Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах

Исследовали устойчивость эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) к воздействию 5 криозащитных сред и определяли условия их витрификации. Полученные экспериментальные данные показали, что на стадии развития, соответствующей началу пульсации сердца, наибольшее количество витрифицированных эмбрионов (до 1...

Full description

Saved in:

Bibliographic Details
Date:	2009
Main Authors:	Миксон, К.Б., Копейка, Е.Ф., Линник, Т.П.
Format:	Article
Language:	English
Published:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2009
Subjects:	Теоретическая и экспериментальная криобиология
Online Access:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5404
Tags:	Add Tag No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 2. — С. 154-162. — Бібліогр.: 32 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-5404
record_format	dspace
spelling	Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. 2010-01-18T17:33:40Z 2010-01-18T17:33:40Z 2009 Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 2. — С. 154-162. — Бібліогр.: 32 назв. — рос. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5404 597.554.3-131.7:547.569.2 Исследовали устойчивость эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) к воздействию 5 криозащитных сред и определяли условия их витрификации. Полученные экспериментальные данные показали, что на стадии развития, соответствующей началу пульсации сердца, наибольшее количество витрифицированных эмбрионов (до 100%) было при инкубировании 30 мин в криозащитной среде, состоящей из 30% сахарозы, 10% этиленгликоля, 3% полиэтиленоксида 1500 и 20% 1,2-пропандиола. Температура витрификации эмбрионов вьюна на этой стадии развития была в диапазоне –80...–176°С. Досліджували стійкість ембріонів в’юна (Misgurnus fossilis) до дії 5 кріозахисних середовищ і визначали умови їх вітрифікації. Отримані експериментальні дані показали, що на стадії розвитку, яка відповідає початку пульсації серця, найбільша кількість вітрифікованих ембріонів (до 100%) була при 30-хвилинній обробці їх кріозахисним середовищем, яке складається з 30% сахарози, 10% етиленгліколю, 3% поліетиленоксиду 1500 і 20% 1,2-пропандіолу. Температура вітрифікації ембріонів в’юна на цій стадії розвитку була в діапазоні –80...–176°С. Resistance of loach (Misgurnus fossilis) embryos to the effect of 5 cryoprotective media was investigated and the conditions of their vitrification were determined. The obtained experimental data demonstrated, that at a developmental stage, corresponding to the heart beating onset, the highest number of vitrified embryos (up to 100%) was observed during 30 min incubation within a cryoprotective medium, consisting of 30% sucrose, 10% ethylene glycol, 3% polyethylene oxide – 1500 and 20% 1,2-propane diol. Vitrification temperature of loach embryos at this developmental stage was within –80...–176°C range. en ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Теоретическая и экспериментальная криобиология Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах Conditions for Loach (Misgurnus fossilis) Embryo Vitrification in Cryoprotective Media Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах
spellingShingle	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П. Теоретическая и экспериментальная криобиология
title_short	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах
title_full	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах
title_fullStr	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах
title_full_unstemmed	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах
title_sort	условия витрификации эмбрионов вьюна (misgurnus fossilis) в криозащитных средах
author	Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П.
author_facet	Миксон, К.Б. Копейка, Е.Ф. Линник, Т.П.
topic	Теоретическая и экспериментальная криобиология
topic_facet	Теоретическая и экспериментальная криобиология
publishDate	2009
language	English
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
format	Article
title_alt	Conditions for Loach (Misgurnus fossilis) Embryo Vitrification in Cryoprotective Media
description	Исследовали устойчивость эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) к воздействию 5 криозащитных сред и определяли условия их витрификации. Полученные экспериментальные данные показали, что на стадии развития, соответствующей началу пульсации сердца, наибольшее количество витрифицированных эмбрионов (до 100%) было при инкубировании 30 мин в криозащитной среде, состоящей из 30% сахарозы, 10% этиленгликоля, 3% полиэтиленоксида 1500 и 20% 1,2-пропандиола. Температура витрификации эмбрионов вьюна на этой стадии развития была в диапазоне –80...–176°С. Досліджували стійкість ембріонів в’юна (Misgurnus fossilis) до дії 5 кріозахисних середовищ і визначали умови їх вітрифікації. Отримані експериментальні дані показали, що на стадії розвитку, яка відповідає початку пульсації серця, найбільша кількість вітрифікованих ембріонів (до 100%) була при 30-хвилинній обробці їх кріозахисним середовищем, яке складається з 30% сахарози, 10% етиленгліколю, 3% поліетиленоксиду 1500 і 20% 1,2-пропандіолу. Температура вітрифікації ембріонів в’юна на цій стадії розвитку була в діапазоні –80...–176°С. Resistance of loach (Misgurnus fossilis) embryos to the effect of 5 cryoprotective media was investigated and the conditions of their vitrification were determined. The obtained experimental data demonstrated, that at a developmental stage, corresponding to the heart beating onset, the highest number of vitrified embryos (up to 100%) was observed during 30 min incubation within a cryoprotective medium, consisting of 30% sucrose, 10% ethylene glycol, 3% polyethylene oxide – 1500 and 20% 1,2-propane diol. Vitrification temperature of loach embryos at this developmental stage was within –80...–176°C range.
