Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения
Показано, что взаимосвязь между трансформацией формы клеток, осмотической устойчивостью, а также степенью повреждения клеток в процессе гипотермического хранения (ГХ) обусловлено ионной силой и рН среды эквилибрации. Степень повреждения клеток в неэлектролитных средах в процессе ГХ достоверно ниже,...
Збережено в:
| Дата: | 2009 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Russian |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5396 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения / Н.В. Репин, В.В. Кирошка, О.И. Головко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 10-17. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-5396 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Репин, Н.В. Кирошка, В.В. Головко, О.И. 2010-01-18T14:42:28Z 2010-01-18T14:42:28Z 2009 Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения / Н.В. Репин, В.В. Кирошка, О.И. Головко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 10-17. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5396 612.111:612.592:541.1 Показано, что взаимосвязь между трансформацией формы клеток, осмотической устойчивостью, а также степенью повреждения клеток в процессе гипотермического хранения (ГХ) обусловлено ионной силой и рН среды эквилибрации. Степень повреждения клеток в неэлектролитных средах в процессе ГХ достоверно ниже, а их осмотическая устойчивость выше по сравнению с электролитными. Наиболее устойчивой к действию факторов среды является эхиноцитарная форма эритроцитов. Показано, що взаємозв’язок між трансформацією форми клітин, осмотичною стійкістю, а також ступенем ушкодження клітин у процесі гіпотермічного зберігання (ГЗ) обумовлений іонною силою та рН середовища еквілібрації. Ступінь ушкодження клітин у неелектролітних середовищах при ГЗ достовірно нижче, а їх осмотична стійкість вище у порівнянні з електролітними. Найбільш стійкою до дії факторів середовища є ехіноцитарна форма еритроцитів. It has been shown that the observed relationship between transformation of cell shape and their osmotic resistance as well as damage degree during hypothermal storage (HS) is stipulated by ionic strength and equilibration medium pH. The degree of cell damage in non-electrolyte media during HS is statistically lower and their osmotic resistance is higher if compared with electrolyte ones. The most resistant to the factors of medium is echinocyte shape of erythrocytes. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения Analysis of Morphology of Erythrocytes and Their Resistance Depending on pH and Ionic Strength under Hypothermal Storage Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| spellingShingle |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения Репин, Н.В. Кирошка, В.В. Головко, О.И. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| title_full |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| title_fullStr |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| title_full_unstemmed |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| title_sort |
анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рн и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения |
| author |
Репин, Н.В. Кирошка, В.В. Головко, О.И. |
| author_facet |
Репин, Н.В. Кирошка, В.В. Головко, О.И. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2009 |
| language |
Russian |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Analysis of Morphology of Erythrocytes and Their Resistance Depending on pH and Ionic Strength under Hypothermal Storage |
| description |
Показано, что взаимосвязь между трансформацией формы клеток, осмотической устойчивостью, а также степенью повреждения клеток в процессе гипотермического хранения (ГХ) обусловлено ионной силой и рН среды эквилибрации. Степень повреждения клеток в неэлектролитных средах в процессе ГХ достоверно ниже, а их осмотическая устойчивость выше по сравнению с электролитными. Наиболее устойчивой к действию факторов среды является эхиноцитарная форма эритроцитов.
Показано, що взаємозв’язок між трансформацією форми клітин, осмотичною стійкістю, а також ступенем ушкодження клітин у процесі гіпотермічного зберігання (ГЗ) обумовлений іонною силою та рН середовища еквілібрації. Ступінь ушкодження клітин у неелектролітних середовищах при ГЗ достовірно нижче, а їх осмотична стійкість вище у порівнянні з електролітними. Найбільш стійкою до дії факторів середовища є ехіноцитарна форма еритроцитів.
It has been shown that the observed relationship between transformation of cell shape and their osmotic resistance as well as damage degree during hypothermal storage (HS) is stipulated by ionic strength and equilibration medium pH. The degree of cell damage in non-electrolyte media during HS is statistically lower and their osmotic resistance is higher if compared with electrolyte ones. The most resistant to the factors of medium is echinocyte shape of erythrocytes.
