Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования
Проведено сравнительное исследование стероидогенных потенциалов биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования. Биологический материал тестисов в виде криоконсервированной суспензии клеток интерстиция (СКИ) обладает большей способностью к синтезу и секреции половых сте...
Збережено в:
| Дата: | 2009 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5389 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования / А.В. Пахомов, Г.А. Божок, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 63-70. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860130072232460288 |
|---|---|
| author | Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Гурина, Т.М. |
| author_facet | Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Гурина, Т.М. |
| citation_txt | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования / А.В. Пахомов, Г.А. Божок, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 63-70. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | Проведено сравнительное исследование стероидогенных потенциалов биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования. Биологический материал тестисов в виде криоконсервированной суспензии клеток интерстиция (СКИ) обладает большей способностью к синтезу и секреции половых стероидов по сравнению с фрагментами тестисов. Использование разработанного нами способа криоконсервирования для СКИ приводит к лучшей сохранности стероидогенных клеток по сравнению с существующими аналогичными режимами.
Проведено порівняльне дослідження стероїдогенних потенціалів біологічного матеріалу тестисів статевозрілих щурів після кріоконсервування. Біологічний матеріал тестисів у вигляді кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію (СКІ) має більшу здатність до синтезу і секреції статевих стероїдів у порівнянні з фрагментами тестисів. Використання розробленого нами способу кріоконсерування для СКІ дозволяє краще зберігати стероїдогенні клітини у порівнянні з існуючими аналогічними режимами.
Comparative study of steroidogenic potentials of biological material of testes of mature rats after cryopreservation was performed. Biological materials of tsetse as cryopreserved suspension of interstitial cells has higher ability to synthesize and secret sexual steroids if compared with testes fragments. Use of designed by us cryopreservation method for interstitial cell suspension (ICS) results in higher integrity of steroidogenic cells if compared with existing analogous regimens.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:44:01Z |
| format | Article |
| fulltext |
63 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
УДК 57.043:591.463.2.085
À.Â. ÏÀÕÎÌÎÂ*, Ã.À. ÁÎÆÎÊ, Ò.Ì. ÃÓÐÈÍÀ
Èññëåäîâàíèå ñòåðîèäîãåííîãî ïîòåíöèàëà
áèîëîãè÷åñêîãî ìàòåðèàëà òåñòèñîâ ïîëîâîçðåëûõ
êðûñ ïîñëå êðèîêîíñåðâèðîâàíèÿ
UDC 57.043:591.463.2.085
A.V. PAKHOMOV*, G.A. BOZHOK, T.M. GURINA
Study of Steroidogenic Potential of Post-Thaw
Biological Material of Mature Rats’ Testes
Проведено сравнительное исследование стероидогенных потенциалов биологического материала тестисов половозрелых
крыс после криоконсервирования. Биологический материал тестисов в виде криоконсервированной суспензии клеток
интерстиция (СКИ) обладает большей способностью к синтезу и секреции половых стероидов по сравнению с фрагментами
тестисов. Использование разработанного нами способа криоконсервирования для СКИ приводит к лучшей сохранности
стероидогенных клеток по сравнению с существующими аналогичными режимами.
Ключевые слова: тестостерон, клетки Лейдига, скорость охлаждения, 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, переохлаждение.
Проведено порівняльне дослідження стероїдогенних потенціалів біологічного матеріалу тестисів статевозрілих щурів
після кріоконсервування. Біологічний матеріал тестисів у вигляді кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію (СКІ) має
більшу здатність до синтезу і секреції статевих стероїдів у порівнянні з фрагментами тестисів. Використання розробленого
нами способу кріоконсерування для СКІ дозволяє краще зберігати стероїдогенні клітини у порівнянні з існуючими аналогічними
режимами.
Ключові слова: тестостерон, клітини Лейдига, швидкість охолодження, 3β-гідроксистероїддегідрогеназа, переохолодження.
Comparative study of steroidogenic potentials of biological material of testes of mature rats after cryopreservation was performed.
Biological materials of tsetse as cryopreserved suspension of interstitial cells has higher ability to synthesize and secret sexual steroids
if compared with testes fragments. Use of designed by us cryopreservation method for interstitial cell suspension (ICS) results in
higher integrity of steroidogenic cells if compared with existing analogous regimens.
Keywords: testosterone, Leydig cells, cooling rate, 3β-hydroxysteroid dehydrogenase, overcooling.
* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:
óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38
(057) 373-30-07, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:
cryo@online.kharkov.ua
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57
373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû
ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ
Трансплантация ткани и клеток мужских гонад –
один из способов решения проблем андрогенной
недостаточности, которая развивается как следст-
вие различных патологических состояний организ-
ма или длительной гормональной терапии. Однако
для эффективного использования данного метода
необходимо создать банк полноценного донорского
материала, обеспечивающего его долгосрочное
хранение.
Криоконсервирование мужских гонад позволяет
сохранить значительный стероидогенный потен-
циал биологического материала. В [1, 7–9] опи-
саны программы для замораживания фрагментов
фетальной тестикулярной ткани человека, фраг-
ментов и клеток тестисов взрослых крыс. В качест-
ве криопротектора использовали ДМСО. Образцы
охлаждали со скоростью 1–2°С/мин до темпе-
ратур –40...–70°С с последующим их погружением
в жидкий азот. Медленное охлаждение в этих
режимах позволяет сохранить морфологическую
структуру тканей тестисов.
