, комбинирование в среде замо-
раживания непроникающих и проникающих крио-
протекторов позволит использовать невысокие
концентрации последних, что обеспечит сохране-
ние осмотической устойчивости клеток при замо-
раживании-отогреве и позволит упростить отмыва-
ние эритроцитов после размораживания и отмывать
одним изотоническим раствором NaCl при 35–37°С
без использования гипертонических растворов.
It is suggested that the method of rapid two-stage
freezing exibits higher cell resistance to post-hyperto-
nic stress during thawing and removing cryoprotectants
if compared with the freezing with "optimal" constant
rate [2, 6, 13]. This method provides a high survival of
major types of bone marrow cells and enables to ex-
clude their fractionation if required [6]. The analysis
of related papers shows that simplification of stepwise
cooling regimens, possible reduction of penetrating
cryo-protectant concentration in cryopreservative me-
dia as well as preservation of post-thaw cell osmotic
resistance are associated with the using of combined
media comprising penetrating and non-penetrating cryo-
protective components [15–17, 26, 27].
When studying erythrocyte survival after freeze-
thawing in combined media containing various poly-
mers (polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone) and
penetrating cryoprotectant 1,2-propane diol (1,2-PD)
it was noted that these combinations enabled to re-
duce the concentration of 1,2-PD, to increase cooling
rate and to obtain a high stability of frozen-thawed eryth-
rocytes in re-suspending medium for 3 days after wash-
ing. However, it is necessary to use hypertonic solu-
tions to wash the erythrocytes from cryopreservative,
since the concentration of 1,2-PD in the freezing me-
dium remain high (20%) [3, 4]. If the medium with
erythrocytes contains less than 6% of glycerol the cells
transfered to NaCl isotonic solution remain osmotically
resistant [5]. It denotes that for excluding the hyper-
tonic solutions from washing procedure it is necessary
to supplement the cryopreservative medium with low
concentration of penetrating cryoprotectant. Erythro-
cyte damage rate under hypertonic stress essentially
depends on temperature of re-suspending medium. The
cells are most resistant to this damage factor under
35–37°C [31].
Thus, the combining of non-penetrating and pe-
netrating cryoprotectants in freezing medium enables
to use low concentrations of the latter that provides
preservation of osmotic resistance of cells during
freeze-thawing and allows to simplify the procedure
of erythrocyte washing after freeze-thawing and ap-
ply only NaCl isotonic solution at 35–37°C without
hypertonic ones.
The research aim was to study the cryoprotective
efficiency of combined cryopresevatives containing po-
lymers and low concentrations of penetrating cryo-
protectants.
Materials and methods
Following substances were used in the research:
NaCl ('chemically pure' grade), Na2SO4 ('chemically
pure' grade), sucrose ('pure for analysis' grade),
polyethylene glycols with molecular mass of 1500, 2000
(PEG-1500 and PEG-2000, Merck, Germany); dextrans
with molecular mass of 10000 (D-10000, Pharmacea
Fine Chemicals, Sweden) and 35000 (D-35000, Serva,
127 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
Germany); glycerol (Russia); 1,2-propane diol (Khim-
prom, Russia). The freezing media were prepared on
the base of isoosmotic solution (0.3% NaCl and 6.85%
sucrose). Each cryopreservative medium contained
20% polymeric substance or 20% polymeric substance +
5% penetrating cryoprotectant.
Human erythrocytes were derived from donor blood
of 2nd group by 4-fold washing with 0.9% NaCl solu-
tion. Erythrocytes were re-suspended in 1 ml of freez-
ing media to reach 40% hematocrit and incubated in
polyethylene ampoules for 40 min at 25°C, plunged into
liquid nitrogen (–196°C) and left for 30 min, then
transfered to water bath at 40°C for 3 min. After thaw-
ing 1 ml of frozen-thawed suspension was diluted 10
times with NaCl isotonic solution (0.9%) at 37°C with
slow agitation for at least 30 sec, and then centrifuged
at 3,000 rpm for 5 min with the following removal of
supernatant. This procedure was repeated. Afterwards
the cells were additionally washed thrice with NaCl
isotonic solution (0.9%) at 37°C without considering
the erythrocyte sediment dilution rate.
Osmotic hemolysis of erythrocytes was studied in
the medium, containing 10 mM tris-buffer, pH 7.4, and
NaCl with different concentrations (0.09–0.9%); 1 ml
of cell suspension with 0.6% hematocrit was incubated
for 15 min at 25°C, and then centrifuged at 3,000 rpm
for 3 min.
Hemolysis percentage was calculated after spec-
trophotometrical assessing of hemoglobin amount in
supernatant of sample by measuring the optical den-
sity at 543 nm:
[А1/А2]×100,
where A1 is optical density of supernatant of experi-
mental sample; A2 is optical density after complete
hemolysis in the control sample.
Transport of H+ ions in erythrocytes in sulfate me-
dium was investigated in thermostated well (37°C) with
pH electrode and constant agitation of cell suspension.
The changes of environmental pH were recorded.
Two ml of 0.15 mol/l NaCl solution and 50 ml of eryth-
rocyte sediment were stepwise introduced into the well
(to reach 2% final hematocrit). Herewith pH value of
cell suspension usually made 6.6–6.7, that corresponded
to pH of extracellular medium during storage of blood
[10]. To investigate H+ ion transport in erythrocytes
2 ml of 0.11 mol/l Na2SO4 solution were introduced
into thermostated well. Correction of solution's pH to
reach 6.6–6.7 values was performed using NaOH or
H2SO4. Thereafter 50 ml of erythrocyte sediment (80%
hematocrit) were introduced into the well and the dy-
namics of pH changes was recorded.
During introduction of erythrocytes into Na2SO4
isotonic solution without buffer components a two-
phase alteration of extracellular medium pH (acidifi-
cation and following alkalization) occured. This altera-
Цель работы – исследование криопротекторной
эффективности комбинированных криоконсер-
вантов, содержащих полимеры и невысокие кон-
центрации проникающих криопротекторов.
Материалы и методы
В работе использовали NaCl (х. ч.); Na2SO4
(х. ч.); сахарозу (ч. д. а.); полиэтиленгликоли с
молекулярной массой 1500, 2000 (ПЭГ-1500, ПЭГ-
2000, “Merck”, Германия); декстраны с молекуляр-
ной массой 10000 (Д-10000, “Pharmacea Fine Che-
micals”, Швеция) и 35000 (Д-35000, “Serva”, Герма-
ния); глицерин (Россия); 1,2-пропандиол (“Хим-
пром”, Россия). Среды замораживания готовили
на изоосмотическом растворе (0,3% NaCl и 6,85 %
сахарозы). Каждый криоконсервант содержал 20%
полимера или 20% полимера + 5% проникающего
криопротектора.
