Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс
Изучали действие различных концентраций криопротектора ДМСО на способность к пролиферации изолированных
 нервных клеток новорожденных крыс и их окрашивание трипановым синим до и после криоконсервирования. Установлено,
 что 7,5 и 10% – оптимальные концентрации криопротектора, при кото...
Gespeichert in:
| Datum: | 2011 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44962 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева
 на сохранность нервных клеток новорожденных крыс // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 263-272. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860234724181540864 |
|---|---|
| author | Ляшенко, Т.Д. Сукач, А.Н. |
| author_facet | Ляшенко, Т.Д. Сукач, А.Н. |
| citation_txt | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева
 на сохранность нервных клеток новорожденных крыс // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 263-272. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| description | Изучали действие различных концентраций криопротектора ДМСО на способность к пролиферации изолированных
нервных клеток новорожденных крыс и их окрашивание трипановым синим до и после криоконсервирования. Установлено,
что 7,5 и 10% – оптимальные концентрации криопротектора, при которых нервные стволовые/прогениторные клетки
новорожденных крыс сохраняют способность к пролиферации и дифференциации после криоконсервирования. Показано, что
для сохранения функциональной активности нервных клеток новорожденных крыс присутствие сыворотки в среде
замораживания обязательно. Показано, что жизнеспособность нервных клеток новорожденных крыс, определенная по
исключению трипанового синего, лишь частично коррелирует с функциональной активностью клеток.
Вивчали дію різних концентрацій кріопротектора ДМСО на здатність до проліферації ізольованих нервових клітин
новонароджених щурів та їх забарвлення трипановим синім до і після кріоконсервування. Встановлено, що 7,5 і 10% –
оптимальні концентрації кріопротектора, при яких нервові стовбурові/прогеніторні клітини новонароджених щурів зберігають
здатність до проліферації і диференціації після кріоконсервування. Показано, що для збереження функціональної активності
нервових клітин новонароджених щурів присутність сироватки в середовищі заморожування є обов'язковою. Показано, що
життєздатність нервових клітин новонароджених щурів, визначена по виключенню трипанового синього, лише частково
корелює з функціональною активністю клітин.
The effect of cryoprotectant dimethyl sulfoxide of different concentrations on the ability of isolated neural cells of newborn rats
to proliferate and to be stained with trypan blue before and after freeze-thawing was studied. The cryoprotectant concentrations of 7.5
and 10% were established as the optimal ones, which preserved the ability of the neural stem/progenitor cells of newborn rats to
proliferate and differentiate after freeze-thawing. Preservation of the functional activity of newborn rat neural cells demanded the
presence of serum in freezing medium. It was demonstrated that the viability of newborn rat neural cells, assessed by trypan blue
exclusion, only partially reflected the cell functional activity.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:23:07Z |
| format | Article |
| fulltext |
263
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
ljashenko_tanja@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: ljashenko_tanja@mail.ru
1G.S. Skovoroda Kharkov National Pedagogical University,
Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
1Харьковский национальный педагогический университет
им. Г.С. Сковороды
2Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
За последнее десятилетие достигнут огромный
прогресс в изучении биологических свойств и ха-
рактеристик нервных стволовых клеток [4, 6]. При
этом основное внимание исследователей уделя-
лось нервным стволовым/прогениторным клеткам
эмбрионов, плодов, взрослых человека и животных.
Постнатальные стволовые/прогениторные клетки
до настоящего времени изучены недостаточно.
Исследование ранних постнатальных нервных
клеток (НК) животных и человека позволит объяс-
нить клеточные механизмы активации нейрогенеза
в постнатальном мозге, а также изучить возмож-
ный нейрогенный репарационный “ответ” нервных
стволовых/прогениторных клеток при различных
патологиях и повреждениях мозга, что имеет по-
тенциальную клиническую важность.
In the past decade a huge progress in studying bio-
logical properties and characteristics of neural stem
cells has been achieved [4, 6]. Herewith the research-
ers were focused on the neural stem/progenitor cells
of human and animal embryos, fetuses and adult or-
ganisms. Postnatal stem/progenitor cells have remained
poorly studied until now. The study of animal and hu-
man early postnatal neural cells (NCs) would enable
to explain cell mechanisms of neurogenesis activation
in a postnatal brain, as well as to study a possible neu-
rogenic reparative “response” of neural stem/progeni-
tor cells under different pathologies and brain injuries,
that is of potential clinical importance.
The usage of isolated human and animal early post-
natal NC culture enables to perform detailed investi-
gations of mechanisms of neural differentiation, gene
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
УДК 547.569.2:57.043: 591.88.084
Т.Д. ЛЯШЕНКО1*, А.Н. СУКАЧ1,2
Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева
на сохранность нервных клеток новорожденных крыс
UDC 547.569.2:57.043: 591.88.084
T.D. LYASHENKO1*, A.N. SUKACH1,2
The Effect of DMSO of Different Concentrations and Freeze-Thawing
on Newborn Rat Neural Cell Survival
Изучали действие различных концентраций криопротектора ДМСО на способность к пролиферации изолированных
нервных клеток новорожденных крыс и их окрашивание трипановым синим до и после криоконсервирования. Установлено,
что 7,5 и 10% – оптимальные концентрации криопротектора, при которых нервные стволовые/прогениторные клетки
новорожденных крыс сохраняют способность к пролиферации и дифференциации после криоконсервирования. Показано, что
для сохранения функциональной активности нервных клеток новорожденных крыс присутствие сыворотки в среде
замораживания обязательно. Показано, что жизнеспособность нервных клеток новорожденных крыс, определенная по
исключению трипанового синего, лишь частично коррелирует с функциональной активностью клеток.
Ключевые слова: нервные клетки новорожденных крыс, криоконсервирование, жизнеспособность, культивирование.
Вивчали дію різних концентрацій кріопротектора ДМСО на здатність до проліферації ізольованих нервових клітин
новонароджених щурів та їх забарвлення трипановим синім до і після кріоконсервування. Встановлено, що 7,5 і 10% –
оптимальні концентрації кріопротектора, при яких нервові стовбурові/прогеніторні клітини новонароджених щурів зберігають
здатність до проліферації і диференціації після кріоконсервування. Показано, що для збереження функціональної активності
нервових клітин новонароджених щурів присутність сироватки в середовищі заморожування є обов'язковою. Показано, що
життєздатність нервових клітин новонароджених щурів, визначена по виключенню трипанового синього, лише частково
корелює з функціональною активністю клітин.
