Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина
Методами электронной и флуоресцентной спектроскопии изучено влияние диметилсульфоксида (ДМСО) и диэтилсульфоксида (ДЭСО) на термическую (тепловую и холодовую) денатурацию сывороточного альбумина человека в температурном интервале от –20 до 90°С. Выявлено, что при тепловой денатурации в присутствии Д...
Saved in:
| Date: | 2009 |
|---|---|
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2009
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5397 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина / К.Р. Григорян, Ш.А. Маркарян, М.Г. Азнаурян // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859685889234436096 |
|---|---|
| author | Григорян, К.Р. Маркарян, Ш.А. Азнаурян, М.Г. |
| author_facet | Григорян, К.Р. Маркарян, Ш.А. Азнаурян, М.Г. |
| citation_txt | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина / К.Р. Григорян, Ш.А. Маркарян, М.Г. Азнаурян // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | Методами электронной и флуоресцентной спектроскопии изучено влияние диметилсульфоксида (ДМСО) и диэтилсульфоксида (ДЭСО) на термическую (тепловую и холодовую) денатурацию сывороточного альбумина человека в температурном интервале от –20 до 90°С. Выявлено, что при тепловой денатурации в присутствии ДЭСО наблюдается переход кислотного характера при температуре 47,61°С, а при холодовой денатурации прямые гидрофобные взаимодействия сульфоксидов с поверхностью белка приводят к образованию стабильной “ледяной” оболочки, которая предохраняет белок от необратимых структурных изменений.
Методами електронної та флуоресцентної спектроскопії досліджено вплив диметилсульфоксиду (ДМСО) і діетилсульфоксиду (ДЕСО) на термічну (теплову та холодову) денатурацію сироваткового альбуміну людини в температурному інтервалі від –20 до 90°С. Встановлено, що за теплової денатурації у присутності ДЕСО спостерігається перехід кислотного характеру при температурі 47,61°С, а за холодової денатурації прямі гідрофобні взаємодії сульфоксидів з поверхнею білка приводять до появи стабільної “льодяної” оболонки, яка захищає білок від необоротних структурних змін.
The effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) and diethyl sulfoxide (DESO) on thermal (heat and cold) denaturation of human serum albumin within temperature range from –20 to 90°C was investigated by electron and fluorescent spectroscopy. It has been established that at heat induced denaturation in the presence of DESO an acid-neutral transition was observed at 47.61°C. It was shown that at cold induced denaturation the direct hydrophobic interactions of sulphoxide molecules with protein surface result in the formation of stable “ice” layer, providing the protein protection from irreversible structure changes.
|
| first_indexed | 2025-11-30T22:28:03Z |
| format | Article |
| fulltext |
3 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
УДК 57.536.483
Ê.Ð. ÃÐÈÃÎÐßÍ*, Ø.À. ÌÀÐÊÀÐßÍ, Ì.Ã. ÀÇÍÀÓÐßÍ
Âëèÿíèå äèìåòèëñóëüôîêñèäà è äèýòèëñóëüôîêñèäà
íà òåðìè÷åñêóþ äåíàòóðàöèþ ÷åëîâå÷åñêîãî
ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà
UDC 57.536.483
K.R. GRIGORYAN*, S.A. MARKARIAN, M.G. AZNAURYAN
Effect of Dimethyl Sulfoxide and Diethyl Sulfoxide
on Thermal Denaturation of Human Serum Albumin
Методами электронной и флуоресцентной спектроскопии изучено влияние диметилсульфоксида (ДМСО) и диэтил-
сульфоксида (ДЭСО) на термическую (тепловую и холодовую) денатурацию сывороточного альбумина человека в
температурном интервале от –20 до 90°С. Выявлено, что при тепловой денатурации в присутствии ДЭСО наблюдается переход
кислотного характера при температуре 47,61°С, а при холодовой денатурации прямые гидрофобные взаимодействия
сульфоксидов с поверхностью белка приводят к образованию стабильной “ледяной” оболочки, которая предохраняет белок
от необратимых структурных изменений.
Ключевые слова: альбумин, термическая денатурация, электронная спектроскопия, флуоресцентная спектроскопия,
диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид.
Методами електронної та флуоресцентної спектроскопії досліджено вплив диметилсульфоксиду (ДМСО) і діетил-
сульфоксиду (ДЕСО) на термічну (теплову та холодову) денатурацію сироваткового альбуміну людини в температурному
інтервалі від –20 до 90°С. Встановлено, що за теплової денатурації у присутності ДЕСО спостерігається перехід кислотного
характеру при температурі 47,61°С, а за холодової денатурації прямі гідрофобні взаємодії сульфоксидів з поверхнею білка
приводять до появи стабільної “льодяної” оболонки, яка захищає білок від необоротних структурних змін.
Ключові слова: альбумін, термічна денатурація, електронна спектроскопія, флуоресцентна спектроскопія, диметил-
сульфоксид, діетилсульфоксид.
The effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) and diethyl sulfoxide (DESO) on thermal (heat and cold) denaturation of human serum
albumin within temperature range from –20 to 90°C was investigated by electron and fluorescent spectroscopy. It has been estab-
lished that at heat induced denaturation in the presence of DESO an acid-neutral transition was observed at 47.61°C. It was shown
that at cold induced denaturation the direct hydrophobic interactions of sulphoxide molecules with protein surface result in the
formation of stable “ice” layer, providing the protein protection from irreversible structure changes.