Эритроциты человека получали из донорской
крови 2-й группы четырехкратным отмыванием
0,9% раствором NaCl. Образцы эритроцитов в сре-
дах замораживания объемом 1 мл и с гематокри-
том 40% в полиэтиленовых ампулах инкубировали
40 мин при 25°С, погружали в жидкий азот (–196°С)
и выдерживали 30 мин, затем переносили на водя-
ную баню при 40°С на 3 мин. После отогрева 1 мл
размороженной суспензии при температуре 37°С,
медленно перемешивая, разводили изотоническим
раствором NaCl (0,9%) в 10 раз в течение не менее
30 с и центрифугировали при 3000 об/мин, 5 мин с
последующим удалением надосадочной жидкости.
Данную процедуру повторяли. После этого без уче-
та скорости разведения осадка эритроцитов клетки
дополнительно отмывали 3 раза изотоническим
раствором NaCl (0,9%) при 37°С.
Осмотический гемолиз эритроцитов исследо-
вали в среде, содержащей 10 мМ трис-буфер с рН
7,4 и NaCl с различными концентрациями (0,09–
0,9%); 1 мл суспензии клеток с гематокритом 0,6%
инкубировали 15 мин при 25°С, далее центрифуги-
ровали при 3000 об/мин в течение 3 мин.
Степень гемолиза вычисляли после спектрофо-
тометрического определения количества гемогло-
бина в супернатанте образцов, измеряя оптичес-
кую плотность при длине волны 543 нм [19]:
[А1/А2]×100,
где А1 – оптическая плотность супернатанта экс-
периментального образца; А2 – оптическая плот-
ность при полном гемолизе контрольного образца.
Транспорт ионов Н+ в эритроцитах в сульфатной
среде исследовали в термостатируемой ячейке
(37°С) с рН-электродом при постоянном переме-
шивании клеточной суспензии. Изменения рН
внешней среды регистрировали при помощи само-
писца. В ячейку вносили последовательно 2 мл
128 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
0,15 моль/л NaCl и 50 мкл эритроцитарного осадка
(конечный гематокрит в ячейке 2%). При этом
значение рН клеточной суспензии обычно состав-
ляло 6,6–6,7, что соответствует рН внеклеточной
среды при хранении крови [10]. Для исследования
транспорта ионов Н+ в эритроцитах вносили 2 мл
раствора 0,11 моль/л Na2SO4 в термостатируемую
ячейку. Используя раствор NaОН или Н2SO4, осу-
ществляли коррекцию рН среды до значений 6,6–
6,7. После этого в ячейку вносили 50 мкл осадка
эритроцитов (80% гематокрита) и регистрировали
динамику изменения рН среды.
При внесении эритроцитов в изотонический
раствор Na2SO4, не содержащий буферных компо-
нентов, происходит двухфазное изменение рН
внешней среды: закисление с последующим заще-
лачиванием. Такое изменение рН связано с обме-
ном внутриклеточного Cl– на внеклеточный SO4
2–
[23].
На рис. 1 представлена характерная экспери-
ментальная кривая установления стационарного
значения рН суспензии эритроцитов в изотони-
ческой сульфатной среде (0,11 моль/л Na2SO4).
Начальное значение рН ~6,70 (показание рН
суспензии эритроцитов в среде, содержащей
0,15 моль/л NaCl), конечное значение рН ~6,75–
6,85.
Использовав экспериментальные параметры
tmax, рНtmax, рН° (рис. 1), по уравнениям [8]
( )12
1
2 kk
k
klntmax −
=
и [ ] [ ]
( ) ( ) ( )
−
=
−−− 121212 1
1
2
11
1
2
k/k/kkk/k/
maxt k
k
k
kHH o
можно рассчитать константы скорости k1 и k2
(выход и вход ионов Н+ соответственно). Посколь-
ку в эксперименте регистрируются изменения рН
внешней среды, для вычисления констант скорос-
тей концентрацию ионов Н+ необходимо предста-
вить как изменение их концентраций во внешней
среде:
[Н]o = [Н]0 – [Н]∝ ;
[Н]tmax = [Н]max – [Н]о,
где [Н]0, [Н]max, [Н]∝ – концентрации ионов Н+ во
внешней среде суспензии эритроцитов в начале
эксперимента, в момент tmax и при максимальном
закислении после внесения эритроцитов в среду,
содержащую 0,3 моль/л сахарозы.
tion of pH is associated with interchange of intracellu-
lar Cl– with extracellular SO4
2– [23].
Fig. 1 shows characteristic experimental curve of
reaching the pH stable value of erythrocyte suspen-
sion in isotonic sulfate medium (0.11 mol/l Na2SO4).
The initial value of pH was ~6.70 (pH indication of
erythrocyte suspension in the medium, containing
0.15 mol/l NaCl), the final value of pH was ~6.75–
6.85.
Using the experimental parameters tmax, рНtmax,
рН° (Fig.1) and the equations [8]
( )12
1
2 kk
k
klntmax −
= , and
[ ] [ ]
( ) ( ) ( )
−
=
−−− 121212 1
1
2
11
1
2
k/k/kkk/k/
maxt k
k
k
kHH o
it is possible to calculate the rate constants, k1 and k2
(outflux and influx of H+ ions, accordingly). Whereas
the pH changes in the external medium are recorded
in the experiment the calculation of transport constants
requires to represent H+ ion concentrations as the chan-
ges of their concentrations in the external media:
[Н]o = [Н]0 – [Н]∝ ;
[Н]tmax = [Н]max – [Н]о,
6
6,5
7
0 1 2 3 4
рНо
рНtmax
tmax
Время, мин Time, min
pH
Рис. 1. Изменение рН раствора, содержащего 2 мл
0,11 моль/л Na2SO4, после внесения 50 мкл осадка эрит-
роцитов.
Fig. 1. Change of pH solution, containing 2 ml of 0.11 mol/l
Na2SO4 after introduction of 50 µl erythrocyte sediment.
129 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
where [Н]0, [Н]max, [Н]∝ are the H+ ion concentra-
tions in the external medium at the start of the experi-
ment, in the moment of tmax and in the moment of maxi-
mum acidification after introduction of erythrocytes into
the medium, containing 0.3 mol/l sucrose.
Transport of H+ ions through erythrocyte membrane
in sulfate medium is coupled with transport of Cl– and
SO4
2– anions. Unidirectional flow of H+ ions was cal-
culated after transformation of the formula [9]:
J = k·d·Ci (mmol·(3,1×1013 cells·min)–1),
where k is kinetic constant, sec–1; d is ratio between
volume of cell liquid (l) and erythrocyte dry weight, kg;
Ci is concentration of intracellular Cl– (it would be sub-
stituted by ∆H, the change of H+ ion concentration in
external medium during interchange of Cl– with SO4
2–).
