Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora
For the first time, a method of multicomponent electrophoretic analysis for the research of Erwinia carotovora virus-like-particles (VLP) has been proposed. VLP have been obtained in the way of lysogen induction of E. carotovora. This method is also effective in the analysis of native spherical viri...
Saved in:
| Date: | 2008 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2008
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4950 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora / Е.Д. Крылова, Т.В. Иваница, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2008. — № 6. — С. 158-163. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859718883903012864 |
|---|---|
| author | Крылова, Е.Д. Иваница, Т.В. Товкач, Ф.И. |
| author_facet | Крылова, Е.Д. Иваница, Т.В. Товкач, Ф.И. |
| citation_txt | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora / Е.Д. Крылова, Т.В. Иваница, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2008. — № 6. — С. 158-163. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | For the first time, a method of multicomponent electrophoretic analysis for the research of Erwinia carotovora virus-like-particles (VLP) has been proposed. VLP have been obtained in the way of lysogen induction of E. carotovora. This method is also effective in the analysis of native spherical virions, capsids, and phage-tail-like bacteriocins. It has allowed us to separate and to identify macromolecular carotovoricins specific against Escherichia coli and E. carotovora.
|
| first_indexed | 2025-12-01T09:02:42Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 579.842.1/.2:578.26:578.89
© 2008
Е.Д. Крылова, Т. В. Иваница, Ф. И. Товкач
Применение многокомпонентного
электрофоретического анализа для исследования
вирусоподобных частиц Erwinia carotovora
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины И. Г. Скрипалем)
For the first time, a method of multicomponent electrophoretic analysis for the research of
Erwinia carotovora virus-like-particles (VLP) has been proposed. VLP have been obtained in the
way of lysogen induction of E. carotovora. This method is also effective in the analysis of native
spherical virions, capsids, and phage-tail-like bacteriocins. It has allowed us to separate and to
identify macromolecular carotovoricins specific against Escherichia coli and E. carotovora.
Ранее было показано [1, 2], что множественная дефектная лизогения может рассматри-
ваться в качестве одного из видовых признаков важной фитопатогенной бактерии Erwinia
carotovora. При лизогенной индукции ее клетки синтезируют отдельные компоненты фаго-
вого вириона — капсиды, базальные пластины и хвостовые отростки. Последние способны
убивать родственные бактерии, а также некоторые лабораторные штаммы Escherichia coli
и носят название макромолекулярных каротоворицинов — MCTV [1]. Большое разнообра-
зие, наряду с неспособностью формировать целостный вирион [1, 2], во многом затрудняет
исследование вирусоподобных частиц (VLP) эрвиний. В связи с этим их экологическое зна-
чение и, особенно, их роль в формировании патогенности E. carotovora до сих пор остаются
неизученными.
Представленная работа имеет отношение к начальному этапу решения указанной про-
блемы, цель которого состояла в использовании многокомпонентного электрофоретическо-
го анализа VLP в гелях агарозы.
В качестве источника вирусоподобных частиц использовали референсный штамм E. ca-
rotovora subsp. carotovora Ec153 = ATCC 15359 = NCPPB 1847. Биологическая активность
каротоворицинов в налидиксовых лизатах этой бактерии была определена с применением
двух индикаторных штаммов E. carotovora М2-4/50RI и E. coli C600 [1]. Для этого с мест
нанесения препаратов MCTV на двухслойные индикаторные чашки, после инкубации их
при оптимальных условиях роста индикаторных культур в течение 18 ч, вырезали агаровые
блочки размером 5×5×3 мм. Блочки помещали в стерильный буфер А на 5 ч при 4 ◦С. Да-
лее определяли титр выживших клеток и соотносили его с концентрацией газонных клеток,
которые не подвергались воздействию бактериоцинов. Киллерную активность бактериоци-
нов выражали через величину
KA = − ln
B
B 0
,
где B/B0 — выживаемость бактерий, B0 и B — концентрация клеток в блочке, отобранном
с бактериального газона и негативного пятна, формируемого MCTV, соответственно. В этом
случае одна единица активности соответствует 37% выживаемости или е−1 [3].
