Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения
Получены данные по сохранности клеток интерстиция тестисов крыс после замораживания-отогрева с использованием скоростей охлаждения 1; 5 и 10 град/мин и растворов глицерина (7%), диметилсульфоксида (10%), этиленгликоля (7%) и диметилформамида (5%). Установлено, что глицерин обеспечивает достаточно вы...
Gespeichert in:
| Datum: | 2011 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44903 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения / Н.А. Чернобай, Т.М. Гурина, А.В. Пахомов // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 273-279. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859591490297135104 |
|---|---|
| author | Чернобай, Н.А. Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. |
| author_facet | Чернобай, Н.А. Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. |
| citation_txt | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения / Н.А. Чернобай, Т.М. Гурина, А.В. Пахомов // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 273-279. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| description | Получены данные по сохранности клеток интерстиция тестисов крыс после замораживания-отогрева с использованием скоростей охлаждения 1; 5 и 10 град/мин и растворов глицерина (7%), диметилсульфоксида (10%), этиленгликоля (7%) и диметилформамида (5%). Установлено, что глицерин обеспечивает достаточно высокую (до 75%) сохранность клеток при всех использованных скоростях замораживания. При применении других криопротекторов значения сохранности клеток повышались (от 56 до 83%) с увеличением скорости охлаждения от 1 до 10 град/мин. Показано, что охлаждение со скоростями около 10 град/мин может обеспечивать достаточно высокую сохранность клеток интерстиция тестисов после замораживания-отогрева.
Отримано дані щодо збереженості клітин інтерстиція тестисів щурів після заморожування-відігрівання з використанням швидкостей охолодження 1; 5 та 10 град/хв та розчинів гліцерину (7%), диметилсульфоксиду (10%), етиленгліколю (7%) та диметилформаміду (5%). Встановлено, що гліцерин забезпечує достатньо високу (до 75%) збереженість клітин під час використання всіх швидкостей заморожування. При застосуванні інших кріопротекторів збереженість клітин зростала (від 56 до 83%) при збільшенні швидкості заморожування від 1 до 10 град/хв. Показано, що охолодження зі швидкостями близько 10 град/хв може забезпечити достатньо високий рівень збереженості клітин інтерстиція тестисів після заморожування-відігрівання.
The survival of testes interstitial cells after freeze-thawing using the cooling rates of 1; 5 and 10 deg/min and glycerol (7%), dimethyl sulfoxide (10%), ethylene glycol (7%) and dimethyl formamide (5%) solutions has been estimated. Using of glycerol provided sufficiently high (up to 75%) cell survival under all the studied cooling rates. Cell survival increased (from 56% upto 83%) if cooling rates were elevated from 1 up to 10 deg/min in the case of other cryoprotectants. Cooling rates about 10 deg/min provided sufficiently high level of post-thaw cell survival.
|
| first_indexed | 2025-11-27T15:16:56Z |
| format | Article |
| fulltext |
273
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-38-71, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
nadiia_chernobai@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3871, fax: +380 57 373 3084, e-mail: nadiia_chernobai@mail.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
На сегодняшний день низкотемпературное кон-
сервирование – единственно доступный способ дол-
госрочного хранения клеток, в том числе гормо-
нально-активных. Разработка научно обоснованных
способов криоконсервирования возможна с учетом
процессов массообмена в системе “клетка-окру-
жающая среда” на разных этапах криоконсервиро-
вания. Фазовый переход “вода-лед”, являющийся
неотъемлемым этапом технологического процесса
низкотемпературного консервирования биологи-
ческих объектов, обусловливает возникновение
целой цепочки повреждающих факторов, к кото-
рым, прежде всего, следует отнести дегидратацию
и внутриклеточную кристаллизацию. Оптимальная
скорость охлаждения, специфичная для конкрет-
ного типа клеток, обеспечивает баланс трансмемб-
ранного массообмена “клетка-окружающая сре-
To date, low-temperature preservation is the only
method for long-term storage of cells, including hor-
monally active ones. Development of fundamentally
attested methods of cryopreservation is possible when
considering the mass transfer processes in the system
“cell-environment” at different stages of cryopreser-
vation. “Water-ice” phase transition, being an essen-
tial step in the process of low temperature preserva-
tion of biological objects, causes the appearance of
variety of damaging factors, which primarily include
dehydration and intracellular crystallization. The opti-
mal cooling rate is specific to a particular cell type, and
provides an equilibrium transmembrane mass transfer
between cell and environment, resulting in dehydration
of cells, which, on the one hand, is sufficient to elimi-
nate the possibility of intracellular ice formation, on the
other hand it does not reach the critical level of fatal
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
УДК 577.352.4:612.111.085:547.42
Н.А. ЧЕРНОБАЙ*, Т.М. ГУРИНА, А.В. ПАХОМОВ
Криозащитная эффективность ряда криопротекторов
в зависимости от скорости охлаждения
UDC 577.352.4:612.111.085:547.42
N.A. CHERNOBAI*, T.M. GURINA, A.V. PAKHOMOV
Cryoprotective Efficiency of Some Cryoprotectants
Depending on Cooling Rate
Получены данные по сохранности клеток интерстиция тестисов крыс после замораживания-отогрева с использованием
скоростей охлаждения 1; 5 и 10 град/мин и растворов глицерина (7%), диметилсульфоксида (10%), этиленгликоля (7%) и
диметилформамида (5%). Установлено, что глицерин обеспечивает достаточно высокую (до 75%) сохранность клеток при всех
использованных скоростях замораживания. При применении других криопротекторов значения сохранности клеток повышались
(от 56 до 83%) с увеличением скорости охлаждения от 1 до 10 град/мин. Показано, что охлаждение со скоростями около
10 град/мин может обеспечивать достаточно высокую сохранность клеток интерстиция тестисов после замораживания-отогрева.