The number of normal cells 3.1×1013 corresponds
to 1 kg of erythrocyte dry weight and with membrane
surface of 4.4×107 cm2 [9]. Therefore the formula for
H+ ion flow is:
J = k·d·∆Н (mmol(kg·sec)–1).
The statistical processing was performed on the
base of results obtained in erythrocytes from 5 donors.
The data are presented as mean ± standard error. Non-
parametric Mann-Whitney's method at p < 0.05 was used
to determine statistical significance of the results [1].
Results and discussion
Freeze-thawing of erythrocytes in the medium with
dextrans D-35000 and D-10000 caused 36.7 and 40.4%
hemolysis, correspondingly, and resulted in increased
H+ ion flow rate in non-hemolyzed cells. Introduction
of glycerol or 1,2-PD into these media significantly de-
creased erythrocyte damage level, herewith the val-
ues of H+ ion flows in remaining cells differed insig-
nificantly from the values of the intact cells (Table 1).
The research results of erythrocyte osmotic hemo-
lysis are presented in Fig. 2. After freeze-thawing of
the cells with dextrans the increasing of osmotic fra-
gility in saline media with 0.45–0.9% NaCl was ob-
served, and within the range of 0.09–0.4% concentra-
tion there was found the increased erythrocyte osmotic
resistance if compared with the intact cells. Erythro-
cyte freeze-thawing in the medium with dextrans in
combination with glycerol or 1,2-PD did not result in
significant changes in osmotic hemolysis curves if com-
pared with the intact cells. A little difference among
the curves was observed at 0.18–0.3% NaCl concen-
tration.
Erythrocyte freeze-thawing with PEG-2000 and
PEG-1500 resulted in 55 and 64% hemolysis, corre-
spondingly, as well as the increasing of H+ ion flow
rate in non-hemolyzed cells. Introduction into these
media of glycerol or 1,2-PD also reduced erythrocyte
Движение ионов Н+ через мембрану эритроци-
тов в сульфатной среде сопряжено с транспортом
анионов Cl– и SO4
2– [23]. Однонаправленный поток
ионов Н+ вычисляли после преобразования форму-
лы [9]:
J = k·d·Ci (ммоль·(3,1×1013 кл·мин)–1),
где k – константа скорости, с–1; d – отношение
объема клеточной воды (л) к сухому остатку эрит-
роцитов, кг; Ci – концентрация внутриклеточного
Cl– (ее замещали на ∆Н – изменение концентрации
ионов Н+ во внешней среде при обмене Cl– на SO4
2–).
Количество 3,1×1013 нормальных клеток соответ-
ствует 1 кг сухого остатка эритроцитов с площадью
мембран 4,4×107 см2 [9]. Поэтому формула для
потока ионов Н+ имеет вид:
J = k·d·∆Н (ммоль(кг·с)–1).
Статистические расчеты производили на осно-
ве результатов, полученных на эритроцитах от 5
доноров. Данные представлены как среднее зна-
чение ± стандартная ошибка. Для определения
статистической достоверности результатов ис-
пользовали непараметрический метод Манна-
Уитни при р < 0,05 [1].
Результаты и обсуждение
Замораживание-отогрев эритроцитов в среде с
декстранами вызывает 36,7 и 40,4% гемолиза при
использовании Д-35000 и Д-10000 соответственно
и приводит к повышению скорости потоков для
ионов Н+ в негемолизированных клетках. Включе-
ние в данные среды глицерина или 1,2-ПД сущест-
венно снижает степень повреждения эритроцитов,
при этом показатели потоков ионов Н+ для остатка
клеток незначительно отличаются от величин для
интактных клеток (табл. 1).
Результаты исследования осмотического гемо-
лиза эритроцитов представлены на рис. 2. После
их замораживания-отогрева с декстранами отме-
чаются повышение осмотической хрупкости в
солевой среде при концентрации NaCl 0,45–0,9%,
а в интервале концентраций соли 0,09–0,4% –
повышение осмотической устойчивости эритро-
цитов по сравнению с интактными клетками. Замо-
раживание-отогрев эритроцитов в среде с декстра-
нами в сочетании с глицерином или 1,2-ПД не
приводит к значительному изменению кривых
осмотического гемолиза по сравнению с интакт-
ными клетками. Небольшое различие между кри-
выми отмечается при концентрации NaCl 0,18-
0,3%.
Замораживание-отогрев эритроцитов с ПЭГ
вызывает 55 и 64% гемолиза для ПЭГ-2000 и
ПЭГ-1500 соответственно, а также увеличение
яинавижаромазыдерС
aidemgnizeerF
яинавижаромазелсопзиломеГ -
%,яинавымтоиавергото
ezeerfretfasisylomeH - gniwaht
%,gnihsawdna
НвоноикотоП + хатицортирэв
H+ setycorhtyreniwolfnoi
J
tuo
× 01 7
)иктелкзи(с/гк/ьлом
)llecfotuo(ces/gk/lom
J
ni
× 01 7
)уктелкв(с/гк/ьлом
)llecotni(ces/gk/lom
иктелкеынткатнИ
sllectcatnI - 16,0±34,5 25,0±00,4
Д- 00053
D- 00053 0,4±7,63 01,1±79,7
# 38,0±98,5 #
Д- нирецилг+00053
D- lorecylg+00053 *4,4±22 18,0±80,6 07,0±79,4
Д- 2,1+00053 - ДП
D- 2,1+00053 - DP *1,4±02 47,0±59,5 17,0±48,4
Д- 00001
D- 00001 6,5±4,04 50,1±71,8
# 28,0±31,6 #
Д- нирецилг+00001
D- lorecylg+00001 *6,4±4,22 57,0±33,6 27,0±21,5
Д- 2,1+00001 - ДП
D- 2,1+00001 - DP *3,5±5,02 37,0±79,5 85,0±58,4
130 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
скорости потока ионов Н+ в негемолизированных
клетках. Включение в указанные среды глицерина
или 1,2-ПД также снижает степень повреждения
эритроцитов, при этом скорость потоков ионов Н+
для остатка клеток существенно не повышается
по сравнению с интактными клетками (табл. 2).
Замораживание-отогрев эритроцитов с ПЭГ в
комбинации с проникающими криопротекторами
приводит к незначительным изменениям кривых
осмотического гемолиза эритроцитов по сравне-
нию с интактными клетками (рис. 3). Степень
повреждения эритроцитов после замораживания-
отогрева в средах с декстранами (табл. 1) ниже,
чем в средах с ПЭГ (табл. 2).
Таким образом, эритроциты, замороженные-
отогретые с полимерными непроникающими крио-
протекторами и отмытые изотоническим раство-
ром NaCl, имеют необычные осмотические свой-
ства: в них значительно повышается скорость пото-
ка ионов Н+ (табл. 1 и 2), снижается осмотическая
устойчивость в диапазоне концентрации NaCl 0,45–
0,9%, а в интервале концентрации NaCl 0,09–0,4%
повышается устойчивость замороженных-отогре-
тых эритроцитов (рис. 2 и 3) по сравнению с
интактными клетками. Включение в криоконсер-
вант глицерина или 1,2-ПД способствует сохране-
нию удовлетворительных осмотических свойств
damage rate, and H+ ion flow rate in remaining cell
was not significantly increased if compared with the
intact cells (Table 2).