|
| issn |
0233-7673 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5396 |
| citation_txt |
Анализ морфологии эритроцитов и их устойчивости в зависимости от рН и ионной силы среды в условиях гипотермического хранения / Н.В. Репин, В.В. Кирошка, О.И. Головко // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 10-17. — Бібліогр.: 11 назв. — рос. |
| work_keys_str_mv |
AT repinnv analizmorfologiiéritrocitoviihustoičivostivzavisimostiotrniionnoisilysredyvusloviâhgipotermičeskogohraneniâ AT kiroškavv analizmorfologiiéritrocitoviihustoičivostivzavisimostiotrniionnoisilysredyvusloviâhgipotermičeskogohraneniâ AT golovkooi analizmorfologiiéritrocitoviihustoičivostivzavisimostiotrniionnoisilysredyvusloviâhgipotermičeskogohraneniâ AT repinnv analysisofmorphologyoferythrocytesandtheirresistancedependingonphandionicstrengthunderhypothermalstorage AT kiroškavv analysisofmorphologyoferythrocytesandtheirresistancedependingonphandionicstrengthunderhypothermalstorage AT golovkooi analysisofmorphologyoferythrocytesandtheirresistancedependingonphandionicstrengthunderhypothermalstorage |
| first_indexed |
2025-11-25T22:42:20Z |
| last_indexed |
2025-11-25T22:42:20Z |
| _version_ |
1850569127640432640 |
| fulltext |
10 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
УДК 612.111:612.592:541.1
Í.Â. ÐÅÏÈÍ1*, Â.Â. ÊÈÐÎØÊÀ1, Î.È. ÃÎËÎÂÊÎ2
Àíàëèç ìîðôîëîãèè ýðèòðîöèòîâ è èõ óñòîé÷èâîñòè
â çàâèñèìîñòè îò ðÍ è èîííîé ñèëû ñðåäû
â óñëîâèÿõ ãèïîòåðìè÷åñêîãî õðàíåíèÿ
UDC 612.111:612.592:541.1
N.V. REPIN1*, V.V. KIROSHKA1, O.I. GOLOVKO2
Analysis of Morphology of Erythrocytes and Their
Resistance Depending on pH and Ionic
Strength Under Hypothermal Storage
Показано, что взаимосвязь между трансформацией формы клеток, осмотической устойчивостью, а также степенью
повреждения клеток в процессе гипотермического хранения (ГХ) обусловлено ионной силой и рН среды эквилибрации.
Степень повреждения клеток в неэлектролитных средах в процессе ГХ достоверно ниже, а их осмотическая устойчивость
выше по сравнению с электролитными. Наиболее устойчивой к действию факторов среды является эхиноцитарная форма
эритроцитов.
Ключевые слова: эритроциты, гипотермическое хранение, ионная сила, рН среды.
Показано, що взаємозв’язок між трансформацією форми клітин, осмотичною стійкістю, а також ступенем ушкодження
клітин у процесі гіпотермічного зберігання (ГЗ) обумовлений іонною силою та рН середовища еквілібрації. Ступінь ушкодження
клітин у неелектролітних середовищах при ГЗ достовірно нижче, а їх осмотична стійкість вище у порівнянні з електролітними.
Найбільш стійкою до дії факторів середовища є ехіноцитарна форма еритроцитів.
Ключові слова: еритроцити, гіпотермічне зберігання, іонна сила, рН середовища.
It has been shown that the observed relationship between transformation of cell shape and their osmotic resistance as well as
damage degree during hypothermal storage (HS) is stipulated by ionic strength and equilibration medium pH. The degree of cell damage
in non-electrolyte media during HS is statistically lower and their osmotic resistance is higher if compared with electrolyte ones. The
most resistant to the factors of medium is echinocyte shape of erythrocytes.
Keywords: erythrocytes, hypothermal storage, ionic strength, medium pH.
В последние годы достаточно много внимания
уделяется подбору и разработке сред для гипотер-
мического хранения (ГХ) эритроцитов. Несмотря
на значительные успехи в этом направлении, отме-
чается, что свою функциональную полноценность
эритроциты сохраняют лишь в течение первых 3-х
суток [8]. При ГХ эритроцитов снижаются внутри-
клеточный рН, концентрации АТФ и 2,3-ДФГ,
повышается уровень свободного гемоглобина и
изменяется структура мембраны вплоть до фор-
мирования микровезикул [7, 10]. Таким образом,
вопросы, связанные с изучением механизмов пов-
реждения клеток в условиях ГХ, остаются актуаль-
ными.
Цель работы – исследование морфологии эрит-
роцитов и их устойчивости к гипотоническому ли-
зису в зависимости от ионной силы, а также рН
среды эквилибрации в условиях гипотермического
хранения.
Recently quite much attention has been paid to the
selection and designing of the media for hypothermal
storage (HS) of erythrocytes. In spite of significant
successes in this direction there is noted that its func-
tional integrity the erythrocytes preserve only during
first 3 days [8]. At HS of erythrocytes intracellular
pH, ATP and 2,3-DPG reduce, the level of free hemo-
globin rises and the structure of membrane up to the
formation of microvesicles [7, 10] changes. Thus the
tasks related to the study of mechanisms of cell damage
under HS have remained an actual one.
The research aim is to investigate the morphology
of erythrocytes and their resistance to hypotonic lysis
depending on ionic strength as well as pH of equilib-
ration medium under hypothermal storage.
Materials and methods
The research objects were erythrocytes of whole
donor’s blood of the 2nd and 3rd groups (5 donors in
* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:
óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38
(057) 373-30-34, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà:
nvrepin@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya
str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3034, fax: +380 57
373 3084, e-mail: nvrepin@mail.ru
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2 V.N. Karazin National University, Kharkov, Ukraine
1Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû
ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ
2Õàðüêîâñêèé íàöèîíàëüíûé óíèâåðñèòåò èì. Â.Í. Êàðàçèíà
11 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Объектом исследования были эритроциты цель-
ной донорской крови II и III групп (по 5 доноров в
каждой группе), трижды отмытые от плазмы и
форменных элементов крови раствором фосфатно-
солевого буфера (ФСБ) (20 мМ фосфатного буфера
(ФБ; 130 мМ NaCl; 5,6 мМ глюкозы, рН 7,4)) цент-
рифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин.
