Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia
For the first time, it is shown that the expression products of defective prophages are typical not only of the defective lysogenic systems of phytopathogenic Erwinia carotovora, but also of epiphytic bacterium Pantoea agglomerans. It is established that viral particles like phage’s capsids are pack...
Збережено в:
| Дата: | 2008 |
|---|---|
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Видавничий дім "Академперіодика" НАН України
2008
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5669 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia / Ф.И. Товкач, Т.В. Иваница, А.И. Кушкина // Доп. НАН України. — 2008. — № 7. — С. 170-175. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859683850449321984 |
|---|---|
| author | Товкач, Ф.И. Иваница, Т.В. Кушкина, А.И. |
| author_facet | Товкач, Ф.И. Иваница, Т.В. Кушкина, А.И. |
| citation_txt | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia / Ф.И. Товкач, Т.В. Иваница, А.И. Кушкина // Доп. НАН України. — 2008. — № 7. — С. 170-175. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| description | For the first time, it is shown that the expression products of defective prophages are typical not only of the defective lysogenic systems of phytopathogenic Erwinia carotovora, but also of epiphytic bacterium Pantoea agglomerans. It is established that viral particles like phage’s capsids are packing a bacterial DNA, whose size is determined by the pulse field gel electrophoresis separation. Based on the data on capsid structures that form the virulent mutant ZF40/421, a proposition about the forming mechanism of defective virions of E. carotovora is made.
|
| first_indexed | 2025-11-30T21:37:16Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 578.81
© 2008
Ф. И. Товкач, Т.В. Иваница, А. И. Кушкина
Характеристика дефектных частиц вирусной природы
у бактерий рода Erwinia
(Представлено членом-корреспондентом НАН Украины И. Г. Скрипалем)
For the first time, it is shown that the expression products of defective prophages are typical not
only of the defective lysogenic systems of phytopathogenic Erwinia carotovora, but also of epi-
phytic bacterium Pantoea agglomerans. It is established that viral particles like phage’s capsids
are packing a bacterial DNA, whose size is determined by the pulse field gel electrophoresis
separation. Based on the data on capsid structures that form the virulent mutant ZF40/421,
a proposition about the forming mechanism of defective virions of E. carotovora is made.
Определение соотношения между полноценными и дефектными вирусами в окружающей
среде является важной задачей современной вирусологии. Формирование дефектных вири-
онов при вирусных инфекциях связано с аттенуацией вирусной популяции и “угасанием”
инфекций. С теоретической точки зрения сборка вирусных частиц и, особенно, фолдинг
капсидов входят в разряд наиболее актуальных проблем современной биологии.
Наличие дефектных фагов обусловлено многими причинами. Во-первых, они могут быть
результатом экспрессии неполных профагов, у которых сохранена структурная область ге-
нома [1]. Во-вторых, дефекты очень часто могут быть вызваны абортивными фаговыми ин-
фекциями, следствием которых является накопление неполных вирусных частиц [2]. В-тре-
тьих, в природе существуют оригинальные фаговые системы, например такие, как Р2-Р4.
Развитие дефектного сателлитного фага Р4 возможно только при условии использования
им продуктов многих генов фага-помощника Р2 [3].
Хотя дефектные фаги не способны вызывать полноценной инфекции, они могут играть
важную роль в горизонтальном переносе генов путем трансдукции как в водных, так и
в почвенных экосистемах. Кроме того, их наличие показательно для дефектно-лизогенных
систем и абортивных инфекций.
Erwinia carotovora subsp. сarotovora (Ecc) и Pantoea agglomerans (E. herbicola) являют-
ся представителями бактериальных консорциумов, которые ассоциированы с различными
растениями. Изучение этих фитопатогенных бактерий невозможно без учета лизогенного
состояния и участия умеренных фагов в их экологии.
Ранее было показано, что при лизогенной индукции штаммы E. carotovora различного
происхождения синтезируют отдельные компоненты вирусной частицы — головки, базаль-
ные пластинки и хвостовые отростки, которые не собираются в целостный инфекционный
вирион [1]. При этом хвостовые отростки представляют собой макромолекулярные каро-
товорицины (MCTV), убивающие близкородственные штаммы E. carotovora. Недавно мы
впервые показали, что капсидные структуры дефектных умеренных фагов эрвиний упако-
вывают молекулы ДНК [4]. Происхождение этой ДНК неизвестно. С другой стороны, не
установлено, способны ли частицы типа фаговых головок осуществлять генерализованную
трансдукцию маркеров между штаммами E. carotovora. Важным вопросом является также
обнаружение ДНК-содержащих вирусоподобных частиц (VLP-ДНК) у бактерий, которые,
170 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №7
как и пектолитические эрвинии, ассоциированы с растениями, например у такого эпифита,
как P. аgglomerans. Данная работа направлена на решение вышеуказанных проблем.
