Іммобілізація протеази С у біогель ламідан
Досліджено вплив препарату ламідан на збереження активності при іммобілізації протеолітичних ферментів різного походження (папаїн, трипсин, терилітин, лужна протеаза, протеаза С). Методами SDS- і нативного електрофорезу вивчено кількісний склад білковихфракцій препарату протеази С, їх молекулярні...
Saved in:
| Published in: | Досягнення біології та медицини |
|---|---|
| Date: | 2009 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Національна академія наук України
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47410 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. — 2009. — № 2(14). — С. 25-28. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859483089329192960 |
|---|---|
| author | Романовська, І.І. Декіна, С.С. Мартинюк, Н.Б. |
| author_facet | Романовська, І.І. Декіна, С.С. Мартинюк, Н.Б. |
| citation_txt | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. — 2009. — № 2(14). — С. 25-28. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Досягнення біології та медицини |
| description | Досліджено вплив препарату ламідан на збереження активності при іммобілізації протеолітичних ферментів
різного походження (папаїн, трипсин, терилітин, лужна
протеаза, протеаза С). Методами SDS- і нативного електрофорезу вивчено кількісний склад білковихфракцій препарату протеази С, їх молекулярні маси й активність. Розроблено ефективний спосіб іммобілізації протеази С у біогель ламідан із кількісним включенням ферменту й отримано текстильні покриття пролонгованої дії з 95%-м збереженням протеолітичної активності.
The influence of Lamidan preparation on activity preservation
with proteolytic enzymes of different origin (papain, trypsin,
terrilytin, alkalint protease, protease C) immobilization was
studied. Using the SDS- and native electrophoresis methods, the
quantitative composition of protease C preparation fractions was
investigated, their molecular masses and activity were determined. An effective method of protease C immobilization in
biogel lamidan was developed, with quantitative entrapment of
enzyme; the textile coatings with prolonged action and 95%
retaining of proteolytic activity were obtained.
|
| first_indexed | 2025-11-24T15:11:54Z |
| format | Article |
| fulltext |
¹ 2 (14) 2009 25
Традиційним текстильним
матеріалам належить вагоме
місце серед медичних перев’язу-
вальних засобів. Ефективність
їх застосування зумовлена та-
кими властивостями, як висока
сорбційна здатність, еластич-
ність, драпованість, повітропро-
никність, легкість та ін. Основ-
ні зусилля дослідників сьогодні
зосереджені на проблемі надан-
ня перев’язувальним засобам
додаткових лікувальних власти-
востей шляхом введення в текс-
тильний матеріал необхідних
препаратів. При цьому важ-
ливо, щоб уведений препарат
здійснював довготривалу дію,
що забезпечить пролонгований
ефект, усуне необхідність час-
тих перев’язок, не порушувати-
ме процесу загоєння рани [1–4].
Одним із найбільш перспек-
тивних носіїв для створення
таких матеріалів є природний
екстракт-біогель — ламідан.
Сировиною для нього є бурі
морські водорості ламінарії
японської (Laminaria japonica
Aresch), а його основою на 35 %
є альгінат натрію [5]. Окрім со-
лей альгінової кислоти ламідан
містить ліпіди (поліненаси-
чені жирні кислоти), пігменти
(хлорофіл і його похідні), золу
(22,6 %), рослинні волокна
(8,6 %), а також деякі мікроеле-
менти (кальцій, йод, селен, маг-
ній, цинк, мідь) і вітаміни (А,
В12, С, Е, D, К).
Підставою для вивчення ім-
мобілізації протеази С у ламі-
дан стала можливість отриман-
ня високоефективного матеріа-
лу з властивістю регенерувати
травмовані шкірні покриви та
прискорювати відновлення тка-
нин. Розробка таких видів лі-
карських форм є актуальною
проблемою для різних галузей
медицини, таких як травмато-
логія, опікова терапія та ін.