Transplantation of tissue and cells of male gonads
is one of the ways to solve the problem of androgenic
insufficiency, developing as the result of different
pathological states of an organism or lasting hormonal
therapy. However for efficient use of this method it is
necessary to establish bank of valuable donor’s ma-
terial, providing its long-term storage.
Cryopreservation of male gonads enables to pre-
serve significant steroidogenic potential of biological
material. The reports [1, 7–9] describe the freezing
protocols for the fragments of fetal human testicular
tissue, fragments and cells of adult rats’ testes. DMSO
was used as cryoprotectant. The samples were cooled
with the rate of 1–2°C/min down to the temperatures
of –40...–70°C with following their plunging into liquid
nitrogen. Slow cooling with these regimens allows the
preservation of morphological structure of testes tis-
sue.
However the same cooling rates used for testes
cryopreservation as a cell suspension from our point
of view do not provide the same good outcome on bio-
64 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
Однако аналогичные скорости охлаждения, ис-
пользуемые для криоконсервирования тестисов в
виде клеточной суспензии, по нашему мнению, не
обеспечивают таких же высоких результатов по
сохранности биоматериала, которые получены для
фрагментов. При криоконсервировании клеточ-
ного материала необходимо учесть физические
процессы, происходящие в охлаждаемой системе
при различных скоростях охлаждения в разных
температурных диапазонах для создания наиболее
оптимального режима, позволяющего сохранить
стероидогенные клетки.
На основе данных о сохранности стероидпро-
дуцирующих клеток в зависимости от скорости их
охлаждения в разных температурных интервалах
нами была разработана программа замораживания
биологического материала тестисов взрослых
крыс в виде суспензии клеток интерстиция (СКИ)
[1]. Программа замораживания включала началь-
ную скорость охлаждения 1–2°С/мин, процедуру
программного снятия переохлаждения, последу-
ющее использование более высоких скоростей
(15–20°С/мин) при охлаждении до –40°С и в ин-
тервале температур от –40 до –70°С (20–25°С/мин)
с дальнейшим погружением образцов в жидкий
азот.
Цель работы – исследовать влияние различных
режимов замораживания на сохранность стероидо-
генных свойств СКИ и фрагментов тестисов (ФТ).
В соответствии с поставленной целью предпо-
лагалось решить следующие задачи. Исследовать
сохранность стероидогенных свойств (продукция
тестостерона, 3β-гидроксистероиддегидрогеназ-
ная активность, наличие липидных включений)
СКИ и ФТ, которые были криоконсервированы со
скоростью 1–2°С/мин до –40 и –70°С с последу-
ющим погружением в жидкий азот. На основании
этих данных сделать вывод о влиянии на сохран-
ность материала медленного охлаждения и разной
конечной температуры охлаждения образца перед
погружением в жидкий азот. Дать сравнительную
оценку стероидогенных свойств биологического
материала тестисов в виде СКИ и ФТ.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Эксперименты проведены в соответствии с
“Общими принципами экспериментов на живот-
ных”, одобренными II Национальным конгрессом
по биоэтике (20.09.04 г., Киев) и согласованными с
положениями “Европейской конвенции о защите
позвоночных животных, используемых для экспе-
риментальных и других научных целей” (Страс-
бург, 1985).
Материал тестисов получали от половозрелых
животных в возрасте 4–5 месяцев. После экстирпа-
ции семенники освобождали от оболочки, измель-
material preservation, if compared with those obtained
for the fragments. During cryopreservation of cells it
is necessary to take into account physical processes
occurring in the system under cooling at different
cooling rates within various temperature ranges for
the creation of the most optimal regimens enabling to
preserve steroidogenic cells.
Based on the data about the integrity of steroid-
producing cells depending on their cooling rates within
various temperature intervals we have designed the
freezing protocol for testes biological material of mature
rats as interstitial cell suspension (ICS) [1]. Freezing
program comprised initial cooling rate of 1–2°C, the
procedure of programmable overcooling dismissal,
following use of higher rates (15–20°C) during cooling
down to –40°C and within the temperature interval
from –40 down to –70°C (20–25°C/min) with following
immersion of samples in liquid nitrogen.
The research aim is to study the effect of different
freezing regimens on integrity of steroidogenic pro-
perties of ICS and testes fragments (TFs).
In accordance with the set goal there was proposed
to solve the following tasks: to study the integrity of
steroidogenic properties (production of testosterone,
3β-hydroxysteroiddehydrogenase activity, presence of
lipid inclusions) of ICS and TFs, cryopreserved with
the rate of 1–2°C/min down to –40 and –70°C with
following plunging into liquid nitrogen; based on these
data to conclude on the effect of slow cooling and dif-
ferent final temperature of sample cooling on material
integrity prior to submerging into liquid nitrogen; to
comparatively estimate the steroidogenic properties of
biological material of testes as ICS and FTs.
Materials and methods
The experiments were performed in accordance
with “General principles of experiments in animals”,
approved by the 2nd National Congress on bioethics
(20.09.04, Kiev) and coordinated with the statements
of European convention for the “Protection of verteb-
rate animals used for experimental and other scientific
purposes” (Strasbourg, 1985).
