Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования
Стромальные клетки, изолированные из костного мозга (КМ) взрослого человека, после экспансии in vitro демонстрируют специфический иммунофенотип и способность к мультилинейной дифференцировке, свойственные мезенхимальным стволовым клеткам (МСК). Установлено, что криоконсервирование МСК КМ человека...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Datum: | 2010 |
| Hauptverfasser: | , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2010
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44906 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 4. — С. 436-442. — Бібліогр.: 10 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859648211847741440 |
|---|---|
| author | Петренко, Ю.А. Скоробогатова, Н.Г. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Петренко, Ю.А. Скоробогатова, Н.Г. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 4. — С. 436-442. — Бібліогр.: 10 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Стромальные клетки, изолированные из костного мозга (КМ) взрослого человека, после экспансии in vitro демонстрируют
специфический иммунофенотип и способность к мультилинейной дифференцировке, свойственные мезенхимальным стволовым
клеткам (МСК). Установлено, что криоконсервирование МСК КМ человека путем медленного двухступенчатого замораживания
под защитой 10% ДМСО позволяет сохранить их иммунофенотип и способность к индуцированным in vitro остеогенной и
адипогенной дифференцировкам.
Стромальні клітини, які були ізольовані з кісткового мозку (КМ) дорослої людини, після експансії in vitro демонструють
специфічний імунофенотип та здатність до мультилінійного диференціювання, що є характерним для мезенхімальних стовбурових
клітин (МСК). Встановлено, що кріоконсервування МСК КМ людини шляхом повільного двоступінчастого заморожування
під захистом 10% ДМСО дозволяє зберегти їхній імунофенотип та здатність до індукованого in vitro остеогенного та адипогенного
диференціювань.
Stromal cells derived from adult human bone marrow (BM) after in vitro expansion demonstrate a specific immunophenotype and
ability to multilineage differentiation, inherent to mecenchymal stromal cells (MSCs)m. It was established that cryopreservation of
human BM MSCs by two-step freezing under protection of 10% DMSO enables to preserve their immunophenotype and ability to
induced osteogenic and adipogenic differentiation in vitro.
|
| first_indexed | 2025-12-07T13:30:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
436
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.:+38
(057) 373-30-34, факс: +38 (057) 373-30-84, электронная почта:
yuripetrenko@cryo.org.ua.
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3034, fax: +380 57 373 3084, e-mail: yuripetrenko@cryo.org.ua.
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
УДК 615.014.41:611.018.46.08
Ю.А. ПЕТРЕНКО*, Н.Г. СКОРОБОГАТОВА, Н.А. ВОЛКОВА, А.Ю. ПЕТРЕНКО
Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного
потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга
человека после криоконсервирования
UDC 615.014.41:611.018.46.08
YU.A. PETRENKO*, N.G. SKOROBOGATOVA, N.A. VOLKOVA, A.YU. PETRENKO
Characterization of Immunophenotype and Differentiation
Potential of Human Bone Marrow Mesenchymal
Stromal Cells after Cryopreservation
Стромальные клетки, изолированные из костного мозга (КМ) взрослого человека, после экспансии in vitro демонстрируют
специфический иммунофенотип и способность к мультилинейной дифференцировке, свойственные мезенхимальным стволовым
клеткам (МСК). Установлено, что криоконсервирование МСК КМ человека путем медленного двухступенчатого замораживания
под защитой 10% ДМСО позволяет сохранить их иммунофенотип и способность к индуцированным in vitro остеогенной и
адипогенной дифференцировкам.
Ключевые слова: криоконсервирование, мезенхимальные стромальные клетки, костный мозг человека, адипогенная и
остеогенная дифференцировка, иммунофенотип.
Стромальні клітини, які були ізольовані з кісткового мозку (КМ) дорослої людини, після експансії in vitro демонструють
специфічний імунофенотип та здатність до мультилінійного диференціювання, що є характерним для мезенхімальних стовбурових
клітин (МСК). Встановлено, що кріоконсервування МСК КМ людини шляхом повільного двоступінчастого заморожування
під захистом 10% ДМСО дозволяє зберегти їхній імунофенотип та здатність до індукованого in vitro остеогенного та адипогенного
диференціювань.