Метою роботи було дослі-
дження методу іммобілізації
протеази С у ламідан і фізико-
хімічних властивостей отрима-
ного препарату.
Матеріали та методи
дослідження
У роботі використовували
протеазу С Acremonium chryso-
genum, штам 291-1 (ДП «Ен-
зим», Україна); папаїн (Merck,
Німеччина); трипсин (Merck,
Німеччина), терилітин (ФС 42-
2245-84, Росія); лужну протеа-
зу (ДП «Ензим», Україна); гель
ламідану з Laminaria japonica
Aresch (ТУ У 15.2-34396838-
001:2006).
Протеолітичну активність
визначали згідно [6] з викорис-
танням N-α-бензоїл-D,L-аргі-
нін-п-нітроанілід гідрохлориду.
За одиницю протеолітичної ак-
тивності брали таку кількість
ферменту, що за 1 хв при 37 °С
сприяє утворенню 1 мкмоль
n-нітроаніліну. Вміст білка кон-
тролювали методом Лоурі —
Хартрі [7].
Дослідження білково-фрак-
ційного складу протеази С і
протеолітичної активності про-
водили методом електрофоре-
зу в ПААГ згідно з [8].
Іммобілізацію здійснювали,
попередньо розчиняючи 40 мг
ферментного препарату у 5 см3
натрій-фосфатного буферного
розчину (рН 7,4; 0,03 М). Отри-
маний розчин додавали при
постійному перемішуванні до
10 см3 гелю ламідану, після
цього однорідну суміш рівно-
мірно розподіляли на тканин-
ному покритті для формування
пов’язок, сушили при кімнатній
температурі та герметично па-
кували.
Для вивчення залежності
протеолітичної активності луж-
ної протеази від рН, однакові
за активністю проби іммобілі-
зованого та вільного ферменту
інкубували у відповідних буфер-
них розчинах (рН 4,0–10,0), з
подальшим визначенням актив-
ності. Вплив температури на про-
теолітичну активність вільного й
іммобілізованого ферменту ви-
вчали в діапазоні від 10 до 70 °С
при рН 7,4. Для вивчення тер-
мостабільності однакові за ак-
тивністю проби термостатува-
ли при 60 °С і визначали залиш-
кову активність з інтервалом
10–20 хв. Константи швидкості
інактивації обчислені з викори-
станням кінетичної схеми дисо-
ціативної термоінактивації для
іммобілізованого препарату і за
тангенсом кута нахилу прямої
графіка залежності натураль-
ного логарифма величини за-
лишкової активності від часу
методом лінійної регресії для
вільного.
Результати дослідження
та їх обговорення
З метою отримання рано-
вого покриття на текстильній
основі з ламіданом і протеолі-
тичним ферментом було необ-
хідно вивчити можливість ім-
мобілізації кількох протеаз, що
з успіхом застосовуються у ра-
новій та опіковій терапії в ме-
дицині, масові співвідношення
фермент : носій, фізико-хімічні
особливості функціонування от-
риманих препаратів, а також
УДК 615.355:577.152.34
І. І. Романовська, канд. хім. наук, доц.,
С. С. Декіна,
Н. Б. Мартинюк
ІММОБІЛІЗАЦІЯ ПРОТЕАЗИ С
У БІОГЕЛЬ ЛАМІДАН
Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, Одеса
ÄÎÑßÃÍÅÍÍß Á²ÎËÎò¯ òà ÌÅÄÈÖÈÍÈ26
можливість довготривалого збе-
рігання.
У табл. 1 наведені результа-
ти іммобілізації деяких проте-
аз у ламідан. Втрата активності
чотирьох із них пояснюється
високою концентрацією солей
у ламідані. Зміна масових спів-
відношень носій : фермент у
межах 1 : 0,02 – 1 : 1 не призве-
ла до позитивних результатів.