Keywords: albumin, thermal denaturation, electron spectroscopy, fluorescent spectroscopy, dimethyl sulfoxide, diethyl sulfoxide.
* Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ:
óë. À. Ìàíóêÿíà 1, Åðåâàí, Àðìåíèÿ 0025; ôàêñ: (+37410) 57-
64-21; ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà: kara@ysu.am
* To whom correspondence should be addressed: 1, A. Manukyan
str., Yerevan, Armenia; fax: (+387410) 57 6421, e-mail: kara@ysu.am
Yerevan State University, Yerevan, ArmeniaÅðåâàíñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò
Денатурированная форма белка – структурное
состояние, которое зависит от вида денатурации
(нагревание, замораживание, влияние давления),
и свойств среды (сорастворитель, рН, ионная сила)
[11, 16, 21]. В нативном белке доминируют неко-
валентные сегмент-сегментные взаимодействия, а
также взаимодействия аминокислотных остатков
с молекулами окружающего растворителя. В “раз-
ворачивании” белка растворитель играет главную
роль, так как межмолекулярные взаимодействия
модулируются свойствами и составом растворителя.
Для защиты биологических молекул при замо-
раживании используют различные криозащитные
вещества: натуральные сахара, обеспечивающие
Denaturated form of protein is a structural state
depending on denaturation type (heating, freezing,
pressure effect) as well as medium properties
(cosolvent, pH, ionic strength) [11, 16, 21]. In native
protein the non-covalent segment-segment inter-
actions prevail as well as those of amino acid residues
with molecules of surrounding solvent. In protein un-
folding the solvent plays the main role, since inter-
molecular interactions are modulated by the solvent
properties and composition.
To protect biological molecules during freezing
different cryoprotective agents are used: natural su-
gars, providing the protection without penetration into
a cell; polyalcohols, alcohols, glycerol, penetrating
ÒÅÎÐÅÒÈ×ÅÑÊÀß
È ÝÊÑÏÅÐÈÌÅÍÒÀËÜÍÀß
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈß
THEORETICAL
AND EXPERIMENTAL
CRYOBIOLOGY
4 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
защиту без проникновения в клетку; полиспирты,
глицерин, которые проникают в клетку и умень-
шают вероятность образования кристаллов льда.
Установлено, что растворы, содержащие диметил-
сульфоксид (ДМСО), диэтилсульфоксид (ДЭСО),
являются эффективными криопротекторами [5, 14,
23]. Криопротекторные свойства ДМСО обуслов-
лены его способностью замещать молекулы воды,
связанные с клеточными элементами, и влиять на
структуру воды.
В работах [13, 15] приведены результаты иссле-
дования структурных особенностей водных раст-
воров ДМСО и ДЭСО. В настоящее время изучает-
ся поведение биологических молекул в смешанных
растворителях. В работах [3, 7, 12] приведены
данные об изменении термостабильности ДНК,
фосфолипидных липосом и E. coli в зависимости
от количества добавляемого сорастворителя –
диалкилсульфоксида.
Цель работы – изучить влияние ДМСО и ДЭСО
на температурные зависимости спектральных
свойств сывороточного альбумина человека в
температурном интервале –20...90°C.
Ìàòåðèàëû è ìåòîäû
Использовали сывороточный альбумин челове-
ка (САЧ) с содержанием жирных кислот менее
0,005% и ДМСО (Sigma, США), раствор хлорида
натрия (“Ликвор”, Армения). ДЭСО был синтези-
рован и очищен согласно методике [4]. Во всех
экспериментах растворы белка готовили на основе
бинарной смеси раствора хлорида натрия и сульф-
оксида. В работе использовали одинаковую кон-
центрацию белка 0,4 мг/мл. Концентрацию белка
в растворе определяли с помощью УФ-спектроско-
пии при λ = 280 нм. Молярный коэффициент
поглощения принимали равным 36,500 M–1·см–1.
Концентрация ДМСО составляла 7,5–37,5%,
ДЭСО – 0,25–25,0% (v/v).
УФ-спектрометрические измерения проводили
с помощью спектрометра Specord 50PC (Германия)
и термостата Lauda A100 (Германия). Скорость
сканирования температуры составляла 1°С/мин.
Кривые плавления нормировали (от 0 до 1) с
помощью компьютерной программы ORIGIN 7.5.
Для анализа кривых плавления использовали
модель Эйринга и Ламри “нативный белок –
обратимая денатурация – необратимая денатура-
ция”. По кривым плавления определяли темпера-
туру отдельных стадий денатурации белка с абсо-
лютной погрешностью расчета ±0,3°C.
Флуоресцентные измерения проводили с по-
мощью флуоресцентного спектрофотометра Varian
Cary Eclipse (Австралия) в температурном интерва-
ле –20...20°C. Спектры регистрировали в интерва-
ле λ = 310–450 нм при длине волны возбуждения
into a cell and preventing ice crystal formation. It has
been established that the solutions, containing dime-
thyl sulfoxide (DMSO), diethyl sulfoxide (DESO), are
effective cryoprotectants [5, 14, 23]. Cryoprotective
properties of DMSO are stipulated by its ability to
substitute water molecules, bound with cell elements
and affect water structure.
Structural peculiarities of DMSO and DESO aque-
ous solutions are presented in the [13, 15]. At present
the behavior of biological molecules in mixed solvents
has been studied. The effect of added cosolvent, dialkyl
sulfoxide, on the thermostability of DNA, phospholipid
liposomes and E. coli is presented in [3, 7, 12].