issn	0233-7673
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5404
citation_txt	Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах / К.Б. Миксон, Е.Ф. Копейка, Т.П. Линник // Пробл. криобиологии. — 2009. — T. 19, № 2. — С. 154-162. — Бібліогр.: 32 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT miksonkb usloviâvitrifikaciiémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisvkriozaŝitnyhsredah AT kopeikaef usloviâvitrifikaciiémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisvkriozaŝitnyhsredah AT linniktp usloviâvitrifikaciiémbrionovvʹûnamisgurnusfossilisvkriozaŝitnyhsredah AT miksonkb conditionsforloachmisgurnusfossilisembryovitrificationincryoprotectivemedia AT kopeikaef conditionsforloachmisgurnusfossilisembryovitrificationincryoprotectivemedia AT linniktp conditionsforloachmisgurnusfossilisembryovitrificationincryoprotectivemedia
first_indexed	2025-11-27T09:05:18Z
last_indexed	2025-11-27T09:05:18Z
_version_	1850807792635478016
fulltext	154 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 * Àâòîð, êîòîðîìó íåîáõîäèìî íàïðàâëÿòü êîððåñïîíäåíöèþ: óë. Ïåðåÿñëàâñêàÿ, 23, ã. Õàðüêîâ, Óêðàèíà 61015; òåë.:+38 (057) 373-19-31, ôàêñ: +38 (057) 373-30-84, ýëåêòðîííàÿ ïî÷òà: cryo@online.kharkov.ua * To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 1931, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na- tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Èíñòèòóò ïðîáëåì êðèîáèîëîãèè è êðèîìåäèöèíû ÍÀÍ Óêðàèíû, ã. Õàðüêîâ УДК 597.554.3-131.7:547.569.2 Ê.Á. ÌÈÊÑÎÍ, Å.Ô. ÊÎÏÅÉÊÀ, Ò.Ï. ËÈÍÍÈÊ Óñëîâèÿ âèòðèôèêàöèè ýìáðèîíîâ âüþíà (Misgurnus fossilis) â êðèîçàùèòíûõ ñðåäàõ UDC 597.554.3-131.7:547.569.2 K.B. MIKSON, E.F. KOPEIKA, T.P. LINNIK Conditions for Loach (Misgurnus fossilis) Embryo Vitrification in Cryoprotective Media Исследовали устойчивость эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) к воздействию 5 криозащитных сред и определяли условия их витрификации. Полученные экспериментальные данные показали, что на стадии развития, соответствующей началу пульсации сердца, наибольшее количество витрифицированных эмбрионов (до 100%) было при инкубировании 30 мин в криозащитной среде, состоящей из 30% сахарозы, 10% этиленгликоля, 3% полиэтиленоксида 1500 и 20% 1,2-пропандиола. Температура витрификации эмбрионов вьюна на этой стадии развития была в диапазоне –80...–176°С. Ключевые слова: эмбрионы, вьюн (Misgurnus fossilis), криозащитная среда, витрификация. Досліджували стійкість ембріонів в’юна (Misgurnus fossilis) до дії 5 кріозахисних середовищ і визначали умови їх вітрифікації. Отримані експериментальні дані показали, що на стадії розвитку, яка відповідає початку пульсації серця, найбільша кількість вітрифікованих ембріонів (до 100%) була при 30-хвилинній обробці їх кріозахисним середовищем, яке складається з 30% сахарози, 10% етиленгліколю, 3% поліетиленоксиду 1500 і 20% 1,2-пропандіолу. Температура вітрифікації ембріонів в’юна на цій стадії розвитку була в діапазоні –80...–176°С. Ключові слова: ембріони, в’юн (Misgurnus fossilis), кріозахисне середовище, вітрифікація. Resistance of loach (Misgurnus fossilis) embryos to the effect of 5 cryoprotective media was investigated and the conditions of their vitrification were determined. The obtained experimental data demonstrated, that at a developmental stage, corresponding to the heart beating onset, the highest number of vitrified embryos (up to 100%) was observed during 30 min incubation within a cryoprotective medium, consisting of 30% sucrose, 10% ethylene glycol, 3% polyethylene oxide – 1500 and 20% 1,2-propane diol. Vitrification temperature of loach embryos at this developmental stage was within –80...–176°C range. Key-words: embryos, mud loach (Misgurnus fossilis), cryoprotectant medium, vitrification. Решение проблемы криоконсервирования ооци- тов и эмбрионов рыб позволит создать страховые запасы гамет и эмбрионов ценных и промысловых видов рыб, а также предотвратить их исчезновение в результате массовых эпизоотий [7]. Особенно это важно для редких и исчезающих видов [11]. Боль- шую пользу результаты исследований могут при- нести в селекции промысловых видов, при полу- чении товарной личинки в любое время года неза- висимо от их нерестовых периодов. Однако до настоящего времени методы крио- консервирования эмбрионов рыб не разработаны [15, 28, 30] из-за крупных размеров яйцеклеток, сложно устроенного комплекса, состоящего из эмб- риональных клеток и желточного мешка, низкой проницаемости мембран и чувствительности эм- брионов к переохлаждению [19, 21]. Попытки заморозить эмбрионы рыб традиционными мето- дами в средах с низкими концентрациями криопро- текторов и низкими скоростями охлаждения не дали надежных результатов [18]. Поэтому большинство Solving the problem of fish oocyte and embryo cryopreservation will enable creating the reserve stocks for gametes and embryos of useful and target fish species, as well as preventing their endangered state because of mass epizootic diseases [7]. This is of a special importance for rare and endangered species [11]. Research results may be of great benefit in se- lecting the target species, when procuring market larva at any season independently on their spawning periods. However the methods for fish embryo cryopre- servation have still remained undeveloped [15, 28, 30] because of a big size of oocytes, a complicated way of complex organisation, consisting of embryonic cells and yolk sac, low membrane permeability and embryo sensitivity to overcooling [19, 21]. The attempts to freeze fish embryos using the standard methods in the media with low cryoprotective concentrations and low cooling rates did not provide the reliable results [18]. Therefore the applying of vitrification procedure is considered to be perspective by most researchers [24, 27]. 