Виходячи з отриманих даних,
об’єктом для іммобілізації була
обрана протеаза С, яка прак-
тично повністю зберігала свою
протеолітичну активність при
масовому співвідношенні ламі-
дан : фермент 1 : 0,04.
Однак протеаза С являє со-
бою суміш кількох екзопротеї-
наз, тому цікаво було дослідити
білково-фракційний склад дано-
го препарату методом SDS-
електрофорезу білків у ПААГ
(рис. 1).
У електрофоретичному спект-
рі ферменту можна виділити три
основні зони (табл. 2). Основна
кількість матеріалу (49,42 %)
зосереджена в більш низькомо-
лекулярній частині спектра про-
теази з відносною електрофо-
ретичною рухливістю (Rf) у
15 % ПААГ від 0,40 до 0,58.
Дана частина спектра виглядає
як масивна, розтягнута, інтен-
сивно забарвлена пляма. Денси-
тометруванням виділені у цій
зоні 6 основних фракцій; 28,49 %
білків (фракції 1 і 2) цієї зони ма-
ють молекулярну масу < 10 кДа.
Молекулярна маса білків фрак-
ції 3 — (11,5±3,8) кДа (11,4 %
у загальному спектрі). Вміст
фракції 4 (М. м. 14,00±0,80)
становить 9,08 % у загальному
спектрі. Молекулярні маси
фракцій 5, 6 (М. м. 16,0–14,5)
становлять 12,05 %.
Далі середньорухлива час-
тина спектра, в якій ідентифі-
куються дві смуги зі значення-
ми Rf у 15 % ПААГ відповідно
0,37; 0,34. Відмічені смуги кіль-
кісно близькі одна одній. Пито-
мі частки в спектрі 10,60 і
9,43 %, молекулярні маси білків
18,5; 20,0 кДа відповідно.
У малорухливій частині спект-
ра ферменту ідентифікуються
п’ять смуг зі значеннями Rf у
15 % ПААГ відповідно 0,31;
0,28; 0,25; 0,22 і 0,16. Найбіль-
ша фракція білка у цій зоні —
Таблиця 1
Визначення протеолітичної активності протеаз,
іммобілізованих у ламідан
Фермент
Протеолітична активність, ПО/г Збереження
До іммобілізації
Після іммобі- активності,
лізації % від початкової
Папаїн 365,2 — 0
Трипсин 273,4 53,3 19,5
Терилітин 34,5 — 0
Лужна протеаза 83,7 — 0
Протеаза С 494,9 473,0 95,9
Таблиця 2
Білкові фракції препарату
протеази С, виявлені
SDS-електрофорезом
Моле-
Питома
№ кулярна
частка
фракції
Rf маса,
фракції
кДа
в спект-
рі, %
Швидка зона
1 0,58 Продук- 5,29
ти дегра-
дації
2 0,54 <10,0 11,60
3 0,49 11,5 11,40
4 0,46 14,0 9,08
5 0,40 14,5 20,48
6 0,43 16,0 12,05
Всі 0,58– <10,0– 49,42
фракції 0,40 16,0
зони
Середньорухлива зона
7 0,37 18,5 10,60
8 0,34 20,0 9,43
Всі 0,34– 18,0– 20,03
фракції 0,37 20,0
зони
Повільна зона
9 0,31 24,0 7,48
10 0,28 26,3 8,85
11 0,25 30,0 6,78
12 0,22 33,5 6,21
13 0,16 43,0 1,27
Всі 0,16– 24,0– 30,59
фракції 0,31 43,0
зони
№ 10. Кількісно вона становить
у загальному спектрі 8,85 % (М.
м. 26,3 кДа). Питомі частки та
молекулярні маси білків цих
фракцій такі: № 9 — 7,48 %,
(24,0±7,6) кДа; № 11 — 6,78 %,
(30,0±9,1) кДа; № 12 — 6,21 %,
(33,5± 9,8) кДа; № 13 — 1,27 %,
(43,0±9,8) кДа.