The aim of the research is to study the effect of
DMSO and DESO on temperature dependences of
spectral properties of human serum albumin within
temperature range of –20...90°C.
Materials and methods
Human serum albumin (HSA) with the content of
fatty acids less than 0.005% and DMSO (Sigma,
USA), sodium chloride solution (“Likvor”, Armenia)
were used. DESO was synthesized and purified accor-
ding to the method [4]. In all the experiments the solu-
tions were prepared using binary mixture of sodium
chloride and sulfoxide solution. The same protein con-
centration of 0.4 mg/ml was used. The protein concen-
tration was determined by UV-spectroscopy at λ =
280 nm, using molar coefficient of absorption of
36.500 M–1·cm–1. The concentrations of DMSO and
DESO were kept 7.5–37.5%, and 0.25–25.0% (v/v),
correspondingly.
UV spectrometric measurements were performed
using spectrometer (Specord 50PC, Germany) and
thermostat (Lauda A100, Germany). The temperature
scanning rate was 1°C/min. The melting curves were
normalized (from 0 to 1) using computer software
ORIGIN 7.5. For analysis of melting curves the model
of Eyring and Lamry “native protein – reversible
denaturation – irreversible denaturation” was used.
From melting curves the temperature of certain dena-
turation stages was determined with absolute accuracy
of calculations of ±0.3°C.
Fluorescent measurements were performed by the
fluorescent spectrophotometer (Varian Cary Eclipse,
Australia) within temperature interval –20...20°C. The
spectra were recorded within the range λ = 310–
450 nm and excitation wavelength λ = 295 nm. The
width of excitation and emission slits was 5 nm. For
low temperature measurements the cryostat Optistat
DN (Oxford Instruments, UK) was used. The studied
samples were placed into cryostat at room temperature,
afterwards the temperature was lowered with liquid
nitrogen. The temperature reduction with the rate of
1°C/min (±0.1°C) was controlled by the temperature
controller (ITC-502S, UK). The melting curves of
5 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
λ = 295 нм. Значения ширины входной и выходной
щелей составляли 5 нм. Для низкотемпературных
измерений использовали криостат Optistat DN
(Oxford Instruments, Великобритания). Исследуе-
мые образцы помещали в криостат при комнатной
температуре, после чего снижали температуру
жидким азотом. Понижение температуры со
скоростью 1°C/мин (±0,1°C) контролировали с
помощью температурного регулятора ITC-502S
(Великобритания). Кривые плавления холодовой
денатурации нормировали (от 0 до 1) с помощью
компьютерной программы ORIGIN 7.5.
Измерения pH проводили на рН-метре Jenway
4330 (Великобритания). Абсолютная погрешность
измерения составляла ±0,003 единиц pH.
Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå
Сывороточный альбумин человека является
одним из важнейших транспортных белков плазмы
крови и составляет 60% от общего количества
сывороточных белков. Третичная структура альбу-
мина сформирована из трех доменов (I, II, III),
которые образуют сердцевидную молекулу. Ами-
нокислотная последовательность и структура до-
менов сходны. На поверхности белка расположено
одинаковое число гидрофильных и гидрофобных
аминокислотных остатков, контактирующих с вод-
ным раствором. Выявлено, что все домены альбу-
мина подвергаются денатурации независимо друг
от друга [18].
Влияние ДМСО и ДЭСО на тепловую денатура-
цию альбумина исследовали при 20...90°C мето-
дом УФ-спектроскопии. В этих условиях термичес-
кое “разворачивание” альбумина описывается
многоступенчатым механизмом по аппроксима-
ционной модели Эйринга и Ламри [19], согласно
которой денатурация альбумина имеет обратимую
и необратимую стадии. Первая стадия – превраще-
ние “нативный белок – обратимое развернутое
состояние” (63,20°C), вторая – необратимая денату-
рация (74,30°С).
На рис. 1 приведены УФ-профили термической
денатурации альбумина в присутствии ДМСО и
ДЭСО, по которым определяли температуру обра-
тимой Tm1 и необратимой Tm2 денатурации (приве-
дены в таблице). В присутствии ДЭСО кривая
денатурации характеризуется трехступенчатым
переходом: дополнительно появляется переход при
47,61°C (Тm3). Ход кривой указывает на наличие
трех форм, что можно объяснить изменением рН
растворов. Из данных таблицы следует, что в
присутствии ДМСО рН растворов практически не
изменяется, а в присутствии ДЭСО – резко падает
до 3,5. Кислотно-денатурированная форма белков
описывается как состояние “расплавленной глобу-
лы”, т. е. как преобладающая промежуточная фор-
Температура, °С Temperature, °C
П
ог
ло
щ
ен
ие
п
ри
2
80
н
м
(н
ор
м
.)
Ab
so
rp
tio
n
at
2
80
n
m
(n
or
m
al
iz
ed
)
denaturation were normalized (from 0 to 1) with
ORIGIN 7.5 software .
Measurements of pH values were performed on
pH-meter Jenway 4330 (UK). Absolute accuracy of
measurements was ±0.03 pH units.
Results and discussion
Human serum albumin is one of the most important
blood plasma transport proteins and makes 60% of
total amount of serum proteins. Tertiary structure of
albumin developed of three domains (I, II, III) form
heart-shaped molecule. Amino acid sequence and
structure of domains are similar. On the protein surface
the same number of hydrophilic and hydrophobic amino
acid residues, being in contact with aqueous solution
are located. It has been revealed that all albumin
domains denaturate independently [18].