Ключові слова: нервові клітини новонароджених щурів, кріоконсервування, життєздатність, культивування.
The effect of cryoprotectant dimethyl sulfoxide of different concentrations on the ability of isolated neural cells of newborn rats
to proliferate and to be stained with trypan blue before and after freeze-thawing was studied. The cryoprotectant concentrations of 7.5
and 10% were established as the optimal ones, which preserved the ability of the neural stem/progenitor cells of newborn rats to
proliferate and differentiate after freeze-thawing. Preservation of the functional activity of newborn rat neural cells demanded the
presence of serum in freezing medium. It was demonstrated that the viability of newborn rat neural cells, assessed by trypan blue
exclusion, only partially reflected the cell functional activity.
Key words: newborn rat neural cells, freeze-thawing, viability, culturing.
264 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Использование культуры изолированных ранних
постнатальных НК человека и животных позволяет
проводить детальные исследования механизмов
нервного дифференцирования, экспрессии генов, а
также влияния сигналов микроокружения, которые
регулируют фенотипическую специализацию в
нервных тканях млекопитающих. Поэтому актуаль-
но создание низкотемпературного банка ранних
постнатальных НК, что требует разработки эффек-
тивных методов их криоконсервирования.
Наиболее часто для криоконсервирования ядер-
ных клеток используется криопротектор ДМСО.
Его защитное действие основано на высокой ско-
рости проникновения через клеточную мембрану
и образовании большого количества водородных
связей с молекулами жидкой фазы клетки. Это
приводит к уменьшению вероятности образования
внутриклеточных кристаллов льда, а также к сни-
жению эффекта концентрирования внутриклеточ-
ных солей при отрицательных температурах, что
уменьшает степень криоповреждения клетки [3].
Однако, помимо криозащитных свойств, ДМСО
обладает токсическим действием по отношению
к замораживаемым биообъектам [9]. Поэтому ак-
туальным является подбор оптимальной концент-
рации ДМСО, обеспечивающей максимальные
криопротекторные свойства при минимальном
повреждающем действии.
При низкотемпературном хранении постнаталь-
ных НК важно изучить роль сыворотки крови, кото-
рая часто используется в протоколах криоконсер-
вирования различных ядерных клеток.
Цель работы – изучение влияния различных
концентраций ДМСО, сыворотки и замораживания-
отогрева на сохранность (концентрацию и жизне-
способность), а также поведение в условиях куль-
тивирования in vitro НК новорожденных крыс.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на беспородных бе-
лых новорожденных крысах. Нервные клетки вы-
деляли из ткани мозга ферментативно-механичес-
ким методом. Для этого ткань мозга инкубировали
10 мин в 0,25%-м растворе трипсина при 37°С, за-
тем дезагрегировали вибрацией [8] на единичные
клетки, добавляя 2-кратный объем среды DMEM/
F12 (“Sigma”, США) с 10% сыворотки крови крыс.
Полученную суспензию фильтровали через нейло-
новый фильтр, после чего отмывали от трипсина
центрифугированием при 1500 об/мин. Диспергиро-
вали осадки клеток в средах с сывороткой и без нее.
Охлаждали клетки в среде DMEM/F12 с 10%
сыворотки крови крыс и без нее со скоростью
1 град/мин до –80°С в криоконтейнерах (“Corning”,
США). Перед замораживанием суспензию клеток
expression, as well as the effect of microenvironment
signals, regulating phenotypical specialization in mam-
malian neural tissues. Proceeding from this fact of
current interest is to establish the low temperature bank
for early postnatal NCs, requiring the development of
efficient methods for their cryopreservation.
The DMSO is the most often used cryoprotectant
for cryopreservation of nucleated cells. Its protective
effect is based on a high rate of penetration through
cell membrane and formation of a large number of
hydrogen bonds with molecules of cell liquid. This re-
sults in a decrease of intracellular ice crystal forma-
tion probability, as well in a reduction of the effect of
intracellular salt concentrating under negative tempera-
tures, thereby decreasing the cell cryoinjury degree [3].
However, in addition to cryoprotective properties,
DMSO possesses a toxic effect towards processed
bioobjects [9]. Therefore of relevance is to select the
optimal DMSO concentrations, providing the maximum
cryoprotective properties together with minimum dam-
aging effect.
Under postnatal NC low temperature storage of
importance is to study the role of blood serum, being
frequently used in cryopreservation protocols for dif-
ferent nucleated cells.
The research was aimed to study the effect of
DMSO of different concentrations, serum and freeze-
thawing on survival (concentration and viability), as well
as behavior during in vitro culturing of newborn rat
NCs.
Materials and methods
The experiments were carried-out in breadless
white newborn rats. Neural cells were isolated from
brain tissue using the enzymatic and mechanical
method. For this purpose the brain tissue was incu-
bated within 10 min in 0.25% trypsin solution at 37°C,
then disaggregated by vibration [8] into single cells and
suspended in two-fold volume of DMEM/F12 medium
(Sigma, USA) supplemented with 10% rat blood se-
rum. The obtained suspension was filtered through
nylon filter, then washed-out of trypsin with centrifu-
gation at 1500 rpm. Cell sediments were dispersed in
media with/without serum.
Cells were cooled in DMEM/F12 medium with or
without 10% rat blood serum with 1 degree/min rate
down to –80°C in cryocontainers (Corning, USA). Be-
fore freezing the cell suspension was mixed with
cryoprotectant solution in 1:1 ratio. DMSO solution was
added by drops up to 2.5; 5; 7.5; 10 and 12.5% con-
centrations. Herewith the cell final concentration was
20 mln/ml and the volume was 200 µl. An equal volu-
me of culturing medium was added into the control cell
samples. After adding the DMSO the NC suspension
was incubated at 4°C for 15 min and then cooled down
265 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
смешивали с раствором криопротектора в соотно-
шении 1:1. Раствор ДМСО добавляли по каплям
до концентраций 2,5; 5; 7,5; 10 и 12,5%. При этом ко-
нечная концентрация клеток составляла 20 млн/мл,
а объем – 200 мкл. В контрольные образцы клеток
добавляли равный объем среды культивирования.
