Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli
Методом афінної адсорбційної хроматографії за допомогою імуносорбента на основі гаптену з гіперімунних антитоксичних сироваток крові кролів і молозива 1-го надою корів, вакцинованих кон’югатом ентеротоксинів Escherichia coli, виділені антитоксини. Отримані антитіла мали високу специфічність, що дає...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Досягнення біології та медицини |
|---|---|
| Datum: | 2011 |
| Hauptverfasser: | , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Ukrainisch |
| Veröffentlicht: |
Національна академія наук України
2011
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47480 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli / Ю.С. Сухарєв, С.О. Гужвинська // Досягнення біології та медицини. — 2011. — № 1(17). — С. 45-47. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859982889045721088 |
|---|---|
| author | Сухарєв, Ю.С. Гужвинська, С.О. |
| author_facet | Сухарєв, Ю.С. Гужвинська, С.О. |
| citation_txt | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli / Ю.С. Сухарєв, С.О. Гужвинська // Досягнення біології та медицини. — 2011. — № 1(17). — С. 45-47. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Досягнення біології та медицини |
| description | Методом афінної адсорбційної хроматографії за допомогою імуносорбента на основі гаптену з гіперімунних антитоксичних сироваток крові кролів і молозива
1-го надою корів, вакцинованих кон’югатом ентеротоксинів Escherichia coli, виділені антитоксини. Отримані антитіла мали високу специфічність, що дає підставу використовувати їх при конструюванні тест-систем для ідентифікації ентеротоксигенних E. coli, при діагностиці колібактеріозу сільськогосподарських тварин.
Using immunosorbent-based hapten, by affinity adsorption chromatography of hyperimmune antitoxic rabbit sera
and colostrum 1st milking cows vaccinated with the conjugate
enterotoxin Escherichia coli, antitoxins were isolated. Production of antibodies is highly specific, which gives reason
to use them in the design of test systems for identification
of enterotoxigenic E. coli, while diagnosing colibacteriosis
of agricultural animals.
|
| first_indexed | 2025-12-07T16:27:11Z |
| format | Article |
| fulltext |
¹ 1 (17) 2011 45
Найпоширенішим серед но-
вонароджених сільськогоспо-
дарських тварин інфекційних
захворювань, спричинюваних
Escherichia coli, є колібактеріоз,
що створює одну з найсерйоз-
ніших проблем для сучасної
ветеринарної медицини [1–3].
За даними світової літера-
тури, одним із головних кри-
теріїв оцінки патогенності збуд-
ника колібактеріозу є наяв-
ність у нього генів, детермі-
нуючих синтез ентеротокси-
нів: термостабільного (ST) і
термолабільного (LT), з екс-
пресією яких і пов’язаний роз-
виток діарейного синдрому при
цьому захворюванні [4].
Гіперімунні сироватки, що
застосовуються при колібак-
теріозі, на жаль, не містять у
повному обсязі комплекс спе-
цифічних антитоксичних ан-
титіл, які забезпечують якіс-
ний захист тварин від заражен-
ня токсигенними штамами киш-
кової палички, а також роб-
лять неможливим їх викорис-
тання при проведенні діагнос-
тичних досліджень [5; 6]. Зав-
дання ускладнюється тим, що
з двух видів ентеротоксинів
тільки LT має імуногенні влас-
тивості, тоді як ST — гаптен,
що робить неможливим одер-
жання імунізуючого препара-
ту на його основі.
Оскільки сьогодні в Україні
не виробляють протиколібак-
теріозні діагностичні сироват-
ки, які дозволяють ідентифіку-
вати збудника захворювання
за його основними факторами
патогенності [7], для їх отри-
мання пропонують використо-
вувати кон’югат LT/ST-ентеро-
токсинів E. coli, індукуючий
синтез антитоксичних антитіл,
специфічних як до LT, так і до
ST [8].
Більшість антисироваток,
призначених для вивчення пев-
них антигенів, потребують по-
переднього видалення антитіл із
небажаною специфічністю. Це
неминуче при використанні
навіть найчистішого імуногена,
якщо у нього є спільні епітопи
зі спорідненими молекулами.