The material of testes was obtained from mature
animals aged from 4 to 5 months. After extirpation the
coating was removed from testes, afterwards they
were disintegrated into fragments by 0.5–1 mm3,
washed-out from blood with medium 199 and used as
the TFs.
For ICS obtaining the testes after extirpation were
subjected to mild treatment with collagenase (4 mg/
ml) in medium 199 with 20 mM Hepes (pH 7.4) at 32–
34°C and constant mixing for 15 min. Prior to
separation of the resulted suspension of cells in sucrose
gradient density the primary sedimentation of tubular
structures was performed, afterwards the fraction of
cells with the density of 1.127–1.176 g/cm3 was
65 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
чали на фрагменты 0,5–1 мм3, промывали от крови
средой 199 и использовали как ФТ.
Для получения СКИ тестисы после экстирпации
подвергали мягкой обработке коллагеназой (4 мг/мл)
на среде 199 с 20 мМ HEPES (рН 7,4) при 32–34°C
и непрерывном встряхивании на протяжении 15 мин.
Перед разделением полученной суспензии клеток
в градиенте плотности сахарозы осуществляли пер-
вичное осаждение тубулярных структур, после
чего была получена фракция клеток плотностью
1,127–1,176 г/см3. Клетки отмывали средой 199 с
20 мМ HEPES (рН 7,4) для дальнейшего использо-
вания в экспериментах.
Показатели ФТ и СКИ на данном этапе иссле-
дований принимали за контрольные (интактный
контроль).
При криоконсервировании ФТ и СКИ использо-
вали раствор криопротектора ДМСО, который
готовили на среде 199 с 20 мМ HEPES и в соот-
ношении 1:1 добавляли к клеткам для достижения
конечной концентрации 10%. Объем замораживае-
мого образца составлял 1 мл.
После добавления раствора криопротектора
образцы охлаждали на программном заморажи-
вателе “Cryoson” (Германия) в криоампулах
(“Nunс”, США). Регистрацию программы замора-
живания проводили при помощи установленной в
криоампулы медь-константановой термопары и
самописца типа “Endim” 622.01.
При криоконсервировании образцов использо-
вали следующие программы:
– программа 1 (для ФТ и СКИ): от 22–24 до –
40°С образцы охлаждали со скоростью 1–2°С/мин.
После достижения температуры –40°С образцы
погружали в жидкий азот;
– программа 2 (для СКИ): от 22–24 до –70°С
образцы охлаждали со скоростью 1–2°С/мин. Пос-
ле достижения температуры –70°С образцы погру-
жали в жидкий азот;
– программа 3 (для СКИ): образцы охлаждали
от 22–24°С со скоростью 1–2°С/мин. После прог-
раммного снятия переохлаждения, предусмотрен-
ного возможностями замораживателя “Cryoson”,
скорость охлаждения до –40°С была 15–20°С/мин, а
в интервале температур от –40 до –70°С – 20–
25°С/мин.
Отогревали образцы на водяной бане при темпе-
ратуре 32–34°С. ДМСО удаляли при постепенном
снижении его концентрации в среде.
Гистохимическое окрашивание на выявление
активности 3β-гидроксистероиддегидрогеназы
(3β-ГСД) проводили методом, описанным в [6].
Для этого 2–4×106 клеток инкубировались в 2,5 мл
забуференного физиологического раствора (рН 7,4),
содержащего 0,2 мг/мл нитросинего тетразолия,
obtained. The cells were washed out with medium 199
with 20 mM HEPES (pH 7.4) for further use in expe-
riments.
Characteristics of TFs and ICS on this stage of
investigations were considered as control values (intact
control).
During cryopreservation of TFs and ICS there was
used the solution of DMSO cryoprotectant, prepared
with medium 199 with 20 mM HEPES and in 1:1 ratio
was added to cells for achieving the final concentration
of 10%. The volume of the samples under freezing
was 1ml.
After adding the cryoprotective solution the samples
were cooled with programmable freezer “Cryoson”
(Germany) in cryovials (“Nunc”, USA). The recording
of freezing program was performed using the copper-
constantan thermocouple adjusted in cryovials and with
recording device of the “Endim” 622.01 type.
During cryopreservation of the samples the follo-
wing protocols were used:
– program 1 (for TFs and ICS): from 22–24 down
to –40°C the samples were cooled with the rate of 1–
2°C/min. When achieving –40°C the samples were
plunged into liquid nitrogen;
– program 2 (for ICS): from 22–24 down to –70°C
the samples were cooled with the rate of 1–2°C/min.
When achieving –70°C the samples were plunged into
liquid nitrogen;
– program 3 (for ICS): the samples were cooled
from 22–24°C with the rate of 1–2°C/min. After
programmable dismissal of overcooling foreseen with
the capacities of “Cryoson” freezer, the cooling arte
down to –40°C was 15–20°C/min and 20–25°C/min
within temperature interval from –40 down to –70°C.
The samples were thawed on water bath at 32–
34°C. DMSO was removed by stepwise reduction of
its concentration in the medium.