После добавления ДМСО суспензию НК инкуби-
ровали при 4°С в течение 15 мин. Нервные клетки,
замороженные до –80°С, через сутки помещали в
жидкий азот. Размораживали клетки на водяной
бане при 40°С.
После размораживания НК однократно отмы-
вали от ДМСО средой DMEM/F12 с сывороткой
или без нее с последующим центрифугированием
на протяжении 3 мин при 100g. Осадок клеток дис-
пергировали в среде отмывания.
Жизнеспособность НК оценивали по исключе-
нию витального красителя трипанового синего [10].
Количество клеток подсчитывали в камере Горяе-
ва. Подсчет жизнеспособности и количества кле-
ток проводили сразу после выделения, 15-минут-
ной инкубации при 4°С в присутствии ДМСО, а
также после отмывания деконсервированных сус-
пензий НК от криопротектора.
Нервные клетки культивировали в 24-луночных
планшетах (“Corning”) в обогащенной среде
DMEM/F12 (“Sigma”) [1] в СО2 инкубаторе при
37°С в атмосфере 5% CO2, 95% воздуха. Среду куль-
тивирования заменяли на свежую через 3–4 дня.
Культуры НК, предварительно зафиксирован-
ные в 4%-м параформальдегиде, иммуноцитохими-
чески окрашивали [2] на маркерные белки ней-
ронов (β tubulin III), нервных стволовых клеток
(nestin) и нервных прогениторных клеток (vimentin).
В качестве первичных антител использовали mouse
monoclonal to β Tubulin III (“Sigma”), mouse monoclo-
nal to Nestin (“Abcam”, Великобритания) и rabbit
polyclonal to Vimentin (“Abcam”). В качестве вто-
ричных антител использовали Chromeo 546 goat
anti-mouse (“Abcam”), Chromeo 488 goat anti-rabbit
(“Abcam”). Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342
(“Sigma”).
Микроскопирование и микрофотосъемку куль-
тур проводили на микроскопе Observer Z1 (“Carl
Zeiss”, Германия).
Результаты статистически обрабатывали по
методу Стьюдента с использованием программы
MS Excel.
Эксперименты были проведены в соответствии
с “Общими принципами экспериментов на живот-
ных”, одобренными II конгрессом по биоэтике
(20.09.07, Киев, Украина) и согласованными с поло-
жениями “Европейской Конвенции о защите позво-
ночных животных, используемых для эксперимен-
тальных и других научных целей” (Страсбург,
1986).
to –80°C. One day after the cells were transferred
into a liquid nitrogen. Cells were thawed in water bath
at 40°C.
After thawing the NCs were once washed-out of
DMSO with DMEM/F12 medium with/without serum
with following centrifugation for 3 min at 100g. The
cell sediment was dispersed in washing medium.
The NCs’ viability was assessed by trypan blue vi-
tal dye exclusion [10]. Cell number was calculated in
Goryaev’s chamber. The viability and cell number were
calculated right after isolation, after 15 minutes of in-
cubation at 4°C in DMSO presence, as well as after
cryoprotectant wash-out procedure of frozen-thawed
NC suspension.
Neural cells were cultured in 24-well plates (Cor-
ning) in the enriched DMEM/F12 medium (Sigma) [1]
in CO2 incubator at 37°C under 5% CO2, 95% air at-
mosphere. Culturing medium was replaced for a fresh
one every 3–4 days.
The NC cultures, preliminarily fixed in 4% parafor-
maldehyde were immunocytochemically stained [2] for
marker proteins: mouse monoclonal to β Tubulin III
(Sigma) for neurons, monoclonal to Nestin (Abcam,
Great Britain) for neural stem cells and rabbit polyclonal
to Vimentin (Abcam) for neural progenitor cells. The
Chromeo 546 goat anti-mouse (Abcam), Chromeo 488
goat anti-rabbit (Abcam) were used as secondary an-
tibodies. Cell nuclei were stained with Hoechst 33342
(Sigma).
Microscopy and microimaging of cultures were
performed with Observer Z1 microscope (Carl Zeiss,
Germany).
The results were statistically processed using the
Student’s method with MS Excel Software.
The experiments were done in accordance with the
General Principles of Experiments in Animals, approved
by the 2nd National Congress in Bioethics (Kiev, 2007)
and agreed to the statements of the European Con-
vention for the Protection of Vertebrate Animals Used
for Experimental and Other Scientific Purposes (Stras-
bourg, 1986).
Results and discussion
Since DMSO has a manifested toxic effect on cells
under concentration higher than 12% [7, 11] in the re-
search we used the cryoprotectant concentration not
higher than 12.5%.
The viability and concentration of freshly isolated
NCs from newborn rats did not depend on serum pres-
ence in the medium and made 54 ± 4.6% and 20.9 ±
1.4 mln/ml in serum-free medium and 56.2 ± 4.2% and
21.6 ± 0.8 mln/ml in serum-enriched one.
The Fig. 1 shows that DMSO adding into NC sus-
pension reduced the viability and a number of cells both
in serum-free and serum-enriched media. Herewith a
decrease in viability and cell concentration was ob-
0
10
20
30
40
50
60
70
0 2,5 5 7,5 10 12,5
0
5
10
15
20
25
0
10
20
30
40
50
60
70
0 2,5 5 7,5 10 12,5
0
5
10
15
20
25
266 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Результаты и обсуждение
Поскольку ДМСО обладает выраженным ток-
сическим действием на клетки при концентрации
выше 12% [7, 11], в исследовании использовали
концентрацию криопротектора не более 12,5%.
Жизнеспособность и концентрация свежевыде-
ленных НК новорожденных крыс не зависели от
наличия в среде сыворотки и составляли: 54 ± 4,6%
и 20,9 ± 1,4 млн/мл в среде без сыворотки и 56,2 ±
4,2% и 21,6 ± 0,8 млн/мл в среде с сывороткой.