Ключевые слова: криоконсервирование, скорость охлаждения, клетки интерстиция тестисов, проницаемость, криопро-
текторы.
Отримано дані щодо збереженості клітин інтерстиція тестисів щурів після заморожування-відігрівання з використанням
швидкостей охолодження 1; 5 та 10 град/хв та розчинів гліцерину (7%), диметилсульфоксиду (10%), етиленгліколю (7%) та
диметилформаміду (5%). Встановлено, що гліцерин забезпечує достатньо високу (до 75%) збереженість клітин під час
використання всіх швидкостей заморожування. При застосуванні інших кріопротекторів збереженість клітин зростала (від 56
до 83%) при збільшенні швидкості заморожування від 1 до 10 град/хв. Показано, що охолодження зі швидкостями близько
10 град/хв може забезпечити достатньо високий рівень збереженості клітин інтерстиція тестисів після заморожування-
відігрівання.
Ключові слова: кріоконсервування, швидкість охолодження, клітини інтерстиція тестисів, проникність, кріопротектори.
The survival of testes interstitial cells after freeze-thawing using the cooling rates of 1; 5 and 10 deg/min and glycerol (7%),
dimethyl sulfoxide (10%), ethylene glycol (7%) and dimethyl formamide (5%) solutions has been estimated. Using of glycerol
provided sufficiently high (up to 75%) cell survival under all the studied cooling rates. Cell survival increased (from 56% upto 83%)
if cooling rates were elevated from 1 up to 10 deg/min in the case of other cryoprotectants. Cooling rates about 10 deg/min provided
sufficiently high level of post-thaw cell survival.
Key words: cryopreservation, cooling rate, testes interstitial cells, permeability, cryoprotectants.
274 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
да”, в результате которого обезвоживание клеток,
с одной стороны, является достаточным, чтобы
исключить вероятность внутриклеточного льдо-
образования, а с другой – не достигает критичес-
кого уровня, чтобы привести к неизбежному пов-
реждению клеток. Существенную роль в этом про-
цессе играют особенности строения плазматичес-
ких мембран клеток, лимитирующих водный поток.
Цель работы – оценить влияние скоростей ох-
лаждения на сохранность клеток интерстиция тес-
тисов при использовании в качестве криопротекто-
ров растворы глицерина, диметилсульфоксида
(ДМСО), этиленгликоля (ЭГ) и диметилформамида
(ДМФА), проникающая способность которых изу-
чена [7].
Материалы и методы
Объектом исследований были клетки ткани се-
менников крыс, полученные ферментативным
методом [6]. Суспензии включали клетки диамет-
ром 4,21–21 мкм. Наиболее многочисленной была
популяция клеток размерами 11–16 мкм, на
которых проводили исследования.
В работе использовали растворы глицерина,
ДМСО, ЭГ и ДМФА, приготовленные на среде 199
с 20 мМ Hepes.
Исследовали сохранность клеток интерстиция
тестисов после их 30-минутной экспозиции при
температуре 20°С в растворах криопротекторов 5;
7; 10 и 15%-х концентраций. На основании этих
исследований подбирали оптимальные концент-
рации криопротекторов для криоконсервирования,
которые существенно не снижали их сохранность.
Жизнеспособность клеток до и после заморажи-
вания-отогрева контролировали методом суправи-
тального окрашивания с использованием 0,2%-го
водного раствора трипанового синего [3].
Количество жизнеспособных клеток опреде-
ляли по формуле:
%W
общ
окр 100×
∑
∑
= ,
где ∑окр – количество окрашенных клеток; ∑общ –
общее количество клеток.
Для оценки влияния на клетки экспозиции с крио-
протекторами и замораживания-отогрева был вве-
ден относительный показатель сохранности, опре-
деляемый из соотношения:
%
W
WN 100
0
1 ×= ,
cell damage. An important role in this process is played
by structural features of cell plasma membrane, limit-
ing the water flow.
The aim of the study was to assess the effect of
cooling rate on the survival of testes interstitial cells
when using the cryoprotectant solutions of glycerol,
dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and
dimethyl formamide (DMFA), which permeability was
studied earlier [7].