Крім того, зазвичай сироватка
містить антитіла до контамі-
нуючих молекул, що знаходять-
ся в імунізуючому препараті, які
можуть бути присутніми в до-
сліджуваних зразках.
Метою досліджень було
одержання очищених антиток-
сичних антитіл до кон’югова-
них ентеротоксинів E. coli.
Матеріали та методи
дослідження
Новизна запропонованого
рішення полягала в тому, що
виділення специфічних антиток-
синів проводили методом афін-
ної адсорбційної хроматографії
за допомогою сконструйова-
ного імуносорбента на основі
гаптену з гіперімунних анти-
токсичних сироваток крові кро-
лів і молозива 1-го надою корів,
вакцинованих кон’югатом ен-
теротоксинів E. coli.
Результати дослідження
та їх обговорення
Приготування імуносорбен-
та на основі гаптену: 250 мг
ST розчиняли в 5 мл фосфат-
ного буфера, рН 7,0. Додава-
ли по краплях 1–2 мл 2,5%-го
водного розчину глутаральде-
гіду при перемішуванні, до по-
чатку утворення гелю. Витри-
ÍÍÍÍÍîâ³ ìåäèêî-á³îëîã³÷í³ òåõíîëî㳿îâ³ ìåäèêî-á³îëîã³÷í³ òåõíîëî㳿îâ³ ìåäèêî-á³îëîã³÷í³ òåõíîëî㳿îâ³ ìåäèêî-á³îëîã³÷í³ òåõíîëî㳿îâ³ ìåäèêî-á³îëîã³÷í³ òåõíîëî㳿
УДК 619:579.842.11
Ю. С. Сухарєв1, канд. біол. наук,
С. О. Гужвинська2, канд. с.-г. наук
ОТРИМАННЯ АНТИТОКСИЧНИХ АНТИТІЛ
ДО КОН’ЮГОВАНИХ ЕНТЕРОТОКСИНІВ
ESCHERICHIA COLI
1 Харківська державна зооветеринарна академія,
2 ННЦ «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини»
НААН України, Харків
ÄÎÑßÃÍÅÍÍß Á²ÎËÎò¯ òà ÌÅÄÈÖÈÍÈ46
мували гель при кімнатній тем-
пературі 3 год, а потім руйну-
вали його в гомогенізаторі Пот-
тера або продавлювали через
ін’єкційні голки різного діа-
метра, до утворення дрібних
частинок. Промивали гель ве-
ликою кількістю води, а потім
0,2 М фосфатним буфером,
рН 7,4; 0,1 М гліцин-HCl буфе-
ром, рН 3,2 і далі кілька разів
фосфатним буфером, рН 7,4.
Блокували залишені ділянки
зв’язування додаванням 1%-го
(вага/об’єм) розчину БСА у
фосфатному буфері в об’ємі,
рівному об’єму гелю; реакцію
проводили протягом 2 год при
кімнатній температурі або про-
тягом ночі при 4 °С.
Адсорбція антитоксичних
антитіл містила два етапи:
1. Інкубація імуносорбента з
гіперімунною сироваткою для
формування комплексу анти-
ген-антитіло.
2. Руйнування комплексу
імуносорбент-антитіло й елю-
ція антитіл.
Імуносорбент додавали до
антитоксичної гіперімунної
сироватки крові кролів і моло-
зива корів у співвідношенні:
10 мг вихідного антигену в
сорбенті на 1 мл антисироват-
ки. Суміш ретельно розтирали
і перемішували у магнітній мі-
шалці при кімнатній темпера-
турі протягом 1–2 год, потім
переносили в холодильник і за-
лишали на 12–15 год при 4 °С.
Після цього антисироватки
відокремлювали центрифугу-
ванням при 5000 g протягом
15 хв і контролювали повноту їх
виснаження в реакції пасивної
гемаглютинації (РПГА) за допо-
могою еритроцитів великої ро-
гатої худоби (ВРХ), сенсибілізо-
ваних ST-ентеротоксином E. coli.
Після видалення виснаже-
них антисироваток імуносор-
бент суспендували не менше 4
разів у 10-кратному об’ємі фі-
зіологічного розчину (рН 7,2),
із проміжним центрифугуван-
ням при 2000 g протягом 15 хв,
для відмивання від незв’язаних
антитіл.