155 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 исследователей считают перспективным примене- ние процедур витрификации [24, 27]. Использование сред с высокой концентрацией криопротекторов и последующей витрификацией эмбрионов солоноводных рыб позволило получить после размораживания 32% жизнеспособных эмб- рионов ложного палтуса [9] и 2,13% желтой камба- лы [26]. Однако эмбрионы пресноводных рыб ме- нее устойчивы к экстремальным факторам крио- консервирования [9, 26]. Поэтому для эмбрионов каждого вида рыб необходимо определять как крио- защитную среду, так и условия их витрификации. Цель данной работы – определение состава криозащитной среды и режимов охлаждения, поз- воляющих витрифицировать эмбрионы вьюна на стадии развития 35 (начало пульсации сердца). Ìàòåðèàëû è ìåòîäû Половозрелых особей вьюна (Misgurnus fossi- lis L. 1758) возрастом от 4 до 6 лет отлавливали из мест их природного обитания во время ледостава, сортировали по полу и содержали раздельно при 4–5°C в пластиковых контейнерах с отстоянной водопроводной водой. Перед проведением экспе- риментов температуру повышали до 21°C [1]. В каждом эксперименте при повторах (n = 5) было использовано 3 самки и 5 самцов. Эмбрионы были получены по методу, модифи- цированному Нейфахом [4]. После инъекции хорио- нического гонадотропина (самкам по 300 ед., сам- цам по 100 ед.) производителей помещали в пласти- ковые контейнеры с отстоянной водопроводной во- дой объемом 10 л и содержали при температуре 21°C. Созревание наступало через 30–36 ч. Икру каждой самки осеменяли смесью измельченных семенников от нескольких самцов и распределяли по чашкам Петри примерно по 200 штук для пос- àäåðÑ muideM %,àâòñåùåâåèíàæðåäîÑ %,tnetnocecnatsbuS àçîðàõàÑ esorcuS ÎÝÏ - 0051 OEP - 0051 ÃÝ GE 2,1 - ÄÏ 2,1 -DP ÖÀÌ CAM 1Ñ 03 3 5,7 02 5,2 2Ñ 3,7 51,2 5,7 - - 3Ñ 8 2,2 01 - - 4Ñ 03 3 01 02 - 5Ñ 03 3 01 - - Состав криозащитных сред Composition of cryoprotective media Примечание: ПЭО-1500 – полиэтиленоксид с м. м. 1500; ЭГ – этиленгли- коль; 1,2-ПД – 1,2-пропандиол; МАЦ – метилацетамид. Notes: PEO-1500 – polyethylene oxide with molecular weight 1500; EG – ethylene glycol; 1,2-PD – 1,2-propane diol; MAC – methyl acetamide. ледующей инкубации в воде при темпе- ратуре 21°C, pH 7,2, dGH 6,7 мг-экв/л. Воду меняли три раза в сутки. Погиб- шие и остановившиеся в развитии эмб- рионы удаляли. Оценку развивающихся эмбрионов проводили согласно картам эмбрионального развития [1]. Развиваю- щиеся эмбрионы, которые находились на стадии развития, соответствующей на- чалу пульсации сердца, отбирали при каждом повторе от трех самок. Эмб- рионы освобождали от наружных оболо- чек гидравлическим ударом без повреж- дений. В каждой серии эмбрионы от трех самок (20 штук) подвергали обработке криозащитными средами (таблица) с интервалом в 5 мин в течение 25–60 мин для установления времени выживания. Using the media with high cryoprotective concen- tration and following embryo vitrification of saltwater fish species enabled to obtain after freeze-thawing 32 and 2.13% of viable embryos of flounder [9] and Alaska plaice [26], correspondingly. However the freshwater fish embryos are less resistant to extreme cryopreservation factors [9, 26]. Therefore for emb- ryos of each species it is necessary to determine both cryoprotective medium and conditions for their vitrifica- tion. This research was aimed to determine the compo- sition of cryoprotective medium and cooling regimens, allowing to vitrify loach embryo at the developmental stage 35 (heart beating onset). Materials and methods Mature loach (Misgurnus fossilis L. 1758) species aged from 4 to 6 years were caught from their natural habitats during freeze-up, sex-graded and kept separately at 4–5°C in plastic containers with settled tap water. Prior to experiment performance we rise temperature up to 21°C [1]. In each experiment with the repeats (n = 5) we used 3 females and 5 males. Embryos were procured according to the method, modified by Neifakh [4]. After injecting chorionic gonadotropin (by 300 and 100 units for females and males, correspondingly) the spawners were placed into 10 l plastic containers with settled water and kept at 21°C. Maturation occurred in 30–36 hrs. Each female eggs were inseminated by the mixture of testes from several males and distributed by Petri dishes approxi- mately by 200 pieces for following incubation in water at 21°C, pH 7.2, dGH 6.7 mg-eq/l. Water was changed thrice a day. Died and stopped in their development embryos were removed. Developing embryos were estimated according to the embryonic development maps [1]. Embryos in progress, being at the develop- s c 156 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 За развитием отмытых эмбрионов наблюдали до стадии свободно плавающей личинки. Для замораживания эмбрионы отбирали микро- пипеткой поштучно с общим объемом криозащит- ной среды 15–20 мкл и накапывали на охлажден- ную медную пластину, размещенную в парах жид- кого азота. Витрифицированные эмбрионы в каж- дой среде определяли визуально по степени проз- рачности. Статистический анализ проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA. Для определения статистически значимых различий по выживаемости в сравниваемых группах эмбрионов использовали тесты Тюки и Манна-Уитни. Статис- тически значимыми отличия считали при р < 0,05. Результаты представляли в виде среднего ± стан- дартная ошибка. Все величины преобразовывали в arcsin для приведения полученных данных к нормальному распределению. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Эмбрионы костистых рыб развиваются быстро, и их устойчивость к криопротекторам и переохлаж- дению изменяется неравномерно, что некоторые авторы [17, 29] связывают с асинхронностью деле- ния клеток на разных стадиях развития. Количество желтка на поздних стадиях развития значительно снижается в связи с интенсивным эндогенным питанием, а оболочки хориона разрыхляются [1], что позволяет уменьшить время эквилибрации в криозащитных средах. Чтобы достичь состояния витрификации при замораживании эмбрионов вьюна на стадии развития 35 использовали высокие концентрации криозащитных сред. В связи с низкой проницаемостью эмбриональ- ных мембран необходимо увеличивать время инкубации эмбрионов в криозащитных средах, что могло привести к их гибели еще до замораживания вследствие токсичности криопротекторов [7, 26]. Поэтому на первом этапе исследований опреде- ляли динамику гибели эмбрионов в зависимости от времени эквилибрации с криозащитными сре- дами. Было установлено, что при инкубации эмбрио- нов в криозащитных средах в течение 25 мин пока- затель уровня выживаемости не имел статисти- чески значимых различий с контрольными группа- ми (тест Манна-Уитни, р < 0,05) (рис. 1). При инкубации эмбрионов в течение 30 мин наблюдалось несущественное снижение уровня их выживаемости во всех криозащитных средах. Пос- ле инкубации в криозащитных средах в течение 30–35 мин сердце перестает пульсировать, но у отмытых эмбрионов впоследствии восстанавли- валось биение сердца и сохранялась способность к развитию. Увеличение времени инкубации эмб- mental stage, corresponding to the heart beating