Erythrocyte freeze-thawing with PEG in combina-
tion with penetrating cryoprotectants resulted in insig-
nificant changes of erythrocyte osmotic hemolysis
curves if compared with the intact cells (Fig. 3). Eryth-
rocyte damage rate after freeze-thawing in the media
with dextrans (Table 1) was lower, than in the media
with PEG (Table 2).
Thus, the erythrocytes frozen-thawed with poly-
meric non-penetrating cryoprotectants and washed with
NaCl isotonic solution have unusual osmotic proper-
ties such as: H+ ion flow rate is significantly increased
in these cells (Tables 1 and 2), osmotic resistance within
the range of 0.45–0.9% NaCl concentration is reduced,
and within the range of 0.09–0.4% NaCl concentra-
tion the resistance of frozen-thawed erythrocytes is
increased if compared with the intact cells. Introduc-
tion of glycerol or 1,2-PD into cryopreservation media
contributes to preservation of adequate osmotic prop-
erties of frozen-thawed erythrocytes. This corresponds
to the increasing of frozen-thawed cell survival (Ta-
bles 1 and 2). The obtained results testify to the fact
that combination of non-penetrating cryoprotectants
with penetrating ones reveals the effective cryopro-
tective peculiarities of resulted mixture.
Примечание: * – статистически достоверно по сравнению с соответствующими показателями гемолиза эритроцитов при
замораживании в среде без проникающего криопротектора (р< 0,05); # – статистически достоверно по сравнению с интактными
клетками (р < 0,05).
Note: * – statistically significant if compared with appropriate indices of erythrocyte hemolysis during freezing in the medium
without penetrating cryoprotectant (p<0.05); # – statistically significant if compared with the intact cells (p < 0.05).
Таблица 1. Степень повреждения и скорость потока ионов Н+ в эритроцитах, замороженных-отогретых в среде
с декстранами (концентрация 20%) в комбинации с глицерином или 1,2-ПД (концентрация 5%)
Table 1. Damage degree and H+ ion flow rate in erythrocytes frozen-thawed in the medium with dextrans
(20% concentration) in combination with glycerol or 1,2-PD (5% concentration)
яинавижаромазыдерС
aidemgnizeerF
яинавижаромазелсопзиломеГ -
%,яинавымтоиавергото
ezeerfretfasisylomeH - gniwaht
%,gnihsawdna
НвоноикотоП + хатицортирэв
H+ setycorhtyreniwolfnoi
J
tuo
× 01 7
)иктелкзи(с/гк/ьлом
)llecfotuo(ces/gk/lom
J
ni
× 01 7
)уктелкв(с/гк/ьлом
)llecotni(ces/gk/lom
иктелкеынткатнИ
sllectcatnI - 16,0±34,5 25,0±00,4
ГЭП - 0002
GEP - 0002 7,4±0,55 41,1±60,8
# 58,0±70,6 #
ГЭП - нирецилг+0002
GEP - lorecylg+0002 *3,5±0,82 38,0±02,6 07,0±10,5
ГЭП - 2,1+0002 - ДП
GEP - 2,1+0002 - DP *2,4±3,92 18,0±30,6 36,0±09,4
ГЭП - 0051
GEP - 0051 0,3±0,46 89,0±22,8
# 88,0±32,6 #
ГЭП - нирецилг+0051
GEP - lorecylg+0051 *6,4±8,24 28,0±06,6 86,0±51,5
ГЭП - 2,1+0051 - ДП
GEP - 2,1+0051 - DP *2,5±4,04 08,0±41,6 17,0±11,5
131 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
It is known that erythrocyte introduction into sulfate
medium induces H+ ion outflux and their following in-
flux into the cell. Outflux of H+ ion occurs due to func-
tioning of Jacobs-Stewart cycle whereas their influx is
associated with sulfate transport during interchange
with chloride [23].
The functioning of the mentioned above cycle de-
pends on coupled action of Cl–/HCO3
–-exchanger and
carbonic anhydrase enzyme, which could be bound with
cytoplasmic fragment of anion exchanger [25]. The
degree and character of bounding of exchanger with
carbonic anhydrase could determine a coupling and rate
of H+, Cl– and SO4
2– ion exchange between cell and
medium [25]. It may be suggested that erythrocyte
freeze-thawing in the media with polymers results in
damage of membrane structures, including the change
of mutual localization of Jacobs-Stewart cycle compo-
nents with the following activation of H+ ion transport.
However, most likely the increasing of H+ ion flow rate
in frozen-thawed erythrocytes is associated with the
impaired barrier function of membranes, this increase
is less significant if cryopreservation medium addition-
ally contains glycerol or 1,2-PD (Table 1 and 2).
A higher osmotic resistance of frozen-thawed eryth-
rocytes if compared with the intact cells within the range
of hypotonic concentrations of NaCl was found after
freeze-thawing in the medium with trehalose or dex-
tran [20], but not with glycerol [20, 29]. It denotes that
замороженных эритроцитов. Это соотносится с по-
вышением сохранности замороженных клеток
(табл. 1 и 2). Полученные результаты свидетель-
ствуют, что при сочетании непроникающих крио-
протекторов с проникающими проявляется эф-
фективное криопротекторное свойство комбиниро-
ванного состава.
Известно, что внесение эритроцитов в сульфат-
ную среду вызывает выход ионов Н+ с последую-
щим их входом в клетку. Выход ионов Н+ происхо-
дит вследствие функционирования цикла Якобса-
Стюарта, тогда как их вход связан с транспортом
сульфата в обмен на хлорид [23].
Работа указанного цикла зависит от согласо-
ванного функционирования Cl–/НСO3
–-обменника и
фермента карбоангидразы, который может нахо-
диться в связанном состоянии с цитоплазматичес-
ким фрагментом анионного обменника [25]. Сте-
пень и характер ассоциации обменника с карбоан-
гидразой могут определять согласованность и
скорость обмена ионов Н+, Cl– и SO4
2– между
клеткой и средой [25]. Можно предположить, что
замораживание эритроцитов в средах с полимера-
ми приводит к нарушению структуры мембраны,
которое включает изменение взаимной локализа-
ции компонентов цикла Якобса-Стюарта с после-
дующей активацией транспорта ионов Н+. Однако,
вероятнее всего, повышение скорости потока ионов
Примечание: * – статистически достоверно по сравнению с соответствующими показателями гемолиза эритроцитов при
замораживании в среде без проникающего криопротектора (р< 0,05); # – статистически достоверно по сравнению с интактными
клетками (р < 0,05).