Таким чином, у спектрі про-
теази всього ідентифікуються
тринадцять білкових фракцій у
діапазоні молекулярних мас від
< 10 до 43 кДа. Молекулярні
маси основних білків 10–16 кДа
(50 %), 18–20 кДа (20 % усіх
білків) і 24–43 кДа (30 % білків).
Нативний електрофорез ви-
явив збереження протеолітич-
ної активності як у кислому
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Рис. 1. Електрофореграма препарату протеази С
¹ 2 (14) 2009 27
(рН=4,9) середовищі (знайдено
16 білкових фракцій з Rf=0,09–
0,9, з яких тільки 9 властива
протеолітична активність), так
і в лужному (рН=8,9) (знайде-
но 2 білкові фракції з Rf=0,05–
0,33).
У результаті іммобілізації
були отримані текстильні по-
криття, характеристики яких
наведені в табл. 3. При іммо-
білізації відзначене кількісне
включення ферменту і 96%-не
збереження протеолітичної ак-
тивності (475 од/г). Максимум
активності ферменту спостері-
гається через 1 год, і протягом
тривалого часу (24 год) вона
залишається постійною, ство-
рюючи тим самим пролонгова-
ну протеолітичну дію. Отрима-
ний іммобілізований препарат
стабільний при зберіганні в
умовах низьких температур (0–
4 °С) протягом 12 міс.
Реологічні властивості ламі-
дану з іммобілізованою про-
теазою С вивчали, визначаючи
відносну, питому, приведену і
кінематичну в’язкості розчинів
альгінату натрію (оскільки ла-
мідан на 35 % складається з
альгінату) й альгінату з протеа-
зою. В усіх випадках спостері-
гали значне зменшення в’яз-
кості розчину носія з фермен-
том, що може свідчити про ут-
ворення білкового асоціату по-
лімеру з білком і подальшої ком-
пактизації молекул.
При вивченні залежності
протеолітичної активності від
рН середовища в інтервалі 3,0–
12,0 (рис. 2, а) не спостерігало-
ся значного розширення рН-
профілю активності іммобілізо-
ваного ферменту порівняно з
вільним, однак слід зазначити,
що при вивченні рН-стабіль-
ності при рН 5,5 (37 °С) через
2 год інкубації активність іммо-
білізованої протеази становила
60 %, тимчасом як вільна не
функціонувала в даних умовах.
Така поведінка іммобілізовано-
го ферменту пояснюється ста-
білізувальною дією матриці.
Температурні залежності
протеолітичної активності про-
теази С наведені на рис. 2, б.
Порівняння констант термо-
інактивації вільної та іммобілі-
зованої протеази С, розрахова-
них за тангенсом кута нахилу
прямої графіка залежності на-
турального логарифма величин
залишкової активності препа-
ратів від часу, показало, що ім-
мобілізований фермент більш
стійкий при високих температу-
рах, ніж його вільна форма
(0,176 хв-1 і 0,209 хв-1 відповід-
но).
Таким чином, у результаті
проведеної роботи досліджено
120
100
80
60
40
20
0
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
а
0 2 4 6 8 10 12 14
б
0 20 40 60 80
pH Температура, °C
іммобілізована протеаза С вільна протеаза С
Рис. 2. Залежність активності (А) вільної та іммобілізованої протеази С:
а — від рН; б — від температури інкубаційного середовища
А, % від макс. А, % від макс.