Materials and methods
The investigations were carried-out in rat testes cells
isolated by enzymatic method [6]. Suspensions com-
prised the cells of 4.21–21 µm diameter. The most part
made the population of cells of 11–16 µm, and these
cells were used in the study.
In this work we used solutions of glycerol, DMSO,
DMFA, ethylene glycol prepared with 199 medium
supplemented with 20 mM Hepes.
We investigated the survival of testes interstitial cells
after 30 minutes of exposure at 20°C in cryoprotectant
solutions of 5, 7, 10, and 15%. Basing on these studies
we selected the optimal concentrations of cryoprotec-
tants for freeze-thawing, which did not significantly
reduced the cell survival.
The viability of cells before and after freeze-thaw-
ing was assessed using supravital staining with 0.2%
aqueous solution of trypan blue [3].
The number of viable cells was determined by the
formula:
%W
total
stained 100×
∑
∑= ,
where Σstained is the number of stained cells; Σtotal is
total number of cells.
To assess the effect of exposure with cryoprotec-
tants and freeze-thawing on the cells we introduced a
relative index of survival calculated with the following
relation:
%
W
WN 100
0
1 ×= ,
where W0 and W1 are viabilities of cells before and
after the effect (exposure with cryoprotectant solution
of freeze-thawing), correspondingly.
Before freeze-thawing the solutions of cryoprotec-
tants were added to cell suspension in a 1:1 ratio to get
the required final concentration. After that the sam-
ples of 1 ml were incubated during 5 min at 20°C, and
cooled in the programmable freezer Cryoson (Germa-
ny) in cryotubes (Nunc, USA) of 1.8 ml using constant
275 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
где W0 и W1 – количество жизнеспособных клеток
до и после воздействия (экспозиция в растворе
криопротектора или после замораживания-ото-
грева) соответственно.
При криоконсервировании растворы криопротек-
торов добавляли к клеточной суспензии в соотно-
шении 1:1 для получения необходимой конечной
концентрации. Затем полученные образцы объе-
мом 1 мл инкубировали в течение 5 мин при темпе-
ратуре 20°С, замораживали на программном замо-
раживателе “Cryoson” (Германия) в криоампулах
(“Nunc”, США) объемом 1,8 мл с постоянными
скоростями охлаждения 1; 5 или 10 град/мин до
–40оС и затем контейнер с образцами погружали в
жидкий азот для хранения.
После хранения в течение недели образцы ото-
гревали на водяной бане при 32...34°С. Криопро-
тектор удаляли трехкратным центрифугированием
клеток интерстиция тестисов (1500 об/мин в тече-
ние 3 мин), используя среду 199 с 20 мМ Hepes.
Далее определяли относительный показатель со-
хранности клеток после замораживания-отогрева.
Используя модифицированную физико-мате-
матическую модель Кедем-Качальского [1], опи-
сали осмотическое поведение изолированных кле-
ток на основных этапах замораживания-отогрева.
В качестве транспортных характеристик клеток в
данной модели используются коэффициенты прони-
цаемости для воды (Lp) и криопротектора (Кp), а
наиболее существенных геометрических парамет-
ров – поверхностно-объемное отношение клетки
(γ=S0/V0) и относительный осмотически неактив-
ный объем (α=Vα/V0, где Vα – объем дегидратиро-
ванной клетки; V0 – объем интактной клетки), опре-
деленные нами ранее [7, 8]. Решениями модели
при известных значениях Lp и Кp являются: зависи-
мости y(T), π1
in(T) и π2
in(T), где у – относительный
объем клетки; π1
in и π2
in – осмотическое давление
первого и второго растворённого вещества внутри
клетки соответственно.
Кинетику изменения концентрации С внеклеточ-
ного раствора в процессе замораживания задавали
при расчетах аналитически, путем аппроксимации
фазовой диаграммы плавления водных растворов
исследуемых криопротекторов [1] в следующем
виде:
С = –9,7664×10-3T2 + 3,8264T – 313,4059 – ЭГ;
С = –26,1×10-3T2 + 12,608T – 1496,8 – глицерина;
С = –14×10-3T2 + 5,86T–550,77 – ДМСО;
С = –0,238×10-3T3 + 0,1519T2 – 32,4425T + 2376,471 –
ДМФА,
где Т – текущая температура.
Статистическую обработку результатов экспе-
риментов проводили по методу Стьюдента-Фи-
шера.
cooling rates of 1, 5 or 10 deg/min down to –40°C and
then the container with the samples were plunged into
liquid nitrogen for storage.
After one-week storage the samples were warmed
in a water bath at 32…34°C. Cryoprotectant was re-
moved by triple centrifugation of testes interstitial cells
(1500 rpm for 3 min), using medium 199 with 20 mM
Hepes. Then, a relative index of post-thaw cell sur-
vival was determined.