Note: * – statistically significant if compared with appropriate indices of erythrocyte hemolysis during freezing in the medium
without penetrating cryoprotectant (p<0.05); # – statistically significant if compared with the intact cells (p < 0.05).
Таблица 2. Степень повреждения и скорость потока ионов Н+ в эритроцитах, замороженных в среде
с полиэтиленгликолями (конц. 20%) в комбинации с глицерином или 1,2-ПД (конц. 5%)
Table 2. Damage degree and H+ ion flow rate in erythrocytes frozen in the medium with polyethylene glycols
(20% concentration) in combination with glycerol or 1,2-PD (5% concentration)
132 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
Н+ в замороженных-отогретых эритроцитах свя-
зано с нарушением барьерной функции мембран,
уровень его повышения уменьшается, если крио-
консервант дополнительно включает глицерин или
1,2-ПД (табл. 1 и 2).
Большая осмотическая устойчивость заморо-
женных-отогретых эритроцитов, по сравнению с
интактными клетками, в интервале гипотоничес-
ких концентраций NaCl выявлена при заморажива-
нии-отогреве в среде с трегалозой или декстра-
ном [20], но не с глицерином [20, 29]. Это указывает
на то, что полученный эффект выявляется только
после замораживания-отогрева эритроцитов в
средах с непроникающими криопротекторами и,
возможно, связан с нарастанием градиента кон-
центрации непроникающих криопротекторов на
мембранах клеток при замораживании-отогреве.
Эритроциты, замороженные-отогретые в среде с
непроникающими и проникающими криопротекто-
рами по сравнению со средой, содержащей только
непроникающий криопротектор, по осмотической
хрупкости более подобны интактным эритроцитам
(рис. 2 и 3). Исследование осмотического гемолиза
показывает, что включение в среды с полимерами
проникающих криопротекторов предупреждает
значительные изменения осмотических свойств
замороженных-отогретых эритроцитов.
Согласно данным литературы [22] глицерин в
концентрации 5% эффективен при замораживании
эритроцитов до –30°С, однако при замораживании
до –130°С его криопротекторная активность резко
the obtained effect is revealed only after freeze-thaw-
ing of erythrocytes in the media with non-penetrating
cryoprotectants and is likely associated with increase
in concentration gradient of non-penetrating cryoprotec-
tants on cell membranes during freezing. The osmotic
fragility of the erythrocytes frozen-thawed in the me-
dium with non-penetrating and penetrating cryopro-
tectants is more similar to the intact erythrocytes if
compared with the cells frozen-thawed in the medium
containing only non-penetrating cryoprotectant (Fig. 2
and 3). The studying of osmotic hemolysis showed,
that introduction of penetrating cryoprotectants into the
media with polymeric cryoprotectants prevented sig-
nificant changes in osmotic properties of frozen-thawed
erythrocytes.
According to Rapatz and Luyet [22] 5% glycerol
concetration is effective when freezing erythrocytes
down to –30°C, however, when freezing the cells down
to –130°C its cryoprotective activity sharply reduces.
Glucose and sucrose are effective when freezing eryth-
rocytes down to –40...–130°C. Herewith the protec-
tive activity of polyvinylpyrrolidone (PVP) is between
the ones of penetrating cryoprotectants and sugars [22].
Such penetrating cryoprotectants as glycerol protect
cells during slow freezing [18] and non-penetrating ones
act during rapid freezing [12]. Probably the combina-
tion of glycerol with glucose, sucrose and polymers
like PVP in cryopreservation medium represents a suf-
ficient cryoprotective effect. This suggestion conforms
with the obtained results on a degree of damage, H+
ion flow rate and osmotic hemolysis of erythrocytes
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Рис. 2. Осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в среде, содержащей: а – 20% Д-35000 ( , , ) + 5%
глицерина ( ) или 5% 1,2-ПД ( ); б – 20% Д-10000 ( , , ) + 5% глицерина ( ) или 5% 1,2-ПД ( ); – интактные
клетки.
Fig. 2. Osmotic hemolysis of erythrocytes frozen in the medium, containing: a – 20% D-35000 ( , , ) + 5% glycerol ( )
or 5% 1,2-PD (2); b – 20% D-10000 ( , , ) + 5% glycerol ( ) or 5% 1,2-PD (2); – intact cells.
а a б b
133 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
снижается. Глюкоза и сахароза эффективны при
замораживании эритроцитов до температуры –40...
–130°С. При этом поливинилпирролидон (ПВП) по
защитной активности занимает промежуточное
положение между проникающими криопротекто-
рами и сахарами [22]. Такие проникающие крио-
протекторы, как глицерин, защищают клетки при
медленном охлаждении [18], непроникающие – при
быстром [12]. Возможно, сочетание в криоконсер-
ванте глицерина с глюкозой, сахарозой и полиме-
рами, подобными ПВП, дает хороший криозащит-
ный эффект. Это предположение согласуется с
полученными результатами относительно степени
повреждения, скорости потока ионов Н+ и осмоти-
ческого гемолиза эритроцитов, замороженных в
среде, содержащей сахарозу, полимер и проникаю-
щий криопротектор (глицерин или 1,2-ПД) (табл. 1
и 2; рис. 2 и 3). Сочетание в криоконсерванте гли-
церина или 1,2-ПД с сахарозой устраняет эффект
“упаковки”, вероятно, за счет ослабления постги-
пертонического стресса эритроцитов в ходе быст-
рого замораживания-отогрева [7]. Устранение эф-
фекта “упаковки” сопровождается сохранением
осмотической хрупкости замороженных-отогре-
тых эритроцитов как при повышении концентрации
глицерина в среде замораживания (от 20 до 40%),
так и при включении в криоконсервант с глицерином
(20%) мембранотропных реагентов [29]. Получен-
ные результаты по сохранению осмотических
свойств эритроцитов, замороженных-отогретых в
frozen-thawed in the medium containing sucrose, poly-
meric substance and penetrating cryoprotectant (glyc-
erol or 1,2-PD) (Tables 1 and 2; Fig. 2 and 3). The
combination of glycerol or 1,2-PD with sucrose in
cryopreservation medium eliminates the "packing" ef-
fect probably due to the weakening of post-hypertonic
stress action in erythrocytes during rapid freeze-thaw-
ing [7]. Elimination of "packing" effect is accompanied
by preservation of osmotic fragility in frozen-thawed
erythrocytes both when increasing glycerol concen-
tration in the freezing medium (from 20 to 40%) and
when introduce membrane trophic reagents [29] into
cryopreservation medium with glycerol (20%). The
obtained results about preservation of osmotic proper-
ties of erythrocytes frozen-thawed in combined media
containing sucrose, polymeric substance (dextran or
PEG) and penetrating cryoprotectant (glycerol or 1,2-
PD) (Table 1 and 2; Fig. 2 and 3) conform with the
observations of Wagner et al. [29] and confirm the
suggestion that elimination of "packing" effect is trig-
gered by the weakening of post-hypertonic stress ac-
tion in cells during freeze-thawing.