Елюцію антитіл проводили
гліцин-HCl буфером (рН 2,5),
послідовно 3–4 рази, енергійно
перемішуючи осад із 2,5 мл бу-
фера при кімнатній темпера-
турі протягом 5–10 хв. Елюат
відокремлювали центрифугу-
ванням при 5000 g протягом
10 хв і відразу нейтралізували
до рН 7,0 сухим гідрокарбо-
натом натрію.
Після елюції імуносорбент
відмивали 3–4 рази в 10-крат-
ному об’ємі фізіологічного роз-
чину (рН 7,2), центрифугува-
ли при 2000 g протягом 15 хв
і консервували азидом натрію
(1:10 000), зберігали при тем-
пературі 4 °С. Імуносорбент
використовували від 3 до 5
разів. Вихід специфічних ан-
титіл, елюйованих з імуносор-
бента, сягав 60–90 %.
Адсорбція специфічних ан-
титіл із гіперімунних антиток-
сичних сироваток крові кролів
і молозива 1-го надою корів,
імунізованих кон’югатом ен-
теротоксинів E. coli, приводи-
ла до різкого зниження титру
антитіл у сироватках. Збіль-
шення кількості циклів вико-
ристання імуносорбента до 4–
5 разів повністю виснажувало
сироватки від антитоксичних
антитіл (табл. 1).
Специфічність антитіл ви-
значали у реакції дифузної пре-
ципітації (РДП) на предметно-
му склі в 0,85%-му агарі “Dif-
co”. У центральну лунку вно-
сили антитіла до кон’югату, а
в периферійні — 2-кратні роз-
ведення ST- і LT-ентероток-
синів. У контролі використо-
вували культуральний без-
клітинний фільтрат токсиген-
ного штаму Proteus vulgaris і
стерильне середовище культи-
вування токсигенних штамів
E. coli. Реакцію проводили при
кімнатній температурі у во-
логій камері протягом 48 год.
При позитивному результаті
реакції навколо лунок із гомо-
логічними антигенами з’явля-
лися зони преципітації у формі
концентричних кілець. Спе-
цифічними вважали антиток-
сини, що давали негативні ре-
зультати з контрольними анти-
генами (табл. 2 і 3).
Висновки
1. Методом афінної адсорб-
ційної хроматографії, викорис-
товуючи імуносорбент на ос-
Таблиця 1
Титр антитіл (реакція дифузної преципітації)
у виснажених за допомогою імуносорбента
гіперімунних антитоксичних сироватках крові кролів
і молозива корів, імунізованих кон’югатом ентеротоксинів E. coli
Вихідний титр Кратність Титр антитіл
Досліджувана антитіл викорис- у виснаженій
сироватка у сироватці тання сироватці Р
(X±s log2), сорбенту (Х±s log2),
n=4 n=4
Антитоксична крові 4,00±1,82 1 2,60±0,18 ≤0,05
кролів 2 1,30±0,21 ≤0,05
3 0,10±0,03 ≤0,05
4 — —
Молозива 1-го надою 6,66±0,69 1 5,10±1,26 ≤0,05
імунізованих корів 2 3,80±0,71 ≤0,05
3 2,30±0,09 ≤0,05
4 1,10±0,22 ≤0,05
5 — —
¹ 1 (17) 2011 47
ванні тест-систем для іден-
тифікації ентеротоксигенних
E. coli за їх основними факто-
рами патогенності, при діагно-
стиці колібактеріозу. Цей ме-
тод досить простий, не потре-
бує багато часу і забезпечує
ефективний вихід антитіл.
ЛІТЕРАТУРА
1. Олійник Л. В. Фактори патоген-
ності шиготоксинпродукуючих еше-
рихій, виділених від здорової вели-
кої рогатої худоби / Л. В. Олійник,
Л. В. Зоценко // Вісник Білоцерківсь-
кого ДАУ. — Біла Церква, 2004. –
№ 28. – С. 166–171.