Для ГХ клеток (гематокрит 20%) использовали хо-
лодильную камеру (4°С) и среды различного соста-
ва: электролитные – среда 1 (130 мМ NaCl; рН 5,4;
7,2; 8,6) и среда 2 (130 мМ КCl; рН 5,4; 7,2; 8,6);
неэлектролитные – среда 3 (260 мМ маннита; рН
5,4; 7,2; 8,6) и среда 4 (260 мМ сахарозы; рН 5,4;
7,2; 8,6). Все исследуемые среды содержали 20 мМ
ФБ.
Изменение формы эритроцитов, их размеры и
степень гетерогенности популяции контролировали
с помощью растрового электронного микроскопа
РЭММА-101А (AO “SELMI”, Украина), снаб-
женного системой цифрового вывода изображения.
Для морфологических исследований клетки фикси-
ровали 2%-м раствором глутарового альдегида
(ГА) на ФБ, смешивая его с суспензией клеток в
соотношении 1:1. Конечная концентрация ГА сос-
тавляла 1% [2]. Для каждой экспериментальной
точки был определен морфологический индекс [3].
Ультраструктуру и состояние гликокаликса эрит-
роцитов исследовали в трансмиссионном элект-
ронном микроскопе TEM-125K, снабженном сис-
темой съема и анализа изображения САИ-01А
(AO “SELMI”, Украина) с помощью CCD камеры
DX-2 и пакета программ фирмы “KAPPA” (Герма-
ния) при ускоряющем напряжении 75 кВ. В качест-
ве дополнительного фиксатора использовали руте-
ний красный по методу [1].
Повреждение эритроцитов при ГХ и их устой-
чивость к гипотонии фиксировали спектрофо-
тометром СФ-4А (ЛОМО, Россия) с проточной
кюветой (длина волны 543 нм) по концентрации
свободного гемоглобина в надосадке. Осмотичес-
кую устойчивость эритроцитов определяли путем
их переноса из сред инкубации в среды NaCl (90 и
140 мОсм), содержащие 20 мМ ФБ, рН 7,2 при
37°С, в соотношении 1:10. Осмолярность гипото-
нических сред контролировали осмометром
ОМКА-1Ц-01 (Украина).
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
При переносе эритроцитов в среды с различным
значением рН выявлена достаточно высокая сох-
ранность исходной формы эритроцитов практи-
чески до 2-х суток ГХ, за исключением неэлектро-
литных сред при рН 8,6, в которых с 30-й минуты
наблюдались интенсивные процессы трансформа-
ции клеток в эхиноциты, а со 2-х суток – в сферо-
эхиноциты.
each), thrice washed-out from plasma and blood formed
elements with the solution of phosphate-salt buffer
(PSB) (20 mM phosphate buffer (PB); 130 mM NaCl;
5.6 mM glucose, pH 7.4) with centrifugation at
3,000 rpm for 5 min. For HS of cells (hematocrit 20%)
there was used freezing chamber (4°C) and the media
of different composition: electrolyte one, medium 1
(130 mM NaCl; pH 5.4; 7.2; 8.6) and medium 2 (130
mM KCl; pH 5.4; 7.2; 8.6); non-electrolyte one,
medium 3 (260 mM mannit ; pH 5.4; 7.2; 8.6) and
medium 4 (260 mM sucrose; pH 5.4; 7.2; 8.6). All the
studies media contained 20 mM phosphate buffer.
The change of the shape of erythrocytes, their sizes
and degree of population heterogeneity was controlled
with raster electron microscope REMMA-101A (JSC
“SELMI”, Ukraine), equipped with the system of digital
retrieval of images. For morphological studies the cells
were fixed with 2% solution of glutaraldehyde (GA)
on PB mixing it with cell suspension in 1:1 ratio. Final
GA concentration made 1% [2]. For each experimen-
tal point there was found the morphological index [3].
Ultrastructure and state of glycocalix of erythrocytes
were studied with transmission electron microscope
TEM-125K equipped with the system of image recor-
ding and analysis SAI-01A (JSC “SELMI”, Ukraine)
using CCD camera DX-2 and “KAPPA” software
(Germany) with accelerating voltage of 75 kV. As ad-
ditional fixer there was used ruthenium red according
to the method [1].
Damage of erythrocytes at HS and their resistance
to hypotony was fixed with spectrophotometer SF-4A
(LOMO, Russia) with flow cell (543 nm wave length)
on concentration of free hemoglobin in supernatant.
Osmotic resistance of erythrocytes was found by their
transfer from incubation medium in NaCl media (90
and 140 mOsm), containing 20 mM PB, pH 7.2 at 37°C
in 1:10 ratio. Osmolarity of hypotonic media was
controlled with osmometer OMKA-1C-01 (Ukraine).