Applying the modified physical-mathematical model
of Kedem-Kachalsky [1], we described the osmotic
behavior of isolated cells at key stages of freeze-thawing
process. The following transport parameters of the cells
are used in this model: the coefficients of permeability
for water (Lp) and cryoprotectant (Kp), as well as the
most significant geometrical parameters: cell surface-
to-volume ratio (γ = S0/V0) and relative osmotically in-
active volume (α = Vα / V0, where Vα is the volume of
dehydrated cell; V0 is volume of intact cell, found by us
earlier [7, 8]. If the values Lp and Kp are known the
solutions of this model are the dependencies y(T),
π1
in(T) and π2
in(T) temperature, where y is the rela-
tive cell volume; π1
in and π2
in are the osmotic pressu-
res of the first and second solute inside the cell, corre-
spondingly
The kinetics of the changes in concentration of ex-
tracellular solution during freezing in the calculations
was set analytically by approximating the phase dia-
gram of melting of aqueous solutions of the studied
cryoprotectants [1] as follows:
С = –9.7664×10-3T2 + 3.8264T – 313.4059 – EG;
С = –26.1×10-3T2 + 12.608T – 1496.8 – glycerol;
С = –14×10-3T2 + 5.86T–550.77 – DMSO;
С = –0.238×10-3T3 + 0,1519T2 – 32.4425T + 2376.471 –
DMFA,
where T is the current temperature.
Statistical processing of experimental data was
performed by the Student-Fisher’s method.
Results and discussion
It was found that exposure of testes interstitium
cells in the solutions of cryoprotectants led to an in-
crease of number of damaged cells. After 30 min in-
cubation in 5% solutions of studied substances the sur-
vival of cell slightly decreased (by 2–8%) comparing
to the control, in the case of 7% cryoprotectant solu-
tions under the same conditions, the survival decreased
by 7–14%. The most significant damage was observed
in 10 and 15% solutions of studied cryoprotectants, the
number of damaged cells increased by 10–20% (Fig. 1).
Analysis of the obtained data on the survival of tes-
tes interstitial cells after exposure in solutions of gly-
cerol, ethylene glycol and DMFA of various concentra-
tions allowed to conclude that the maximum concen-
trations of cryoprotectants, which do not significantly
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
276 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Результаты и обсуждение
Установлено, что после экспозиции клеток ин-
терстиция тестисов с растворами криопротекторов
количество поврежденных клеток достоверно
увеличивалось. После 30-минутной инкубации c
5%-ми растворами исследуемых веществ со-
хранность клеток незначительно снижалась (на 2–
8%) по сравнению с контролем, при использовании
7%-х растворов криопротекторов при тех же усло-
виях сохранность уменьшалась на 7–14%. Наи-
большее повреждающее действие оказали 10 и
15%-е растворы исследуемых криопротекторов,
количество поврежденных клеток увеличивалось
на 10–20% (рис. 1). Анализируя полученные дан-
ные о сохранности клеток интерстиция тестисов
после экспозиции в растворах глицерина, ЭГ и
ДМФА различных концентраций, мы пришли к
заключению, что максимальные концентрации
криопротекторов, которые существенно не сни-
жают сохранность, для ДМФА – 5%, для ЭГ и гли-
церина – 7%. При дальнейших экспериментах
применяли эти концентрации. Концентрация ДМСО
10% была выбрана с учетом данных предыдущих
исследований [4, 5].
На рис. 2 показана зависимость сохранности
клеток интерстиция тестисов от скорости замора-
живания с различными криопротекторами. Из
приведенных данных видно, что глицерин обеспечи-
вает достаточно высокую (до 75%) сохранность
клеток после замораживания со скоростями 1; 5 и
10 град/мин. Замораживание с применением раст-
воров ДМСО и ЭГ со скоростью 1 град/мин обес-
печивало сохранность клеток интерстиция тести-
сов до 59%. С увеличением скорости охлаждения
до 5÷10 град/мин сохранность в среднем повы-
шалась до 72%.
Наиболее высокие значения сохранности (83%)
были получены после охлаждения клеток со ско-
ростью 10 град/мин с использованием ДМФА. При
снижении скорости охлаждения до 1 град/мин
сохранность клеток уменьшалась до 56%. Исполь-
зовав данные работы [8], можно предположить, что
более низкая сохранность клеток интерстиция тес-
тисов после замораживания-оттаивания в присут-
ствии ДМФА при медленном охлаждении обуслов-
лена чрезвычайно высокой проникающей способ-
ностью (К1 = 24,45×10–7 м/с при температуре 20°С)
этого вещества через мембраны клеток интерсти-
ция тестисов, что могло стать причиной дополни-
тельного поступления криопротектора в клетки еще
на этапе охлаждения.
Исследование влияния замораживания при вы-
сокой скорости охлаждения (85–100 град/мин) в
присутствии 10% ДМСО на сохранность орга-
нотипической культуры семенников после отогрева
[2] показало, что быстрое охлаждение может при-
Рис. 1. Сохранность клеток интерстиция тестисов после
30-минутной экспозиции (при 20°С) клеточной суспен-
зии с растворами криопротекторов различных концент-
раций: – глицерина; – ЭГ; – ДМФА; * – различия
достоверны по отношению к значениям сохранности при
5%-й концентрации соответствующего криопротектора
(p < 0,05).