2. Липин А. В. Диспепсия телят
/ А. В. Липин // Ветеринарный кон-
сультант. – 2002. – № 15. – С. 6–7.
3. Ломако Ю. В. Эпизоотический
мониторинг колибактериоза ново-
рожденных телят в Республике Бела-
русь / Ю. В. Ломако, Н. Н. Андросик
// Ветеринарная медицина Беларуси.
– 2002. – № 2. – С. 15– 17.
4. Wingate D. Guidelines for adults
on self-medication for the treatment of
acute diarrhea / D. Wingate, S. E. Phil-
lips, S. J. Lewis // Aliment. Pharmacol.
Ther. – 2001. – Vol. 15. – P. 773–782.
5. Искра И. Ю. Гипериммунные
сыворотки, их применение. Краткая
история / И. Ю. Искра // Сеть ветери-
нарных клиник «Алден-Вет». – 2007.
– С. 10–15.
6. Малов В. А. Антибактериальные
препараты в лечении острых кишеч-
ных (диарейных) заболеваний / В. А.
Малов, А. Н. Горобченко // Лечащий
врач. – 2006. – № 5. – С. 5–6.
7. Thielman N. M. Acute infectious
diarrhea / N. M. Thielman, R. L. Guer-
rant // N. Engl. J. Med. – 2004. –
Vol. 350 (1). – P. 38–47.
8. Сухарев Ю. С. Энтеротоксины
Escherichia coli (методы получения,
очистки, изготовление иммунизирую-
щих препаратов, антитоксических
сывороток и диагностических тест-
систем на их основе) / Ю. С. Сухарев.
– Харьков : Коллегиум, 2009. – 92 с.
Таблиця 2
Титр ентеротоксинів гомологічних і гетерологічних штамів E. coli,
що визначався у реакції дифузної преципітації
за допомогою антитіл до кон’югату,
адсорбованих з антитоксичної гіперімунної сироватки крові кролів
Антитіла до кон’югату ентеротоксинів,
адсорбовані з антитоксичної гіперімунної Значення
сироватки крові кролів (РДП)
Титр ST-ентеротоксину гомологічного штаму 3,76±0,30
(X±s log2), n=4
Титр ST-ентеротоксину гетерологічного штаму 2,65±0,27
(X±s log2), n=4
Титр LT-ентеротоксину гомологічного штаму 4,00±0,35
(X±s log2), n=4
Титр LT-ентеротоксину гетерологічного штаму 3,55±0,30
(X±s log2), n=4
Контроль — безклітинний фільтрат Proteus vulgaris —
Таблиця 3
Титр ентеротоксинів гомологічних і гетерологічних штамів E. coli,
що визначався у реакції дифузної преципітації
за допомогою антитіл до кон’югату,
адсорбованих з антитоксичної гіперімунної сироватки
молозива 1-го надою корів
Антитіла до кон’югату ентеротоксинів,
адсорбовані з антитоксичної гіперімунної Значення
сироватки молозива 1-го надою корів (РДП)
Титр ST-ентеротоксину гомологічного штаму 6,26±0,98
(X±s log2), n=4
Титр ST-ентеротоксину гетерологічного штаму 4,50±0,81
(X±s log2), n=4
Титр LT-ентеротоксину гомологічного штаму 6,67±0,53
(X±s log2), n=4
Титр LT-ентеротоксину гетерологічного штаму 6,00±0,81
(X±s log2), n=4
Контроль — безклітинний фільтрат Proteus vulgaris —
нові гаптену, з гіперімунних
антитоксичних сироваток крові
кролів і молозива 1-го надою
корів, вакцинованих кон’юга-
том ентеротоксинів E. coli, ви-
ділені антитоксини.
2. Отримані антитіла мали
специфічність як до LT-, так і
до ST-ентеротоксинів.