158 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №6
Для анализа VLP-частиц, содержащих ДНК, использовали метод, в котором их иден-
тификация основана на окраске этидий бромидом [4]. Для разделения любых VLP-час-
тиц, в том числе и свободных от нуклеиновых кислот, впервые использовали 0,8–1,0% гели
агарозы для изоэлектрофокусирования белков (Agarose for Isoelectric Focusing type VIII,
“Sigma”, A-4905) и стандартную трис-фосфатную буферную систему [5], без Na2ЭДТА. Го-
ризонтальный электрофорез проводили при напряженностях постоянного электрического
поля 6–11 В/см. Затем гелевую пластину переносили в емкость и выдерживали 30 мин
в фиксирующем растворе, содержащем сульфосалициловую и трихлоруксусную кислоты
в концентрациях 5 и 10% соответственно. Далее гель дважды отмывали по 15 мин в обес-
цвечивающем растворе: 35% этанола и 10% уксусной кислоты. После этого перенесенный
на стекло гель накрывали несколькими слоями фильтровальной бумаги и высушивали
под прессом 1 кг в течение 12–18 ч. Высушенный гель окрашивали 0,2% Coomassie Blue
R 250 (Blue R C. I., “Serva”, 42660) 5–10 мин и отмывали в обесцвечивающем растворе.
Гели фотографировали на пленку Микрат 300 или сканировали, получая их цифровые изо-
бражения.
Исследовали два типа вирусоподобных частиц E. carotovora Ес153. Первый тип VLP
получали методом ультрацентрифугирования [2], другой — в результате концентрирования
бактериальных лизатов и разделения частиц с помощью ионообменной хроматографии на
DEAE-целлюлозе (DEAE 23 SS, “Serva”, 09047). Через колонку диаметром 1,6 см и высотой
32,5 см, уравновешенную буфером NaP (0,02 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0), про-
пускали 700 мл лизата клеток, полученного после лизогенной индукции каротоворицинов
налидиксовой кислотой [1]. В составе каждой фракции определяли наличие белка и опа-
лесценции, характерной для растворов вирусных частиц. Киллерную активность фракций
устанавливали методом негативных зон, образуемых частицами MCTV на газонах чувстви-
тельных бактерий.
Для сравнительного анализа в опытах использовали препараты фагов MS2, FE44 [6]
и ZF40 [7] и MCTV EspZM-1 E. carotovora ZM-1 [1]. РНК-содержащий колифаг MS2 концент-
рировали и очищали, применяя один цикл дифференциального ультрацентрифyгирования
частиц в роторе SW41 при 35 000 об/мин в течение 90 мин. Концентрированные частицы
других фагов и MCTV получали методом осветления лизатов [8].
Величину подвижности (ЕМ) капсида типа С1 фага ZF40 [4] в геле агарозы условно при-
нимали за единицу. Таким образом, все VLP, зафиксированные в виде электрофоретических
полос в IEF-пластине, располагающиеся вблизи старта и выше полосы, соответствующей
капсиду 1, будут иметь значение меньше единицы. Напротив, те частицы, у которых этот
показатель больше единицы, будут отражены рефлексами, находящимися ниже такового
для капсида 1 (см. далее рис 1.)
Применение предлагаемого нами многокомпонентного электрофоретического анализа
оказалось эффективным не только в случае VLP E. carotovora, но и для изучения нативных
вирионов и промежуточных компонентов сборки фаговых частиц. Последние, как правило,
представляют собой капсиды, заполненные нуклеиновой кислотой или “пустые” прокапси-
ды [4].
Как видно из электрофореграмм, приведенных на рис. 1, а, вирусные частицы E. caro-
tovora Ес153 и ZM-1 и фаговые частицы характеризуются высокой подвижностью, которая
является удовлетворительной для их обнаружения и анализа. Опыты показывают, что иден-
тификация электрофоретических полос, соответствующих указанным макромолекулярным
структурам, является более надежной в IEF-гелях, чем в гелях агарозы, традиционно при-
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №6 159
Рис. 1. Электрофореграмма вирионов, вирусоподобных частиц, ДНК и РНК в гелях агарозы для изоэлект-
рофокусирования. Гели окрашены Coomassie Blue R 250 и этидий бромидом — 1 мкг/мл, 20 мин (б и в).