onset, were selected at every repeat from three females. External embryonic membranes were removed by means of hydraulic shock without damages. In each series the embryos of three females (20 pieces) were treated with cryoprotective media (Table) with 5 min interval during 25–60 min to establish a survival time. Development of washed-out embryos was obser- ved up to the stage of free swimming larvae. For freezing the embryos were selected with micro- pipette by the piece with 15–20 ml total volume of cryoprotective medium and pipetted on a cooled copper plate, placed in liquid nitrogen vapour. Vitrified embryos in each medium were visually detected by the clarity degree. Statistical processing was done using the “Statis- tica” software. In order to determine the statically significant differences on the survival rate in embryo groups under comparison we used the Tukey’s and Mann-Whitney’s tests. Statistically significant values were calculated at p < 0.05. Results were presented as a mean ± standard error. All values were transfor- med in arcsin to bring the obtained data into the normal distribution. Results and discussion Bony fish embryos develop rapidly and their resistance to cryoprotectants and overcooling changes in a nonuniform way, that is believed by some authors [17, 29] to be associated with cell mitosis at different developmental stages. At late developmental stages the yolk amount considerably reduces due to an intensive endogenous nutrition and the chorion mem- branes are getting loosed [1], allowing to reduce the equilibration time in cryoprotective media. To achieve the vitrification state during loach embryo freezing at developmental stage 35 we used high concentrated cryoprotective media. Due to a low permeability of embryonic membranes it is necessary to increase the incubation time for emb- ryos in cryoprotective media, that might result in their death even before freezing because of cryoprotective toxicity [7, 26]. Therefore at the first stage of research we determined the dynamics of embryo death depen- ding on equilibration time with cryoprotective media. During 25 min incubation of embryos in cryopro- tective media the index of survival level was established to have no statistically significant differences with the control groups (Mann-Whitney’s test, p < 0.05) (Fig. 1). During 30 min embryo’s incubation a slight decrease in their survival level was observed in all the cryopro- tective media. After incubating in cryoprotective media within 30–35 min, heart stops beating, but in washed embryos heart beatings recovered and the capability for development was kept. 157 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 рионов от 40 до 60 мин приводило к высокой смерт- ности, что нецелесообразно при проведении замо- раживания, т. е. оптимальное время эквилибрации составляет 30–35 мин. Мы использовали в криозащитных средах криопротекторы 1,2-пропандиол (1,2-ПД) и полиэти- леноксид с м. м. 1500 (ПЭО-1500) потому, что эти криопротекторы в составе криозащитных сред для эмбрионов других карповых были отмечены как малотоксичные [29]. Добавление в криозащитные среды С1 и С4 криопротекторов 1,2-ПД и ПЭО- 1500 не оказало отрицательного воздействия на выживаемость эмбрионов при инкубировании в течение 35 мин, несмотря на то, что в С1 выживае- мость наименьшая, а в С4 – наибольшая. Было установлено, что метилацетамид (МАЦ) обладает высокой проницаемостью и не оказывает существенного влияния на выживаемость сперма- тозоидов птиц [2], но в наших экспериментах он оказал негативное влияние на выживаемость эмб- рионов вьюна при увеличении времени инкубации свыше 15 мин, что согласуется с [12]. В среде С1 с присутствием криопротектора МАЦ установлен самый низкий уровень выживаемости. Однако нами было показано, что увеличение содержания сахарозы в криозащитных средах способно в некоторой степени снизить токсичность остальных криопротекторов и нейтрализовать их негативное влияние. Это согласуется с результатами [23]. Эффект влияния самок на выживаемость эмб- рионов наблюдался во всех экспериментальных группах (рис. 2). Были установлены различия по уровню выжи- ваемости между группами эмбрионов, полученных Rise in incubation time for embryos to 40–60 min resulted in a high mortality rate, that was not expedient during freezing and the optimal equilibration time was 30–35 min. We used 1,2-propane diol (1,2-PD) and polyethy- lene oxide with molecular weight of 1500 (PEO-1500) in cryoprotective media because of their low-toxicity as part of cryoprotective media for embryos of other carp species [29]. Adding 1,2-PD and PEO-1500 into C1 and C4 cryoprotective media had no negative effect on embryo survival during 35 min incubation, despite the fact, that the lowest and highest survivals were in C1 and C4, correspondingly. Methyl acetamide (MAC) was established to have a high permeability and no significant effect on bird spermatozoa survival [2], but in our experiments it negatively affected the index for loach embryo when increasing incubation time over 15 min, that correlated to the data, reported in the paper [12]. In C1 medium with MAC presence there was established the lowest survival level. However we demonstrated a sucrose content increase in cryoprotective media as capable to reduce in some extent the toxicity of the rest cryo- protectants and neutralise their negative effect. This correlates with the result [23]. The effect of female influence on embryo survival was observed in all the experimental groups (Fig. 2). Differences on survival level between embryo groups, obtained from different females, were estab- lished. Statistically significant differences were defined between the 2nd and 3rd females. The same effect was found in the paper [12, 22]. Differences in embryo survival of different females the authors explained by those in fish physiological state and its embryos as well. �� С4* 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 25 30 35 40 45 50 55 60 К Время эквилибрации, мин Equilibration duration, min Рис. 1. Выживаемость эмбрионов вьюна (среднее ± стандартная ошибка) в зависимости от времени инкубации в криозащитных средах (n = 5): – C1; – C2; – C3; 123 123 – C4; 123123 – C5;К – контроль;* – статистические различия между значениями для времени инкубации, р < 0,05 Fig. 1. Loach embryo survival (mean ± standard error) depending on incubation time in cryoprotective media (n = 5): – C1; – C2; – C3; 12 12 12 – C4; 123 123 123 – C5; K