Как видно из рис. 1, добавление ДМСО к свеже-
выделенной суспензии НК снижало жизнеспособ-
ность и уменьшало их количество в среде как без
сыворотки, так и с сывороткой. При этом снижение
жизнеспособности и концентрации клеток наблю-
далось уже после добавления 2,5% ДМСО. Повы-
шение концентрации ДМСО до 5% достоверно не
изменяло жизнеспособность и количество клеток
по сравнению с 2,5% ДМСО (рис. 1), а при кон-
центрации ДМСО 7,5% как в среде с сывороткой,
так и без нее жизнеспособность и концентрация
НК снижались на 30–35% и 29% соответственно
по сравнению с образцами клеточных суспензий,
не содержащими ДМСО. Повышение концентра-
ции ДМСО до 10 и 12,5% в среде с сывороткой и
без нее не приводило к изменению количества кле-
ток, однако при этом наблюдалось существенное
снижение жизнеспособности клеток: на 57% при
10% ДМСО и на 72–76% при 12,5% ДМСО (рис. 1).
После замораживания-отогрева НК без крио-
протектора жизнеспособность и концентрация кле-
ток снижались на 60 и 67% по сравнению с исход-
ными значениями (рис. 2, 3). При этом присутствие
сыворотки в среде замораживания не влияло на жиз-
неспособность и концентрацию клеток. Присутст-
вие в среде замораживания 2,5 и 5% ДМСО сохра-
няло 37 и 47% клеток в среде без сыворотки и 38 и
52% – с сывороткой. Жизнеспособность клеток при
этом не зависела от присутствия сыворотки и
составляла 32–37% (рис. 2). Повышение концент-
рации ДМСО в среде замораживания до 7,5; 10 и
12,5% как в присутствии сыворотки, так и без нее
не оказывало влияния на изменение концентрации
клеток, однако снижало жизнеспособность по срав-
нению со средой, содержащей 5% ДМСО (рис. 2,
3). При этом падение жизнеспособности пропорцио-
нально зависело от концентрации ДМСО в среде
замораживания.
Поскольку ДМСО обладает токсичным дейст-
вием на клетки [7, 11], мы изучали влияние отмы-
вания криопротектора на концентрацию и жизнеспо-
собность НК после замораживания-отогрева. Как
видно из рис. 2, отмывание деконсервированных
клеток от ДМСО фактически не приводит к повы-
шению их жизнеспособности. Однако отмывание
от ДМСО во всех случаях приводило к уменьше-
нию количества клеток в 1,5–2 раза (рис. 3).
served even after adding 2.5% DMSO. Increasing the
DMSO concentration up to 5% did not statistically and
significantly change the cell viability and number if
compared to the case of 2.5% DMSO (Fig. 1). An
increase in DMSO concentration up to 7.5% both in
serum-free and serum-enriched media resulted in a fall
of NCs’ viability by 30–35% and a decrease in cell
concentration by 29% as compared to DMSO-free cell
suspension samples. An increase in DMSO concen-
tration up to 10 and 12.5% in serum-free and serum-
enriched media did not change the cell number, but at
the same time there was observed a considerable re-
duction in cell viability by 57, 72–76% at 10 and 12.5%
DMSO, correspondingly (Fig. 1).
After freeze-thawing of NCs without cryoprotectant
the cell viability and concentration reduced by 60 and
67% if compared to the initial values (Fig. 2, 3). Here-
with the presence of serum in freezing medium did not
Рис. 1. Влияние ДМСО и сыворотки на жизнеспо-
собность ( ) и концентрацию ( ) изолированных НК
крыс: A – без сыворотки; B – с сывороткой.
Fig. 1. DMSO and serum effects on viability ( ) and con-
centration ( ) of rat isolated NCs: A – serum-free; B –
serum-enriched media.
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
Н
К,
%
N
C
v
ia
bi
lit
y,
%
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
Н
К,
м
лн
/л
N
C
c
on
ce
nt
ra
tio
n,
m
ln
/l
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
Н
К,
%
N
C
v
ia
bi
lit
y,
%
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
Н
К,
м
лн
/л
N
C
c
on
ce
nt
ra
tio
n,
m
ln
/l
A
B
0
5
10
15
20
25
К 0 2,5 5 7,5 10 12,5
0
5
10
15
20
25
К 0 2,5 5 7,5 10 12,5
0
10
20
30
40
50
60
70
К 0 2,5 5 7,5 10 12,5
0
10
20
30
40
50
60
70
К 0 2,5 5 7,5 10 12,5
267 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Таким образом, наибольшее количество НК,
исключающих витальный краситель трипановый
синий, сохраняется при использовании для криокон-
сервирования 5%-го ДМСО. Наличие сыворотки
в среде замораживания существенного влияния на
жизнеспособность и количество клеток не оказы-
вает. Использование центрифугирования для от-
мывания деконсервированных НК от ДМСО не
приводит к повышению жизнеспособности клеток,
однако сопровождается значительной их потерей.
affect the cell viability and concentration. The presen-
ce of 2.5 and 5% DMSO in freezing medium preserved
37 and 47% cells in serum-free medium and 38 and
52% in serum-enriched one. The cell viability did not
thereby depend on serum presence and made 32–37%
(Fig. 2). An increase in DMSO concentration in freez-
ing medium up to 7.5, 10 and 12.5% both with and
without serum did not change cell concentration, but
resulted in a significant fall in their viability if com-
pared to the medium, containing 5% DMSO (Fig. 2,
Рис. 2. Влияние отмывания криопротектора на жизнеспособность изолированных НК, криоконсервированных с
различными концентрациями ДМСО без сыворотки (A) и с сывороткой (B); К – жизнеспособность свежевыделенных
НК; – жизнеспособность НК до отмывания ДМСО; – жизнеспособность НК после отмывания ДМСО.
Fig. 2. Effect of cryoprotectant washing-out on viability of isolated NCs, frozen-thawed in the presence of different
concentrations of DMSO in serum-free (A) and serum-enriched media (B); K denotes the viability of freshly isolated NCs;
– NCs’ viability prior to DMSO washing-out; – NCs’ viability after DMSO washing-out.
Рис. 3. Влияние отмывания криопротектора на концентрацию изолированных НК, криоконсервированных с
различными концентрациями ДМСО без сыворотки (A) и с сывороткой (B); К – исходная концентрация НК; –
концентрация НК до отмывания ДМСО; – концентрация НК после отмывания ДМСО.
Fig. 3. The effect of cryoprotectant washing-out on concentration of isolated NCs, frozen-thawed in the presence of with
different concentrations of DMSO in serum-free (A) and serum-enriched media (B); K denotes NCs’ initial concentration;
– NCs concentration prior to DMSO washing-out; – NCs’ concentration after DMSO washing-out.