Fig. 1. Testes interstitium cell survival after 30 min exposure
(at 20°С) of cell suspension with cryoprotectant solutions
of various concentrations: – glycerol; – EG; – DMFA;
* – the differences are statistically significant comparing to
the data of survival at 5% concentration of corresponding
cryoprotectant (p < 0.05).
Контроль
Control
С
ох
ра
нн
ос
ть
к
ле
то
к,
%
C
el
l s
ur
vi
va
l,
%
5 7 10 15
reduce the cell survival are: 5% for DMFA, and 7% for
ethylene glycol and glycerol. In further experiments these
concentrations were used. The concentration of DMSO
of 10% was chosen based on previous studies [4, 5].
Fig. 2 represents the data on survival of testes in-
terstitial cells in dependence of cooling rates and types
of cryoprotectant. The data show that glycerol pro-
vides quite a high survival (75%) of cells after cooling
with rates of 1, 5 and 10 deg/min. Freezing with DMSO
and EG solutions using cooling rate of 1 deg/min re-
sulted in the survival of testes interstitial cells of 59%.
Increasing of cooling rate up to 5÷10 deg/min led to a
rise up to 72% in average.
The highest values of cell survival (83%) were ob-
tained using cooling rate of 10 deg/min and DMFA
solution. Reducing of the cooling rate down to 1 deg/min
led to a decrease in cell survival down to 56%. Using
our recent data [8], we can assume that the lower sur-
vival of testes interstitial cells after freeze-thawing in
the presence of DMFA and slow cooling is due to the
extremely high permeability (K1 = 24.45×10–7 m/s at
20°C) of this substance through testes interstitial cell
membranes that could cause additional entry of the
cryoprotectant into the cells already at the stage of
cooling.
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
*
*
*
* *
277 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
водить к внутриклеточной кристаллизации за счет
недостаточной дегидратации клеток в процессе
охлаждения. Оптимальной же скоростью, не приво-
дящей к значительному снижению сохранности
клеток после замораживания-оттаивания, по мнению
автора, является скорость охлаждения 5 град/мин.
Полученные данные свидетельствуют, что при
оценке криозащитных свойств криопротекторов
варьирование скоростей охлаждения может пока-
зать, какой из них является более эффективным.
Мембраны клеток интерстиция тестисов так же
хорошо проницаемы для глицерина, как и для ЭГ и
ДМСО [8], вместе с тем, если для ЭГ и ДМСО
предпочтительным оказалось более быстрое ох-
лаждение, то при использовании глицерина досто-
верных различий влияния скорости охлаждения в
диапазоне 1÷10 град/мин на сохранность клеток
интерстиция тестисов нами не выявлено. Для
ДМФА более эффективными оказались скорости
охлаждения образцов 5 и 10 град/мин.
Успех криоконсервирования во многом опреде-
ляется осмотическим поведением клеток на ос-
новных его этапах, которое зависит от степени
согласования применяемых процедур с транспорт-
ными характеристиками плазматических мембран
криоконсервируемых клеток и их геометрическими
параметрами. Анализ осмотического поведения
клеток при различных процедурах криоконсервиро-
вания дает возможность определить наиболее
оптимальные условия насыщения клеток крио-
протектором и его удаления из клеток, согласовать
процедуру экспозиции в растворе криопротектора
с процедурой дальнейшего замораживания и т. п.
Используя вычисленные ранее коэффициенты
проницаемости и соответствующие геометричес-
кие параметры клеток интерстиция тестисов [7,
8], было проведено моделирование их осмотичес-
кого поведения на этапе охлаждения с различными
скоростями.
На рис. 3 показана динамика изменения относи-
тельного объёма исследуемых клеток при охлаж-
дении со скоростями 1; 10 и 100 град/мин.
Из представленных данных видно, что при ско-
рости охлаждения 1 град/мин в присутствии ДМСО
обезвоживание клеток завершается к –10°С, при
замораживании с растворами ЭГ и ДМФА к –20°С,
а при использовании глицерина достижение мини-
мального объема клеток наблюдается к –45°С.
Данный факт свидетельствует о снижении прони-
цаемости мембран клеток интерстиция тестисов
при охлаждении для молекул глицерина по сравне-
нию с использованием других криопротекторов.
Увеличение скорости охлаждения до 10 град/мин
в присутствии всех исследуемых веществ рас-
ширяет температурный диапазон обезвоживания
клеток интерстиция тестисов. При охлаждении со
Investigation of the effect of freezing with rapid
cooling (85–100 deg/min) in the presence of 10%
DMSO on the survival of testes organotypic culture
after thawing [2] has shown that rapid cooling could
lead to intracellular crystallization due to insufficient
dehydration of cells during cooling. The optimal cool-
ing rate which caused less significant reduction in cell
survival after freeze-thawing was reported as 5 deg/min.