Ключові слова: кріоконсервування, мезенхімальні стромальні клітини, кістковий мозок людини, адипогенне та остеогенне
диференціювання, імунофенотип.
Stromal cells derived from adult human bone marrow (BM) after in vitro expansion demonstrate a specific immunophenotype and
ability to multilineage differentiation, inherent to mecenchymal stromal cells (MSCs)m. It was established that cryopreservation of
human BM MSCs by two-step freezing under protection of 10% DMSO enables to preserve their immunophenotype and ability to
induced osteogenic and adipogenic differentiation in vitro.
Key words: cryopreservation, mesenchymal stromal cells, human bone marrow, adipogenic and osteogenic differentiation, immuno-
phenotype.
Мезенхимальные стволовые (стромальные)
клетки (МСК) находят все более широкое приме-
нение в различных областях биологии и медицины
благодаря их высокой способности дифференци-
роваться в различные типы клеток и низкой имму-
ногенности [3, 5, 7]. Показано, что МСК присут-
ствуют во многих органах и тканях взрослого орга-
низма – костном мозге (КМ), коже, жировой,
костной, мышечной тканях и др. [3, 4, 6, 9]. Однако
в качестве "золотого стандарта" при оценке и срав-
нении биологического потенциала данного типа
клеток, выделенных из разных источников, рас-
сматривают МСК КМ взрослых доноров. В связи
с этим актуально исследование морфофункцио-
нальных свойств МСК КМ после различных воз-
действий.
Криоконсервирование МСК КМ требует приме-
нения таких методических подходов, которые
Mesenchymal stem (stromal) cells (MSCs) have
found a wide application in different fields of biol-
ogy and medicine due to their high ability of differ-
entiation into various cell types and low immunoge-
nicity [3, 5, 7]. MSCs have been shown to be present
in many organs and tissues of adult organism: bone
marrow (BM), skin, adipose tissue, muscle etc. [3,
4, 6, 9]. However as "a gold standard" when estimat-
ing and comparing biological potential of cells, iso-
lated from different sources, the BM MSCs of adult
donors are considered. The study of morpho-func-
tional properties of BM MSCs after different effects
is an important point. .
BM MSCs cryopreservation needs the application
of methodical approaches allowing the maximum
preservation of not only viability but also unique bio-
logical properties of these cells. Usually the BM
MSCs are cryopreserved after sub-culturing by slow
437 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
позволяют максимально сохранять не только
жизнеспособность, но и уникальные биологические
свойства этих клеток. Обычно криоконсервиро-
вание МСК КМ проводят после предварительного
субкультивирования путем медленного заморажи-
вания с применением криозащитных сред, содер-
жащих диметилсульфоксид (ДМСО) [6, 8]. Необхо-
димым этапом криобиотехнологического процесса
является контроль стабильности иммунофенотипа
и способности к направленной мультилинейной
дифференцировке МСК КМ после криоконсерви-
рования.
Цель работы – исследование иммунофенотипа
и способности к направленным специфическим
дифференцировкам мезенхимальных стромальных
клеток костного мозга человека до и после криокон-
сервирования.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на КМ, полученном
от взрослых доноров после их информированного
письменного согласия, в соответствии с рекомен-
дациями Хельсинкской декларации Всемирной
медицинской ассоциации по проведению биомеди-
цинских исследований. Источником клеток были
фрагменты спонгиозной ткани, которые извлекали
в виде цилиндров диаметром 6–8 мм из гребня
подвздошной кости с помощью инструментов для
мозаичной хондропластики, что обеспечивало ма-
лую инвазивность процедуры. Первичную суспен-
зию клеток получали вымыванием изотонической
средой из костных цилиндров, затем ее центрифу-
гировали при 150g в течение 10 мин. Ядросодер-
жащие клетки из полученного осадка подсчиты-
вали в камере Горяева с использованием 3%-й
уксусной кислоты. Культивировали клетки в среде,
дополненной 15% эмбриональной сыворотки (ЭС)
крупного рогатого скота ("Биолот", Россия), 2 мМ
L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл
стрептомицина при 37°С, 5% СО2 и абсолютной
влажности. Первую замену среды осуществляли
через 48 ч культивирования и далее – через каждые
3-е суток.