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
Н
К,
%
N
C
v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
Н
К,
%
N
C
v
ia
bi
lit
y,
%
A B
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
Н
К,
м
лн
/л
N
C
c
on
ce
nt
ra
tio
n,
m
ln
/l
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
Ко
нц
ен
тр
ац
ия
Н
К,
м
лн
/л
N
C
c
on
ce
nt
ra
tio
n,
m
ln
/l
A B
268 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Следует отметить, что определение жизнеспо-
собности по исключению трипанового синего клет-
ками – достаточно грубый метод, который в боль-
шей мере является тестом физической целост-
ности клеток и не отражает их функциональную и
метаболическую сохранность. Наиболее “стро-
гим” тестом жизнеспособности клеток является
их способность к росту (пролиферации и дифферен-
цировке) в культуре. Поэтому следующим этапом
нашей работы было определение влияния замора-
живания-отогрева в средах с различными концент-
рациями ДМСО с сывороткой и без нее на способ-
ность НК формировать агрегаты, прикрепляться
к поверхности пластика, пролиферировать и диф-
ференцироваться. Для этого свежевыделенные и
деконсервированные НК сеяли в 24-луночные
планшеты в концентрации 2 млн/мл. При этом сус-
пензию деконсервированных НК перед посевом
разводили до конечной концентрации ДМСО в
среде культивирования 0,25%.
Свежеизолированные НК формировали агре-
гаты уже через сутки культивирования (рис. 4, А).
На протяжении 1–3 суток культивирования боль-
шинство агрегатов прикреплялось, их составляю-
щие клетки начинали интенсивно мигрировать и
дифференцироваться, формируя участки монослоя
(рис. 4, B). При этом наблюдалось значительное
количество клеток с морфологией нейронов. Через
2–4 суток культивирования формировались неболь-
шие участки клеточного монослоя, морфологичес-
ки состоящего преимущественно из клеток глии.
На 5–7-е сутки культивирования на поверхности
глиального монослоя появлялись клетки, морфоло-
гически похожие на нейробласты (рис. 4, C), коли-
чество которых при дальнейшем культивировании
увеличивалось. На 6–9-е сутки культивирования
образовывались колонии недифференцированных
β-тубулин-III положительных (данные по окраши-
ванию не представлены) клеток (рис. 4, D), кото-
рые в процессе культивирования увеличивались в
размерах и формировали контакты с соседними
колониями.
Культивирование НК, замороженных-отогретых
со всеми используемыми нами концентрациями
ДМСО без сыворотки, приводило к формированию
мелких, рыхлых и бесформенных агрегатов, кото-
рые при дальнейшем культивировании к подложке
не прикреплялись. При этом в лунках наблюдалось
небольшое количество плавающих единичных кле-
ток, некоторые из них прикреплялись и расплас-
тывались.
При культивировании НК, замороженных-ото-
гретых с сывороткой без ДМСО или с 2,5% ДМСО,
отмечалось большое количество плавающих еди-
ничных клеток, а также формирование мелких,
3). At the same time the viability fall proportionally to
DMSO concentration in freezing medium.
Since DMSO has a toxic effect on cells [7, 11] we
studied the effect of cryoprotectant washing-out on
NCs concentration and viability after their freeze-thaw-
ing. The Fig. 2 shows the frozen-thawed cell washing-
out of DMSO as actually not resulting in their viability
increase. However, the washing-out of DMSO in the
all the cases resulted in cell number decrease in 1.5–2
times (Fig. 3).
Thus, the highest number of NCs, excluding trypan
blue vital dye is preserved when using 5% DMSO dur-
ing cryopreservation. The serum presence in freezing
medium does not significantly affect the cell viability
and number. The usage of centrifugation for frozen-
thawed NCs washing-out of DMSO does not augment
the cell viability, but is accompanied with their high loss.
Of note is the fact, that the viability assessment
from data of trypan blue exclusion by cells is quite a
rough method, and is more likely the test for physical
integrity of cells and does not reflect their functional
and metabolic state preservation. The most “rigorous”
test for cell viability is their capability to proliferate and
differentiate under in vitro culture. Therefore the next
step in our research was to determine the effect of
freeze-thawing in media with different concentrations
of DMSO with and without serum on the NCs’ capa-
bility to form aggregates, attach to plastic surface, pro-
liferate and differentiate. For this purpose the freshly
isolated and frozen-thawed NCs were inoculated into
24-well plates in 2 mln/ml concentration. Herewith the
suspension of frozen-thawed NCs before inoculation
was diluted to the 0.25% final DMSO concentration in
culturing medium.
The freshly isolated NCs formed aggregates even
after one day of culturing (Fig. 4A). Within 1–3 days
of culturing the most aggregates attached, their com-
posing cells began an intensive migration and differen-
tiation, forming monolayer sites (Fig. 4B). At the same
time there was observed a great number of cells with
neuron morphology. Following 2–4 culturing days the
small sites of cell monolayer, being composed morpho-
logically of most glial cells, were formed. To the 5th–
7th culturing days on the surface of glial monolayer the
cells, being morphologically similar to neuroblasts, ap-
peared (Fig. 4C), and their number increased under
following culturing. To the 6th–9th culturing days there
were formed the colonies of non-differentiated β tubulin
III positive cells (no data on staining presented)
(Fig. 4D), which during culturing increased in size and
formed contacts with nearby colonies.
Culturing of NCs, frozen-thawed in the presence
of all studied DMSO concentrations in serum-free
media, resulted in formation of small, loose and form-
less aggregates, which did not attach to the substrate
269 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
рыхлых и бесформенных агрегатов. В процессе
дальнейшего культивирования прикрепления и
распластывания единичных клеток и агрегатов не
наблюдалось.
В первые сутки культивирования НК, криокон-
сервированных с сывороткой и 5; 7,5; 10; 12,5%
ДМСО, формировались агрегаты среднего раз-
мера. Некоторые из них в процессе культивиро-
вания сливались, уплотнялись и прикреплялись к
подложке. На 3–4-е сутки культивирования при-
креплялось 90% агрегатов. Клетки прикрепленных
агрегатов мигрировали, дифференцировались и
пролиферировали. Первоначально происходила
дифференциация преимущественно в направлении
клеток с глиальной морфологией. На 4–6-е сутки
культивирования наблюдалось формирование
участков монослоя, состоящих из клеток глии. На
7–10-е сутки культивирования на этом монослое
появлялись клетки, морфологически похожие на
нейробласты (рис. 5, А). На 10–16-е сутки куль-
тивирования образовывались колонии нестин- и
виментин-положительных клеток (рис. 5, В, С).