is control; * – statistically significant differences between values for equilibration time, p < 0.05, Вы жи ва ем ос ть э м бр ио но в, a rc si n % Em br yo s ur vi va l, ar si n % * * * * 158ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 от разных самок. Статистически значимые разли- чия были определены между 2-й и 3-й самками. Подобный эффект был описан в [3, 22]. Различия в выживаемости эмбрионов разных самок авторы объяснили различиями в физиологическом состоя- нии рыб, и, следовательно, их эмбрионов. Эмбрионы, обработанные в течение 30 мин криозащитными средами, замораживали для опре- деления оптимальной витрифицирующей среды. Измерение температуры медной пластины с по- мощью термопары показало, что диапазон темпе- ратур, в котором происходит витрификация, –80... –176°С. При более высоких температурах замора- живания не наблюдалось стеклования объектов, а при температуре замораживания ниже –176°С не удавалось зафиксировать стеклование, так как капля раствора с эмбрионом разрушалась. При замораживании определялся наибольший процент витрифицированных эмбрионов (рис. 3). Установлено, что эмбрионы вьюна имеют вы- сокую устойчивость к воздействию криопротекто- ров на стадиях развития 23–35 (образование за- чатков глаз – начало пульсации сердца) [3]. Для каждого вида рыб эти стадии индивидуальны, и у большинства исследованных находятся в диапа- зоне между стадией развития, соответствующей поздней гаструле и началу биения сердца [16, 31, 32]. Однако эмбрионы вьюна на стадии развития 23 имеют большое количество желтка, который может препятствовать их витрификации [20]. На более поздних стадиях развития желточный мешок меньше. Кроме того, мы предположили, что на стадии 35 проницаемость эмбриональных мембран выше, что поможет осуществить дегидратацию эмбрионов и насыщение их криозащитными сре- дами. Наши результаты согласуются с результа- тами Robles et al. [26, 27] об устойчивости эмб- рионов на поздних стадиях развития к переохлаж- дению, токсичности криопротекторов и механичес- ким повреждениям. В наших экспериментах невитрифицированные эмбрионы были белого цвета, что указывает на при- сутствие межклеточных и внутриклеточных крис- таллов льда у эмбриона или желточного мешка. Было установлено, что лучшей средой, в кото- рой наблюдался наибольший процент витрифи- цированных эмбрионов, является среда С4, состоя- щая из 30% сахарозы + 10% этиленгликоля (ЭГ) + 3% ПЭО-1500 и 20% 1,2-ПД. После витрифицирования эмбрионы погружали в жидкий азот и сохраняли в течение 60 мин, отогре- вали эмбрионы в чашках Петри объемом 40 мл с водой при температуре 22°С. Для удаления крио- протекторов троекратно меняли воду. В дальней- шем эмбрионы инкубировались при температуре Embryos treated with cryoprotective media for 30 min were frozen to determine the optimal vitrifying medium. Measuring temperature of copper plate using thermocouple has shown the temperature range, where vitrification occurs, to be –80...–176°C. Under higher freezing temperatures no objects’ vitrification was observed, but under those, lower than –176°C the vitrification could not be fixed because of the dest- ruction of embryo-contained solution drop with . During freezing there was determined the highest percentage of vitrified embryos (Fig. 3). Loach embryos were established to be high resistant to cryoprotective effect at developmental stages 23- 35 (eye bud formation – heart beating onset) [3]. For each fish species these stages are individual and in the most researches they are within the range between developmental stage, corresponding to the late gastrula and heart beating onset [16, 31, 32]. However the loach embryos at the developmental stage 23 have a big amount of yolk, which may prevent their vitrification [20]. At later developmental stages the yolk sac is smaller. In addition, we believed that at the stage 35 the permeability of embryonic membranes was higher, assisting in realising embryo dehydration and their saturation with cryoprotective media. Our results correlate with those of Robles et al. [26, 27] on embryo resistance at later developmental stages to overcooling, cryoprotective toxicity and mechanical damages. Рис. 2. Выживаемость эмбрионов разных самок после инкубирования в криозащитных средах. Статистически значимые различия существуют между группами, не имеющими одинаковых символов (тест Тюки, р < 0,05, n=5): – стандартное отклонение; – стандартная ошибка; – среднее. Fig. 2. Survival of embryos from different females after incubating in cryoprotective media. Statistically significant differences exist between the groups without equal symbols (Tukey’s test, p<0.05, n = 5): – standard deviation; – standard error; – is mean. Самки Females Вы жи ва ем ос ть э м бр ио но в, a rc si n % Em br yo s ur vi va l, ar si n % 159 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 20°С. Видимых морфологических изменений у размороженных эмбрионов в сравнении с контроль- ными группами не установлено, но отсутствовало биение сердца. Статистически значимые отличия в показа- телях уровня гибели эмбрионов установлены после 6 ч инкубации (~ 20%) (p < 0,05). Через 14 ч инкуба- ции после оттаивания во всех случаях (n = 5) эмбрионы погибали (100%), что выражалось в побелении эмбрионов, указывающее на некроти- зацию тканевых структур (рис. 4). Для эмбрионов морского карася на стадии раз- вития, соответствующей началу биения сердца, ус- тановлено, что с увеличением концентрации криозащитной среды повышается процент витри- фицированных эмбрионов [12]. При использовании криозащитной среды, состоящей из 20,5% диме- тилсульфоксида + 15,5% ацетамида + 10% пропи- ленгликоля + 6% пропиленэтиленгликоля был получен относительно высокий процент витрифици- рованных эмбрионов (> 40%). Но уровень смерт- ности резко возрастал с увеличением времени экви- либрации (более 15 мин) в этой среде. После размо- раживания все эмбрионы погибали. Они белели или имели повреждения в виде разбухания, деструкту- ризации оболочек и др. При замораживании эмбрионов ложного пал- туса в криозащитных средах с различными комби- a c ab b c 0 20 40 60 80 100 C1 C2 C3 C4 C5 Криозащитная среда Cryoprotective medium Ви тр иф иц ир ов ан ны е э м бр ио ны , % Vi tri fie d em br yo s, % Рис. 3. Витрификация эмбрионов после 30 мин эквилиб- рации в 5 криозащитных средах. Статистически значимые различия определены между группами, не имеющими одинаковых символов (тест Тюки, р < 0,05, среднее ± стандартная ошибка, n = 5). Fig. 3. Embryo