The obtained data suggest that when assessing the
protective properties of cryoprotectants the varying of
cooling rates could reveal which substance is more
efficient. Testes interstitial cell membranes are highly
permeable for glycerol, as well as for EG and DMSO
[8]. However, while EG and DMSO showed better
action during rapid cooling, the application of glycerol
did not reveal the significant differences in the effect
of cooling rate in the range of 1÷10 deg/min on the
survival of testes interstitial cells. In the case of DMFA
the more efficient cooling rates were 5 and 10 deg/min.
The success of cryopreservation is mainly deter-
mined by the osmotic reactions of the cells at the main
stages of the process, which depend on the coordina-
tion of the applied procedures and the transport cha-
racteristics of cell plasma membrane as well as cell
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
����
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Рис. 2. Сохранность клеток интерстиция тестисов после
замораживания-отогрева с растворами глицерина (7%),
ДМСО (10%), ЭГ (7%) и ДМФА (5%) со скоростями,
град/мин: – 1, – 5; – 10; * – различия достоверны
относительно охлаждения со скоростью 1 град/мин в
присутствии ДМСО, ЭГ и ДМФА; # – различия дос-
товерны относительно охлаждения со скоростями 1 и
5 град/мин в присутствии ДМФА (р < 0,05).
Fig. 2. Testes interstitium cell survival after freeze-thawing
with solutions of glycerol (7%), DMSO (10%), EG (7%) and
DMFA (5%) with various cooling rates, deg/min: – 1; –
5; – 10; * – the differences are statistically significant
comparing to the data for cooling rates of 1 deg/min and in
the presence of DMSO, EG and DMFA; # – the differences
are statistically significant comparing to the data for cool-
ing rates of 1 and 5 deg/min and in the presence of DMFA;
(p < 0.05).
Контроль
Control
С
ох
ра
нн
ос
ть
к
ле
то
к,
%
C
el
l s
ur
vi
va
l,
%
Глицерин
Glycerol
ДМСО
DMSO
ЭГ
EG
ДМФА
DMFA
* * *
*
*
#
278 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
скоростью 100 град/мин степень обезвоживания
клеток становится незначительной, что может при-
вести к внутриклеточной кристаллизации и стать
причиной повреждения клеток.
Результаты прогнозирования осмотического
поведения клеток интерстиция тестисов при замо-
раживании с разными скоростями позволяют дать
следующее объяснение повышению сохранности
клеток при повышении скорости охлаждения до
10 град/мин в присутствии ДМСО, ЭГ и ДМФА.
Охлаждение со скоростью 1 град/мин сопря-
жено с длительным нахождением клеток в обезво-
женном состоянии, что может стать причиной их
гибели в результате осмотического стресса. Увели-
чение скорости охлаждения до 10 град/мин сни-
жает время экспозиции клеток в дегидратирован-
ном состоянии, исключая одновременно и внутри-
клеточную кристаллизацию, и внутриклеточный
стресс. Вместе с тем, очевидно, что дальнейшее
увеличение скорости охлаждения (до 100 град/мин)
исключает дегидратацию, в результате чего клетки
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-80 -60 -40 -20 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-80 -60 -40 -20 0
Рис. 3. Зависимости относительного объёма клеток интерстиция тестисов от тем-
пературы при охлаждении со скоростями 1; 10 и 100 град/мин (отмечены у
соответствующих кривых) в присутствии растворов: глицерина (A); ЭГ (B); ДМСО
(C) и ДМФА (D).
Fig. 3. Dependencies of testes interstitium cell normalized volume vs. temperature during
cooling with rates of 1; 10 and 100 deg/min (marked near the curves) in the presence of
glycerol (A); EG (B); DMSO (C) and DMFA (D).
in the presence of EG and DMFA before –20°C, and
in the case of glycerol the minimal cell volume is
reached nearly –45°C. This fact indicates a higher de-
crease in the permeability of testes interstitium cell
membranes for glycerol molecules during cooling com-
paring to other studied cryoprotectants.
The increase in the rate of cooling up to 10 deg/min
in the presence of all the studied substances extends
the temperature range of testes interstitium cell dehy-
dration. In the case of cooling rate of 100 deg/min the
dehydration of cells becomes negligible, and this can
lead to intracellular crystallization and cause cell dam-
age.
The simulation of testes interstitial cell osmotic
behavior during freezing with various cooling rates al-
low to explain the rise in the cell survival when in-
creasing the cooling rate up to 10 deg/min in the pres-
ence of DMSO, EG and DMFA.
Cooling rate of 1 deg/min is associated with long
period of cell dehydration, which could result in their
death due to osmotic stress. The increase in the rate
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
V
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
V/
V 0
Температура, °С
Temperature, °C
Температура, °С
Temperature, °C
Температура, °С
Temperature, °C
Температура, °С
Temperature, °C
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
V
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
V/
V 0
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
V
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
V/
V 0
О
тн
ос
ит
ел
ьн
ы
й
об
ъе
м
V
/V
0
N
or
m
al
iz
ed
v
ol
um
e
V/
V 0
geometrical parameters.