Histochemical staining on revealing the activity of
3b-hydroxysteroiddehydrogenase (3β-HSD) was per-
formed with the method described [6]. For this aim 2–
4×106 cells were incubated in 2.5 ml buffered physio-
logical solution (pH 7.4), containing 0.2 mg/ml nitro-
blue tetrasoliuim, 1 mg/ml NAD and 0.12 mg/ml dehyd-
roepiandrosterone for 90 min at 32–34°C. Positively
stained cells (HSD(+)-cells) had violet staining on
recovered tetrasolium.
Staining with nile red (NR) was performed on the
method reported [10]. The dye (1 g) was diluted in
1 ml DMSO. Prior to staining the solution of dye was
diluted by 1:100 with physiological solution with
phosphate buffer (pH 7.4) and 15ml of this solution
was added to 1 ml of physiological solution with
phosphate buffer. The recording of fluorescence was
done at excitation wavelength 455–500 nm with
fluorescent microscope “Olympus IX 71”.
66 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
1 мг/мл НАД и 0,12 мг/мл дегидроэпиандростерона
в течение 90 мин при 32–34°C. Позитивно окра-
шенные клетки (ГСД(+)-клетки) имели фиолетовую
окраску восстановленного тетразолия.
Окрашивание нильским красным (НК) прово-
дили по методу, описанному в [10]. В 1 мл ДМСО
растворяли 1 мг красителя. Перед окрашиванием
раствор красителя разводили 1:100 физиологичес-
ким раствором на фосфатном буфере (рН 7,4) и
добавляли 15 мкл данного раствора к 1 мл клеточной
суспензии (1–2×106 кл/мл). Окрашивали 10 мин при
32–34°C. После окрашивания клетки однократно
отмывали от избытка красителя 1 мл физиологи-
ческого раствора на фосфатном буфере. Регистра-
цию флюоресценции проводили при длине волны
возбуждения 455–500 нм при помощи флюорес-
центного микроскопа “Olympus IX 71”.
Для определения общей сохранности клеток,
сохранности ГСД(+)-клеток и клеток, включающих
НК (НК(+)-клетки) во ФТ, их дополнительно обра-
батывали коллагеназой и разделяли полученную
суспензию клеток в градиенте плотности сахарозы
аналогично методу получения СКИ.
Сохранность клеток контролировали методом
суправитального окрашивания трипановым синим.
Общую сохранность клеток после замораживания
по различным программам, а также сохранность
ГСД(+)- и НК(+)-клеток выражали в процентах по
отношению к количеству этих клеток в образцах
до замораживания.
Базальную и стимулированную секрецию тесто-
стерона исследовали путем инкубации СКИ и ФТ
в среде 199 с 20 мМ HEPES в течение часа при
32–34°C. Как стимулятор стероидогенеза использо-
вали хорионический гонадотропин (ХГ) в концент-
рации 1 МЕ/мл. Содержание тестостерона измеря-
ли в инкубационной среде радиоиммунологическим
методом при помощи наборов “РИА СТ-тесто-
стерон” и рассчитывали на количество клеток в об-
разцах до замораживания.
Статистическую обработку результатов прово-
дили с использованием однофакторного диспер-
сионного анализа и t-критерия Стьюдента с по-
мощью пакета программ Excel.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Фрагменты тестисов состоят из двух основных
компонентов: семенных канальцев и расположен-
ного между ними комплекса интерстициальных
клеток, включающих клетки Лейдига, ответствен-
ные за синтез мужских половых стероидных гормо-
нов.
3β-ГСД представляет собой один из ключевых
ферментов в реакциях превращения эфиров холес-
терина, находящихся в клетке в виде липидных ка-
пель, в тестостерон. Таким образом, 3β-ГСД и нали-
For determining the total integrity of cells, integrity
of HSD(+)-cells and those including NR (NR(+)-cells)
into TFs, they were additionally treated with colla-
genase and the resulted suspension of cells was centri-
fuged in sucrose density gradient similar to the method
of ICS obtaining.
Cell integrity was controlled with the method of
supravital staining with trypane blue. Total integrity of
cells after freezing on various programs in respect to
the number of these cells in the samples prior to freezing
was expressed in percentage.
Basal and stimulated secretions of testosterone
were studied by means of incubation of ICS and TFs
in the medium 199 with 20 mM HEPES for an hour at
32–34°C. Chorionic gonadotropin (CG) under 1 IU/ml
concentration was used as steroidogenesis stimulator.
Testosterone content was measured in incubation
medium with radio immunological method using the
kits “RIA ST-testosterone” (Russia) and counted per
the number of cells in samples prior to freezing.
Statistical processing of the results was performed
using single factor dispersion analysis and Student’s t-
criterion with Excel software.
Results and discussion
Testes fragments consist of two main components:
seminiferous tubules and located between them
complex of interstitial cells, including Leydig cells
responsible for the synthesis of male sexual steroid
hormones. 3β-HSD represents one of key enzymes in
the reactions of transformation of the cholesterol ethers,
being in a cell as lipid drops, into testosterone. Thus
3β-HSD and presence of significant amount of lipid
inclusions are the characteristics of steroid-production
of cells in testes. To reveal the activity of 3β-HSD the
histochemical reaction with nitroblue tetrasolium [6] is
used and for the visualization of lipid inclusions the
NR staining is used [10].