vitrification after 30 min equilibration in 5 cryoprotective media. Statistically significant differences were determined between the groups without equal symbols (Tukey’s test, p < 0.05, mean ± standard error, n = 5). In our experiments the non-vitrified embryos were white, suggesting the presence of inter- and intracellular ice crystals in embryos or yolk sac. It was established that the best medium with obser- ved highest percentage of vitrified embryos was the medium C4, consisting of 30% sucrose + 10% ethylene glycol (EG) + 3% PEO-1500 and 20% 1,2-PD. After vitrifying the embryos were immersed into liquid nitrogen and preserved within 60 min, then thawed in 40 ml Petri dishes with water at 22°C. Water was thrice changed for cryoprotectant removing. Further embryos were incubated at 20°C. No visible morphological changes in frozen-thawed embryos compared to the control groups were revealed, but heart beating was absent. Statistically significant differences in the indices of embryo death level were found out 6 hrs later incu- bation (20%) (p < 0.05). After 14 hrs incubation follo- wing thawing in all the cases (n = 5) the embryos died (100%), that was manifested in embryo whitening, pointing to the tissue structure nectrotisation (Fig. 4). For red sea bream embryos at the developmental stage, corresponding to the heart beating onset, there was established, that with an increase in cryoprotective medium concentration the percentage of vitrified embryos augmented [12]. When using cryoprotective medium, comprising 20.5% dimethyl sufoxide +15.5% acetamide + 10% propylene glycol + 6% propylene ethylene glycol, quite a high percentage of vitrified embryos (> 40%) was obtained. However the mortality level sharply increased with a rise in equilibration time (more than 15 min) in this medium. After freeze- 0 20 40 60 80 100 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Время инкубации, ч Incubation duration, hrs Вы жи ва ем ос ть э м бр ио но в, % Em br yo s ur vi va l, % Рис. 4. Выживаемость эмбрионов вьюна после оттаи- вания (n = 5), среднее ± стандартное отклонение: – n 1; – n 2; – n 3; – n 4; – n 5. Fig. 4. Loach embryo survival after thawing (n = 5), mean ± standard deviation: – n 1; – n 2; – n 3; – n 4; – n 5. 160 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 нациями метанола, глицерина и пропиленгликоля отмечался высокий процент витрификации (85– 95%) [9]. При этом был получен высокий показа- тель уровня выживаемости эмбрионов (до 32%) при оттаивании. Эмбрионы наблюдались в течение 90 ч, что составило время от момента оттаивания до гибели последнего. Однако в сообщении [13] указывается на недо- статки этого метода. Повторный эксперимент, проведенный при тех же условиях, показал низкий уровень витрифицированных эмбрионов. При дальнейшем охлаждении часть их белела, что указывало на присутствие критического объема кристаллической фазы, а при отогреве все эмб- рионы белели. При замораживании эмбрионов линя в указан- ных криозащитных средах при тех же условиях (в экспериментах использовано свыше 5000 эмбрио- нов) [14] результаты соответствовали данным [13]. Это объяснялось тем, что эмбрионы пресноводных рыб менее устойчивы к высоким концентрациям криопротекторов, чем эмбрионы морских, которые имеют природную резистентность к гипертоничес- ким растворам [10, 26]. В работе [26] использовали криозащитные сре- ды, состоящие из комбинаций метанола, пропан- диола и этиленгликоля, в которых 0,92–2,13% эмб- рионов желтой камбалы определены как морфо- логически интактные в течение первого часа после оттаивания, но они не развивались и затем все поги- бали. Таким образом, в нашей работе получен ус- тойчивый высокий уровень витрифицирования эмбрионов вьюна (91,3 ± 18,7%), что позволяет говорить о необходимости продолжения исследова- ний в данном направлении. Мы предполагаем, что гибель эмбрионов после отогрева была обусловлена различными причина- ми. Во-первых, возможно существовали микропов- реждения, вызванные криозащитными средами, и дальнейшее охлаждение отрицательно сказы- валось на компенсаторных реакциях [6, 8]. Во- вторых, при охлаждении вероятно возникали микроскопические центры кристаллизации, что приводило к рекристаллизационным процессам, вызывающим механические повреждения отдель- ных клеток при оттаивании [18]. В-третьих, повреждения мембранных структур были связа- ны с индивидуальной чувствительностью биологи- ческого объекта [5, 25] или были использованы неоптимальные режимы оттаивания [7]. Âûâîäû В результате проведенных исследований опре- делена лучшая среда для витрифицирования эмб- рионов вьюна на стадии пульсации сердца сос- thawing all embryos died. They whitened and had swelling-like damages, membrane destructurisation etc. When freezing Japanese flounder’s embryos within cryoprotective media with different combinations of methanol, glycerol and propylene glycol there was ob- served a high percentage of vitrification (85–95%) [9]. At the same time there was obtained a high index of embryo survival level (up to 20%) during thawing. Emb- ryos were observed during 90 hrs, that made the time from the moment of thawing to the death of last one. However this method’s disadvantages are reported in the paper [13]. Repeated experiment, performed under the same conditions showed a low level of vitrified embryos. During following cooling a part of them whitened, that pointed to the presence of critical volume of crystal phase, but under thawing all embryos whitened. During freezing of common tench embryos in the mentioned cryoprotective media under the same conditions (over 5,000 embryos were used in the experiments) [14], the results corresponded to the data, reported in the paper [13]. This was explained by the fact, that freshwater fish embryos were less resistant to high concentrations of cryoprotectants, than those of seawater ones, which had a natural resistance to hypertonic solutions [10, 26]. In the paper [26] there were applied cryoprotective media, consisting of methanol, propanediol and ethylene glycol combinations, where 0.92–2.12% Alaska plaice embryos were determined as morphologically intact within the first hour after thawing, but they did not develop and then all died. Thus, in our research we obtained a stable high rate (91.3 ± 18.7%) of vitrified loach embryos (despite freshwater species), that enabled concluding about a right way in studying fish embryo freezing. We assume embryo death after thawing as stipu- lated by different causes. First, microdamages of chemical character, caused by cryoprotective media, might occur and further cooling negatively affected the compensatory reactions [6, 8]. Secondly, there was a probable formation of microscopic centers of crystallisation, resulting in recrystallisation micro- processes, causing mechanical damages of single cells during thawing [18]. Thirdly, the damages of membrane structures were associated to an individual sensitivity of biological object [5, 25] or non-optimal regimens of thawing were used [7]. Conclusions As a result of the research performed there was determined the best medium for loach embryo vitrification at heart beating stage, consisting of 30% sucrose, 10% EG, 3% PEO-1500 and 20% 1,2-PD. Freezing regimen, enabling to achieve 91.3 ± 18.7% embryo vitrification was determined. 