Results and discussion
During transfer of erythrocytes with different pH
values there was revealed quite high integrity of initial
form of erythrocytes practically up to 48 hrs of HS,
excluding non-electrolyte media with pH 8.6., wherein
from the 30th min there were observed intensive
processes of shape transformation into echinocytes and
into spherocytes from the second day.
During HS there were revealed manifested change
of cell shapes depending on the composition and pH
of exposure medium. Under acid values of pH in non-
electrolyte media and the one containing NaCl to the
7th day of HS there was found a heterogenous popu-
lation of cell consisting of discocytes and echinocytes
(Fig. 1, a), meanwhile in the medium, containing KCl
practically all the cells were transformed into slightly
stomatocyte shapes (Fig. 1, b). Under neutral pH values
12 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
Рис. 1. Морфологическое состояние эритроцитов при ГХ к 7-м суткам в зависимости от состава и рН среды экспозиции:
а – среда 1, рН 5,4; б – среда 2, рН 5,4; в – среда 1, рН 7,2; г – среда 2, рН 8,6.
Fig. 1. Morphological state of erythrocytes at HS to the 7th day depending on composition and exposure medium pH: a –
medium 1, pH 5.4; b – medium 2, pH 5.4; c – medium 1; pH 7.2, d – medium 2, pH 8.6.
a a
в c
б b
г d
В процессе ГХ выявлены более выраженные
изменения формы клеток в зависимости от состава
и рН среды экспозиции. При кислых значениях рН
в неэлектролитных средах и среде, содержащей
NaCl, на 7-е сутки ГХ наблюдалась гетерогенная
популяция клеток, состоящая из дискоцитов и эхи-
ноцитов (рис. 1, а), тогда как в среде, содержащей
КCl, практически все клетки трансформированы в
слабостоматоцитарные формы (рис.1, б). При нейт-
ральных значениях рН в неэлектролитных и элект-
ролитных средах на 7-е сутки ГХ 90% клеток
имеют форму эхиноцитов (рис. 1, в).
Щелочные значения рН выявили различную
направленность трансформации формы эритро-
цитов в зависимости от ионной силы. В электро-
литных средах наблюдается образование гетероген-
ной популяции клеток, состоящей из уплощенных
дискоидных форм и сфероэхиноцитов (рис. 1, г),
тогда как в неэлектролитных отмечена однонап-
равленная трансформация формы клеток с образо-
in non-electrolyte and electrolyte media to the 7th day
of HS 90% of cell were of echinocyte shape (Fig. 1, c).
Alkyl pH values showed different orientation of
shape transformation of erythrocytes depending on
ionic strength. In electrolyte media there is observed
the formation of heterogenous population of cells con-
sisting of discoid forms and spheroechinocytes (Fig. 1,
d), whilst in non-electrolyte ones there was observed
mono-orientated transformation of cell shape with the
formation of spheroechinocytes (Fig. 2, a). It should
be noted that to the 7th day of HS at alkyl pH the
microvesicles in the media of both types are formed.
When extending the HS terms up to the 14th and
21st days in NaCl- and KCl-containing media at pH
5.4 the damage of some cells and transformation of
the rest cells into spheroechinocytes is observed, in
non-electrolyte media the echinocytes and discoechino-
cytes are preserved. At neutral and alkyl pH in the
media of both types to the 21st storage day the sphero-
echinocytes dominate (Fig. 2, b).
13 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
ванием сфероэхиноцитов (рис. 2, a). Следует отме-
тить, что на 7-е сутки ГХ при щелочных рН обра-
зуются микровезикулы в средах обоих видов.
При увеличении сроков ГХ до 14- и 21-х суток
в NaCl- и КCl-содержащих средах при рН 5,4
наблюдаются повреждение части клеток и транс-
формация оставшихся клеток в сфероэхиноциты,
в неэлектролитных средах сохраняются эхиноциты
и дискоэхиноциты. При нейтральных и щелочных
рН в средах обоих видов к 21-м суткам хранения
доминируют сфероэхиноциты (рис. 2, б).
Анализ целостности клеток показал (рис. 3), что
во всех исследуемых средах эквилибрации гемо-
лиз отсутствовал на протяжении первых 7 суток
ГХ, исключая электролитные среды при кислых
значениях рН, где величина гемолиза составляла
4–6%. На 14-е сутки отмечается более выражен-
ная зависимость уровня гемолиза от значений рН
среды. Максимальный повреждающий эффект
оказывали среды с рН 5,4, в которых к 14-м суткам
ГХ уровень гемолиза в электролитных средах
составлял 17–20% и в неэлектролитных – 6–10%
(рис. 3). При рН 8,6 степень повреждения клеток
была несколько ниже (11–14 и 5–6% гемолиза для
обоих видов сред соответственно).