Колонии в процессе дальнейшего культивирования
увеличивались в размерах.
Максимальное количество нейробластов и ко-
лоний стволовых/прогениторных клеток образовы-
валось из НК, криоконсервированных с 7,5 и 10%
ДМСО. При культивировании НК, замороженных-
отогретых с 5 и 12,5% ДМСО, нейробласты и ко-
лонии стволовых/прогениторных клеток появля-
лись на 2–4 суток позже по сравнению с клетками,
криоконсервированными с 7,5 и 10% ДМСО, и их
количество было меньше.
during further culturing. At the same time a small
number of floating single cells was observed in wells,
and only some of them were attached and flattened.
When culturing the NCs, frozen-thawed in serum-
enriched media without or with 2.5% DMSO, there
was observed a big number of floating single cells, as
well as the small, loose and amorphous aggregates
were formed. During following culturing no attach-
ment and flattening of single cells and aggregates were
observed.
Within first culturing days of NCs, frozen-thawed
in serum-enriched media and in the presence of 5, 7.5,
10, and 12.5% DMSO the middle-sized aggregates
were formed. Some of them fused, become condensed
and attached to the substrate during culturing. To the
3rd–4th culturing days 90% of aggregates were at-
tached. Cells of attached aggregates migrated, differ-
entiated and proliferated. Initially the differentiation
occurred mostly towards cells with glial morphology.
To the 4th–6th culturing days there was noted the for-
mation of monolayer sites, consisting of glial cells. To
the 7th–10th culturing days the cells, being morphologi-
cally similar to neuroblasts appeared on this monol-
ayer (Fig. 5A). To the 10th–16th days of culturing there
were formed the colonies of nestin- and vimentin-posi-
tive cells (Fig. 5B and C). Within further culturing the
colonies increased in size.
Maximum number of neuroblasts and colonies of
stem/progenitor cells was formed from NCs, frozen-
thawed in the presence of 7.5 and 10% DMSO. Dur-
ing culturing of NCs, frozen-thawed in the presence of
5 and 12.5% DMSO the neuroblasts and colonies of
stem/progenitor cells appeared to the 2nd–4th days later
Рис. 4. Формирование свеже-
изолированными НК новорож-
денных крыс агрегатов (А),
которые в процессе дальней-
шего культивирования при-
креплялись, их клетки мигриро-
вали, дифференцировались и
пролиферировали (В), форми-
руя монослой, на котором
образовывались нейробласто-
подобные клетки (С) и колонии
недифференцированных кле-
ток (D). Масштаб 100 мкм.
Fig. 4. Freshly isolated newborn
rat NCs formed the aggregates
(A), which attached under follow-
ing culturing, their cells migrated,
differentiated and proliferated
(B), forming the monolayer, where
the neuroblast-like cells (C) and
colonies of non-differentiated
cells (D) were formed. Scale bar
100 µm.
270 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Таким образом, проведенные исследования по-
казали, что присутствие ДМСО даже в невысоких
концентрациях в среде как с сывороткой, так и без
нее оказывает токсическое действие на НК.
Замораживание-отогрев НК в среде без ДМСО
как с сывороткой, так и без нее приводит к паде-
нию жизнеспособности и гибели значительной час-
ти клеток (количество клеток уменьшилось в два
раза).
ДМСО в концентрации 5–12,5% предохраняет
НК от разрушения в процессе замораживания-
отогрева, что выражается в сохранении большего
их количества. При этом максимальное количество
НК, исключающих витальный краситель трипа-
новый синий, отмечалось при использовании 5%
ДМСО. Присутствие сыворотки в среде криокон-
сервирования на сохранность количества и жизне-
способности НК влияния не оказывало.
Культивирование деконсервированных НК in
vitro выявило, что жизнеспособность, определен-
ная по исключению клетками трипанового синего,
не вполне согласуется со способностью клеток
прикрепляться, распластываться и расти в культу-
ре. Культивирование, в отличие от экспериментов
по определению жизнеспособности НК с исполь-
зованием трипанового синего, показало, что 7,5 и
10% – оптимальные концентрации ДМСО, при ко-
торых максимально сохраняются функциональные
способности НК. При этом присутствие сыворотки
в среде криоконсервирования обязательно.
При культивировании НК, замороженных-ото-
гретых с различными концентрациями ДМСО, их
жизнеспособность, определенная по исключению
if compared to cells, frozen-thawed in the presence of
7.5 and 10% DMSO, and their number was lower.
Thus, the performed research demonstrated the
DMSO presence even in low concentrations in both
serum-free and serum-enriched media as causing a
toxic effect on NCs.
Freeze-thawing of NCs without DMSO in both se-
rum-free and serum-enriched media resulted in a fall
of viability and death of a great part of cells (cell number
reduced twice).
DMSO in concentration of 5–12,5% protects NCs
against damages during freeze-thawing, that manifests
in preservation of their greater number after thawing.
Moreover the maximum number of NCs, excluding
trypan blue vital dye was noted after freeze-thawing
in presence of 5% DMSO. The serum in cryopreserva-
tion medium had no effect on the preservation of NCs’
number and viability at that.
In vitro culturing of frozen-thawed NCs revealed
the viability, determined by trypan blue exclusion by
cells, as not completely correlating to cell capability to
attach, flatten and grow in culture. In contrast to the
experiments on assessment of NCs viability with trypan
blue application, the culturing demonstrated the 7.5 and
10% DMSO concentrations as the optimal ones, when
NCs’ functional capabilities were maximally preserved.
Herewith the serum presence in cryopreservation me-
dium was obligatory.
The comparison of culturing results for NCs, fro-
zen-thawed in the presence of different concentrations
of DMSO with their viability, determined by trypan blue
exclusion, indicates to the fact, that cell staining with
trypan blue after freeze-thawing in DMSO presence
Рис. 5. Иммуноцитохимическое
окрашивание криоконсервиро-
ванных НК новорожденных
крыс после 14 суток культивиро-
вания. Первичная культура про-
лиферирующих клеток (А) де-
монстрирует высокий уровень
нестин- (B) и виментин-положи-
тельных (C) клеток. Ядра клеток
были окрашены красителем
Hoechst (D). Масштаб 100 мкм.