Культивированные МСК КМ 3–4-го пассажей
криоконсервировали в культуральной среде, содер-
жащей 20% ЭС и 10% ДМСО, со скоростью
1 градус/мин до –80°С по протоколу фирмы-произ-
водителя Cryo 1°С Freezing Container (“Nalgene”,
США) с последующим погружением в жидкий
азот.
Образцы хранили при –196°С в течение 4–6
месяцев. Криоконсервированные образцы отогре-
вали на водяной бане при 37°С. Для удаления
криозащитной среды клеточные суспензии разбав-
freezing with the application of cryoprotective me-
dia, containing dimethyl sulfoxide (DMSO) [6, 8]. The
essential stage of cryobiotechnological process is the
post-thaw control of immunophenotype stability and
ability to directed multi-lineage differentiation of BM
MSCs.
The aim of this research was to investigate the
immunophenotype and specific differentiations abili-
ties of human bone marrow mesenchymal stromal
cells prior to and after cryopreservation.
Materials and methods
The experiments were carried-out using BM,
obtained from adult donors after their informed writ-
ten consent in the accordance with the WMA dec-
laration of Helsinki for medical research. As the
source of the cells spongious tissue fragments were
used. These fragments (6-8 mm cylinders) were iso-
lated from iliac crest by the application of instruments
for mosaic chondroplastics, which provided low in-
vasiveness of the procedure. Primary cell suspension
was obtained by washing-out from bone cylinders
with isotonic medium, followed by centrifugation at
150g for 10 min. Nucleated cells from the obtained
pellets were counted in Goryaev's chamber using 3%
acetic acid. The cells were cultured in the medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS)
(Biolot, Russia), 2 mM L-glutamine, 50 units/ml peni-
cillin and 50 mg/ml streptomycin at 37°C, 5% CO2
and absolute humidity. The first change of the me-
dium was performed after 48 hrs of culturing and later
every 3 days.
Cultured BM MSCs of the 3rd–4th passages were
cryopreserved in the culture medium, supplemented
by 20% FS and 10% DMSO with the cooling rate
of 1 degree/min down to –80°C using Cryo 1°C
Freezing Container (Nalgene, USA) according to the
manufacturing protocol with following plunging into
liquid nitrogen.
The samples were stored at –196°C for 4–6
months. Cryopreserved samples were thawed on wa-
ter bath at 37°C. To remove cryoprotective medium
the cell suspensions were diluted with the culture
medium, containing 10% FS in 1:10 ratio with follow-
ing centrifugation (150g, 10 min). Cell pellets were
re-suspended in a new portion of culture medium.
The cell integrity was assessed by vital staining with
trypan blue.
Freshly isolated and cryopreserved stromal cells
were cultured for 3–4 passages, afterwards immuno-
phenotyping and induction of osteo- and adipogenesis
in vitro were performed. Vital control of the state
of cell cultures was prepared daily using inverted mi-
croscope CETI (Belgium).
438 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
ляли средой культивирования, содержащей 10% ЭС,
в соотношении 1:10 с последующим центрифугиро-
ванием (150g, 10 мин). Клеточный осадок ресус-
пендировали в новой порции культуральной среды.
Сохранность клеток оценивали с помощью прижиз-
ненного окрашивания трипановым синим.
Свежевыделенные и криоконсервированные
стромальные клетки культивировали в течение 3–
4-х пассажей, после чего проводили иммунофеноти-
пирование и индукцию остео- и адипогенеза in vitro.
Прижизненный контроль состояния клеточных
культур осуществляли ежедневно с помощью ин-
вертированного микроскопа “CETI” (Бельгия).
Для иммунофенотипического анализа культиви-
рованные клетки окрашивали моноклональными
антителами CD29-РЕ, CD45-PE, CD105-FITC
(“Serotec”, Великобритания), CD34 Class II-FITC,
CD38-RPE (“DAKO”, Голландия), CD44-FITC,
CD73-PE (“BD Biosciences”, США) согласно инст-
рукции производителей, дважды отмывали центри-
фугированием при 200 g в течение 10 мин в раст-
воре Хэнкса и анализировали на проточном цито-
метре “FACS Calibur” (“BD Biosciences”, США).