161 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 тоящая из 30% сахарозы, 10% ЭГ, 3% ПЭО-1500 и 20% 1,2-ПД. Определен режим замораживания, позволяю- щий достичь 91,3 ± 8,7% витрификации эмбрионов. Установлено, что выживаемость эмбрионов в криозащитных средах зависит от индивидуальных особенностей особей, от которых были получены клетки. Литература Костомарова А.А. Вьюн Misgurnus fossilis L. // Объекты биологии развития.– М.: Наука, 1975.– C. 308–323. Линник Т.П., Бизикина О.В . Криоконсервирование спермы петухов. II. Криопротекторная активность амидов и диолов // Пробл. криобиологии.– 2001.– №4.– С. 43–51. Миксон К.Б., Копейка Е.Ф., Ишков Г.С. Влияние компо- нентов криозащитной среды на эмбрионы вьюна (Misgur- nus fossilis, L.1758) // Ветеринарна медицина: Міжвідом- чий тематичний збірник.– 2008.– Вип. 89.– С. 271–274. Нейфах А.А. Использование метода радиоактивной инактивации ядер для исследования их функций в раннем развитии рыб // Журн. общей биол.– 1959.– №20.– С. 202-213. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы.– Киев: Наук. думка, 1978.– 204 с. Ahammad M.M., Bhattacharyya D., Banerjee R.D., Bandyo- padhyay P.K. Toxicity of protectants to embryos of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) after cold storage at different storage time periods // Cell Preservation Technology.– 2004.– Vol. 2, N3.– P. 227–233. Bart A.N. New approaches in cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 179– 187. Cabrita E., Robles V., Chereguini O., Real M. et al. Toxicity of different permeable and non-permeable cryoprotectants on turbot embryos (Scophthalmus maximus) // Cryobiology.– 2002.– Vol. 45, N3.– P. 261. Chen S.L., Tian Y.S. Cryopreservation of flounder (Para- lichthys olivaceus) embryos by vitrification // Therioge- nology.– 2004.– Vol. 63, N4.– P. 1207–1219. Chen S.L. Progress and prospect of cryopreservation of fish gametes and embryos // J. Fish China.– 2002.– Vol. 26, N2.– P. 161–168. Cryopreservation in aquatic species / Eds: T.R. Tiersch and P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World Aquaculture Society, 2000.– 441 p. Ding F.H., Xiao Z.Z., Li J. Preliminary studies on the vitrification of red sea bream (Pagrus major) embryos // Theriogenology.– 2007.– Vol. 68, N5.– P. 702–708. Edashige K., Valdez D.M., Hara T. et al. Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) embryos are difficult to cryopre- serve by vitrification // Cryobiology.– 2006.– Vol. 53, N1.– P. 96–106. El-Battawy K.A., Linhart O. Preleminary studies on cryopreservation of common tench (Tinca tinca) embryos (Work in progress) // Journal of Fisheries International.– 2008.– Vol. 3, N1.– P. 12–18. Gwo J.C. Cryopreservation of eggs and embryos from aquatic organisms / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 211– 229. Haga Y. On the subzero temperature preservation of fertilised eggs of rainbow trout // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.– 1982.– Vol. 48, N11.– P. 1569–1572. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Embryo survival in cryoprotective media was established as dependent on individual peculiarities of females. References Kostomarova A.A. Loach Misgurnus fossilis L. // Objects of developmental biology.– Moscow: Nauka, 1975.– P. 308–323. Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. II. Amide and diol cryoprotective activity // Problems of Cryo- biology.– 2001.– N4.– P. 43–51. Mikson K.B., Kopeika E.F., Ishkov G.S. Effect of components of cryoprotective media on loach embryos (Missgurnus fossilis, L. 1758) // Veterinarnaya meditsina: Interdepartmental Thematic Collection.– 2008.– Issue 89.– P. 271–274. Neifakh A.A. Usage of method of radioactive inactivation of nuclei for studying their function in early development of fish // Zhurn. Obschey Biologii.– 1959.– N20.– P. 202–213. Pushkar N.S., Shrago M.I., Belous A.M., Kalugin Yu.V. Cryoprotectants.– Kiev: Nauk. dumka, 1978.– 204 p. Ahammad M.M., Bhattacharyya D., Banerjee R.D., Bandyo- padhyay P.K. Toxicity of protectants to embryos of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) after cold storage at different storage time periods // Cell Preservation Technology.– 2004.– Vol. 2, N3.– P. 227–233. Bart A.N. New approaches in cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 179– 187. Cabrita E., Robles V., Chereguini O., Real M. et al. Toxicity of different permeable and non-permeable cryoprotectants on turbot embryos (Scophthalmus maximus) // Cryobiology.– 2002.– Vol. 45, N3.– P. 261. Chen S.L., Tian Y.S. Cryopreservation of flounder (Para- lichthys olivaceus) embryos by vitrification // Therioge- nology.– 2004.– Vol. 63, N4.– P. 1207–1219. Chen S.L. Progress and prospect of cryopreservation of fish gametes and embryos // J. Fish China.– 2002.– Vol. 26, N2.– P. 161–168. Cryopreservation in aquatic species / Eds: T.R. Tiersch and P.M. Mazik.– Baton Rouge: The World Aquaculture Society, 2000.– 441 p. Ding F.H., Xiao Z.Z., Li J. Preliminary studies on the vitrification of red sea bream (Pagrus major) embryos // Theriogenology.– 2007.– Vol. 68, N5.– P. 702–708. Edashige K., Valdez D.M., Hara T. et al. Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) embryos are difficult to cryopre- serve by vitrification // Cryobiology.– 2006.– Vol. 53, N1.– P. 96–106. El-Battawy K.A., Linhart O. Preleminary studies on cryopreservation of common tench (Tinca tinca) embryos (Work in progress) // Journal of Fisheries International.– 2008.– Vol. 3, N1.– P. 12–18. Gwo J.C. Cryopreservation of eggs and embryos from aquatic organisms / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 211– 229. Haga Y. On the subzero temperature preservation of fertilised eggs of rainbow trout // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.