The effect of DMSO and DESO on heat denatu-
ration of albumin was studied at 20...90°C by UV-
spectroscopy method. Under these conditions the ther-
mal “unfolding” of albumin is described by multistep
mechanism according to Eyring and Lamry appro-
ximation model, according which the albumin denatu-
ration has reversible and irreversible stages. The first
stage is the transformation of “native protein – rever-
sible unfolded state” (63.20°C), the second one is
irreversible denaturation (74.30°C).
Fig. 1 shows the UV-profiles of thermal denatura-
tion of albumin in the presence of DMSO and DESO
by means of which the temperature values of reversible
Tm1 and irreversible Tm2 denaturations were found
(shown in Table). In the presence of DESO the dena-
turation curve is characterized by three-step transition:
additional transition appears at 47.61°C (Tm3). The
trend of curve points to the presence of three forms
that may be explained by the change in pH of solutions.
Рис. 1. УФ-профили термической денатурации альбуми-
на в присутствии 15% ДМСО (1) и 25% ДЭСО (2).
Fig. 1. UV-profiles of thermal denaturation of albumin in the
presence of 15% DMSO (1) and 25% DESO (2).
6 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
ма белка при денатурации между нативной и
денатурированной [17]. Известно, что белки могут
формировать “расплавленную глобулу”, если гидро-
фобные взаимодействия имеют сравнительно
сильный и быстрый характер [8]. На рис. 2 приве-
дены флуоресцентные спектры альбумина в при-
сутствии ДМСО при 20°С. Установлено, что с уве-
личением концентрации ДМСО (с 7,5% до 37,5%)
наблюдаются повышение интенсивности флуорес-
ценции триптофана и коротковолновое смещение
эмиссии, что свидетельствует о возрастании гидро-
фобности микроокружения триптофана в присут-
ствии ДМСО.
Таким образом, при высоких концентрациях
ДМСО прямые гидрофобные взаимодействия
сульфоксидов с поверхностью белка могут приво-
дить к денатурации альбумина. Этот эффект прояв-
ляется при более низких концентрациях ДЭСО. При
интерпретации данных тепловой денатурации
альбумина в присутствии ДЭСО важно учитывать
изменение pH растворов.
Многие белки находятся в нативном состоянии
при 10...40°C, при более высоких температурах
происходит обратимая денатурация, а при низких
температурах – холодовая денатурация [20]. Мно-
гие физико-химические свойства белков зависят
от изменения структуры растворителя вследствие
снижения температуры [6, 9]. В водных растворах
понижение температуры приводит к образованию
большой фракции гексагонального льда, при этом
неполярные группы белка экспонируют в льдо-
образную водную фазу и происходит холодовая
денатурация [22].
Сывороточный альбумин человека содержит
только один триптофановый остаток (Trp-214), ко-
торый погружен в гидрофобную полость в домене
From table it follows that in the presence of DMSO
the pH of the solutions does not practically change
and in the presence of DESO sharply reduces down
to 3.5. Acid-denaturated form of proteins is described
as an intermediate form of protein at denaturation
between native and denaturated one [17]. It is known
that proteins can form “molten globule” if hydrophobic
interactions are strong and rapid [8]. Fig. 2 demonstra-
tes the fluorescent spectra of albumin in presence of
DMSO at 20°C. It has been established that with the
increase of DMSO concentration (from 7.5 up to
37.5%) an increase of fluorescence intensity for trypto-
phan and short wave shift of the emission is observed
that testifies to a rising hydrophobicity of tryptophan
microenvironment in the presence of DMSO.
Thus, under high concentrations of DMSO the direct
hydrophobic interactions of sulfoxides with protein
surface may lead to albumin denaturation. This effect
is manifested under lower DESO concentrations.
When interpreting the data on heat denaturation of
albumin in the presence of DESO it is important to
consider the changes in solution pH values.
Many proteins are in native state at 10...40°C, under
higher temperatures reversible denaturation takes pla-
ce and the cold induced denaturation under low tem-
peratures [20]. Many physical and chemical properties
of proteins depend on the changes in the solvent struc-
ture due to temperature reduction [6, 7]. In aqueous
solutions the temperature lowering results in the for-
mation of big fraction of hexagonal ice, herewith non-
polar groups of proteins contact with ice forming aque-
ous phase and the cold denaturation takes place [22].
Human serum albumin contains only one trypto-
phan residue (trp-214), immerged into hydrophobic
Примечание: * – полученные данные; # – данные [19].
Notes: * – finding data; # – data of [19].
üëåòèðîâòñàÐ
tnevloS Hp
Ñ°,èèöàðóòàíåäàðóòàðåïìåÒ
C°,erutarepmetnoitarutaneD
T
1m
T
2m
T
3m
H
2
O* 4,7 34,36 53,47 -
H
2
O# 4,7 02,36 03,47 -
H
2
O# 3,4 01,36 00,47 02,64
ÎÑÌÄ -H
2
O
OSMD-H
2
O 5,7 99,95 25,47 -
ÎÑÝÄ -H
2
O
OSED-H
2
O 5,3 58,15 44,47 16,74
Значения температуры плавления альбумина
в присутствии ДМСО и ДЭСО
Values of melting temperature of albumin in the
presence of DMSO and DESO
Рис. 2. Спектры флуоресценции альбумина в присут-
ствии ДМСО (1 – 0%; 2 – 7,5%; 3 – 18,75%; 4 – 30,0%;
5 – 37,5%) при температуре 20°С и длине волны возбуж-
дения 295 нм.