Таблиця 3
Характеристики іммобілізованої у ламідан протеази С
Показники Результати
визначення
Протеолітична активність, 475,0±15,6
ПО/г ферменту
Вміст ферменту, мг/г препарату 40,0±2,7
Органолептичні характеристики Однорідні непрозорі еластичні
текстильні покриття
Площа, см2 36,0±2,1
Товщина, мм 3,5±0,3
Маса, г 0,83±0,05
Розчинність у воді, у фізіологічному Нерозчинні, набрякають
розчині
ÄÎÑßÃÍÅÍÍß Á²ÎËÎò¯ òà ÌÅÄÈÖÈÍÈ28
вплив препарату ламідан на
збереження активності при
іммобілізації протеолітичних
ферментів різного походження
(папаїн, трипсин, терилітин,
лужна протеаза, протеаза С),
методом електрофорезу вивче-
но кількісний склад білкових
фракцій препарату та визначе-
но їх молекулярні маси; розроб-
лено ефективний спосіб іммоб-
ілізації протеази С у біогель ла-
мідан з кількісним включенням
ферменту й отримано текстиль-
ні покриття пролонгованої дії,
рН- та термостабільні з 95%-м
збереженням протеолітичної
активності.
ЛІТЕРАТУРА
1. Олтаржевская Н. Д. Текстиль и
медицина. Перевязочные материалы
с пролонгированным лечебным дей-
ствием / Н. Д. Олтаржевская, М. А.
Коровина, Л. Б. Савилова // Российс-
кий химический журнал. — 2002. —
Т. 46, № 1. — С. 133-141.
2. Давиденко Т. И. Иммобилиза-
ция ферментных препаратов / Т. И.
Давиденко // Вісник ОНУ. Серія хімія.
— 2003. — Т. 8, № 4. — С. 135-147.
3. Юданова Т. Н. Современные
раневые покрытия : получение и свой-
ства (обзор) / Т. Н. Юданова, И. В.
Решетов // Хим.-фарм. журнал. —
2006. — Т. 40, № 2. — С. 24-31.
4. Шаповалов С. Г. Современные
раневые покрытия в комбустиологии
/ С. Г. Шаповалов // ФАРМиндекс-
Практик. — 2005. — Вып. 8. — С. 38-46.
5. Ермак И. М. Взаимодействие
бактериальных липополисахаридов с
белками и полисахаридами. Модифи-
кация физиологической активности
липополисахаридов : автореф. дис. ...
д-ра хим. наук / И. М. Ермак. — Вла-
дивосток, 2006.
6. Полыгалина Г. В. Определение
активности ферментов / Г. В. Полы-
галина, В. С. Чередниченко, Л. В. Ри-
марева. — М. : ДеЛи принт, 2003. —
385 с.
7. Hartree E. F. Determination of
protein: a modification of the Lowry
method that gives a linear photometric
response / E. F. Hartree // Anal. Bio-
chem. — 1972. — Vol. 48, N 1. —
Р. 422-427.
8. Духин С. С. Электрофорез / С. С.
Духин, Б. В. Дерягин. — М. : Наука,
1976. — 332 с.
УДК 615.355:577.152.34
І. І. Романовська, С. С. Декіна, Н. Б. Мартинюк
ІММОБІЛІЗАЦІЯ ПРОТЕАЗИ С У БІОГЕЛЬ ЛАМІ-
ДАН
Досліджено вплив препарату ламідан на збереження ак-
тивності при іммобілізації протеолітичних ферментів
різного походження (папаїн, трипсин, терилітин, лужна
протеаза, протеаза С). Методами SDS- і нативного елек-
трофорезу вивчено кількісний склад білкових фракцій пре-
парату протеази С, їх молекулярні маси й активність. Роз-
роблено ефективний спосіб іммобілізації протеази С у біо-
гель ламідан із кількісним включенням ферменту й отри-
мано текстильні покриття пролонгованої дії з 95%-м збе-
реженням протеолітичної активності.
Ключові слова: ранові покриття, ламідан, протеаза С,
електрофорез, іммобілізація.