Минимальная степень повреждения клеток для
данного срока ГХ отмечена для обоих типов сред
при рН 7,2, где величина гемолиза составляла 2–3
и 7–8% для неэлектролитных и электролитных сред
соответственно. Отмеченная тенденция поврежде-
ния клеток, обусловленная составом и рН среды
эквилибрации при ГХ , сохранялась и на 21-е сутки
хранения (рис. 3). Уровень гемолиза при рН 7,2
оставался минимальным по сравнению с кислыми
и щелочными значениями рН в средах как с высо-
The analysis of cell integrity showed (Fig. 3) that
in all studied equilibration media the hemolysis was
absent for 7 days of HS, excluding electrolyte media
at acid pH values, where the hemolysis rate was 4–
6%. To the 14th day there is noted more manifested
dependence of hemolysis rate on medium pH values.
The maximum damaging effect was rendered by media
with pH 5.4, wherein to the 14th day of HS the
hemolysis rate in electrolyte media made 17–20% and
6–10% in non-electrolyte ones (Fig. 3). At pH 8.6 the
damage rate of cells was somewhat lower (11–14 and
5–6% of hemolysis for both media types, correspon-
dingly).
Minimum damage rate of cells for this HS term
was noted for both types of media at pH 7.2, where
the hemolysis rate made 2–3 and 7–8% for non-elec-
trolyte and electrolyte media, correspondingly. At HS
the found tendency of cell damage due to composition
and equilibration medium pH was kept to the 21st
storage day (Fig. 3). Hemolysis rate at pH 7.2 has re-
mained minimal if compared with acid and alkyl pH
values in the media both with high and low tonicity. In
electrolyte media to the 21st day the hemolysis made
10–11% and 4–5% in non-electrolyte ones.
One of the most important membrane components
is its glycocalix, formed with negatively charged sialic
acids of transmembrane proteins and constituting the
surface membrane charge. The charge glycocalix is
considered to be reduced due to medium pH decrease.
We studied its state during HS using special electron
microscopic fixer, containing ruthenium red, binding
specifically with membrane glycocalix [1]. It has been
established that if in the norm and under short storage
terms the glycocalix structure is represented with conti-
nuous membrane adjacent layer (Fig. 4, a, b), then to
Рис. 2. Морфологическое состояние эритроцитов при ГХ на 7-е (a) и 21-е (б) сутки в зависимости от состава и рН
среды экспозиции: а – среда 4, рН 8,6; б – среда 3, рН 7,2.
Fig. 2. Morphological state of erythrocytes at HS to the 7th (a) and 21st days (b) depending on composition and exposure
medium pH: a – medium 4, pH 8.6; b – medium 3, pH 7.2.
a a б b
14
Рис. 3. Уровень гемолиза эритроцитов при ГХ на 7-е
(пунктирная линия), 14-е (пунктир-точки) и 21-е сутки
(сплошная линия) в зависимости от рН и состава среды
инкубации: ◆ – среда 1 (NaCl); ▲ – среда 2 (KCl); ● –
среда 3 (маннит); – среда 4 (сахароза).
Fig. 3. Hemolysis rate of erythrocytes at HS to the 7th (dash
line), 14th (dotted line) and 21st (solid line) days depending
on pH and composition of incubation medium: ◆ – medium
1 (NaCl); ▲– medium 2 (KCl); ● – medium 3 (mannit); –
medium 4 (sucrose).
0
5
10
15
20
25
30
35
5,4 7,2 8,6
pH
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
the 10th–14th days the erythrocyte surface either
contains only its fragments (Fig. 2, c) or is deprived of
them (Fig. 4, d). The observed aggregation of cells
under longer HS terms is explained by very that.
The above mentioned changes in the glycocalix
structure are confirmed with the report [6], demon-
strating that charge density of erythrocyte membrane
significantly reduces after 6 storage days, that is testi-
fied with the decrease in electrophoretic mobility of
erythrocytes.
To reveal the latent cell damage and to explain
possible mechanism of shape transformation there was
analyzed the resistance of different erythrocyte shapes
to hypotonic lysis. It has been shown that during
transfer of erythrocytes into hypotonic solutions the
most resistant cells occurred to be the ones, stored in
non-electrolyte media for all pH values (Fig. 5). In the
case of electrolyte media the cell sensitivity to
hypotonia was determined with exposure medium pH
value: the cells stored at neutral pH values occurred
to be more resistant to the effect of osmotic factor.
The highest rate of cell damage was found at their
transfer into hypotonia from the medium containing
KCl at pH 5.4.
The indices of the highest resistance to hypotonia
of the cells, stored for 7 and more days if compared
with 30 mins’ exposure in the media with different
composition (Fig. 5) is vividly presented in Fig. 6. The
values of morphological index testify to the fact that
maximum of presence of echinocites in all the media
for pH values and media with low ionic strength
corresponds to minimal damage (see Fig. 3) and
maximum of osmotic resistance (Fig. 5).