На рис. а и б препараты частиц: 1 — фага MS2, 2 — фага FE44, 3 — VLP E. carotovora ZM-1, 4 — VLP
E. carotovora Ес153, 5 — фага ZF40.
На рис. в — нуклеиновые кислоты, полученные из указанных препаратов с помощью 0,8% SDS.
Стрелками отмечены положение капсида С1 с электрофоретической подвижностью (ЕМ), принятой за еди-
ницу, и капсида С2 фага ZF40, а также положение полос ДНК и РНК
меняемой для разделения фрагментов ДНК. По нашим данным, это становится возможным
за счет полной отмывки фона после фиксирования и окраски геля (см. рис. 1, а).
Исследование вирусоподобных частиц штамма Ес153 подтвердило множественность мак-
ромолекулярных каротоворицинов, установленных ранее с помощью электронной микро-
скопии [2]. Препарты индуцированных частиц этой бактерии характеризуются наличием
трех беловых полос в геле IEF-агарозы (см. рис. 1, а, 4 ), которые располагаются выше мак-
ромолекулярной полосы капсида С1 фага ZF40 и имеют подвижности 0,44, 0,58 и 0,97. Два
типа частиц с низкими значениями ЕМ (0,44 и 0,58), вероятно, представляют собой фаговые
хвостовые отростки палочковидной формы, которые по данным электронной микроскопии
являются превалирующими компонентами препаратов VLP E. carotovora. Частицы третье-
го типа, по нашему мнению, имеют форму, отличную от палочковидной, так как их подви-
жность сравнима со сферическими частицами С1 диаметром 60 нм [7], а также с таковыми
фага MS2 — значение ЕМ равно 1,18 (см. рис. 1, а, 1 ). Не вызывает сомнений, что капсид
С2 с ЕМ 1,90 (см. рис. 1, а, 5 ) также имеет сферическую форму. Очевидно, что он, как
и два сферических образования фага MS2 с подвижностями 1,90 и 2,29 (см. рис. 1, а, 1 ),
160 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №6
Рис. 2. Электрофореграмма молекул ДНК (1 ) и ДНК-содержащих частиц (2 ) фага ZF40 (а) и VLP
E. carotovora Ес153 (б ). Стрелками отмечены положения вирионов фага ZF40 (Ph), ДНК и капсида С1
представляет собой промежуточные продукты сборки вириона, которые воспроизводимо
обнаруживаются с помощью предложенного метода.
Для того чтобы установить, какие частицы ассоциированы с нуклеиновой кислотой,
IEF-гели окрашивали этидий бромидом. Один из таких гелей представлен на рис. 1, б, из
которого видно, что в этом случае идентифицируются только ДНК-капсиды фагов FE44
и ZF40 (дорожки 2 и 5 ), а также частицы фага MS2, содержащие РНК (дорожка 1 ). При
этом подвижность полос ДНК совпадает с таковой соответствующих белковых полос. В слу-
чае VLP эрвиний дискретные ДНК-полосы не обнаружены. Вместо них материал, имею-
щий отношение к нуклеиновым кислотам, выявляется в виде флуоресцирующих треков
(см. рис. 1, б, 3, 4 ), которые слабо отмываются в воде или электрофоретическом буфере.
Тем не менее в этих двух образцах также содержатся частицы, ассоциированные с моле-
кулами ДНК. Их наличие подтверждает электрофореграмма, приведенная на рис. 1, в, на
которой представлено разделение РНК (дорожка 1 ) и ДНК (дорожки 2–5 ), полученных при
воздействии на частицы 0,8%-го додецилсульфата натрия (SDS) при 60 ◦С в течение 10 мин.