В качестве продуцентов VLP-ДНК использовали E. carotovora subsp. сarotovora ZM1
и P. agglomerans Bg1. Лизогенную индукцию клеток осуществляли митомицином С (1 мкг
на 1 мл активно растущих клеток) и налидиксовой кислотой (20 мкг/мл). Для определения
относительной киллерной активности (Arel) применяли метод зон лизиса. Эту величину
выражали через соотношение диаметра индивидуальной зоны к диаметру максимальной
зоны в данной серии исследований [5]. Концентрированные препараты VLP-ДНК получали
методом дифференциального ультрацентрифугирования и хранили в буфере STMG.
Частицы VLP, содержащие молекулы ДНК, а также рестрикционные фрагменты раз-
деляли в агарозных гелях. В качестве модельного использовали вирулентный мутант
ZF40/421, который способен лизировать специфический лизоген Есс 62А-d1(ZF40c10) [6].
Фаговые частицы получали методом слитного лизиса на минимальных чашках с лакто-
зой. Для одновременного концентрирования и очистки частиц использовали волокнистую
целлюлозу (23SS — фирма “Serva”). После наслаивания лизата, колонку промывали 0,15 М
NaCl, а затем фракционировали 0,25 и 0,4 М NaCl.
Содержимое каждой фракции было проанализировано на наличие частиц с помощью
электрофореза в агарозе. После этого в основных (пиковых) фракциях определяли титр фа-
га, а также наличие капсидов и целостных вирионов с помощью электронной микроскопии.
Ранее мы показали, что штамм Ecc ZM1 при лизогенной индукции продуцирует частицы,
содержащие ДНК, которые по подвижности в гелях агарозы близки к капсиду фага ZF40 [4].
Установлено также, что MCTV этого штамма обусловливают фаг-фаговую индукцию
и приводят к переходу фага ZF40 из состояния псевдолизогении к литическому или лизоген-
ному развитию [7]. Бактериоцины данного штамма на газонах индикаторной культуры Есс
66А образуют негативные пятна лизиса, размер которых коррелирует с киллерной актив-
ностью. Бактериоцинов с такими свойствами у E. сarotovora известно очень мало, поэтому
их изучение может привести к получению новой информации о дефектной лизогении и ба-
ктериоциногенности у E. carotovora.
В процессе работы мы получили два спонтанных мутанта Ecc ZM1 — 40i1 и 40i6, которые
дают повышенный выход MCTV. На рис. 1, а представлена динамика изменения негативных
зон лизиса на индикаторном штамме Есс 66А в зависимости от возраста культур Есс J2/S2
и ZM1(40i1), которые выращивали на минимальной среде А с лактозой.
Более детальный анализ киллерной активности (Arel) показал, что в случае бактери-
ального мутанта 40i1 выход MCTV имеет волнообразный характер, вне зависимости от
того, какой индуктор применялся (см. рис. 1, б ). Как видно из представленных резуль-
татов, наблюдается три “волны” выхода MCTV ZM1. Первая волна характерна для на-
чальной логарифмической фазы роста — около 108 кл./мл (см. рис. 1, б, I). Вторая волна
является показательной для нового пула индуцируемых бактериоцинов. Они появляются
в середине (митомицин С) или в поздней логарифмической (налидиксовая кислота) фазе
роста культуры (см. рис. 1, б, II). Третья волна выхода наблюдается в начальном стацио-
нарном периоде, когда количество клеток достигает 109 или более на 1 мл (см. рис. 1, б,
III). Как следует из приведенного графика, “волны” выхода для двух индукторов находятся
в противофазе, т. е. при достижении максимального выхода MCTV митомицинобработан-
ными клетками, клетки, на которые воздействует налидиксовая кислота, дают минимум
бактериоцинов. Очевидно, это различие отражает разные механизмы действия митоми-
цина С и налидиксовой кислоты на SOS-систему, активация которой, в конечном итоге,
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №7 171
Рис. 1. Зоны лизиса MCTV E. carotovora J2 S2(44S2) и ZM1(40i1), полученные на минимальных чашках
с лактозой (а) и волновой выход каротоворицинов (MCTV) штамма E. carotovora ZM1(40i1) при индукции
клеток митомицином (MTC) и налидиксовой кислотой (NAL) (б : I, II, III — максимальный выход карото-
ворицинов)
приводит к дестабилизации дефектной лизогении E. carotovora и индукции дефектных
фагов.