Дифференцировочный потенциал МСК опреде-
ляли in vitro при культивировании в специфичных
индуктивных средах. Для индукции остеогенеза
применяли среду alpha-МЕМ, содержащую 10%
ЭС; 0,1 мкМ дексаметазона; 0,05 мМ аскорбиновой
кислоты; 10 мМ глицерол-фосфата. Адипогенез ин-
дуцировали в среде alpha-МЕМ, дополненной 10%
Adipogenic Stimulatory Supplements (“Stem Cell
Technologies Inc.”, Канада). Клетки культивировали
в течение 3-х недель, среду меняли через каждые
3-е суток.
Остеогенез выявляли по экспрессии щелочной
фосфатазы и наличию минерализации внеклеточ-
ного матрикса (окрашивание по Ван Коссу) [10].
Адипогенную дифференцировку клеток определяли
по накоплению нейтральных жиров (окрашивание
Oil Red O) [10]. Контролем на спонтанную диффе-
ренцировку служили клетки, культивированные в
ростовой среде без специальных индукторов.
Результаты и обсуждение
Полученные первичные культуры свежеизоли-
рованных стромальных клеток КМ были гетеро-
генными по составу и содержали незначительную
примесь адгезивных гемопоэтических клеток, а
также макрофагов, которые постепенно элимини-
ровались в ходе культивирования. В первичной
культуре стромальных клеток КМ были выявлены
колониеобразующие единицы фибробластов
(КОЕф) с частотой 1–2 на 100 000 посеянных
ядросодержащих клеток [2]. Согласно современ-
For immunophenotypic analysis the cultured cells
were stained with monoclonal antibodies CD29-PE,
CD-45PE, CD-05-FITC (Serotec, UK), CD34 Class
II-FITC, CD38-RPE (Dako, Holland), CD44-FITC,
CD73-PE (BD Biosciences, USA) according to the
manufacturing instructions. Cells were washed-out
twice by centrifugation at 200g for 10 min in Hanks
solution and analyzed using flow cytometer FACS
Calibur (BD Biosciences, USA).
Differentiation potential of MSCs was examined
in vitro when culturing in specific inductive media.
To induce osteogenesis there was applied alpha-
MEM medium, containing 10% FS; 0.1 mM dexame-
tazone; 0.05 mM ascorbic acid; 10 mM glycerol-
phosphate. Adipogenesis was induced in alpha-MEM
medium supplemented with 10% Adipogenic Stimu-
latory Supplements (Stem Cell Technologies Inc.,
Canada). The cells were cultured for 3 weeks, the
medium was changed every 3 days.
Osteogenesis was revealed by the expression of
alkaline phosphatase and presence of mineralization
of extracellular matrix (von Kossa staining) [10]. Adi-
pogenic differentiation of cells was assessed by Oil
Red O staining of accumulated intracellular neutral
lipids [10]. The cells cultured in growth medium with
no special inducers served as the control.
Results and discussion
The obtained primary cultures of freshly isolated
BM stromal cells were heterogenous on the compo-
sition and contained a slight amounts of adhesive
hematopoietic cells, as well as macrophages, gradu-
ally eliminated during following culture. In primary
culture of BM stromal cells the colony-forming units
of fibroblasts (CFUf) were revealed with the fre-
quency of 1–2 per 100,000 plated nucleated cells [2].
According to the current notions this pool of stromal
progenitor cells comprises multipotent MSCs [6].
During following sub-culture there was noted the
formation of new colonies in the culture, testifying
to the proliferation of early MSCs. After 3-4 passa-
ges the subcultures mainly consisted of predominantly
spindle-shaped fibroblast-like cells with small oval
nucleus, which proliferated and formed characteris-
tic flows.
One of the main criteria of characterization of cell
population is the investigation of the specific surface
markers’ expression. The studied human BM fibro-
blast-like cells, subcultured during 4 passages were
characterized by immunophenotype of CD29+,
CD44+, CD73+, CD105+ (Fig. 1).