The combining of hydroxyethyl starch (HES) with
DMSO in cryopreservation medium provides the pres-
ervation of functional indices during freeze-thawing of
stem cells from peripheral blood [11], bone marrow
cells [16, 26, 27], granulocytes [14], lymphocytes [24],
hemopoietic cells of cord blood [15] and human pan-
creas cells [17]. The application of such a combined
cryopreservative simplifies the freezing procedure [15–
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Концентрация NaCl, %
NaCl concentration, %
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Рис. 3. Осмотический гемолиз эритроцитов, замороженных в среде, содержащей: а – 20% ПЭГ-2000 ( , , ) + 5%
глицерина ( ) или 5% 1,2-ПД ( ); б – 20% ПЭГ-1500 ( , , ) + 5% глицерина ( ) или 5% 1,2-ПД ( ); –
интактные клетки.
Fig. 3. Osmotic hemolysis of erythrocytes frozen in the medium, containing: a – 20% PEG-2000 ( , , ) + 5% glycerol
( ) or 5% 1,2-PD (2); b – 20% PEG-1500 ( , , ) + 5% glycerol ( ) or 5% 1,2-PD (2); – intact cells.
а a б b
134 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
комбинированных средах, содержащих сахарозу,
полимер (декстран или ПЭГ) и проникающий
криопротектор (глицерин или 1,2-ПД) (табл. 1 и 2;
рис. 2 и 3), согласуются с данными Wagner C.T. и
соавт. [29] и подтверждают предположение, что
устранение эффекта “упаковки” определяется
ослаблением постгипертонического стресса кле-
ток в процессе замораживания-отогрева.
Сочетание гидроксиэтилированного крахмала
(ГЭК) с ДМСО в криоконсерванте обеспечивает
сохранение функциональных показателей при
замораживании стволовых клеток периферической
крови [11], клеток костного мозга [16, 26, 27],
гранулоцитов [14], лимфоцитов [24], гемопоэтичес-
ких клеток кордовой крови [15] и клеток поджелу-
дочной железы человека [17]. Применение данного
комбинированного криоконсерванта упрощает
процедуру замораживания [15–17, 26, 27]. Вероят-
но, это связано с тем, что использование комбина-
ции ГЭК и ДМСО позволяет избежать значитель-
ного переохлаждения клеточных образцов при
замораживании [16, 27]. Данные литературы
свидетельствуют о том, что защитная эффектив-
ность различных криопротекторов проявляется в
разных интервалах отрицательных температур и
при различных скоростях охлаждения. Можно
предположить, что в комбинированной среде
каждый криопротектор будет проявлять защитное
свойство при “своих” низкотемпературных усло-
виях, но в итоге комбинированный криоконсервант
будет обеспечивать аддитивную криопротектор-
ную эффективность. Кроме того, комбинированные
криоконсерванты ослабляют постгипертонический
стресс при размораживании, что обеспечивает со-
хранение удовлетворительных осмотических
свойств клеток.
Таким образом, эритроциты, отмытые изотони-
ческим раствором NaCl после замораживания-
отогрева в среде с декстранами или ПЭГ, имеют
значительную степень повреждения, а в оставших-
ся клетках наблюдаются существенные измене-
ния осмотических свойств. Сочетание в криокон-
серванте декстранов или ПЭГ с невысокими кон-
центрациями глицерина или 1,2-ПД обеспечивает
криозащитный эффект комбинированного состава,
который противодействует повреждающим факто-
рам при замораживании-отогреве и сохраняет ос-
мотические свойства эритроцитов после их отмы-
вания от криоконсерванта.
Выводы
В эритроцитах, замороженных-отогретых с
декстраном или полиэтиленгликолем, наблюдаются
увеличение скорости потока ионов Н+ по сравнению
с интактными клетками и повышение осмотичес-
кой хрупкости в среде с концентрацией NaCl 0,45–
17, 26, 27]. Most likely this is due to avoidance of sig-
nificant supercooling in cells during freezing provided
by the application of HES and DMSO combination [16,
27]. All these data testify that protection efficiency of
various cryoprotectants is manifested within different
ranges of negative temperatures and under different
cooling rates. It may be suggested that each cryopro-
tectant as a part of combined medium would manifest
a protective property under its "own" low temperature
conditions and eventually the combined cryopreser-
vation medium will provide an additive cryoprotection
efficiency. Moreover the combined cryopreservatives
reduce post-hypertonic stress during freeze-thawing
providing the preservation of sufficient osmotic prop-
erties of cells.
Thus, the erythrocytes washed with NaCl isotonic
solution after freeze-thawing in the medium with
dextrans or PEG have a high damage rate and the re-
maining cells manifest significant changes in osmotic
properties. The combining of dextrans or PEG with
low concentrations of glycerol or 1,2-PD in cryopreser-
vation medium provides effective cryoprotective prop-
erties of combined composition preventing damaging
during freeze-thawing and preserving sufficient osmotic
indices of erythrocytes after removing the cryopre-
servative.
Conclusions
In erythrocytes frozen-thawed with dextran or poly-
ethylene glycol the increasing of H+ ion flow rate if
compared with the intact cells and the raising of osmo-
tic fragility in the medium with 0.45–0.9% NaCl are
revealed. Addition of glycerol or 1,2-PD into cryopre-
servation medium results in preservation of osmotic
properties of frozen-thawed cells.
References
Ashmarin I.P., Vasil'ev I.P., Ambrosov V.A. Express methods
of statistical analysis and planning of experiments.– Lenin-
grad, 1975.– 76 p.
Gordienko E.A. Physical grounds for low temperature preser-
vation of cell suspensions.– Kiev: Naukova Dumka, 1994.–
70 p.
Mezhidov S.Kh., Belyaeva I.M., Vorotilin A.M., Moiseev V.A.
Effect of combination of polyvinylpirrolidon and 1,2-propane-
diol to the erythrocytes survival at cryopreservation //
Problems of Cryobiology.– 1996.– N2.– P. 22–25.
Mezhidov S.Kh., Moiseev V.A. Effect of combination of high
molecular cryoprotectants with 1,2-propanediol to the
erythrocytes survival at cryopreservation // Problems of
Cryobiology.– 1995.– N3.–- P. 46–48.
Mikhnovich E.P., Rozhdestvenskaya M.A., Nedel'sky G.T.
Erythrocyte cryopreservation under –196°C with penetrating
and non-penetrating substances // Actual Tasks of
Cryobiology and Cryomedicine.– Kiev: Naukova Dumka, 1974.–
P. 161–164.
Ostankov M.V. Theoretical grounds and experimental exa-
mination of efficiency of rapid two-stage freezing: Author’s
1.