При воздействии на клетки Есс J2/S2 обоими индукторами волновой выход MCTV не
обнаружен (см. рис. 1, б ). Тем не менее он характерен для тиминовых ауксотрофных мутан-
тов данного штамма [5]. Хотя общий выход каротоворицинов и, соответственно, эффектив-
ность индукции выше для митомицина С (см. рис. 1, б ), для получения VLP-ДНК из штам-
мов Есс ZM1 и Pantoea agglomerans Bg1 была использована налидиксовая кислота. Этот
выбор связан с тем, что при воздействии последней на лизогенные клетки эрвиний проис-
ходит частичная переориентация синтеза, приводящая к увеличенной продукции структур
типа базальных пластинок и фаговых капсидов по сравнению с хвостовыми отростками [1].
Данный факт наряду с волновым выходом MCTV (см. рис. 1, б ), скорее всего, подтвержда-
ет положение о множественном характере дефектной лизогении у фитопатогенных эрвиний
и ее поэтапной дерепрессии при лизогенной индукции [5].
Электрофоретический анализ концентрированных препаратов методом, описанным на-
ми ранее [7], показал, что налидиксовые лизаты клеток обоих бактериальных мутантов
Ecc ZM1 — 40i1 и 40i6, а также штамма Вg1, хотя и в небольшом количестве, но содер-
жат VLP-ДНК (рис. 2). Для того чтобы определить происхождение ДНК, упакованной
в эти частицы, был проведен ее рестрикционный анализ с помощью эндонуклеаз Hind III,
BamH I, EcoR I и Sal I. Как видно из данных, приведенных на рис. 3, гидролиз ДНК VLP
172 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №7
Рис. 2. Электрофореграмма VLP и ДНК штаммов
E. carotovora 40i1 и 40i6 и P. agglomerans Bg1: 1 —
VLP E. carotovora 40i1; 2 — VLP-ДНК 40i1; 3 —
VLP-ДНК 40i6; 4 — VLP P. agglomerans Bg1; 5 —
VLP-ДНК P. agglomerans Bg1
Рис. 3. Электрофореграмма фрагментов рестри-
кции VLP-ДНК E. carotovora в агарозном геле. Эн-
донуклеазы рестрикции: 1 — Hind III-фрагменты
ДНК фага λ СI857; 2 — Hind III; 3 — EcoR I; 4 —
Sma I; 5 — Hpa I
мутанта 40i1 не приводит к образованию дискретных фрагментов. Этот факт достаточно
убедительно свидетельствует о том, что в VLP упакована бактериальная ДНК. Однако
нельзя полностью исключить, что эта ДНК может происходить от множественных про-
фагов. Это возможно при условии, что фаговые капсиды, образованные после индукции,
имеют одинаковый размер и представлены в полученных препаратах в эквимолярных ко-
личествах.
В наших условиях пока не разработаны подходы для осуществления трансдукции гене-
тических маркеров с использованием штамма ZM1 и его VLP-ДНК. Тем не менее в неза-
висимых исследованиях была осуществлена попытка переноса плазмиды pKM101 (маркер
устойчивости к ампицилину) VLP-частицами Ecc 62А в клетки Escherichia coli C600. Так
как в этом случае не было получено положительных результатов, мы предположили, что
VLP-ДНК не способны осуществлять инфекционный процесс и действительно являются
дефектными в отличие от активных колиспецифичных MCTV этого штамма.