Herewith the content of the cells expressed these
markers in the studied cultures comprised more than
90%. Simultaneously they did not express the mark-
439 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
ным представлениям данный пул стромальных кле-
ток-предшественников включает мультипотентные
МСК [6]. При последующем пересеве было отме-
чено формирование новых колоний в культуре, что
свидетельствовало о пролиферации ранних МСК.
После 3–4-х пассажей субкультуры состояли пре-
имущественно из веретенообразных фибробласто-
подобных клеток с небольшим овальным ядром,
которые пролиферировали и формировали харак-
терные потоки.
Одним из основных критериев состава клеточ-
ной популяции является экспрессия специфических
поверхностных маркеров. Исследованные фибро-
бластоподобные клетки КМ человека, субкульти-
вированные в ходе 4-х пассажей, характеризова-
лись иммунофенотипом CD29+, CD44+, CD73+,
CD105+ (рис. 1).
При этом содержание клеток, экспрессировав-
ших данные маркеры, в исследуемой культуре
составляло более 90%. Одновременно они не экс-
прессировали маркеры гемопоэтических стволо-
вых клеток CD34, а также общий маркер гемопоэ-
тических клеток CD45 (рис. 1). Представленный
иммунофенотип характерен для МСК [7]. Следует
Рис. 1. Результаты проточной цитофлуориметрии культуры МСК КМ взрослого человека (4-й пассаж).
Fig. 1. Results of flow cytometry analysis of human adult BM MSCs culture (the 4th passage).
ers of hematopoietic stem cells CD34, as well as
common marker of hematopoietic cells CD45 (Fig. 1).
The presented immunophenotype has been shown for
MSCs [7]. It should be noted that the similar immu-
nophenotype was assessed for MSCs, derived from
adult human derma and adipose tissue [1].
During culturing of MSCs in the medium, that
stimulate cell differentiation in adipose lineage, the
change in cells morphology after 7–10 days was
observed: the cells gained roundish (oval) shape. Fur-
ther culturing resulted in the accumulation of intrac-
ellular lipids, positively stained with Oil Red O. Dur-
ing stimulation of BM MSCs to the differentiation into
osteogenic lineage the expression of alkaline phos-
phatase by cells as well as matrix mineralization,
positively stained with silver nitrate by von Kossa
(non-presented data) were observed.
After cryopreservation, thawing and removal of
cryoprotectants no significant loss of cells was found,
the survival of cells in suspension was not less than
65%. During the culture, cryopreserved cells adhered
to plastic and proliferated. It has been noted that
MSCs directly after cryopreservation formed subcon-
fluent monolayer in average 3 days later if compared
440 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
отметить, что аналогичный иммунофенотип был
установлен и для МСК, источником которых явля-
лись дерма и жировая ткань взрослого человека [1].
При переводе МСК в среду культивирования,
стимулирующую дифференцировку клеток в
адипогенном направлении, наблюдалось изменение
их морфологии через 7–10 суток культивирования,
клетки приобретали округлую (овальную) форму.
Дальнейшее культивирование приводило к накопле-
нию внутриклеточных липидов, которые позитивно
окрашивались масляным красным (Oil Red O). При
стимуляции МСК КМ к дифференцировке в остео-
генном направлении наблюдались экспрессия
клетками щелочной фосфатазы, а также минерали-
зация матрикса, позитивно окрашивающегося
нитратом серебра по Ван Коссу (данные не пред-
ставлены).
После криоконсервирования, отогрева и удале-
ния криопротектора существенной потери клеток
выявлено не было, сохранность суспензии состав-
ляла не менее 65%. При переносе в культуру крио-
консервированные клетки адгезировали к пластику
и пролиферировали. Отмечено, что МСК непосред-
ственно после криоконсервирования формировали
субконфлуентный монослой в среднем на 3-е суток
позднее по сравнению с контролем (некриоконсер-
вированными клетками), что, вероятно, связано с
периодом репаративных процессов в клетках. В
ходе дальнейшего субкультивирования в стандарт-
ных условиях криоконсервированные клетки
активно пролиферировали и не отличались от не-
криоконсервированных.
Исследование иммунофенотипа МСК КМ че-
ловека после криоконсервирования показало, что
он не отличался от такового до криоконсервирова-
ния. Более 90% клеток экспрессировали CD29,
CD44, CD73, CD105 и оставались негативными на
CD45 и CD34.