Fig. 1, a shows that total inetgrity of cells, the one
of HSD(+)- and NR(+)-cells sharply decreased after
cryopreservation of ICS and TFs using program 1. In
these samples the number of HSD(+)-cells reduced
almost down to 30% and the integrity of NR(+)-cells
did not exceed 10%.
The ability to basal and stimulated steroidogenesis
of ICS and TFs, cryopreserved with program 1, was
also reduced if compared with non-frozen samples
(Fig. 1, b). testosterone content in incubation medium
of TFs after CG secretion stimulation made about 23 ±
0.33 nmol/1012 cells, that was more than twice lower
than prior to freezing (49 ± 1.0 nmol/1012 cells) and
48 ± 5 nmol/1012 cells in incubation medium of ICS,
that was also twice lower the level found prior to freezing
(976 nmol/1012 cells). This testified to a significant cryo-
damage of steroidogenic cells, developing during
cryopreservation with program 1.
67
0
10
20
30
40
50
60
70
0
20
40
60
80
100
120
Рис. 1. Сохранность клеток ФТ и СКИ после криоконсервирования с использованием программы 1 (а): – общая
сохранность; – сохранность ГСД(+)-клеток; – сохранность НК(+)-клеток. Cпособность к базальному и
стимулированному стероидогенезу (б): – базальная секреция; – стимулированная секреция. 1 – нативных ФТ;
2 – нативной СКИ; 3 – криоконсервированных ФТ; 4 – криоконсервированной СКИ; * – различия достоверны
относительно нативных ФТ (р<0,05); # – различия достоверны относительно нативной СКИ (р < 0,05).
Fig. 1. Integrity of TFs and ICS cells after cryopreservation using program 1 (a): – total integrity; – integrity of
HSD(+)-cells; – integrity of NR(+)-cells. Ability to basal and stimulated steroidogenesis (b): – basal secretion; –
stimulated secretion. 1 – native TF; 2 – native ICS; 3 – cryopreserved TFs; 4 – cryopreserved ICS; * – differences are
statistically significant versus native TFs (p< 0.05); # – differences are statistically significant versus native ICS (p < 0.05).
С
ох
ра
нн
ос
ть
, %
In
te
gr
ity
, %
ФТ
TFs
СКИ
ICS
1 2 3 4
Те
ст
ос
те
ро
н,
нм
ол
ь/
10
12
к
л
Te
st
os
te
ro
ne
,
nm
ol
/1
012
c
el
ls
чие значительного количества липидных вклю-
чений являются характеристикой стероидпроду-
цирующих клеток в тестисах. Для выявления ак-
тивности 3β-ГСД используют гистохимическую
реакцию с нитросиним тетразолием [6], а для ви-
зуализации липидных включений – краситель НК
[10].
Как видно из рис. 1, общая сохранность клеток,
сохранность ГСД(+)- и НК(+)-клеток резко снижа-
лись после криоконсервирования СКИ и ФТ с ис-
пользованием программы 1. В этих образцах
уменьшалось количество ГСД(+)-клеток практи-
чески до 30%, а сохранность НК(+)-клеток не превы-
шала 10%.
Способность к базальному и стимулированному
стероидогенезу СКИ и ФТ, криоконсервированных
по программе 1, также снижалась по сравнению с
незамороженными образцами (рис. 1, б). Содер-
жание тестостерона в среде инкубации ФТ после
стимуляции секреции ХГ составляло около 23 ±
0,3 нмоль/1012 клеток, что более чем в 2 раза ниже
до замораживания (49 ± 1,0 нмоль/1012 клеток), а в
среде инкубации СКИ – 48 ± 5,0 нмоль/1012 клеток,
что было также в 2 раза ниже уровня, установлен-
ного до замораживания (97 ± 6,0 нмоль/1012 клеток).
Это свидетельствовало о значительном криопов-
реждении стероидогенных клеток, которые разви-
ваются при криоконсервировании по программе 1.
Использование относительно медленных режи-
мов охлаждения (1–2°С/мин) до –40°С для фраг-
ментов тестисов было отмечено в [2, 5]. Это оправ-
дано в связи с возможностью негативного влияния
температурных градиентов и напряжений, вызван-
Use of relatively slow cooling regimens (1–2°C/min)
down to –40°C for testes fragments was reported else-
where [2, 5]. This is feasible due to possible negative
effect of temperature gradients and tensions caused
with irregular ice propagation in a sample during
freezing that impairs the structure of fragment tissue
and reduces the cell integrity in them.
In [7, 9] there was shown the use of slow cooling
at cryopreservation of Leydig cells, herewith their
viability made 75%. The samples were cooled with
constant rate of 1°C/min down to –70°C, afterwards
they were plunged into liquid nitrogen. In our expe-
riments the application of program 2 for ICS did not
result in the increase of total cell integrity, the one of
HSD(+)- and NR(+)-cells if compared to the prog-
ram 1 (Fig. 2, a). Basal and stimulated steroidogenesis
as well statistically and significantly did not differ from
the indices of testosterone level, found at program 1
realization (Fig. 2, b).
Use of programs 1 and 2 during ICS cryopreser-
vation did not result in satisfactory integrity and func-
tional activity of steroidogenic Leydig cells in ICS.