Revealed by us two maximums: damage (electrolyte
media at pH 5.4) and integrity (non-electrolyte media
at pH 7.2) of erythrocytes, characterized with different
shapes, have to be considered from the point of view
of relationship of the shape and ionic homeostasis of a
cell in providing its adaptation to the changing
conditions. The fact of minimum resistance in acid
media at relative preservation of a shape from our point
of view is related to the increased intracellular osmotic
pressure due to the entrance of H+ ions and blocking
of the release of K+ and Cl– ions [3, 9], as well as
effect of H+ ions on negatively charged components
of cytoskeleton-membrane complex and membrane
permeability [4]. The same point of view as for the
increase of the amount of intracellular chlorine under
low pH, resulting in the change of band 3 protein
conformation is presented in the paper [11]. It is
supposed that occurring under these conditions proto-
nization of band 3 protein domain causes the change
in a balanced state of chlorine between extra- and
intracellular medium resulting in its concentration rise
inside a cell. The correlation between the concentration
кой, так и низкой тоничностью. В электролитных
средах на 21-е сутки гемолиз составлял 10–11%,
а в неэлектролитных – 4–5%.
Одной из важнейших структурных составля-
ющих мембраны является ее гликокаликс, образу-
емый отрицательно заряженными сиаловыми
кислотами трансмембранных белков и формиру-
ющий поверхностный мембранный заряд. Счита-
ется, что снижение заряда гликокаликса происходит
при уменьшении рН среды. Мы исследовали его
состояние в процессе ГХ, используя специальный
электронно-микроскопический фиксатор, который
содержит рутений-красный, специфически связы-
вающийся с гликокаликсом мембран [1]. Установ-
лено, что если в норме и при небольших сроках
хранения структура гликокаликса представлена
непрерывным примембранным слоем (рис. 4, а, б),
то к 10–14-м суткам поверхность эритроцита
содержит лишь его фрагменты (рис. 4, в) либо ли-
шена их (рис. 4, г). Именно этим объясняется наб-
людаемая агрегация клеток при более длительных
сроках ГХ.
Отмеченные выше изменения в структуре
гликокаликса подтверждаются данными работы
[6], в которой показано, что плотность заряда мем-
браны эритроцитов значительно снижается после
6 суток хранения, о чем свидетельствует умень-
шение электрофоретической подвижности эритро-
цитов.
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
15 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
a a б b
в c г d
Для выявления латентных повреждений клеток
и объяснения возможного механизма трансфор-
мации формы была проанализирована устойчи-
вость различных форм эритроцитов к гипотони-
ческому лизису. Показано, что при переносе эрит-
роцитов в гипотонические растворы наиболее
устойчивы клетки, хранившиеся в неэлектролит-
ных средах для всех значений рН (рис. 5). В случае
электролитных сред чувствительность клеток к
гипотонии определялась значением рН среды
экспозиции: более устойчивы к действию осмоти-
ческого фактора оказались клетки, хранившиеся
при нейтральных значениях рН. Наиболее высокая
степень повреждения клеток отмечена при их пере-
носе в гипотонию из среды, содержащей КCl, при
рН 5,4.
Факт наибольшей устойчивости к гипотонии
клеток, хранившихся 7 и более суток, по сравнению
с 30-минутной экспозицией в средах различного
состава (рис. 5) наглядно представлен на рис. 6.
Значения морфологического индекса свидетельст-
вуют, что максимум “эхиноцитарности”, отме-
ченный у эритроцитов во всех средах для значения
of intracellular chlorine and change in the shape with
the altering cell pH is reported in the papers [4, 5].
The fact of the highest resistance to hypotonia for
the cells of echinocyte shape, stored at alkyl pH in the
media of low ionic strength, is quite well explained by
the reduction of intracellular osmotic pressure due to
the release out of a cell of K+ and Cl– ions on electro-
chemical gradients, that results in the formation of
echinocytes. Heterogeneous population (discocytes,
echinocytes and stomatocytes) of different modifi-
cations occurred to be more sensitive to osmotic factor
effect.
Conclusions
During HS the relationship between transformation
of cell shape and their osmotic resistance, as well as
the degree of damage depending on ionic strength and
pH of equilibration medium is observed.
Under acid values of pH the erythrocytes are
transformed into heterogeneous population of disco-
cytes and echinocytes not depending on the composition
of storage medium, while neutral pH values caused
transformation of erythrocytes into homogenous, echi-
Рис. 4. Морфологическое состояние гликокаликса мембран эритроцитов после 1 суток ГХ (a,б) и деградация его
структуры к 10–14-м суткам (в, г). Фиксация рутением красным. Обозначения: темные стрелки – гликокаликс; М –
мембрана эритроцита.
Fig. 4. Morphological state of glycocalix of erythrocyte membranes after 24hrs’ HS (a, b) and its structure degradation to
the 10–14th days (c, d). Ruthenium red fixation. Legends: dark arrows – glycocalix; M – erythrocyte membrane.
16 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
рН 7,2 и средах с низкой ионной силой при рН 8,6,
соответствует минимуму повреждения (см. рис. 3)
и максимуму осмотической устойчивости (рис. 5).