Fig. 5. Immunocytochemical stain-
ing of cryopreserved newborn rat
NCs after 14 days of culturing.
Primary culture of proliferating
cells (A) demonstrates a high level
of nestin (B) and vimentin (C)
positive cells. Cell nuclei were
stained with Hoechst dye (D).
Scale bar 100 µm.
271 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
трипанового синего, указывает на то, что окраши-
вание клеток трипановым синим в присутствии
ДМСО скорее отражает изменение степени прони-
цаемости клеточной мембраны для красителя, чем
их жизнеспособность. Действительно, снижение
жизнеспособности НК, определяемое по исклю-
чению трипанового синего клетками в присутствии
ДМСО, может определяться двумя факторами:
увеличением проницаемости клеточной мембраны
для красителя с повышением концентрации ДМСО
[12] и падением жизнеспособности НК вследствие
токсического действия высоких концентраций
криопротектора. Повышение проницаемости кле-
точной мембраны для трипанового синего и токси-
ческий эффект являются следствием изменения
структуры мембраны в присутствии ДМСО [5, 13].
Степень таких изменений зависит от концентрации
ДМСО, вследствие которых нарушается гомео-
стаз клеток и изменяются межмембранные взаи-
модействия, что, в свою очередь, может индуциро-
вать апоптоз клеток. Однако, если проницаемость
клеток изменяется сразу после добавления ДМСО
к клеткам, то для проявления токсического
действия ДМСО необходимы время и условия in
vivo или in vitro. Поэтому увеличение количества
НК, прокрашенных трипановым синим с повыше-
нием концентрации ДМСО в среде, вероятнее все-
го, происходит вследствие изменения проницаемос-
ти клеточных мембран для красителя. С этой точ-
ки зрения использование трипанового синего для
определения жизнеспособности НК в присутствии
ДМСО в среде не целесообразно.
Выводы
Нервные стволовые/прогениторные клетки
новорожденных крыс сохраняют способность к
пролиферации и дифференциации после заморажи-
вания-отогрева. При этом наибольшее количество
функционально активных клеток сохраняется при
использовании 7,5 и 10% ДМСО.
Для сохранения функциональной активности НК
новорожденных крыс присутствие сыворотки в
среде замораживания обязательно.
Жизнеспособность НК новорожденных крыс,
определенная по исключению трипанового синего,
лишь частично отражает функциональную актив-
ность клеток.
Использование центрифугирования для удале-
ния ДМСО из суспензии НК не целесообразно вслед-
ствие значительной потери количества клеток при
незначительном повышении их жизнеспособности.
Авторы выражают благодарность канд. биол. наук
Коваленко И.Ф. и канд. биол. наук Холодному В.С. за
помощь в проведении микрофотосъемки.
reflects a change in cell membrane permeability for a
dye rather than their viability. Really, a decrease in NCs’
viability, determined by trypan blue exclusion by the
cells after freeze-thawing in DMSO presence may be
specified by two factors such as: an increase in cell
membrane permeability for a dye with a rise of DMSO
concentration [12] and a fall of NC viability due to a
toxic effect of high concentrations of cryoprotectant.
The augmentation of cell membrane permeability for
trypan blue and a toxic effect result from a change in
membrane structure in DMSO presence [5, 13]. The
degree of such changes depends on DMSO concen-
tration, resulting in disordered cell homeostasis and
changed membrane-membrane interactions, that in its
turn may induce cell apoptosis. However, if cell per-
meability changes right after DMSO adding to cell sus-
pension, time and in vivo or in vitro conditions are
necessary for DMSO toxic effect manifestation. There-
fore, the augmentation of NCs’ number, stained with
trypan blue following DMSO concentration rise in the
medium, most probably occurs due to a changed cell
membrane permeability for a dye. In this aspect the
application of trypan blue for determining NCs viabil-
ity after freeze-thawing in presence of DMSO in me-
dium is not adequate.
Conclusions
Neural stem/progenitor cells of newborn rats pre-
serve the capability to proliferate and differentiate af-
ter freeze-thawing. Herewith the highest number of
functionally active cells is preserved when using 7.5
and 10% DMSO.
To preserve the functional activity of newborn rat
NCs the presence of serum in freezing medium is ob-
ligatory.
The viability of newborn rat NCs, determined by
trypan blue exclusion, coincides only partially with cell
functional activity.
It is not expedient to use centrifugation to remove
DMSO from NCs suspension due to a great loss of
cell number and only a slight increase in their viability.
The authors thank Dr. Kovalenko I.F. and Dr. Kholod-
nyy V.S. for the assistance with microimaging.
References
Lyashenko T.D., Sukach O.M. Characteristics of isolated
newborn rat's neural cells // Patologiya.– 2009.– Vol. 6, N1.–
P. 55–58.
Sukach A.N. Characteristics of human embryonic neural cells,
derived with non-enzymatic way // Tsitologiya.– 2005.–
Vol. 47, N3.– P. 207–213.
Fuller B., Lane N., Benson E. Life in the frozen state.– London:
CRC Press, 2004.– 672 p.
1.
2.
3.
272 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №3
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №3
Литература
Ляшенко Т.Д., Сукач О.М. Характеристика ізольованих
нервових клітин новонароджених щурів // Патологія.–
2009.– Т. 6, №1.– С. 55–58.
Сукач А.Н. Характеристика эмбриональных нервных
клеток человека, полученных неферментативным
способом // Цитология.– 2005.– Т. 47, №3.– C. 207–213.
Fuller B., Lane N., Benson E. Life in the frozen state.– London:
CRC Press, 2004.– 672 p.
Gage F.H. Mammalian neural stem cells // Science.– 2000.–
Vol. 287, N545.– P. 1433–1438.
Gordeliy V.I., Kiselev M.A., Lesieur P. et al. Lipid membrane
structure and interactions in dimethyl sulfoxide/water
mixtures // Biophys. J.– 1998.– Vol. 75, N5.– P. 2343–2351.
Kornblum H. I. Introduction to Neural Stem Cells // Stroke.–
2007.– Vol. 38 (part 2).– P. 810–816.