3. Висока специфічність ан-
титоксинів дає підставу вико-
ристовувати їх при конструю-
УДК 619:579.842.11
Ю. С. Сухарєв, С. О. Гужвинська
ОТРИМАННЯ АНТИТОКСИЧНИХ АНТИТІЛ
ДО КОН’ЮГОВАНИХ ЕНТЕРОТОКСИНІВ ESCHE-
RICHIA COLI
Методом афінної адсорбційної хроматографії за до-
помогою імуносорбента на основі гаптену з гіперімун-
них антитоксичних сироваток крові кролів і молозива
1-го надою корів, вакцинованих кон’югатом ентероток-
синів Escherichia coli, виділені антитоксини. Отримані ан-
титіла мали високу специфічність, що дає підставу вико-
ристовувати їх при конструюванні тест-систем для іден-
тифікації ентеротоксигенних E. coli, при діагностиці колі-
бактеріозу сільськогосподарських тварин.
Ключові слова: Escherichia coli, антитоксини, імуносор-
бенти, ентеротоксини, гіперімунні антитоксичні сироватки.
UDC 619:579.842.11
Yu. S. Sukharev, S. O. Guzhvinska
GETTING ANTITOXIC ANTIBODIES TO ENTERO-
TOXIN’S CONJUGATED ESCHERICHIA COLI
Using immunosorbent-based hapten, by affinity adsor-
ption chromatography of hyperimmune antitoxic rabbit sera
and colostrum 1st milking cows vaccinated with the conjugate
enterotoxin Escherichia coli, antitoxins were isolated. Pro-
duction of antibodies is highly specific, which gives reason
to use them in the design of test systems for identification
of enterotoxigenic E. coli, while diagnosing colibacteriosis
of agricultural animals.
Key words: Escherichia coli, antitoxins, immunosorbent,
enterotoxins, hyperimmune antitoxic serum conjugate.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-47480 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | XXXX-0102 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T16:27:11Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Національна академія наук України |
| record_format | dspace |
| spelling | Сухарєв, Ю.С. Гужвинська, С.О. 2013-07-14T20:16:28Z 2013-07-14T20:16:28Z 2011 Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli / Ю.С. Сухарєв, С.О. Гужвинська // Досягнення біології та медицини. — 2011. — № 1(17). — С. 45-47. — Бібліогр.: 8 назв. — укр. XXXX-0102 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47480 619:579.842.11 Методом афінної адсорбційної хроматографії за допомогою імуносорбента на основі гаптену з гіперімунних антитоксичних сироваток крові кролів і молозива 1-го надою корів, вакцинованих кон’югатом ентеротоксинів Escherichia coli, виділені антитоксини. Отримані антитіла мали високу специфічність, що дає підставу використовувати їх при конструюванні тест-систем для ідентифікації ентеротоксигенних E. coli, при діагностиці колібактеріозу сільськогосподарських тварин. Using immunosorbent-based hapten, by affinity adsorption chromatography of hyperimmune antitoxic rabbit sera and colostrum 1st milking cows vaccinated with the conjugate enterotoxin Escherichia coli, antitoxins were isolated. Production of antibodies is highly specific, which gives reason to use them in the design of test systems for identification of enterotoxigenic E. coli, while diagnosing colibacteriosis of agricultural animals. uk Національна академія наук України Досягнення біології та медицини Нові медико-біологічні технології Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli Getting antitoxic antibodies to enterotoxin’s conjugated Escherichia coli Article published earlier |
| spellingShingle | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli Сухарєв, Ю.С. Гужвинська, С.О. Нові медико-біологічні технології |
| title | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli |
| title_alt | Getting antitoxic antibodies to enterotoxin’s conjugated Escherichia coli |
| title_full | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli |
| title_fullStr | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli |
| title_full_unstemmed | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli |
| title_short | Отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів Escherichia coli |
| title_sort | отримання антитоксичних антитіл до кон’югованих ентеротоксинів escherichia coli |
| topic | Нові медико-біологічні технології |
| topic_facet | Нові медико-біологічні технології |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/47480 |
| work_keys_str_mv | AT suharêvûs otrimannâantitoksičnihantitíldokonûgovanihenterotoksinívescherichiacoli AT gužvinsʹkaso otrimannâantitoksičnihantitíldokonûgovanihenterotoksinívescherichiacoli AT suharêvûs gettingantitoxicantibodiestoenterotoxinsconjugatedescherichiacoli AT gužvinsʹkaso gettingantitoxicantibodiestoenterotoxinsconjugatedescherichiacoli |