Выявленные нами два максимума – поврежде-
ние (электролитные среды при рН 5,4) и сохран-
ность (неэлектролитные среды при рН 7,2) эритро-
цитов, характеризуемых разными формами, необ-
ходимо рассматривать с точки зрения взаимосвязи
формы и ионного гомеостаза клетки в обеспечении
ее адаптации к меняющимся условиям. Факт
минимальной устойчивости в кислых средах при
относительном сохранении формы, с нашей точки
зрения, связан с повышенным внутриклеточным
осмотическим давлением за счет входа ионов Н+
и блокирования выхода ионов К+ и Cl– [3, 9], а также
с воздействием ионов Н+ на отрицательно заря-
женные компоненты цитоскелет-мембранного
комплекса и мембранную проницаемость [4].
Аналогичная точка зрения относительно увели-
чения количества внутриклеточного хлора при
низких рН, приводящего к изменению конфор-
мации БП-3, изложена в работе [11]. Предпола-
гается, что происходящая в этих условиях прото-
низация внешнего домена БП-3 вызывает измене-
ние равновесного состояния хлора между вне- и
внутриклеточной средой, приводя к увеличению его
концентрации внутри клетки. Корреляция между
концентрацией внутриклеточного хлора и измене-
нием формы при изменении рН клетки отмечается
в работах [4, 5].
Факт наибольшей устойчивости к действию ги-
потонии клеток эхиноцитарных форм, хранившихся
при щелочных рН в средах низкой ионной силы,
достаточно хорошо объясняется снижением
внутриклеточного осмотического давления за счет
выхода из клетки ионов К+ и Cl- по электро-
химическому градиенту, что приводит к образова-
нию эхиноцитов. Гетерогенная популяция (диско-
циты, эхиноциты и стоматоциты) различных моди-
фикаций оказалась более чувствительной к дейст-
вию осмотического фактора.
Âûâîäû
В процессе ГХ наблюдается взаимосвязь меж-
ду трансформацией формы клеток и их осмотичес-
кой устойчивостью, а также степенью повреждения
в зависимости от ионной силы и рН среды эквилиб-
рации.
При кислых значениях рН эритроциты транс-
формируются в гетерогенную популяцию диско-
цитов и эхиноцитов вне зависимости от состава
среды хранения, тогда как нейтральные значения
рН вызывали трансформацию эритроцитов в гомо-
генную, эхиноцитарную популяцию. При щелочных
значениях рН среды на 2-е сутки ГХ в неэлек-
тролитных средах клетки интенсивно трансфор-
5,4 7,2 8,6
nocyte population. Under alkyl values of medium pH
to the 2nd day of HS in non-electrolyte media the cells
are intensively transformed into spheroechinocytes,
Рис. 5. Осмотическая резистентность эритроцитов в
90 мОсмоль NaCl в условиях 30-минутной экспозиции при
20°С (сплошная линия) и на 7-е сутки ГХ (пунктирная
линия) в зависимости от рН среды инкубации с различным
ионным составом: ◆ – среда 1 (NaCl); ▲ – среда 2 (KCl);
● – среда 3 (маннит); – среда 4 (сахароза).
Fig. 5. Osmotic resistance of erythrocytes in 90 mOsm NaCl
under 30 mins’ exposure at 20°C (solid line) and to the 7th
day of HS (dashed line) depending on incubation medium
pH with various compositions: ◆ – medium 1 (NaCl); ▲–
medium 2 (KCl); ● – medium 3 (mannit); – medium 4
(sucrose).
Рис. 6. Морфологический индекс формы эритроцитов
на 7-е сутки ГХ в зависимости от рН и состава среды
инкубации: ◆ – среда 1 (NaCl); ▲ – среда 2 (KCl); ● –
среда 3 (маннит); – среда 4 (сахароза).
Fig. 6. Morphological index of erythrocyte shape to the 7th
day of HS depending on pH and composition of incubation
medium:◆– medium 1 (NaCl); ▲– medium 2 (KCl); ● –
medium 3 (mannit); – medium 4 (sucrose).
-1
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
М
ор
ф
ол
ог
ич
ес
ки
й
ин
де
кс
M
or
ph
ol
og
ic
al
in
de
x
э
хи
но
ци
т
e
ch
in
oc
yt
e
ст
ом
ат
оц
ит
st
om
at
oc
yt
e
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
pH
5,4 7,2 8,6
pH
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
17 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
мируются в сфероэхиноциты, тогда как в электро-
литных – образуется гетерогенная популяция дис-
коцитов и эхиноцитов.
В процессе ГХ степень повреждения клеток в
неэлектролитных средах ГХ достоверно ниже, а
их осмотическая устойчивость выше по сравнению
с электролитными. Установлено, что вне зависи-
мости от ионной силы среды при кислых значениях
рН наблюдается минимальная осмотическая ус-
тойчивость эритроцитов. Наиболее устойчивой
формой к действию факторов среды является эхи-
ноцитарная форма клеток.
Исследование состояния примембранного слоя
эритроцитов при их ГХ показало, что между 10 и
14-ми сутками хранения происходит разрыхление,
а при некоторых условиях отслоение и потеря глико-
каликса.
meanwhile in electrolyte ones the heterogeneous
population of discocytes and echinocytes is formed.