Malinin T.I., Perry V.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on HeLa
cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
Petrenko A.Yu., Sukach A.N. Isolation of intact mitochondria
and hepatocytes using vibration // Anal. Biochem.– 1991.–
Vol. 194, N2.– P. 326–329.
Rowley S.D., Anderson G.L. Effect of DMSO exposure
without cryopreservation on haemopoetic progenitor cells //
Bone Marrow Transplant.– 1993.– Vol. 11, N5.– P. 389–393.
Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell
Biol.– 1976.– Vol. 13.– P. 29–83.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.
Wood D.C., Wood J. Pharmacologic and biochemical
considerations of dimethyl sulfoxide // Ann. N.Y. Acad. Sci.–
1975.– Vol. 243.– P. 7–19.
Yu Z.-W., Quinn P.J. Phase stability of phosphatidylcholines
in dimethylsulfoxide solutions // Biophys. J.– 1995.– Vol. 69,
N4.– P. 1456–1463
Поступила 11.07.2011
Рецензент Г.А. Божок
Gage F.H. Mammalian neural stem cells // Science.– 2000.–
Vol. 287, N545.– P. 1433–1438.
Gordeliy V.I., Kiselev M.A., Lesieur P. et al. Lipid membrane
structure and interactions in dimethyl sulfoxide/water
mixtures // Biophys. J.– 1998.– Vol. 75, N5.– P. 2343–2351.
Kornblum H. I. Introduction to Neural Stem Cells // Stroke.–
2007.– Vol. 38 (part 2).– P. 810–816.
Malinin T.I., Perry V.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on HeLa
cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
Petrenko A.Yu., Sukach A.N. Isolation of intact mitochondria
and hepatocytes using vibration // Anal. Biochem.– 1991.–
Vol. 194, N2.– P. 326–329.
Rowley S.D., Anderson G.L. Effect of DMSO exposure
without cryopreservation on haemopoetic progenitor cells //
Bone Marrow Transplant.– 1993.– Vol. 11, N5.– P. 389–393.
Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell
Biol.– 1976.– Vol. 13.– P. 29–83.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.– P. 253–259.
Wood D.C., Wood J. Pharmacologic and biochemical
considerations of dimethyl sulfoxide // Ann. N.Y. Acad. Sci.–
1975.– Vol. 243.– P. 7–19.
Yu Z.-W., Quinn P.J. Phase stability of phosphatidylcholines
in dimethylsulfoxide solutions // Biophys. J.– 1995.– Vol. 69,
N4.– P. 1456–1463
Accepted 11.07.2011
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-44962 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:23:07Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Ляшенко, Т.Д. Сукач, А.Н. 2013-06-07T05:45:34Z 2013-06-07T05:45:34Z 2011 Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева
 на сохранность нервных клеток новорожденных крыс // Пробл. криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 3. — С. 263-272. — Бібліогр.: 13 назв. — рос., англ. https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44962 547.569.2.:57.043:591.88.084 Изучали действие различных концентраций криопротектора ДМСО на способность к пролиферации изолированных
 нервных клеток новорожденных крыс и их окрашивание трипановым синим до и после криоконсервирования. Установлено,
 что 7,5 и 10% – оптимальные концентрации криопротектора, при которых нервные стволовые/прогениторные клетки
 новорожденных крыс сохраняют способность к пролиферации и дифференциации после криоконсервирования. Показано, что
 для сохранения функциональной активности нервных клеток новорожденных крыс присутствие сыворотки в среде
 замораживания обязательно. Показано, что жизнеспособность нервных клеток новорожденных крыс, определенная по
 исключению трипанового синего, лишь частично коррелирует с функциональной активностью клеток. Вивчали дію різних концентрацій кріопротектора ДМСО на здатність до проліферації ізольованих нервових клітин
 новонароджених щурів та їх забарвлення трипановим синім до і після кріоконсервування. Встановлено, що 7,5 і 10% –
 оптимальні концентрації кріопротектора, при яких нервові стовбурові/прогеніторні клітини новонароджених щурів зберігають
 здатність до проліферації і диференціації після кріоконсервування. Показано, що для збереження функціональної активності
 нервових клітин новонароджених щурів присутність сироватки в середовищі заморожування є обов'язковою. Показано, що
 життєздатність нервових клітин новонароджених щурів, визначена по виключенню трипанового синього, лише частково
 корелює з функціональною активністю клітин. The effect of cryoprotectant dimethyl sulfoxide of different concentrations on the ability of isolated neural cells of newborn rats
 to proliferate and to be stained with trypan blue before and after freeze-thawing was studied. The cryoprotectant concentrations of 7.5
 and 10% were established as the optimal ones, which preserved the ability of the neural stem/progenitor cells of newborn rats to
 proliferate and differentiate after freeze-thawing. Preservation of the functional activity of newborn rat neural cells demanded the
 presence of serum in freezing medium. It was demonstrated that the viability of newborn rat neural cells, assessed by trypan blue
 exclusion, only partially reflected the cell functional activity. Авторы выражают благодарность канд. биол. наук
 Коваленко И.Ф. и канд. биол. наук Холодному В.С. за
 помощь в проведении микрофотосъемки. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс The Effect of DMSO of Different Concentrations and Freeze-Thawing on Newborn Rat Neural Cell Survival Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс Ляшенко, Т.Д. Сукач, А.Н. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| title_alt | The Effect of DMSO of Different Concentrations and Freeze-Thawing on Newborn Rat Neural Cell Survival |
| title_full | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| title_fullStr | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| title_full_unstemmed | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| title_short | Влияние различных концентраций ДМСО и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| title_sort | влияние различных концентраций дмсо и замораживания-отогрева на сохранность нервных клеток новорожденных крыс |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/44962 |
| work_keys_str_mv | AT lâšenkotd vliânierazličnyhkoncentraciidmsoizamoraživaniâotogrevanasohrannostʹnervnyhkletoknovoroždennyhkrys AT sukačan vliânierazličnyhkoncentraciidmsoizamoraživaniâotogrevanasohrannostʹnervnyhkletoknovoroždennyhkrys AT lâšenkotd theeffectofdmsoofdifferentconcentrationsandfreezethawingonnewbornratneuralcellsurvival AT sukačan theeffectofdmsoofdifferentconcentrationsandfreezethawingonnewbornratneuralcellsurvival |