Изучение в условиях in vitro дифференциро-
вочного потенциала культивированных МСК КМ
показало, что криоконсервирование не влияло на
способность исследуемых клеток к направленным
остео- и адипогенной дифференцировкам. Экспрес-
сия клетками щелочной фосфатазы, а также мине-
рализация матрикса в остеогенной культуре сви-
детельствовали о функциональной активности диф-
ференцировавшихся остеобластов (рис. 2).
В адипогенной культуре выявлены клетки,
содержащие вакуоли с нейтральными жирами, что
указывало на дифференцировку криоконсервиро-
ванных МСК в адипогенном направлении (рис. 3).
Таким образом, выделение и последующая экс-
пансия стромальных клеток из первичной суспензии
КМ в условиях монослойного культивирования
Рис. 2. Дифференцировка МСК КМ в остеогенном на-
правлении после криоконсервирования: а – экспрессия
клетками щелочной фосфатазы; б – окрашивание мине-
рализованного матрикса нитратом серебра по Ван Кос-
су, ×100.
Fig. 2. Differentiation of BM MSCs into osteogenic lineage
after cryopreservation: a – expression by the cells of alka-
line phosphatase; b – staining of mineralized matrix with
silver nitrate according to von Kossa, ×100.
а a
б b
with the control (non-cryopreserved cells), which is
likely related to the period of reparative processes
in cells. During further sub-culturing under standard
conditions the cryopreserved cells actively prolifer-
ated and did not differ from non-cryopreserved ones.
The study of immune phenotype of human BM MSCs
after cryopreservation has shown that it did not dif-
fer from that prior to cryopreservation. More than
90% cells expressed CD29, CD44, CD77, CD105
and remained negative on CD45 and CD34.
Investigation of differentiation potential of cultured
BM MSCs in vitro demonstrated that cryopreserva-
tion did not affect the ability of the studied cells to
directed osteo- and adipogenic differentiation. The
alkaline phosphatase expression as well as matrix
441 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
позволили получить практически однородные куль-
туры, обогащенные клетками c иммунофенотипом
и дифференцировочным потенциалом, характер-
ными для МСК. Процесс криоконсервирования с
использованием 10% ДМСО, медленного двухсту-
пенчатого замораживания и быстрого отогрева поз-
воляет в значительной степени сохранить коли-
чество МСК КМ с характерным иммунофеноти-
пом и способностью к индуцированной дифферен-
цировке в остео- и адипогенном направлениях.
Следует отметить, что специфические свойства
криоконсервированных МСК КМ оставались ста-
бильными в ходе последующей экспансии.
Выводы
1. Стромальные клетки, изолированные из
костного мозга взрослого человека, после экспан-
сии in vitro демонстрируют специфический имму-
нофенотип и способность к мультилинейной диффе-
ренцировке, свойственные МСК.
2. Криоконсервирование МСК КМ человека пу-
тем медленного двухступенчатого замораживания
под защитой 10% ДМСО позволяет сохранить их
иммунофенотип и способность к индуцированным
in vitro остео- и адипогенной дифференцировкам.
Рис. 3. Дифференцировка МСК КМ в адипогенном на-
правлении после криоконсервирования (окрашивание
Oil Red O), ×100.
Fig. 3. Differentiation of BM MSCs in adipogenic lineage
after cryopreservation (Oil Red O staining), ×100.
mineralization in osteogenic culture testified to func-
tional activity of differentiated osteoblasts (Fig. 2).
In adipogenic culture the cells contained vacuoles
with neutral lipids, indicating the differentiation of
cryopreserved MSCs into adipogenic lineage (Fig. 3).
Thus the isolation and following expansion of stro-
mal cells from primary BM suspension under mon-
olayer culture conditions enabled the obtaining of
nearly homogenous cultures, enriched with the cells
with immunophenotype and differentiation potential,
inherent to MSCs. Cryopreservation with 10% DMSO
with the application of slow two-step freezing and
rapid thawing enables in a great extent to preserve
the number of BM MSCs with typical immunophe-
notype and ability to induced differentiation into
osteo- and adipogenic lineages. It should be noted
that specific properties of cryopreserved BM MSCs
remained stable during following expansion.