Fig. 2. Fluorescence spectra of albumin in the presence of
DMSO (1 – 0%; 2 – 7.5%; 3 – 18.75%; 4 – 30.0%; 5 –
37.5%) at 20°C and 295 nm excitation wavelength.
Длина волны, нм Wavelength, nm
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
, у
. е
.
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
, r
el
. u
ni
ts
7
II. Флуоресценция триптофана в нативных белках
чувствительна к изменениям полярности окружаю-
щей среды. С понижением температуры интенсив-
ность флуоресценции триптофана увеличивается,
однако максимум эмиссии и форма спектра не
меняются, что можно объяснить изменением экра-
нирования триптофанового остатка. При дальней-
шем понижении температуры резко снижается
интенсивность флуоресценции и раствор альбуми-
на переходит в кристаллическое состояние. После-
дующее повышение температуры (до 20°С) приво-
дит к восстановлению спектральных характерис-
тик флуоресценции. По спектральным характерис-
тикам после отогрева замороженной плазмы крови
можно установить изменение состояния поверх-
ностных (полярных и неполярных) участков бел-
ков плазмы [2]. Наши исследования показали, что
спектральные характеристики альбумина восста-
навливаются после отогрева, что свидетельствует
об обратимом характере происходящих структур-
ных изменений.
На рис. 3 представлены флуоресцентные про-
фили холодовой денатурации альбумина в присут-
ствии ДМСО и ДЭСО в температурном интервале
–20...20°С. При отсутствии сульфоксидов низко-
температурные исследования невозможны, так как
раствор замерзает. Флуоресцентные профили дена-
турации характеризуются двухступенчатым пере-
ходом: в случае ДМСО Tc1 = 10,86°C и Tc2 = –1,38°C;
ДЭСО – Tc1 = 12,75oC и Tc2 = –1,94°C. Нелинейное
изменение спектральных характеристик при тем-
пературах ниже 0°С отражает поэтапное заторма-
живание подвижности кооперативной водно-бел-
ковой матрицы. В работе [1] показано, что при тем-
пературах –10...–20°С замерзают слабосвязанные
с белком слои воды, а при –50...–60°С замерзает
близлежащая к белку вода, составляющая коопера-
тивную систему с его поверхностными областями.
Как видно из полученных данных, воздействие,
достигаемое при использовании ДМСО (20%),
проявляется при более низких концентрациях
ДЭСО (0,25%).
Возможно, влияние органического сораствори-
теля на процесс денатурации белка объясняется
изменением полярности растворителя. В случае
диалкилсульфоксидов полярность сорастворителя
не играет определяющей роли, так как диэлектри-
ческие константы ДМСО и ДЭСО практически не
отличаются в температурном интервале 20...50оС
(диэлектрические константы изменяются с 46,6 до
43,0 и с 44,1 до 39,4 соответственно) [10]. Факти-
чески полярность растворителя не может рассмат-
риваться как важный фактор денатурации альбуми-
на в присутствии ДМСО и ДЭСО. Молекулы
ДМСО взаимодействуют с поверхностью белка в
основном за счет гидрофобных взаимодействий,
cavity in the domain II. Tryptophan fluorescence in
native proteins is sensitive to the changes of environ-
mental polarity. With the temperature reduction the
fluorescence intensity of tryptophan increases, howe-
ver the maximum of emission and spectrum form
remain unchanged that may be explained by the change
of tryphtophan residue shielding. With further lower-
ing of the temperature the fluorescence intensity falls
and albumin solution transits into crystal state. Sub-
sequent temperature rise (up to 20°C) leads to recovery
of fluorescence spectral characteristics. On spectral
characteristics after thawing of blood plasma one may
reveal the changes in state of surface (polar and non-
polar) sites of plasma proteins [2]. Our studies show
that spectral characteristics of albumin are reduced
after thawing testifying to the reversibility of structural
changes.
Fig. 3 shows fluorescent profiles of cold denatura-
tion of albumin in the presence of DMSO and DESO
within temperature range of –20...20°C. In the absen-
ce of sulfoxides low temperature studies are impossible
because of the solution freezing. Fluorescent profiles
of denaturation are characterized by two-stage
transition: for DMSO Tc1 = 10.86°C and Tc2 = –1.38°C;
for DESO Tc1 = 12.75°C and Tc2 = –1.94°C. The non-
linear change of spectral characteristics at tempera-
tures lower than 0°C reflects stage-by-stage inhibition
of cooperative water-protein matrix mobility. In [1] it
has been shown that at temperatures of –10...–20°C
the loosely bound with protein water layers freeze,
and at –50...–60°C the neighboring to protein water
consisting the cooperative system with its surfaces
freeze. The obtained data show the effect achieved
for DMSO (20%) can be reached at lower DESO
concentrations (0.25%).
Температура, °С Temperature, °C
И
нт
ен
си
вн
ос
ть
ф
лу
ор
ес
це
нц
ии
(н
ор
м
.)
Fl
uo
re
sc
en
ce
in
te
ns
ity
(n
or
m
al
iz
ed
)
Рис. 3. Флуоресцентные профили холодовой денатура-
ции альбумина в присутствии 20% ДМСО (1) и 0,25%
ДЭСО (2).
Fig. 3. Fluorescence profiles of cold denaturation of albumin
in the presence of 20% DMSO (1) and 0.25% DESO (2).
PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
8 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
а полярная S=O группа участвует в образовании
водородных связей между молекулами воды и
сульфоксида, вследствие чего меняется структура
воды. В случае ДЭСО эти взаимодействия стано-
вятся более выраженными. Как показали наши ис-
следования, в присутствии ДМСО и ДЭСО снижа-
ется температура денатурации, однако при низких
температурах уменьшение гидрофобных взаимо-
действий и связывание молекул сульфоксида c
активными полостями на поверхности белка при-
водят к формированию стабильной “ледяной”
оболочки, которая предохраняет белок от необра-
тимых структурных изменений.
Âûâîäû
Полученные результаты позволяют заключить,
что при тепловой денатурации альбумина в при-
сутствии ДЭСО проявляется переход кислотного
характера при температуре 47,61°С. В присут-
ствии ДМСО и ДЭСО температура тепловой дена-
турации САЧ снижается, по-видимому, в резуль-
тате гидрофобного взаимодействия сульфоксидов
с поверхностью белка. Причем для ДЭСО этот
эффект наблюдается при значительно меньших
концентрациях, чем для ДМСО. Флуоресцентные
измерения свидетельствуют, что образование
гидрофобной оболочки предохраняет белок от не-
обратимых структурных изменений при низких
температурах .
The effect of organic cosolvent on protein dena-
turation is probably explained by the changes in sol-
vent polarity. In case of dialkyl sulphoxides the polarity
of cosolvent does not play a determining role, since
dielectric constants of DMSO and DESO do not prac-
tically differ within temperature range of 20...50°C
(dielectric constants vary from 46.6 to 43.0 and from
44.1 to 39.4, correspondingly) [10]. In fact, polarity of
solvent cannot be considered as an important factor
of albumin denaturation in the presence DMSO and
DESO. DMSO molecules interact with protein surface
mainly due to hydrophobic interactions, and polar S=O
group participates in the formation of hydrogen bonds
between molecules of water and sulfoxide, leading to
the change in water structure. In case of DESO these
interactions become more pronounced. Our findings
showed that in the presence of DMSO and DESO the
temperature of denaturation is reduced, however under
low temperatures the decrease in hydrophobic inter-
actions and binding of sulfoxide molecules with active
cavities on protein surface result in the formation of
stable “ice” layer, preventing protein from irreversible
structural changes.
Conclusions
Obtained results enable to conclude that at thermal
denaturation of albumin in the presence of DESO a
transition of acid character at 47.61°C is observed. In
the presence of DMSO and DESO the temperature
of thermal denaturation of HSA reduces probably as
a result of hydrophobic interactions of sulphoxides with
protein surface. Moreover, for DESO this effect is
observed at lower concentrations if compared with
DMSO.The fluorescent measurements testify the
formation of hydrophobic layer prevents the protein
against irreversible structural changes under low tem-
peratures.
References
Dyubko T.S. About some aspects of application of fluorescent
analysis in cryobiology// Bull. of Kharkov National University.
Series: Biology.– 2006.–N748.– P. 221–231.
Dyubko T.S., Morozova T.F., Lipina O.V., Romodanova E.O.
Effect of freezing on donor’s blood plasma // Bull. of Kharkov
National University. Series: Biology.– 2006.– N729.– P. 128–
133.
Markarian S.A., Bagramyan K.A., Arakelyan V.B. Kinetic
parameters of E. coli growth after deep freezing in diethyl
sulfoxide presence// Problems of Cryobiology.– 2003.– N2.–
P. 11–15.
Patent of Republic of Armenia N20010041. Method of
purification of diethyl sulphoxide // S.A. Markarian, N.T. Tade-
vosyan.– Filed in: 15.11.2001. Published in 30.12.2002.
Aussedat J., Boutron P., Coquilhat P. et al. Organ preservation
at low temperature: a physical and biological problem // J.
Phys. I France.– 1993.– Vol. 3, N2.– P. 515–531.
Bonincontro A., Cinelli S., Onori G., Stravato A. Dielectric
behavior of lysozyme and ferricytochrome-c in water/ethylene-
glycol solutions // Biophys. J.– 2004.– Vol. 86, N2.– P. 1118–
1123.
Литература
Дюбко Т.С. О некоторых аспектах применения флуорес-
центного анализа в криобиологии // Вестник ХНУ. Серия:
биология.– 2006.– №748.– С. 221–231.
Дюбко Т.С., Морозова Т.Ф., Липина О.В., Ромоданова Е.О.
Влияние замораживания на плазму донорской крови //
Вестник ХНУ. Серия: биология.– 2006.– №729.– С. 128–133.
Маркарян Ш.А., Баграмян К.А., Аракелян В.Б. Кинетичес-
кие параметры роста E. coli после глубокого заморажи-
вания в присутствии диэтилсульфоксида // Пробл. крио-
биологии.– 2003.– №2.– С. 11–15.
Пат. Республики Армения N20010041. Способ очистки
диэтилсульфоксида / Ш.А. Маркарян, Н.Ц. Тадевосян.–
Заявлено: 15.11.2001, Опубл. 30.12.2002.
Aussedat J., Boutron P., Coquilhat P. et al. Organ preservation
at low temperature: a physical and biological problem // J.
Phys. I France.– 1993.– Vol. 3, N2.– P. 515–531.