2.
3.
4.
5.
6.
135 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
Литература
Ашмарин И.П., Васильев И.П., Амбросов В.А. Быстрые
методы статистической обработки и планирование
экспериментов.– Л., 1975.– 76 с.
Гордиенко Е.А. Физические основы низкотемпературного
консервирования клеточных суспензий.– Киев: Наук.
думка, 1994.– 70 с.
Межидов С.Х., Беляева И.М., Воротилин А.М., Мои-
сеев В.А. Влияние сочетания поливинилпирролидона и
1,2-пропандиола на сохранность эритроцитов при крио-
консервировании // Проблемы криобиологии.– 1996.–
№2.– С. 22–25.
Межидов С.Х., Моисеев В.А. Влияние сочетания высоко-
молекулярных криопротекторов с 1,2-пропандиолом на
сохранность эритроцитов при криоконсервировании //
Проблемы криобиологии.– 1995.– №3.– С. 46–48.
Михнович Е.П., Рождественская М.А., Недельский Г.Т.
Криоконсервация эритроцитов при –196°С с проникаю-
щими и непроникающими веществами // Актуальные во-
просы криобиологии и криомедицины: Сб. научных
трудов.– Киев: Наук. думка, 1974.– С. 161–164.
Останков М.В. Теоретичне обґрунтування та експери-
ментальна перевірка ефективності швидкого двоступін-
частого заморожування: Автореф. дис. … канд. біол.
наук.– Харків, 2001.– 20 с.
Рамазанов В.В. Влияние комбинированных сред на по-
вреждение эритроцитов, замороженных с различным
гематокритом // Проблемы криобиологии.– 2006.– Т. 16,
№2.– С. 155–163.
Рамазанов В.В., Лупилова Н.А., Тодрин А.Ф., Бондарен-
ко Т.П. Осмотическая модификация транспорта протонов
в эритроцитах в сульфатной среде // Проблемы криобио-
логии.– 1999 .– №4.– С. 34–41.
Brahm J. Temperature-dependent changes of chloride trans-
port kinetics in human red cells // J. Gen. Physiol.– 1977.–
Vol. 70, N3.– P. 283–306.
Bursaux E., Hilly M., Bluze A., Poyart C. Organic phosphates
modulate anion self-exchange across the human erythrocyte
membrane // Biochim. Biophys. Acta.– 1984.– Vol. 777, N2.–
P. 253–260.
Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
gives better results than DMSO alone // Bull. Cancer.– 2004.–
Vol. 91, N4.– P. E97–102.
Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mammalian
cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms //
Cryobiology.– 1973. – Vol. 10, N6.– P. 488–496.
Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.– Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-
vation of human granulocytes // Cryobiology.– 1975.– Vol. 12,
N3.– P. 181–191.
Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-pro-
grammed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyl-
ethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord
blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue
Za Zhi.– 2004.– Vol. 12, N5.– P. 670–673.
Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated
human marrow cells // Cryobiology.– 1994.– Vol. 31, N4.–
P. 349–354.
0,9%. Если в криоконсервант дополнительно вклю-
чать глицерин или 1,2-ПД, то существенных откло-
нений осмотических свойств замороженных-ото-
гретых клеток не отмечается.
abstract of the thesis of candidate of biol. sciences.– Kharkov,
2001.– 20 p.
Ramazanov V.V. Effect of combined media to erythrocytes
destruction frozen with different hematocrit // Problems of
Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N2.– P. 155–163.
Ramazanov V.V., Lupilova N.A., Todrin A.F., Bondarenko T.P.
Proton transport osmotic modification in erythrocytes in a
sulphatic medium // Problems of Cryobiology.– 1999.– N4.–
P. 34–41.
Brahm J. Temperature-dependent changes of chloride trans-
port kinetics in human red cells // J. Gen. Physiol.– 1977.–
Vol. 70, N3.– P. 283–306.
Bursaux E., Hilly M., Bluze A., Poyart C. Organic phosphates
modulate anion self-exchange across the human erythrocyte
membrane // Biochim. Biophys. Acta.– 1984.– Vol. 777, N2.–
P. 253–260.
Clapisson G., Salinas C., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
gives better results than DMSO alone // Bull. Cancer.– 2004.–
Vol. 91, N4.– P. E97–102.
Connor W., Ashwood-Smith M.J. Cryoprotection of mammalian
cells in tissue culture with polymers; possible mechanisms //
Cryobiology.– 1973. – Vol. 10, N6.– P. 488–496.
Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.– Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Lionetti F.J., Hunt S.M., Gore J.M., Curby W.A. Cryopreser-
vation of human granulocytes // Cryobiology.– 1975.– Vol. 12,
N3.– P. 181–191.
Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-
programmed process using dimethyl sulfoxide and hydroxyl-
ethyl starch as cryoprotectants in cryopreservation of cord
blood hematopoietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue
Za Zhi.– 2004.– Vol. 12, N5.– P. 670–673.
Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated
human marrow cells // Cryobiology.– 1994.– Vol. 31, N4.–
P. 349–354.
Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified
method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl
starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Transplant
Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.
Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14,
N3.– P. 251–272.
Mazur P., Miller R.H. Survival of frozen-thawed human red
cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose //
Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N5.– P. 523–536.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran
during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173–186.
Pitt R.E., Chandrasekaran M., Parks J.E. Performance of a kinetic
model for intracellular ice formation based on the extent of
supercooling // Cryobiology.– 1992.– Vol. 29, N3.– P. 359–373.
Rapatz G., Luyet B. Combined effects of freezing rates and
of various protective agents on the preservation of human
erythrocytes // Cryobiology.– 1968.– Vol. 4, N5.– P. 215–222.
Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol.– 1984.– Vol. 246,
N2.– P. 330–338.
Simon J.D., Albala B.B., Flinton L.J. et al. The cryopreser-
vation of human lymphocytes // Cryobiology.– 1974.– Vol. 11,
N6.– P. 543.
Sterling D., Reithmeier R.A., Casey J.R. A transport meta-
bolon. Functional interaction of carbonic anhydrase II and
chloride/bicarbonate exchangers // J. Biol. Chem.– 2001.–
Vol. 276, N51.– P. 47886–47894.
Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-
served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
136 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №2
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №2
controlled-rate freezing // Blood.– 1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–
978.
Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G., et al. Unfractionated
human marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch // Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N1.–
P. 17–24.
Tsuruta T., Ishimoto Y., Masuoka T. Effects of glycerol on
intracellular ice formation and dehydration of onion epidermis //
Ann. N.-Y. Acad. Sci.– 1998.– Vol. 858.– P. 217–226.
Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood
cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery
following cryopreservation // Cryobiology.– 2000.– Vol. 41,
N3.– P. 178–194.