UDC 615.355:577.152.34
I. I. Romanovska, S. S. Dekina, N. B. Martynyuk
PROTEASE C IMMOBILIZATION IN BIOGEL LAMI-
DAN
The influence of Lamidan preparation on activity preservation
with proteolytic enzymes of different origin (papain, trypsin,
terrilytin, alkalint protease, protease C) immobilization was
studied. Using the SDS- and native electrophoresis methods, the
quantitative composition of protease C preparation fractions was
investigated, their molecular masses and activity were de-
termined. An effective method of protease C immobilization in
biogel lamidan was developed, with quantitative entrapment of
enzyme; the textile coatings with prolonged action and 95%
retaining of proteolytic activity were obtained.
Key words: wound coatings, lamidan, protease C, electro-
phoresis, immobilization.
У випусках журналу:
Фундаментальні проблеми медицини та біології
Нові медико-біологічні технології
Оригінальні дослідження
Огляди
Інформація, хроніка, ювілеї
Передплата приймається
у будь-якому передплатному
пункті
Передплатний індекс 08205
ДОСЯГНЕННЯ
Á²ÎËÎò̄ òà ÌÅÄÈÖÈÍÈ
Ïåðåäïëà÷óéòå
³ ÷èòàéòå
æóðíàë
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-47410 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | XXXX-0102 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-24T15:11:54Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Національна академія наук України |
| record_format | dspace |
| spelling | Романовська, І.І. Декіна, С.С. Мартинюк, Н.Б. 2013-07-14T12:24:34Z 2013-07-14T12:24:34Z 2009 Іммобілізація протеази С у біогель ламідан / І.І. Романовська, С.С. Декіна, Н.Б. Мартинюк // Досягнення біології та медицини. — 2009. — № 2(14). — С. 25-28. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. XXXX-0102 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47410 615.355:577.152.34 Досліджено вплив препарату ламідан на збереження активності при іммобілізації протеолітичних ферментів різного походження (папаїн, трипсин, терилітин, лужна протеаза, протеаза С). Методами SDS- і нативного електрофорезу вивчено кількісний склад білковихфракцій препарату протеази С, їх молекулярні маси й активність. Розроблено ефективний спосіб іммобілізації протеази С у біогель ламідан із кількісним включенням ферменту й отримано текстильні покриття пролонгованої дії з 95%-м збереженням протеолітичної активності. The influence of Lamidan preparation on activity preservation with proteolytic enzymes of different origin (papain, trypsin, terrilytin, alkalint protease, protease C) immobilization was studied. Using the SDS- and native electrophoresis methods, the quantitative composition of protease C preparation fractions was investigated, their molecular masses and activity were determined. An effective method of protease C immobilization in biogel lamidan was developed, with quantitative entrapment of enzyme; the textile coatings with prolonged action and 95% retaining of proteolytic activity were obtained. uk Національна академія наук України Досягнення біології та медицини Фундаментальні проблеми медицини та біології Іммобілізація протеази С у біогель ламідан Protease C immobilization in biogel lamidan Article published earlier |
| spellingShingle | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан Романовська, І.І. Декіна, С.С. Мартинюк, Н.Б. Фундаментальні проблеми медицини та біології |
| title | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан |
| title_alt | Protease C immobilization in biogel lamidan |
| title_full | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан |
| title_fullStr | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан |
| title_full_unstemmed | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан |
| title_short | Іммобілізація протеази С у біогель ламідан |
| title_sort | іммобілізація протеази с у біогель ламідан |
| topic | Фундаментальні проблеми медицини та біології |
| topic_facet | Фундаментальні проблеми медицини та біології |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47410 |
| work_keys_str_mv | AT romanovsʹkaíí ímmobílízacíâproteazisubíogelʹlamídan AT dekínass ímmobílízacíâproteazisubíogelʹlamídan AT martinûknb ímmobílízacíâproteazisubíogelʹlamídan AT romanovsʹkaíí proteasecimmobilizationinbiogellamidan AT dekínass proteasecimmobilizationinbiogellamidan AT martinûknb proteasecimmobilizationinbiogellamidan |