– 1982.– Vol. 48, N11.– P. 1569–1572. Hagedorn M., Kleinhans F.W. Problems and prospects in cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 161–178. Hagedorn M., Peterson A., Mazur P., Kleinhans F.W. High ice nucleation temperature of zebrafish embryos: slow– freezing is not an option // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.– P. 181–189. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 162 PROBLEMS OF CRYOBIOLOGY Vol. 19, 2009, ¹2 ÏÐÎÁËÅÌÛ ÊÐÈÎÁÈÎËÎÃÈÈ Ò. 19, 2009, ¹2 Hagedorn M., Kleinhans F.W. Problems and prospects in cryopreservation of fish embryos / Cryopreservation in Aquatic Species. The World Aquaculture Society.– Louisiana: Baton Rouge, 2000.– P. 161–178. Hagedorn M., Peterson A., Mazur P., Kleinhans F.W. High ice nucleation temperature of zebrafish embryos: slow– freezing is not an option // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.– P. 181–189. Hagedorn M., Kleinhans F.W., Wildt D.E. et al. Chilling sensitivity and cryoprotectant permeability of dechorionated zebrafish embryos, Brachydanio rerio // Cryobiology.– 1997.– Vol. 34, N3.– P. 251–263. Hagedorn M., Hsu E.W., Pilatus U. et al. Magnetic resonance microscopy and spectroscopy reveal kinetics of cryoprotec- tant permeation in a multicompartment biological system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.– 1996.– Vol. 93, 15.– P. 7454– 7459. Isaeva A., Zhang T., Rawson D.M. Studies sensitivity of zebrafish (Danio rerio) oocytes // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.– P. 114–122. Kopeika J., Kopeika E., Zhang T. et al. Effect of DNA repair inhibitor (3-aminobenzamide) on genetic stability of loach (Misgurnus fossilis) embryos derived from cryopreserved sperm // Theriogenology.– 2004.– Vol. 69, N9.– P. 1661–1673. Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M. Sugar exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have low toxity to embryos and oocytes // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N2.– P. 119–130. Liu K.C., Chou T.C., Lin H.D. Cryosurvival of goldfish embryo after subzero freezing // Aquatic Living Resources.– 1993.– Vol. 6, N3.– P. 63–66. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury // Cryobiology.– 1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500. Robles V., Cabrita E., Fletcher G.L. et al. Vitrification assays with embryos from a cold tolerant sub-arctic fish species // Teriogenology.– 2005.– Vol. 64, N7.– P. 1633–1646. Robles V., Cabrita E., Real M. et al. Vitrification of turbot embryos: preliminary assays // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47, N1.– P. 30–39. Tian Y.S., Chen S.L., Yan A.S. et al. Studies on vitrification method of sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos // Acta Zoologica Sinica.– 2003.– N49.– P. 843–850. Zhang T.T. Cryopreservation of gametes and embryos of aquatic species // Life in the Frozen State / Ed. by B. Fuller, E. Benson, N. Lane.– Luton: CRC Press LLC, 2004.– P. 415– 436. Zhang T.T., Rawson D.M. Feasibility studies on vitrification of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos // Cryobio- logy.– 1996.– Vol. 33, N1.– P. 1–13. Zhang T.T., Rawson D.M., Morris G.J. Cryopreservation of pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio) // Aquatic Living Resources– 1993.– Vol. 6, N2.– P. 145–153. Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C. et al. A study on the cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) emb- ryos // Cryo-Letters.– 1989.– Vol. 10.– Р. 271–278. Поступила 19.05.2009 Рецензент И.Ф. Коваленко 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. Hagedorn M., Kleinhans F.W., Wildt D.E. et al. Chilling sensitivity and cryoprotectant permeability of dechorionated zebrafish embryos, Brachydanio rerio // Cryobiology.– 1997.– Vol. 34, N3.– P. 251–263. Hagedorn M., Hsu E.W., Pilatus U. et al. Magnetic resonance microscopy and spectroscopy reveal kinetics of cryoprotec- tant permeation in a multicompartment biological system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.– 1996.– Vol. 93, N15.– P. 7454– 7459. Isaeva A., Zhang T., Rawson D.M. Studies sensitivity of zebrafish (Danio rerio) oocytes // Cryobiology.– 2004.– Vol. 49, N2.– P. 114–122. Kopeika J., Kopeika E., Zhang T. et al. Effect of DNA repair inhibitor (3-aminobenzamide) on genetic stability of loach (Misgurnus fossilis) embryos derived from cryopreserved sperm // Theriogenology.– 2004.– Vol. 69, N9.– P. 1661–1673. Kuleshova L.L., MacFarlane D.R., Trounson A.O., Shaw J.M. Sugar exert a major influence on the vitrification properties of ethylene glycol-based solutions and have low toxity to embryos and oocytes // Cryobiology.– 1999.– Vol. 38, N2.– P. 119–130. Liu K.C., Chou T.C., Lin H.D. Cryosurvival of goldfish embryo after subzero freezing // Aquatic Living Resources.– 1993.– Vol. 6, N3.– P. 63–66. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury // Cryobiology.– 1971.– Vol. 8, N5.– P. 489–500. Robles V., Cabrita E., Fletcher G.L. et al. Vitrification assays with embryos from a cold tolerant sub-arctic fish species // Teriogenology.– 2005.– Vol. 64, N7.– P. 1633–1646. Robles V., Cabrita E., Real M. et al. Vitrification of turbot embryos: preliminary assays // Cryobiology.– 2003.– Vol. 47, N1.– P. 30–39. Tian Y.S., Chen S.L., Yan A.S. et al. Studies on vitrification method of sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos // Acta Zoologica Sinica.– 2003.– N49.– P. 843–850. Zhang T.T. Cryopreservation of gametes and embryos of aquatic species // Life in the Frozen State / Ed. by B. Fuller, E. Benson, N. Lane.– Luton: CRC Press LLC, 2004.– P. 415– 436. Zhang T.T., Rawson D.M. Feasibility studies on vitrification of intact zebrafish (Brachydanio rerio) embryos // Cryobio- logy.– 1996.– Vol. 33, N1.– P. 1–13. Zhang T.T., Rawson D.M., Morris G.J. Cryopreservation of pre-hatch embryos of zebrafish (Brachydanio rerio) // Aquatic Living Resources– 1993.– Vol. 6, N2.– P. 145–153. Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C. et al. A study on the cryopreservation of common carp (Cyprinus carpio) emb- ryos // Cryo-Letters.– 1989.– Vol. 10.– Р. 271–278. Accepted in 19.05.2009 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. .

Условия витрификации эмбрионов вьюна (Misgurnus fossilis) в криозащитных средах

Institution

Similar Items