Conclusions
1. Stromal cells isolated from adult human bone
marrow after in vitro expansion demonstrate the
specific immunophenotype and ability to multi-lineage
differentiation, typical to MSCs.
2. Cryopreservation of human BM MSCs by the
application of slow two-step freezing under protec-
tion of 10% DMSO enables the preservation of their
immunophenotype and ability to the induced in vitro
osteo- and adipogenic differentiation.
Литература
Петренко А.Ю., Петренко Ю.А., Скоробогатова Н.Г. и
др. Стромальные клетки костного мозга, жировой ткани
и кожи человека в ходе экспансии проявляют иммуно-
фенотип и дифференцировочный потенциал мезенхи-
мальных стволовых клеток // Трансплантологія.– 2008.–
Т. 10, №1.– С. 84–86.
Скоробогатова Н.Г., Петренко Ю.А., Волкова Н.А.,
Петренко А.Ю. Изучение способности к дифферен-
References
Petrenko A.Yu., Petrenko Yu.A., Skorobogatova N.G. et al.
Stromal cells of bone marrow, adipose tissue and human skin
during expansion manifest immune phenotype and
differentiation potential of mesenchymal stem cells //
Transplantologiya.– 2008.– Vol. 10, N1.– P. 84–86.
Skorobogatova N.G., Petrenko Yu.A., Volkova N.A., Petren-
ko A.Yu. Study of ability to differentiation into osteogenic and
adipogenic lineages of human bone marrow mesenchymal
stromal cells of clonal origin // Biotechnology.– 2010.– Vol.3,
N3.– P. 72–77.
Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone
marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential
applications // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– P. 180–192.
Bosch P., Musgrave D.S., Lee J.Y. et al. Osteoprogenitor
cells within skeletal muskle // J. Orthop. Res.– 2000.– Vol. 18,
N6.– P. 933–944.
Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growh kinetics,
self-renewal, and the osteogenic potential of purified human
mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and
following cryopreservation // J. Cell Biochem.– 1997.– Vol. 64,
N2.– P. 278–294.
Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: Biology
and potential clinical uses // Exp. Hematol.– 2000.– Vol. 28,
N8.– P. 875–884.
Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The
International Society for Cellular Therapy position statement //
Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N4.– Р. 315–317.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
442 problems
of cryobiology
Vol. 20, 2010, №4
проблемы
криобиологии
Т. 20, 2010, №4
цировке в остеогенном и адипогенном направлениях
мезенхимальных стромальных клеток костного мозга
человека клонального происхожения // Биотехнология.–
2010.– Т. 3, №3.– С. 72–77.
Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone
marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential
applications // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– P. 180–192.
Bosch P., Musgrave D.S., Lee J.Y. et al. Osteoprogenitor
cells within skeletal muskle // J. Orthop. Res.– 2000.– Vol. 18,
N6.– P. 933–944.
Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growh kinetics,
self-renewal, and the osteogenic potential of purified human
mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and
following cryopreservation // J. Cell Biochem.– 1997.– Vol. 64,
N2.– P. 278–294.
Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: Biology
and potential clinical uses // Exp. Hematol.– 2000.– Vol. 28,
N8.– P. 875–884.
Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for
defining multipotent mesenchymal stromal cells. The
International Society for Cellular Therapy position statement //
Cytotherapy.– 2006.– Vol. 8, N4.– Р. 315–317.
Histological and histohemical methods. Theory and practice.
Second edition / Ed. by J.A. Kilrnan.– Oxford: Pergamon
Press, 1990.– 433 p.
Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells
and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–
2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.
Xiang Ying, Zheng Qiang, Jia Bing-bing et al. Ex vivo
expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved
human bone marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang
Univ. Sci. B.– 2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.
Поступила 02.08.2010
Рецензент Т.Г. Дубрава
Histological and histohemical methods. Theory and practice.
Second edition / Ed. by J.A. Kilrnan.– Oxford: Pergamon
Press, 1990.– 433 p.
Tuan R.S., Boland G., Tuli R. Adult mesenchymal stem cells
and cell-based tissue engineering // Arthritis Res. Ther.–
2003.– Vol. 5, N1.– P. 32–45.