When investigating the effect of overcooling and
cooling rate within different temperature intervals on
3β-HSD activity and integrity of cells having lipid
inclusions as well as their hormone production we have
proposed the cooling protocols on program 3[1], com-
prising programmable dismissal of overcooling, fore-
seen with the capacities of “Cryoson” freezer and
higher if compared with programs 1 and 2 cooling rates
down to –70°C.
The result of using program 3 (Fig. 3, a) was an
increased integrity of cells with 3β-HSD activity by
a a б b
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
*
#
68 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
20
40
60
80
100
120
Рис. 2. Сохранность клеток СКИ (а): – общая сохран-
ность; – сохранность ГСД (+)-клеток; – сохранность
НК (+)-клеток. Базальная и стимулированная секреция
тестостерона СКИ (б) после криоконсервирования с
использованием различных программ охлаждения: –
базальная секреция; – стимулированная секреция; * –
различия достоверны относительно данных для програм-
мы 1 (р<0,05).
Fig. 2. Integrity of ICS cells (a): – total integrity; –
integrity of HSD(+)-cells; – integrity of NR(+)-cells.
Ability to basal and stimulated secretion of testosterone
by ICS (b) after cryopreservation using different cooling
protocols. – basal secretion; – stimulated secretion;
* – differences are statistically significant comparing to the
data for progam 1 (p< 0.05).
1 2 3
Программы охлаждения
Cooling program
Программы охлаждения
Cooling program
Контроль 1 2 3
Control
С
ох
ра
нн
ос
ть
, %
In
te
gr
ity
, %
Те
ст
ос
те
ро
н,
нм
ол
ь/
10
12
к
л
Te
st
os
te
ro
ne
,
nm
ol
/1
012
c
el
ls
ных неравномерным расширением льда в образце
в процессе замораживания, что нарушает струк-
туру тканей фрагмента и снижает сохранность
клеток в них.
В [7, 9] было показано использование медлен-
ного охлаждения и при криоконсервировании клеток
Лейдига, при этом их жизнеспособность составля-
ла 75%. Образцы охлаждали с постоянной скорос-
тью 1°С/мин до температуры –70°С, затем погру-
жали в жидкий азот. В наших экспериментах
использование программы 2 для СКИ не приводило
к увеличению общей сохранности клеток, сохран-
ности ГСД(+)- и НК(+)-клеток по сравнению с
программой 1 (рис. 2, а). Базальный и стимулиро-
ванный стероидогенез также достоверно не отли-
чался от показателей уровня тестостерона, установ-
ленных при реализации программы 1 (рис. 2, б).
Использование при криоконсервировании СКИ
программ 1 и 2 не приводит к удовлетворительной
сохранности и функциональной активности сте-
роидогенных клеток Лейдига в СКИ.
При исследовании влияния переохлаждения и
скорости охлаждения в различных температурных
интервалах на 3β-ГСД активность и сохранность
клеток, имеющих липидные включения, а также
их гормонопродукцию нами был предложен режим
охлаждения по программе 3 [1], включающий
программное снятие переохлаждения, предусмот-
ренное возможностями замораживателя “Cryoson”,
и более высокие по сравнению с программами 1 и
2 скорости охлаждения до температуры –70°С.
Результатом использования программы 3
(рис. 2, а) было увеличение сохранности клеток,
обладающих 3β-ГСД активностью, на 50% (с 33
до 83%) и клеток, имеющих липидные включения
(до 32%), по сравнению с программами 1 и 2. Также
значительно была сохранена способность к базаль-
ному и стимулированному стероидогенезу (рис.
2, б). Содержание тестостерона в среде инкубации
СКИ, криоконсервированной по программе 3, при
стимуляции ХГ составляло 75 ± 6 нмоль/1012 клеток
(77% от нативного контроля).
Таким образом, использование криоконсерви-
рованного клеточного материала тестисов в виде
СКИ, криоконсервированной по программе 3, как
источника стероидогенных гормонов более пред-
почтительно, чем фрагментов ткани.
Сравнивая стероидогенные свойства биоло-
гического материала тестисов в виде криоконсер-
вированной по программе 3 СКИ с результатами
использования аналогичных режимов охлаждения
[7, 9], нами была показана лучшая сохранность
клеток, ответственных за синтез тестостерона.
В результате снятия переохлаждения и повы-
шения скорости охлаждения удалось получить
50% (from 33 to 83%) and the cells having lipid inclu-
sions (up to 32%) if compared with programs 1 and 2.
As well there was significantly preserved the ability to
basal and stimulated steroidogenesis (Fig 2, b). Content
of testosterone in incubation medium of ICS cryopre-
served on program 3 with the CG stimulation made
75 ± 6 nmol/1012 cells (77% versus native control).
Thus, use of cryopreserved cell material of testes
as ICS (program 3) as the source of steroidogenic hor-
a a
б b
69 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
криоконсервированный материал СКИ с 83% сох-
ранностью клеток, обладающих активностью
3β-ГСД, которая является одним из маркеров кле-
ток Лейдига. Этот показатель значительно превы-
шает результат, полученный при использовании
скорости охлаждения 1–2°С/мин (75%) [9].
Нами была получена 77%-я сохранность способ-
ности клеток к стимулированной секреции тесто-
стерона в ответ на тропную стимуляцию, что не
уступает аналогичным показателям, приведенным
в [7, 9].