Как следует из рис. 1, скорость миграции нуклеиновых кислот в гелях IEF-агарозы яв-
ляется очень низкой по сравнению с таковой частиц вирусной природы. В связи с этим для
более убедительной демонстрации VLP, содержащих ДНК, мы использовали 0,8–0,9%-ные
гели агарозы NA (“Pharmacia”, 17–0554–03). Это позволило идентифицировать ДНК, ассо-
циированные с частицами, после обработки их SDS. Подвижность ДНК VLP Ес153 состав-
ляет 0,65 и совпадает с таковой контрольной ДНК фага ZF40, после разрушения капсида
С1 и нативных вирионов (рис. 2).
Таким образом, использование электрофореза в нативных системах IEF- и NA-агарозы
и соответствующих методов окраски белков и нуклеиновых кислот позволяют идентифи-
цировать и исследовать любые частицы вирусной природы, которые способны мигрировать
в данных гелях.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №6 161
Рис. 3. Среднее значение киллерной активности (КА) MCTV E. carotovora Eс153, распределенных в DEAE
целлюлозе, по отношению к E. coli C 600 (1 ) и E. carotovora М2–4/50RI (2 )
Рис. 4. Идентификация коли- и каротовораспецифичных MCTV с помощью IEF-геля.
1, 2, 4, 5 и 6 соответствуют фракциям 25, 26, 29, 30 и 31, которые отмечены на рис. 3. Контрольный обра-
зец (3 ) получен методом дифференциального центрифугирования. Стрелками отмечены колиспецифичные
MCTV (Есо) и каротоворицины, убивающие E. carotovora (Есс)
Далее эффективность предложенного анализа вирусных частиц апробировали с помо-
щью разделения множественных VLP E. carotovora Ес153 на колонке с DEAE-целлюлозой.
Для того чтобы соотнести киллерную активность с типом и формой частиц, ее количест-
венно определяли в тех фракциях, которые были способны убивать индикаторные штам-
мы E. carotovora M2–4/50RI и E. coli C 600. В результате опытов установлено наличие
двух пиков киллерной активности (рис. 3). Колиспецифичные MCTV типа фаговых хво-
стовых отростков были обнаружены во фракциях 22–28, полученных после промывки ко-
лонки 0,2 М раствором NaCl. Максимум этого пика, соответствующий фракции 23, выражен
не вполне четко, что, скорее всего, свидетельствует о двух типах близкородственных кил-
леров, лизирующих клетки E. coli. Это предположение подтверждает электрофореграмма
(см. рис. 1, а, 4 ), отражающая наличие двух белковых полос с близкими значениями ЕМ —
0,44 и 0,58. Эти же полосы характерны и для отдельных фракций 25 и 26 (рис. 4, 2, 3 ).
Каротоворицины третьего типа убивают исключительно штаммы E. carotovora. В срав-
нении с колиспецифичными фаговыми отростками они имеют повышенное сродство к
DEAE-целлюлозе, обладают большей подвижностью в гелях IEF-агарозы (см. рис. 1, а, 4 ;
рис. 4, 5, 6, 7 ) и, очевидно, имеют другую форму частиц. Все три типа этих MCTV не содер-
162 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №6
жат ДНК. ДНК-содержащие VLP E. carotovora Ес153 предстоит детально изучить с помо-
щью колоночной хроматографии, нативной белковой системы с применением IEF-агарозы
и электронной микроскопии.
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют об эффективности предло-
женного многокомпонентного электрофоретического анализа вирусоподобных частиц, по-
лучаемых путем лизогенной индукции клеток E. carotovora. Его применение позволит уста-
новить роль VLP в экологии этой важной фитопатогенной бактерии.
1. Товкач Ф.И. Биологические свойства и классификация бактериоцинов Erwinia carotovora // Микро-
биология. – 1998. – 67, № 6. – С. 767–774.
2. Товкач Ф.И. Дефектная лизогения Erwinia carotovora // Там же. – 2002. – 71, № 3. – С. 359–367.