Xiang Ying, Zheng Qiang, Jia Bing-bing et al. Ex vivo
expansion and pluripotential differentiation of cryopreserved
human bone marrow mesenchymal stem cells // J. Zhejiang
Univ. Sci. B.– 2007.– Vol. 8, N2.– P. 136–146.
Accepted in 02.08.2010
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
8.
9.
10.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44906 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T13:30:41Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Петренко, Ю.А. Скоробогатова, Н.Г. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. 2013-06-06T19:06:02Z 2013-06-06T19:06:02Z 2010 Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования / Ю.А. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, Н.А. Волкова, А.Ю. Петренко // Пробл. криобиологии. — 2010. — Т. 20, № 4. — С. 436-442. — Бібліогр.: 10 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44906 615.014.41:611.018.46.08 Стромальные клетки, изолированные из костного мозга (КМ) взрослого человека, после экспансии in vitro демонстрируют специфический иммунофенотип и способность к мультилинейной дифференцировке, свойственные мезенхимальным стволовым клеткам (МСК). Установлено, что криоконсервирование МСК КМ человека путем медленного двухступенчатого замораживания под защитой 10% ДМСО позволяет сохранить их иммунофенотип и способность к индуцированным in vitro остеогенной и адипогенной дифференцировкам. Стромальні клітини, які були ізольовані з кісткового мозку (КМ) дорослої людини, після експансії in vitro демонструють специфічний імунофенотип та здатність до мультилінійного диференціювання, що є характерним для мезенхімальних стовбурових клітин (МСК). Встановлено, що кріоконсервування МСК КМ людини шляхом повільного двоступінчастого заморожування під захистом 10% ДМСО дозволяє зберегти їхній імунофенотип та здатність до індукованого in vitro остеогенного та адипогенного диференціювань. Stromal cells derived from adult human bone marrow (BM) after in vitro expansion demonstrate a specific immunophenotype and ability to multilineage differentiation, inherent to mecenchymal stromal cells (MSCs)m. It was established that cryopreservation of human BM MSCs by two-step freezing under protection of 10% DMSO enables to preserve their immunophenotype and ability to induced osteogenic and adipogenic differentiation in vitro. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Криоконсервирование биообъектов Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования Characterization of Immunophenotype and Differentiation Potential of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells after Cryopreservation Article published earlier |
| spellingShingle | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования Петренко, Ю.А. Скоробогатова, Н.Г. Волкова, Н.А. Петренко, А.Ю. Криоконсервирование биообъектов |
| title | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| title_alt | Characterization of Immunophenotype and Differentiation Potential of Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells after Cryopreservation |
| title_full | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| title_fullStr | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| title_short | Характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| title_sort | характеристика иммунофенотипа и дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека после криоконсервирования |
| topic | Криоконсервирование биообъектов |
| topic_facet | Криоконсервирование биообъектов |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44906 |
| work_keys_str_mv | AT petrenkoûa harakteristikaimmunofenotipaidifferencirovočnogopotencialamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkostnogomozgačelovekaposlekriokonservirovaniâ AT skorobogatovang harakteristikaimmunofenotipaidifferencirovočnogopotencialamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkostnogomozgačelovekaposlekriokonservirovaniâ AT volkovana harakteristikaimmunofenotipaidifferencirovočnogopotencialamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkostnogomozgačelovekaposlekriokonservirovaniâ AT petrenkoaû harakteristikaimmunofenotipaidifferencirovočnogopotencialamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokkostnogomozgačelovekaposlekriokonservirovaniâ AT petrenkoûa characterizationofimmunophenotypeanddifferentiationpotentialofhumanbonemarrowmesenchymalstromalcellsaftercryopreservation AT skorobogatovang characterizationofimmunophenotypeanddifferentiationpotentialofhumanbonemarrowmesenchymalstromalcellsaftercryopreservation AT volkovana characterizationofimmunophenotypeanddifferentiationpotentialofhumanbonemarrowmesenchymalstromalcellsaftercryopreservation AT petrenkoaû characterizationofimmunophenotypeanddifferentiationpotentialofhumanbonemarrowmesenchymalstromalcellsaftercryopreservation |