Для выяснения причины, лежащей в основе процесса образования дефектных вирус-
ных частиц, мы использовали вирулентный мутант ZF40/421 [6]. Показано, что, так же
как и аналогичный мутант с5/5, он имеет дефекты в сборке частиц. Его основной кап-
сид в избытке накапливается в фаголизатах и имеет подвижность меньшую, чем таковая
нормального капсида фага дикого типа. Мутации, которые приводят к появлению мутан-
тов ZF40/421 и c5/5, являются плеотропными. Кроме формирования неправильных капси-
дов, фаг ZF40/421 осуществляет абортивную инфекцию, в результате которой образуется
избыток капсидов типа I и II. Мутантный фаг ZF40/421, в отличие от фага ZF40 дикого
типа, неспособен осуществлять генерализованную трансдукцию плазмиды рКM101, тогда
как мутант c5/5 осуществляет перенос этой плазмиды со значительно более низкой часто-
той, чем точечный мутант с6 фага ZF40. Кроме того, узоры рестрикции фагов ZF40/421 и
c5/5 существенно отличаются от таковых фага ZF40 дикого типа.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №7 173
Рис. 4. Пульс-форетическое разделение молекул фаговой ДНК в агарозе. Полосы внизу геля соответствуют
VLP-ДНК 40i1 (1 ), фага ZF40/421 (5 ) и фагов ZF40/421ф17 (6 ) и ZF40/421ф16 (7 ), обнаруженных при
разделении общей фаговой популяции на колонке с ДЭАЭ целлюлозой (см. текст); 3 и 4 — нативные ДНК
фагов Т3 и Т5 соответственно; 2 — смесь маркерных ДНК фагов Т7, Т5 и Т4 с размерами 40, 122 и 168 т.
п. н снизу вверх соответственно
Разделение фаговых частиц на ионообменной колонке с ДЭАЭ-целлюлозой показало,
что популяция фага ZF40/421 состоит из двух компонентов. Первый из них включает жиз-
неспособные частицы и капсиды, которые смываются с колонки 0,25 М NaCl, второй —
вирионы и капсиды, которые могут быть элюированными при более высокой ионной си-
ле — 0,4 М NaCl. Двухкомпонентный характер популяции фага ZF40/421 установлен нами
впервые в этой работе, однако причины такой гетерогенности требуют дополнительных
исследований. Что касается капсидных структур, то в обоих случаях их количество пре-
валирует над количеством нативных вирионов. Электронномикроскопический и электро-
форетический анализы показывают, что капсиды в подавляющем большинстве заполнены
ДНК. Кроме того, капсиды мутанта ZF40/421 близки по электрофоретической подвижно-
сти к VLP-ДНК штамма Есс ZM1.
Таким образом, у E. carotovora возможно наличие одного из общих механизмов обра-
зования дефектных вирионов, который, как предполагалось ранее [1], связан со сборкой
целостной частицы на уровне прикрепления хвостового отростка к головке фага.
Пульс-форетический анализ нативной ДНК VLP-частиц штамма Есс ZM1(40i1) пока-
зал, что они действительно упаковывают молекулы одинаковой длины (рис. 4, дорожка 1 ).
По предварительной оценке размер этой ДНК составляет около 45 т. п. н. и совпадает с та-
ковым ДНК фага ZF40/421 (см. рис. 4, дорожка 5 ), а также, возможно, с размером ДНК
фага ZF40/421ф17 (дорожка 6 ). Последний, наряду с фагом ZF40/421ф16 (см. рис. 4, до-
рожка 7 ) представляет гетерогенную, возможно, двойную, популяцию фага ZF40. Точные
механизмы возникновения профаговых дефектов, а также фаговой гетерогенности требуют
более углубленного изучения дефектной лизогении эрвиний на уровне первичной последо-
вательности профаговых геномов.
174 ISSN 1025-6415 Reports of the National Academy of Sciences of Ukraine, 2008, №7
Работа частично профинансирована из фонда Министерства образования и науки Украины.
1. Товкач Ф.И. Дефектная лизогения Erwinia carotovota // Микробиология. – 2002. – 71, № 3. – С. 359–
367.
2. Deng Y.M., Liu C.Q., Dunn N.M. Genetic organization and functional analysis of a novel phage abortive
system, Abi from Lactococus lactis // J. Bacteriol. – 1999. – 67, No 1. – P. 135–149.
3. Lindqvist B.H., Deho G., Calendar R. Mechanisms of genome propagation and helper exploitation by
satellite phage P4 // Microbiol. Rev. – 1993. – 57, No 3. – P. 683–702.
4. Иваница Т.В., Товкач Ф.И. Предварительная характеристика ДНК-содержащих вирусоподобных
частиц Erwinia carotovora // Микробиол. журн. – 2007. – 69, № 3. – С. 19–26.
5. Товкач Ф.И., Балко А.Б., Муквич Н.С. Особенности лизогенной индукции бактериоцинов у тими-
новых мутантов Erwinia carotovora // Мiкробiол. журн. – 2006. – 68, № 3. – С. 33–46.