3. Товкач Ф.И., Мороз С.Н., Гвоздяк Р.И. Изучение адсобционных рецепторов макромолекулярных
бактериоцинов Erwinia carotovora subsp. carotovora // Микробиол. журн. – 2002. – 64, № 3. – С. 20–26.
4. Иваница Т.В., Товкач Ф.И. Предварительная характеристика ДНК-содержащих вирусоподобных
частиц Erwinia carotovora // Там же. – 2007. – 69, № 3. – С. 19–26.
5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирова-
ние: Пер. с англ. – Москва: Мир, 1984. – 480 с.
6. Товкач Ф.И. Молекулярно-биологические свойства вирулентного бактериофага FE44 // Доп. НАН
України. – 2002. – № 6. – С. 176–179.
7. Товкач Ф.И. Структурная организация частиц и рестрикционный анализ ДНК умеренного бактери-
офага ZF40 Erwinia carotovora // Микробиология. – 2002. – 71, № 1. – С. 75–81.
8. Девис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий. – Москва: Мир, 1984. – 176 с.
Поступило в редакцию 24.09.2007Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
УДК 547.313.2:581.13:581.143:582.542.11
© 2008
М. М. Щербатюк, Т.П. Маменко
Особливостi видiлення етилену мiжвузлями кукурудзи
(Zea mays L.)
(Представлено академiком НАН України К. М. Ситником)
The intensity of ethylene emission in growing maize stem internodes is studied. The most
intensive ethylene biosynthesis in maize internodes is ascertained for the early stages of deve-
lopment (5 leaves), and the least intensive one — for older stages (a flowering of panicle). So,
during the maize development, the high and low levels of ethylene accumulation are typical of,
respectively, rapidly growing top internodes and lower internodes.
Рiст стебла злакiв здiйснюється за рахунок подiлу та розтягування клiтин у зонах iнтерка-
лярного росту мiжвузлiв (рис. 1). На раннiх перiодах розвитку стебло росте дуже повiльно.
У цей час його рiст забезпечується виключно подiлом клiтин. На пiзнiших етапах — подiлом
та розтягуванням, внаслiдок чого швидкiсть росту значно зростає [1]. Звичайно регуляцiя
ростових процесiв рослин здiйснюється шляхом формування концентрацiйних градiєнтiв
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №6 163
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-4950 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-01T09:02:42Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Крылова, Е.Д. Иваница, Т.В. Товкач, Ф.И. 2009-12-29T13:48:06Z 2009-12-29T13:48:06Z 2008 Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora / Е.Д. Крылова, Т.В. Иваница, Ф.И. Товкач // Доп. НАН України. — 2008. — № 6. — С. 158-163. — Бібліогр.: 8 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4950 579.842.1/.2:578.26:578.89 For the first time, a method of multicomponent electrophoretic analysis for the research of Erwinia carotovora virus-like-particles (VLP) has been proposed. VLP have been obtained in the way of lysogen induction of E. carotovora. This method is also effective in the analysis of native spherical virions, capsids, and phage-tail-like bacteriocins. It has allowed us to separate and to identify macromolecular carotovoricins specific against Escherichia coli and E. carotovora. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біологія Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora Article published earlier |
| spellingShingle | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora Крылова, Е.Д. Иваница, Т.В. Товкач, Ф.И. Біологія |
| title | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora |
| title_full | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora |
| title_fullStr | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora |
| title_full_unstemmed | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora |
| title_short | Применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц Erwinia carotovora |
| title_sort | применение многокомпонентного электрофоретического анализа для исследования вирусоподобных частиц erwinia carotovora |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/4950 |
| work_keys_str_mv | AT krylovaed primeneniemnogokomponentnogoélektroforetičeskogoanalizadlâissledovaniâvirusopodobnyhčasticerwiniacarotovora AT ivanicatv primeneniemnogokomponentnogoélektroforetičeskogoanalizadlâissledovaniâvirusopodobnyhčasticerwiniacarotovora AT tovkačfi primeneniemnogokomponentnogoélektroforetičeskogoanalizadlâissledovaniâvirusopodobnyhčasticerwiniacarotovora |