Использование в программе 3 более низких
концентраций ДМСО (10%) по сравнению с 15%
ДМСО в [7, 9] является преимуществом, так как
ДМСО в более высоких концентрациях может
проявлять токсические эффекты [3, 4].
Âûâîäû
Использование скорости охлаждения 1–2°С/мин,
неконтролируемой скорости охлаждения в темпера-
турном диапазоне от –40 до –70°С при криоконсер-
вировании биологического материала тестисов в
виде СКИ и ФТ приводит к гибели значительного
количества стероидогенных клеток и снижению
способности материала к продукции тестостерона.
Программное снятие переохлаждения и увели-
чение скорости охлаждения до 15–20°С/мин при
охлаждении до –40°С, а в диапазоне температур
–40...–70°С до 20–25°С/мин (программа 3) при-
водит к увеличению сохранности криоконсервиро-
ванных стероидогенных клеток на 50% и их способ-
ности к базальному и стимулированному синтезу
и секреции тестостерона на 26%.
Биологический материал тестисов в виде СКИ,
криоконсервированный с использованием програм-
мы 3, обладает большей способностью к синтезу
и секреции половых стероидов по сравнению с
нативными и криоконсервированными ФТ (75 ± 6,0
против 49 ± 0,5 и 23 ± 0,3 нмоль/1012 клеток ).
mones was more preferable if compared to the tissue
fragments.
When comparing the steroidogenic properties of
biological material of testes as the cryopreserved on
program 3 ICS with the results we have shown higher
cell integrity responsible for testosterone synthesis.
As a result of dismissal of overcooling and increase
of cooling rate it was managed to obtain cryopreserved
material of ICS with 83% integrity of cells having 3β-
HSD activity, which is one of the markers of Leydig
cells. This index significantly exceeds the result
reported [9] when using cooling rate of 1–2°C/min
(75%).
We have obtained 77% integrity of cell capability
to testosterone stimulated secretion in response to
tropic stimulation, and this fact is in coordination with
the same parameters reported [7, 9].
Use of lower DMSO concentrations (10%) if com-
pared with 15% DMSO in program 3 is the advantage,
since DMSO under higher concentrations may manifest
toxic effects [3, 4].
Conclusions
Use of cooling rate of 1–2°C/min, non-controlled
cooling rate within temperature range from –40 down
to –70°C during cryopreservation of biological material
of testes as ICS and TFs results in the death of
significant number of steroidogenic cells and reduced
ability of the material to produce testosterone.
Programmable removal of overcooling and rise in
cooling rate up to 15–20°C/min during cooking down
to –40°C and within the temperature range from –
40... –70°C up to 20–25°C/min (program 3) leads to
the increase of the survival of cryopreserved
steroidogenic cells by 50% and their ability to basal
and stimulated synthesis and secretion of testosterone
by 26%.
Biological materials of testes as ICS cryopreserved
using the program 3 possesses higher ability to syn-
thesize and secret sexual steroids if compared with
native and cryopreserved TFs (75.0 ± 5.0 vs. 49 ± 0.5
and 23 ± 0.33 nmol/1012 cells).
Литература
Гурина Т.М., Пахомов А.В., Божок Г.А. Влияние скорости
охлаждения в различных температурных интервалах на
сохранность стероидогенного потенциала суспензии
интерстициальных клеток семенников взрослых крыс //
Пробл. криобиологии.– 2007.– Т. 17, №4.– С. 394–402.
Керос В.А. Кріоконсервування фетотестикулярної
тканини людини: Автореф. дис. ... канд. мед. наук.– Харків,
2001.– 19 с.
Пахомов А.В., Божок Г.А., Бондаренко Т.П. Влияние
диметилсульфоксида на базальную и стимулированную
секрецию тестостерона клетками интерстиция семен-
ника новорожденных поросят: Матеріали ІХ з’їзду укр.
біохім. товариства // Укр. біохім. журнал.– 2006.– Т. 2.–
С. 18.
Пушкарь Н.С. Криопротекторы.– Киев: Наук. думка.–
1978.– 201 с.
References
Gurina T.M., Pakhomov A.V., Bozhok G.A. Effect of cooling
rate under various temperature intervals on survival of
steroidogenic potential of suspension of interstitial cells of
adult rat’s testes// Problems of Сryobiology.– 2007.– Vol.17,
N4.– P. 394–402.
Keros V.A. Cryopreservation of human fetotesticular tissue:
Author’s abstract of the thesis of Candidate of Medical
Sciences.– Kharkiv, 2001.– 19 p.
Pakhomov A.V., Bozhok G.A., Bondarenko T.P. Effect of
dimethyl sulfoxide on basal and stimulated secretion of
testosterone with interstitial cells of newborn piglets // Ukr.
Biokhem. Zhurn.– 2006.– Vol. 2.– P. 18.
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
70 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Салех Дж. М. Абу Жаяб. Коррекция андрогенной функции
у экспериментальных животных путем трансплантации
нативных и криоконсервированных органных культур
семенников: Дис. …канд. мед. наук. – Киев, 2004. – 129 с.
Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig
cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 1995. – Vol. 53, N1–6.–
P. 61–68.
Chen G.R., Ge R.S., Lin H. et al. Development of a cryo-
preservation protocol for Leydig cells // Hum. Reprod. – 2007.–
Vol. 22, N8. – P. 2160–2168.
Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing cryopre-
servation of human testicular tissue: comparison of protocols
with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide as cryo-
protectants // Hum. Reprod.– 2005.– Vol. 20, N6.– P. 1676–
1687.
Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig
cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.–
1994.– Vol. 26, N3.– P. 145–147.
Tchoukalova Y.D., Harteneck D.A., Karwoski R.A. et al. A
quick, reliable, and automated method for fat cell sizing // J.
Lipid Res.– 2003.– Vol. 44, N9.– P. 1795–1801.
Поступила 02.09.2008
Рецензент В.Е. Чадаев
Pushkar N.S. Cryoprotectants.– Kiev: Naukova Dumka.–
1978.– 201 p.
Salekh J. M. Abu Jajab. Correction of androgen function in
experimental animals by transplantation of native and
cryopreserved organ cultures of testes: Author’s abstract
of the thesis of Candidate of Medical Sciences.– Kiev, 2004.–
129 p.
Benton L., Shan L.X., Hardy M.P. Differentiation of adult Leydig
cells // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. – 1995. – Vol. 53, N1–6.–
P. 61–68.
Chen G.R., Ge R.S., Lin H. et al. Development of a cryo-
preservation protocol for Leydig cells // Hum. Reprod. – 2007.–
Vol. 22, N8. – P. 2160–2168.
Keros V., Rosenlund B., Hultenby K. et al. Optimizing
cryopreservation of human testicular tissue: comparison of
protocols with glycerol, propanediol and dimethylsulphoxide
as cryoprotectants // Hum. Reprod.– 2005.– Vol. 20, N6.–
P. 1676–1687.
Tai J., Tze W.J., Johnson H.W. Cryopreservation of rat Leydig
cells for in vitro and in vivo studies // Horm. Metab. Res.–
1994.– Vol. 26, N3.– P. 145–147.
Tchoukalova Y.D., Harteneck D.A., Karwoski R.A. et al. A
quick, reliable, and automated method for fat cell sizing // J.
Lipid Res.– 2003.– Vol. 44, N9.– P. 1795–1801.
Accepted in 02.09.2008
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-5389 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:44:01Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Гурина, Т.М. 2010-01-18T14:39:22Z 2010-01-18T14:39:22Z 2009 Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования / А.В. Пахомов, Г.А. Божок, Т.М. Гурина // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 63-70. — Бібліогр.: 10 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5389 57.043:591.463.2.085 Проведено сравнительное исследование стероидогенных потенциалов биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования. Биологический материал тестисов в виде криоконсервированной суспензии клеток интерстиция (СКИ) обладает большей способностью к синтезу и секреции половых стероидов по сравнению с фрагментами тестисов. Использование разработанного нами способа криоконсервирования для СКИ приводит к лучшей сохранности стероидогенных клеток по сравнению с существующими аналогичными режимами. Проведено порівняльне дослідження стероїдогенних потенціалів біологічного матеріалу тестисів статевозрілих щурів після кріоконсервування. Біологічний матеріал тестисів у вигляді кріоконсервованої суспензії клітин інтерстицію (СКІ) має більшу здатність до синтезу і секреції статевих стероїдів у порівнянні з фрагментами тестисів. Використання розробленого нами способу кріоконсерування для СКІ дозволяє краще зберігати стероїдогенні клітини у порівнянні з існуючими аналогічними режимами. Comparative study of steroidogenic potentials of biological material of testes of mature rats after cryopreservation was performed. Biological materials of tsetse as cryopreserved suspension of interstitial cells has higher ability to synthesize and secret sexual steroids if compared with testes fragments. Use of designed by us cryopreservation method for interstitial cell suspension (ICS) results in higher integrity of steroidogenic cells if compared with existing analogous regimens. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Криоконсервирование биообъектов Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования Study of Steroidogenic Potential of Post-Thaw Biological Material of Mature Rats’ Testes Article published earlier |
| spellingShingle | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования Пахомов, А.В. Божок, Г.А. Гурина, Т.М. Криоконсервирование биообъектов |
| title | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| title_alt | Study of Steroidogenic Potential of Post-Thaw Biological Material of Mature Rats’ Testes |
| title_full | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| title_fullStr | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| title_short | Исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| title_sort | исследование стероидогенного потенциала биологического материала тестисов половозрелых крыс после криоконсервирования |
| topic | Криоконсервирование биообъектов |
| topic_facet | Криоконсервирование биообъектов |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5389 |
| work_keys_str_mv | AT pahomovav issledovaniesteroidogennogopotencialabiologičeskogomaterialatestisovpolovozrelyhkrysposlekriokonservirovaniâ AT božokga issledovaniesteroidogennogopotencialabiologičeskogomaterialatestisovpolovozrelyhkrysposlekriokonservirovaniâ AT gurinatm issledovaniesteroidogennogopotencialabiologičeskogomaterialatestisovpolovozrelyhkrysposlekriokonservirovaniâ AT pahomovav studyofsteroidogenicpotentialofpostthawbiologicalmaterialofmatureratstestes AT božokga studyofsteroidogenicpotentialofpostthawbiologicalmaterialofmatureratstestes AT gurinatm studyofsteroidogenicpotentialofpostthawbiologicalmaterialofmatureratstestes |