Bonincontro A., Cinelli S., Onori G., Stravato A. Dielectric
behavior of lysozyme and ferricytochrome-c in water/
ethylene-glycol solutions // Biophys. J.– 2004.– Vol. 86, N2.–
P. 1118–1123.
Bonora S., Markarian S.A., Trinchero A., Grigorian K.R. DSC
study on the effect of DMSO and DESO on phospholipid
liposomes // Thermochimica Acta.– 2005.– Vol. 433, N1–2.–
P. 19–26.
Daggett V., Fersht A. Is there a unifying mechanism for protein
folding? // Trends Biochem. Sci.– 2003.– Vol. 28, N1.– P. 18–25.
Fink A.L. Effects of cryoprotectants on enzyme structure //
Cryobiology.– 1986.– Vol. 23, N1.– P. 28–37.
Gabrielian L.S., Markarian S.A. Temperature dependence
of the dielectric relaxation of liquid dimethyl- and diethylsulfoxi-
des // J. Mol. Liq.– 2004.– Vol. 112, N3.– P. 137–140.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
9 PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY
Vol. 19, 2009, ¹1
ÏÐÎÁËÅÌÛ
ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ
Ò. 19, 2009, ¹1
Johannesson H., Denisov V., Halle B. Dimethyl sulfoxide
binding to globular proteins: a nuclear magnetic relaxation
dispersion study // Protein Sci.– 1997.– Vol. 6, N8.– P. 1756–
1763.
Markarian S.A., Asatryan A.A., Grigoryan K.R., Sargsyan H.R.
Effect of DESO on the thermal denaturation of DNA //
Biopolymers.– 2006.– Vol. 81, N1.– P. 1–5.
Markarian S.A., Asatryan A.M, Zatikyan A.L. Volumetric
properties of aqueous solutions of diethylsulfoxide at
temperatures from 298.15 K to 343.15 K // J. Chem. Therm.–
2005.– Vol. 37, N8.– P. 768–777.
Markarian S.A., Bonora, S. Bagramyan K.A., Arakelyan V.B.
Glass-forming property of the system diethyl sulphoxide/water
and its cryoprotective action on Escherichia coli survival //
Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N1.– P. 1–9.
Markarian S.A., Zatikyan A.L., Grigoryan V.V., Grigoryan G.S.
Vapor pressures of pure diethyl sulfoxide from (298.15 to
318.15) K and vapor-liquid equilibria of binary mixtures of
diethyl sulfoxide with water // J. Chem. Eng. Data.– 2005.–
Vol. 50, N1.– P. 23–25.
Michnik A., Drzazga Z. Effect of ethanol on the thermal stability
of human serum albumin // Journal of Thermal Analysis and
Calorimetry.– 2007.– Vol. 88, N2.– P. 449–454.
Muzammil S., Kumar Y., Tayyab S. Molten globule-like state
of human serum albumin at low pH // Eur. J. Biochem.– 1999.–
Vol. 266, N1.– P. 26–32.
Peters T.J. All about albumin biochemistry, genetics and
medical applications.– San Diego, CA: Academic Press,
1996.– 432 p.
Pico G.A. Thermodynamic features of the thermal unfolding
of human serum albumin // Inter. J. Biol. Macromol.– 1997.–
Vol. 20, N1.– P. 63–73.
Privalov P. Protein folding.– New York: W.H. Freeman and
Company, 1992.– 127 p.
Schellman J.A. Protein stability in mixed solvents: a balance
of contact interaction and excluded volume // Biophys. J.–
2003.– Vol. 85, N1.– P. 108–125.
Tsai C.-J., Maizel J.V., Nussinov R. The hydrophobic effect: a
new insight from cold denaturation and a two-state water
structure // Crit. Rev. Bioch. Mol. Biol.– 2002.– Vol. 37, N2.–
P. 55–69.
Yu Z.-W., Quinn P.J. Dimethyl sulphoxide: a review of its
application in cell biology // Biosci. Rep.– 1994.– Vol. 6, N6.–
P. 259–281.
Поступила 15.01.2008
Рецензент Е.Д. Розанова
Bonora S., Markarian S.A., Trinchero A., Grigorian K.R. DSC
study on the effect of DMSO and DESO on phospholipid
liposomes // Thermochimica Acta.– 2005.– Vol. 433, N1–2.–
P. 19–26.
Daggett V., Fersht A. Is there a unifying mechanism for protein
folding? // Trends Biochem. Sci.– 2003.– Vol. 28, N1.– P. 18–25.
Fink A.L. Effects of cryoprotectants on enzyme structure //
Cryobiology.– 1986.– Vol. 23, N1.– P. 28–37.
Gabrielian L.S., Markarian S.A. Temperature dependence of
the dielectric relaxation of liquid dimethyl- and diethylsulfoxi-
des // J. Mol. Liq.– 2004.– Vol. 112, N3.– P. 137–140.
Johannesson H., Denisov V., Halle B. Dimethyl sulfoxide
binding to globular proteins: a nuclear magnetic relaxation
dispersion study // Protein Sci.– 1997.– Vol. 6, N8.– P. 1756–
1763.
Markarian S.A., Asatryan A.A., Grigoryan K.R., Sargsyan H.R.
Effect of DESO on the thermal denaturation of DNA //
Biopolymers.– 2006.– Vol. 81, N1.– P. 1–5.
Markarian S.A., Asatryan A.M, Zatikyan A.L. Volumetric
properties of aqueous solutions of diethylsulfoxide at
temperatures from 298.15 K to 343.15 K // J. Chem. Therm.–
2005.– Vol. 37, N8.– P. 768–777.
Markarian S.A., Bonora, S. Bagramyan K.A., Arakelyan V.B.
Glass-forming property of the system diethyl sulphoxide/water
and its cryoprotective action on Escherichia coli survival //
Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N1.– P. 1–9.