During HS the degree of cell damage in non-
electrolyte media is significantly lower and their osmo-
tic resistance is higher if compared with electrolyte
ones. It has been established that independently on
ionic strength of the medium at acid pH values there is
observed minimal osmotic resistance of erythrocytes.
The most resistance form to the effect of the medium
factors is echinocyte cell shape.
The examination of the state of membrane-adjacent
layer of erythrocytes during HS has shown that
between 10th and 14th storage days the desintegration
and the exfoliation and loss of glycocalyx under certain
conditions take place.
References
Gaer G. Electron microscopy. – Moscow: Mir – 1974.– 488 p.
Krymsky L.D., Nestayko G.V., Rybalov A.G. Raster electron
microscopy of vessels and blood.– Moscow: Mir.– 1974.–
165 p.
Gedde M., Davis K., Huestis H. Cytoplasmic pH and human
erythrocyte shape // Biophys. J. – 1997.– Vol. 72, N3.–
P. 1234–1246.
Gedde M., Huestis H. Membrane potential and human
erythrocytes shape // Biophys. J.–1997.– Vol. 72, N3.–
P. 1220–1233.
Gimsa J., Ried C. Do band 3 protein conformational changes
mediate shape changes of human erythrocytes? // Mol. Membr.
Biol.– 1995.– Vol. 12, N3.– P. 247–254.
Godin Ch.,Caprani A. Effect of blood storage on erythrocyte/
wall interactions:implications for surface charge and rigidity //
Eur. Biophys. J.– 1997.– Vol. 26, N2.– P. 175–182.
Hess J.R., Rugg N., Knapp A. D. et al. The role of electrolytes
and pH in RBC ASs // Тransfusion.– 2001.– Vol. 41, N8.–
P. 1045–1051.
Högman C. F., Löf H., Meryman H. T. Storage of red blood
cells with improved maintenance of 2,3-bisphosphoglycerate //
Transfusion.– 2006. – Vol. 46, N9. – P. 1543–1552.
Liu S., Law F., Knauf P. Effects of external pH on substrate
binding and on the inward chloride translocation rate constant
of band 3 // J. Gen. Physiol.– 1996.– Vol. 107, N2.– P. 271–
291.
Valeri C. R., Pivacek L. E., Cassidy G. P. et al. The survival,
function, and hemolysis of human RBCs stored at 4°C in
additive solution (AS-1, AS-3, or AS-5) for 42 days and then
biochemically modified, frozen, thawed, washed, and stored
at 4°C in sodium chloride and glucose solution for 24 hours //
Тransfusion.– 2000.– Vol. 40, N11.– P. 1341–1345.
Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in the
disc-sphere transformations of the erythrocyte // J. Theor.
Biol.– 1999.– Vol. 196, N3.– P. 343–361.
Accepted in 21.10.2008
Литература
Гайер Г. Электронная гистохимия.– М.: Мир, 1974.– 488 c.
Крымский Л.Д., Нестайко Г.В., Рыбалов А.Г. Растровая
электронная микроскопия сосудов и крови.– М.: Меди-
цина, 1976.– 165 c.
Gedde M., Davis K., Huestis H. Cytoplasmic pH and human
erythrocyte shape // Biophys. J. – 1997.– Vol. 72, N3.–
P. 1234–1246.
Gedde M., Huestis H. Membrane potential and human erythro-
cytes shape // Biophys. J.– 1997.– Vol. 72, N3.– P. 1220–
1233.
Gimsa J., Ried C. Do band 3 protein conformational changes
mediate shape changes of human erythrocytes? // Mol. Membr.
Biol.– 1995.– Vol. 12, N3.– P. 247–254.
Godin Ch.,Caprani A. Effect of blood storage on erythrocyte/
wall interactions:implications for surface charge and rigidity //
Eur. Biophys. J.– 1997.– Vol. 26, N2.– P. 175–182.
Hess J.R., Rugg N., Knapp A. D. et al. The role of electrolytes
and pH in RBC ASs // Тransfusion.– 2001.– Vol. 41, N8.–
P. 1045–1051.
Högman C. F., Löf H., Meryman H. T. Storage of red blood
cells with improved maintenance of 2,3-bisphosphoglycerate //
Transfusion.– 2006. – Vol. 46, N9. – P. 1543–1552.
Liu S., Law F., Knauf P. Effects of external pH on substrate
binding and on the inward chloride translocation rate constant
of band 3 // J. Gen. Physiol.– 1996.– Vol. 107, N2.– P. 271–
291.
Valeri C. R., Pivacek L. E., Cassidy G. P. et al. The survival,
function, and hemolysis of human RBCs stored at 4°C in
additive solution (AS-1, AS-3, or AS-5) for 42 days and then
biochemically modified, frozen, thawed, washed, and stored
at 4°C in sodium chloride and glucose solution for 24 hours //
Тransfusion.– 2000.– Vol. 40, N11.– P. 1341–1345.
Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in the
disc-sphere transformations of the erythrocyte // J. Theor.
Biol.– 1999.– Vol. 196, N3.– P. 343–361.
Поступила 21.10.2008
Рецензент В.С. Марченко
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
|