6. Кушкина А.И., Панщина А.И., Товкач Ф.И. Вирулентные мутанты умеренного бактериофага ZF40
фитопатогенной Erwinia carotovora subsp. carotovora // Тез. Рос. школы-конф. “Генетика микроорга-
низмов и биотехнология”. – Москва; Пущино-на-Оке, 2006. – С. 58.
7. Товкач Ф.И. Лизогенное состояние фитопатогенной бактерии Erwinia carotovora // Доп. НАН Укра-
їни. – 2002. – № 7. – С. 170–173.
Поступило в редакцию 27.12.2007Институт микробиологии и вирусологии
им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
УДК 591.545
© 2008
О. I. Худий, Л. В. Худа, О. Л. Цапок
Характеристика ростових процесiв вирезуба Rutilus
frisii (Nordmann) в умовах Днiстровського водосховища
(Представлено членом-кореспондентом НАН України М.Ю. Євтушенком)
The growth characteristics of fishes enables to estimate a level of the well-being for separate
individuals and populations. However, such researches demand the availability of a significant
volume of animal materials. It can become a certain difficulty when the community of infrequent
species is studied, as small samplings do not allow one to execute high-quality population
researches. Applications of various extrapolation and approximation methods can become an
output from such a situation. The application of such an approach to studying the nonpassage
populations of a infrequent species, Rutilus frisii (Nordmann), is considered.
Вивчення ростових характеристик риб дає можливiсть оцiнити рiвень благополуччя iсну-
вання як окремих особин, так i популяцiї. Однак такi дослiдження вимагають наявностi
значного об’єму тваринного матерiалу. Це може стати певною проблемою, коли йдеться
про угруповання рiдкiсних видiв, оскiльки малi за чисельнiстю вибiрки не дозволяють про-
вести якiсних популяцiйних дослiджень. Виходом з такої ситуацiї може стати застосування
рiзних екстраполяцiйних та апроксимацiйних методiв.
Розглянемо можливiсть застосування такого пiдходу при вивченнi туводної популяцiї
вирезуба — Rutilus frisii (Nordmann).
Вирезуб, занесений до “Червоної книги України” як вид I категорiї (зникаючi) [1], ще
у першiй половинi XX ст. був звичайною рибою в усiх основних рiчкових системах України.
ISSN 1025-6415 Доповiдi Нацiональної академiї наук України, 2008, №7 175
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-5669 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 1025-6415 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-11-30T21:37:16Z |
| publishDate | 2008 |
| publisher | Видавничий дім "Академперіодика" НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Товкач, Ф.И. Иваница, Т.В. Кушкина, А.И. 2010-02-02T10:08:37Z 2010-02-02T10:08:37Z 2008 Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia / Ф.И. Товкач, Т.В. Иваница, А.И. Кушкина // Доп. НАН України. — 2008. — № 7. — С. 170-175. — Бібліогр.: 7 назв. — рос. 1025-6415 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5669 578.81 For the first time, it is shown that the expression products of defective prophages are typical not only of the defective lysogenic systems of phytopathogenic Erwinia carotovora, but also of epiphytic bacterium Pantoea agglomerans. It is established that viral particles like phage’s capsids are packing a bacterial DNA, whose size is determined by the pulse field gel electrophoresis separation. Based on the data on capsid structures that form the virulent mutant ZF40/421, a proposition about the forming mechanism of defective virions of E. carotovora is made. Работа частично профинансирована из фонда Министерства образования и науки Украины. ru Видавничий дім "Академперіодика" НАН України Біологія Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia Article published earlier |
| spellingShingle | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia Товкач, Ф.И. Иваница, Т.В. Кушкина, А.И. Біологія |
| title | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia |
| title_full | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia |
| title_fullStr | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia |
| title_full_unstemmed | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia |
| title_short | Характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода Erwinia |
| title_sort | характеристика дефектных частиц вирусной природы у бактерий рода erwinia |
| topic | Біологія |
| topic_facet | Біологія |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/5669 |
| work_keys_str_mv | AT tovkačfi harakteristikadefektnyhčasticvirusnoiprirodyubakteriirodaerwinia AT ivanicatv harakteristikadefektnyhčasticvirusnoiprirodyubakteriirodaerwinia AT kuškinaai harakteristikadefektnyhčasticvirusnoiprirodyubakteriirodaerwinia |