Markarian S.A., Zatikyan A.L., Grigoryan V.V., Grigoryan G.S.
Vapor pressures of pure diethyl sulfoxide from (298.15 to
318.15) K and vapor-liquid equilibria of binary mixtures of
diethyl sulfoxide with water // J. Chem. Eng. Data.– 2005.–
Vol. 50, N1.– P. 23–25.
Michnik A., Drzazga Z. Effect of ethanol on the thermal stability
of human serum albumin // Journal of Thermal Analysis and
Calorimetry.– 2007.– Vol. 88, N2.– P. 449–454.
Muzammil S., Kumar Y., Tayyab S. Molten globule-like state
of human serum albumin at low pH // Eur. J. Biochem.– 1999.–
Vol. 266, N1.– P. 26–32.
Peters T.J. All about albumin biochemistry, genetics and
medical applications.– San Diego, CA: Academic Press,
1996.– 432 p.
Pico G.A. Thermodynamic features of the thermal unfolding
of human serum albumin // Inter. J. Biol. Macromol.– 1997.–
Vol. 20, N1.– P. 63–73.
Privalov P. Protein folding.– New York: W.H. Freeman and
Company, 1992.– 127 p.
Schellman J.A. Protein stability in mixed solvents: a balance
of contact interaction and exclided volume // Biophys. J.–
2003.– Vol. 85, N1.– P. 108–125.
Tsai C.-J., Maizel J.V., Nussinov R. The hydrophobic effect: a
new insight from cold denaturation and a two-state water
structure // Crit. Rev. Bioch. Mol. Biol.– 2002.– Vol. 37, N2.–
P. 55–69.
Yu Z.-W., Quinn P.J. Dimethyl sulphoxide: a review of its
application in cell biology // Biosci. Rep.– 1994.– Vol. 6, N6.–
P. 259–281.
Accepted in 15.01.2008
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-5397 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T22:28:03Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Григорян, К.Р. Маркарян, Ш.А. Азнаурян, М.Г. 2010-01-18T14:42:54Z 2010-01-18T14:42:54Z 2009 Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина / К.Р. Григорян, Ш.А. Маркарян, М.Г. Азнаурян // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5397 57.536.483 Методами электронной и флуоресцентной спектроскопии изучено влияние диметилсульфоксида (ДМСО) и диэтилсульфоксида (ДЭСО) на термическую (тепловую и холодовую) денатурацию сывороточного альбумина человека в температурном интервале от –20 до 90°С. Выявлено, что при тепловой денатурации в присутствии ДЭСО наблюдается переход кислотного характера при температуре 47,61°С, а при холодовой денатурации прямые гидрофобные взаимодействия сульфоксидов с поверхностью белка приводят к образованию стабильной “ледяной” оболочки, которая предохраняет белок от необратимых структурных изменений. Методами електронної та флуоресцентної спектроскопії досліджено вплив диметилсульфоксиду (ДМСО) і діетилсульфоксиду (ДЕСО) на термічну (теплову та холодову) денатурацію сироваткового альбуміну людини в температурному інтервалі від –20 до 90°С. Встановлено, що за теплової денатурації у присутності ДЕСО спостерігається перехід кислотного характеру при температурі 47,61°С, а за холодової денатурації прямі гідрофобні взаємодії сульфоксидів з поверхнею білка приводять до появи стабільної “льодяної” оболонки, яка захищає білок від необоротних структурних змін. The effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) and diethyl sulfoxide (DESO) on thermal (heat and cold) denaturation of human serum albumin within temperature range from –20 to 90°C was investigated by electron and fluorescent spectroscopy. It has been established that at heat induced denaturation in the presence of DESO an acid-neutral transition was observed at 47.61°C. It was shown that at cold induced denaturation the direct hydrophobic interactions of sulphoxide molecules with protein surface result in the formation of stable “ice” layer, providing the protein protection from irreversible structure changes. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина Effect of Dimethyl Sulfoxide and Diethyl Sulfoxide on Thermal Denaturation of Human Serum Albumin Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина Григорян, К.Р. Маркарян, Ш.А. Азнаурян, М.Г. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| title_alt | Effect of Dimethyl Sulfoxide and Diethyl Sulfoxide on Thermal Denaturation of Human Serum Albumin |
| title_full | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| title_fullStr | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| title_full_unstemmed | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| title_short | Влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| title_sort | влияние диметилсульфоксида и диэтилсульфоксида на термическую денатурацию человеческого сывороточного альбумина |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5397 |
| work_keys_str_mv | AT grigorânkr vliâniedimetilsulʹfoksidaidiétilsulʹfoksidanatermičeskuûdenaturaciûčelovečeskogosyvorotočnogoalʹbumina AT markarânša vliâniedimetilsulʹfoksidaidiétilsulʹfoksidanatermičeskuûdenaturaciûčelovečeskogosyvorotočnogoalʹbumina AT aznaurânmg vliâniedimetilsulʹfoksidaidiétilsulʹfoksidanatermičeskuûdenaturaciûčelovečeskogosyvorotočnogoalʹbumina AT grigorânkr effectofdimethylsulfoxideanddiethylsulfoxideonthermaldenaturationofhumanserumalbumin AT markarânša effectofdimethylsulfoxideanddiethylsulfoxideonthermaldenaturationofhumanserumalbumin AT aznaurânmg effectofdimethylsulfoxideanddiethylsulfoxideonthermaldenaturationofhumanserumalbumin |