Woelders H., Chaveiro А. Theoretical prediction of 'optimal'
freezing programmes // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N3.–
P. 258–271.
Woolgar A.E., Morris C.J. Some combined effects of hy-
pertonic solutions and changes in temperature on post-hyper-
tonic haemolysis of human red blood cells // Cryobiology.–
1973.– Vol. 10, N1.– Р. 82–86.
Accepted 13.10.2009
Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified
method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl
starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Transplant
Proc.– 2004.– Vol. 36, N4.– P. 1133–1134.
Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology.– 1977.– Vol. 14,
N3.– P. 251–272.
Mazur P., Miller R.H. Survival of frozen-thawed human red
cells as a function of the permeation of glycerol and sucrose //
Cryobiology.– 1976.– Vol. 13, N5.– P. 523–536.
Pellerin-Mendes C., Million L., Marchand-Arvier M. et al. In
vitro study of the protective effect of trehalose and dextran
during freezing of human red blood cells in liquid nitrogen //
Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N2.– P. 173–186.
Pitt R.E., Chandrasekaran M., Parks J.E. Performance of a
kinetic model for intracellular ice formation based on the extent
of supercooling // Cryobiology.– 1992.– Vol. 29, N3.– P. 359–
373.
Rapatz G., Luyet B. Combined effects of freezing rates and
of various protective agents on the preservation of human
erythrocytes // Cryobiology.– 1968.– Vol. 4, N5.– P. 215–222.
Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol.– 1984.– Vol. 246,
N2.– P. 330–338.
Simon J.D., Albala B.B., Flinton L.J. et al. The cryopreser-
vation of human lymphocytes // Cryobiology.– 1974.– Vol. 11,
N6.– P. 543.
Sterling D., Reithmeier R.A., Casey J.R. A transport meta-
bolon. Functional interaction of carbonic anhydrase II and
chloride/bicarbonate exchangers // J. Biol. Chem.– 2001.–
Vol. 276, N51.– P. 47886–47894.
Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-
served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without
controlled-rate freezing // Blood.– 1987.– Vol. 70, N4.– P. 974–
978.
Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G., et al. Unfractionated
human marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide
and hydroxyethyl starch // Cryobiology.– 1983.– Vol. 20, N1.–
P. 17–24.
Tsuruta T., Ishimoto Y., Masuoka T. Effects of glycerol on
intracellular ice formation and dehydration of onion epidermis //
Ann. N.-Y. Acad. Sci.– 1998.– Vol. 858.– P. 217–226.
Wagner C.T., Burnett M.B., Livesey S.A., Connor J. Red blood
cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery
following cryopreservation // Cryobiology.– 2000.– Vol. 41,
N3.– P. 178–194.
Woelders H., Chaveiro А. Theoretical prediction of 'optimal'
freezing programmes // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N3.–
P. 258–271.
Woolgar A.E., Morris C.J. Some combined effects of hy-
pertonic solutions and changes in temperature on post-hyper-
tonic haemolysis of human red blood cells // Cryobiology.–
1973.– Vol. 10, N1.– Р. 82–86.
Поступила 13.10.2009
Рецензент О.И. Гордиенко
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
27.
28.
29.
30.
31.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44893 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T22:26:41Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Рамазанов, В.В. 2013-06-06T15:58:15Z 2013-06-06T15:58:15Z 2011 Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов / В.В. Рамазанов// Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 2. — С. 125-136. — Бібліогр.: 31 назв. — рос., англ. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44893 57.043:612.111:547.42/43 Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в комбинированных криоконсервантах, содержащих полимерные непроникающие (декстран, полиэтиленгликоль) и проникающие (глицерин, 1,2-пропандиол) криопротекторы. Установлено, что в эритроцитах, замороженных-отогретых в среде с полимерами, отмечается повышение скорости потока ионов Н+ и осмотической хрупкости в среде, содержащей 0,45–0,9% NaCl. Для сохранения осмотических свойств замороженных- отогретых клеток достаточно включить в среду глицерин или 1,2-пропандиол (1,2-ПД) в концентрации 5%. Полученные результаты позволяют предположить, что криопротекторная эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих непроникающие и проникающие криопротекторы, определяется вкладом различных по механизму действия криозащитных компонентов в суммарную защитную эффективность при замораживании и ослаблением постгипертонического стресса на клетки при размораживании. Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених-відігрітих у комбінованих кріоконсервантах, які містять полімерні непроникаючі (декстран, поліетиленгліколь) і проникаючі (гліцерин, 1,2-пропандіол) кріопротектори. Встановлено, що в еритроцитах, заморожених-відігрітих у середовищі з полімерами, визначається зростання швидкості потоку іонів Н+ і осмотичної крихкості в середовищі, яке містить 0,45–0,9% NaCl. Для збереження осмотичних властивостей заморожених- відігрітих клітин достатньо включити в середовище гліцерин або 1,2-пропандіол в концентрації 5%. Отримані результати дозволяють припустити, що кріопротекторна ефективність комбінованих кріоконсервантів, які містять непроникаючі і проникаючі кріопротектори, визначається внеском різноманітних за механізмом дії кріозахисних компонентів у сумарну захисну ефективність при заморожуванні та послабленням постгіпертонічного стресу на клітини при розморожуванні. The osmotic properties of erythrocytes frozen-thawed in combined cryopreservatives, containing polymeric non-penetrating (dextran, polyethylene glycol) and penetrating (glycerol, 1,2-propane diol) cryoprotectants were studied. It was established that in erythrocytes frozen-thawed in the presence of polymers the increasing of H+ ion flow rate and osmotic fragility in the environment with 0.45–0.9% NaCl was observed. It is sufficient to add 5% glycerol or 1,2-propane diol (1,2-PD) to the medium to preserve osmotic properties of frozen-thawed cells. The obtained results enable to suggest that cryoprotective efficiency of combined cryopreservatives, containing non-penetrating and penetrating cryoprotectants is determined both by the contribution of cryoprotective components differing by action mechanism into the ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов Efficiency of Combined Cryopreservatives Containing Glycerol or 1,2-Propanediol During Freezing of Erythrocytes Article published earlier |
| spellingShingle | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов Рамазанов, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| title_alt | Efficiency of Combined Cryopreservatives Containing Glycerol or 1,2-Propanediol During Freezing of Erythrocytes |
| title_full | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| title_fullStr | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| title_full_unstemmed | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| title_short | Эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| title_sort | эффективность комбинированных криоконсервантов, содержащих глицерин или 1,2-пропандиол, при замораживании эритроцитов |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44893 |
| work_keys_str_mv | AT ramazanovvv éffektivnostʹkombinirovannyhkriokonservantovsoderžaŝihglicerinili12propandiolprizamoraživaniiéritrocitov AT ramazanovvv efficiencyofcombinedcryopreservativescontainingglycerolor12propanediolduringfreezingoferythrocytes |