Analysis of the osmotic
behavior of cells under
conditions of various cryo-
preservation procedures
allow to determine the
most optimal conditions for
saturation of the cells with
cryoprotectant and its re-
moval from the cells, as
well as to coordinate the
procedures of cells’ expo-
sure in cryoprotectant so-
lution and following freez-
ing, etc.
Using previously cal-
culated permeability coef-
ficients and the correspon-
ding geometric parameters
of testes interstitial cells
[7, 8], we simulated their
osmotic behavior during
cooling with different ra-
tes.
Fig. 3 shows the chan-
ges in the normalized vo-
lume of cells when cool-
ing with rates of 1, 10 and
100 deg/min.
The presented data
show that application of
cooling rate of 1 deg/min
in the presence of DMSO
results in completion of cell
dehydration before –10°C,
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-80 -60 -40 -20 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
-80 -60 -40 -20 0
A B
C D
100
10
1
100
10
1
100
10
1
100
10
1
279 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
будут повреждаться в результате внутриклеточной
кристаллизации.
Выводы
Полученные данные о сохранности клеток
после замораживания-отогрева позволяют реко-
мендовать дальнейшее изучение криозащитной
активности растворов глицерина, ЭГ, ДМСО и
ДМФА при разработке новых схем криоконсер-
вирования клеток.
Результаты теоретического прогнозирования
осмотического поведения клеток интерстиция тес-
тисов при охлаждении в присутствии растворов
глицерина, ЭГ, ДМСО и ДМФА показали, что при
скорости охлаждения 1 град/мин снижение со-
хранности может быть обусловлено длительным
нахождением клеток в дегидратированном состоя-
нии. Быстрое охлаждение (85–100 град/мин), хотя
и позволяет избежать длительного действия гипер-
тонии, наблюдающейся при медленных скоростях,
приводит к значительному переохлаждению кле-
ток, в результате чего возникает внутриклеточная
кристаллизация.
of cooling up to 10 deg/min reduces the duration of cell
dehydration, excluding both the intracellular crystalli-
zation, and intracellular stress. However, it is clear that
further increase of cooling rate (up to 100 deg/min)
prevents dehydration, resulting in cell damage due to
intracellular crystallization.
Conclusions
The obtained data about the cell survival after free-
ze-thawing allow to recommend the further study of
cryoprotective activity of glycerol, ethylene glycol,
DMSO and DMFA solutions when developing new
cryopreservation protocols.
The results of theoretical simulation of osmotic beha-
vior of testes interstitium cells during cooling in the pres-
ence of glycerol, ethylene glycol, DMSO and DMFA
solutions showed that application of cooling rate of
1 deg/min resulted in a decrease in the cell survival
due to long duration of cell dehydration. Rapid cooling
(85–100 deg/min) allow to avoid long-term hypertonic
exposure, observed during slow cooling, which could
lead to a significant supercooling of cells and intracel-
lular crystallization.
Литература
Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко-
температурного консервирования клеточных суспен-
зий.– Киев: Наук. думка, 1994.– 142 с.
Легач Е.И. Комбинированная трансплантация криокон-
сервированных органотипических культур эндокринных
желез: Дис. … доктора мед. наук.– Харьков, 2008.– 336 с.
Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования.
Справочник.– М.: Медицина, 1987.– 398 с.
Пахомов А.В., Божок Г.А. Жизнеспособность различных
фракций суспензии клеток семенников при инкубации в
растворах ДМСО // Проблемы криобиологии.– 2005.– Т. 15,
№4.– С. 739–740.
Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И., Бондаренко Т.П.
Гормонопродуцирующая способность клеток интерсти-
ция семенников и органотипической культуры семенни-
ков новорожденных поросят после криоконсервирова-
ния // Проблемы криобиологии.– 2007.– Т. 17, №2.– С.179–
185
Салех Дж. М. Абу Жаяб Коррекция андрогенной функции
у экспериментальных животных путем трансплантации
нативных и криоконсервированных органных культур се-
менников: Дис … канд. мед. наук.– Киев, 2004.– 129 с.
Чернобай Н.А., Коваленко И.Ф., Божок Г.А. и др. Осмо-
тическое поведение клеток интерстиция тестисов в гипер-
тонических растворах NaCl и ПЭО-400 // Проблемы крио-
биологии.– 2010.– Т. 20, №1.– С. 83–87.
Чернобай Н.А., Пахомов А.В., Коваленко И.Ф. и др. За-
висимость проницаемости мембран клеток интерстиция
тестисов для молекул ряда криопротекторов от тем-
пературы // Проблемы криобиологии.– 2010.– Т. 20, №2.–
С. 153–158.
Поступила 21.06.2011
Рецензент О.А. Нардид
References
Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low
temperature preservation of cell suspensions.– Kiev: Naukova
Dumka, 1994.– 142 p.
Legach E.I. Combined transplantation of crypreserved
organotypic cultures of endocrine glands: Dissertation ... of
Doctor of Medical Sciences.– Kharkov, 2008.– 398 p.
Menshikov V.V. Laboratory methods of investigation:
Reference book.– Moscow: Meditsina, 1987.– 398 p.
Pakhomov A.V., Bozhok G.A. Viability of different fractions
of testicular cell suspension at incubation in DMSO solutions //
Problems of Cryobiology.– 2005.– Vol. 15, N4.– P. 739–740.
Pakhomov A.V., Bozhok G.A., Legach E.l., Bondarenko T.P.
Hormone-producing ability of testicular interstitial cells and
organotypic testicular culture of newborn piglets after
cryopreservation // Problems of Cryobiology.– 2007.– Vol. 17,
N2.– P.179–185.
Saleh J.M. Abu Jajab Correction of androgene function in
experimental animals by transplantation of native and
cryopreserved testicular organ culture: Dissertation ... of
Candidate of Medical Sciences.– Kiev, 2004.– 129 p.
Chernobay N.A., Kovalenko I.F., Bozhok G.A. et al. Osmotic
behavior of testes interstitium cells in hypertonic solutions of
NaCl and PEO-400 // Problems of Cryobiology.– 2010.– Vol. 20,
N1.– P. 83–87.
Chernobay N.A., Pakhomov A.V., Kovalenko I.F. et al. Tempe-
rature dependence of testes interstitium cell membrane
permeability for cryopro-tectant molecules // Problems of
Cryobiology.– 2010.– Vol. 20, N2.– P. 153–158.
Accepted 21.06.2011
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44903 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-27T15:16:56Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Чернобай, Н.А. Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. 2013-06-06T17:55:49Z 2013-06-06T17:55:49Z 2011 Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения / Н.А. Чернобай, Т.М. Гурина, А.В. Пахомов // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 273-279. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44903 577.352.4:612.111.085:547.42 Получены данные по сохранности клеток интерстиция тестисов крыс после замораживания-отогрева с использованием скоростей охлаждения 1; 5 и 10 град/мин и растворов глицерина (7%), диметилсульфоксида (10%), этиленгликоля (7%) и диметилформамида (5%). Установлено, что глицерин обеспечивает достаточно высокую (до 75%) сохранность клеток при всех использованных скоростях замораживания. При применении других криопротекторов значения сохранности клеток повышались (от 56 до 83%) с увеличением скорости охлаждения от 1 до 10 град/мин. Показано, что охлаждение со скоростями около 10 град/мин может обеспечивать достаточно высокую сохранность клеток интерстиция тестисов после замораживания-отогрева. Отримано дані щодо збереженості клітин інтерстиція тестисів щурів після заморожування-відігрівання з використанням швидкостей охолодження 1; 5 та 10 град/хв та розчинів гліцерину (7%), диметилсульфоксиду (10%), етиленгліколю (7%) та диметилформаміду (5%). Встановлено, що гліцерин забезпечує достатньо високу (до 75%) збереженість клітин під час використання всіх швидкостей заморожування. При застосуванні інших кріопротекторів збереженість клітин зростала (від 56 до 83%) при збільшенні швидкості заморожування від 1 до 10 град/хв. Показано, що охолодження зі швидкостями близько 10 град/хв може забезпечити достатньо високий рівень збереженості клітин інтерстиція тестисів після заморожування-відігрівання. The survival of testes interstitial cells after freeze-thawing using the cooling rates of 1; 5 and 10 deg/min and glycerol (7%), dimethyl sulfoxide (10%), ethylene glycol (7%) and dimethyl formamide (5%) solutions has been estimated. Using of glycerol provided sufficiently high (up to 75%) cell survival under all the studied cooling rates. Cell survival increased (from 56% upto 83%) if cooling rates were elevated from 1 up to 10 deg/min in the case of other cryoprotectants. Cooling rates about 10 deg/min provided sufficiently high level of post-thaw cell survival. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения Cryoprotective Efficiency of Some Cryoprotectants Depending on Cooling Rate Article published earlier |
| spellingShingle | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения Чернобай, Н.А. Гурина, Т.М. Пахомов, А.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| title_alt | Cryoprotective Efficiency of Some Cryoprotectants Depending on Cooling Rate |
| title_full | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| title_fullStr | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| title_full_unstemmed | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| title_short | Криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| title_sort | криозащитная эффективность ряда криопротекторов в зависимости от скорости охлаждения |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44903 |
| work_keys_str_mv | AT černobaina kriozaŝitnaâéffektivnostʹrâdakrioprotektorovvzavisimostiotskorostiohlaždeniâ AT gurinatm kriozaŝitnaâéffektivnostʹrâdakrioprotektorovvzavisimostiotskorostiohlaždeniâ AT pahomovav kriozaŝitnaâéffektivnostʹrâdakrioprotektorovvzavisimostiotskorostiohlaždeniâ AT černobaina cryoprotectiveefficiencyofsomecryoprotectantsdependingoncoolingrate AT gurinatm cryoprotectiveefficiencyofsomecryoprotectantsdependingoncoolingrate AT pahomovav cryoprotectiveefficiencyofsomecryoprotectantsdependingoncoolingrate |