Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом
Здійснено порівняльний аналіз різних методів, умов екстрагування та ампліфікації ДНК п’яти видів гіркокаштана (Aesculus L.). Підібрано мікросаелітні праймери з ди- і тринуклеотидними мотивами для подальшого використання при уточненні їх систематичного положення. Проведен сравнительный анализ разных...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Физиология и биохимия культурных растений |
|---|---|
| Дата: | 2010 |
| Автори: | , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2010
|
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66295 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом / К.Є. Шаванова, Д.О. Кисельов, Т.М. Чеченєва // Физиология и биохимия культурных растений. — 2010. — Т. 42, № 3. — С. 251-255. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859708614365675520 |
|---|---|
| author | Шаванова, К.Є. Кисельов, Д.О. Чеченєва, Т.М. |
| author_facet | Шаванова, К.Є. Кисельов, Д.О. Чеченєва, Т.М. |
| citation_txt | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом / К.Є. Шаванова, Д.О. Кисельов, Т.М. Чеченєва // Физиология и биохимия культурных растений. — 2010. — Т. 42, № 3. — С. 251-255. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Физиология и биохимия культурных растений |
| description | Здійснено порівняльний аналіз різних методів, умов екстрагування та ампліфікації ДНК п’яти видів гіркокаштана (Aesculus L.). Підібрано мікросаелітні праймери з ди- і тринуклеотидними мотивами для подальшого використання при уточненні їх систематичного положення.
Проведен сравнительный анализ разных методов, условий экстракции и амплификации ДНК пяти видов каштана конского (Aesculus L.). Подобраны микросателлитные праймеры с ди- и тринуклеотидными мотивами для дальнейшего использования при уточнении их систематического положения.
The authors have compared the different methods and conditions of the DNA extraction and amplification for five species Aesculus L. Microsatellite primers for further use in the refinement of their systematic position were selected.
|
| first_indexed | 2025-12-01T03:56:04Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 575:582.746.56
ОПТИМIЗАЦIЯ УМОВ ЕКСТРАГУВАННЯ ТА АМПЛIФIКАЦIЇ ДНК
ГIРКОКАШТАНIВ (РIД AESCULUS L.) ISSR-МЕТОДОМ
К.Є. ШАВАНОВА,1 Д.О. КИСЕЛЬОВ,1 Т.М. ЧЕЧЕНЄВА1, 2
1Національний університет біоресурсів і природокористування України
03041 Київ, вул. Героїв Оборони, 15
2Iнститут фізіології рослин і генетики Національної академії наук України
03022 Київ, вул. Васильківська, 31/17
Здійснено порівняльний аналіз різних методів, умов екстрагування та
ампліфікації ДНК п’яти видів гіркокаштана (Aesculus L.). Підібрано мікроса-
телітні праймери з ди- і тринуклеотидними мотивами для подальшого викорис-
тання при уточненні їх систематичного положення.
Ключові слова: Aesculus L., ДНК, екстрагування, ампліфікація.
Рід Гіркокаштан — Aesculus L. належить до відділу Покритонасінні —
Magnoliophita (Angiospermae), класу Дводольні — Magnoliopsida, порядку
Сапіндоцвіті (Сапіноцвіті) — Sapindales, родини Гіркокаштанові — Hippo-
castanaceae Tarr. Et Gray [4]. Разом з тим у науковій літературі досі є
істотні розходження як у поділі на роди, так і в кількості видів [2, 7, 11],
що потребує ретельного перегляду систематики родини Гіркокаштанові.
Адекватно це можна зробити із застосуванням сучасних молекулярно-
генетичних методів. Для маркування геному рослин розроблено й широ-
ко використовують різні типи молекулярних маркерів. Вони дають змо-
гу провести ідентифікацію та паспортизацію сортів і гібридів, виявити
філогенетичні зв’язки між видами [5, 6].
Головним критерієм для отримання вірогідних даних є чистота ви-
хідної ДНК, тобто вона має бути вільною від інгібіторів ферментативної
активності Taq-полімерази, а саме: білків, поліфенолів, полісахаридів,
поліксилолів, ізопропанолу, хлориду натрію. Чистота нуклеїнової кисло-
ти залежить від методу екстрагування (детергент для лізису, агент преци-
пітації) [1].
За міжнародними стандартами, до методів екстрагування ДНК
ставляться такі вимоги [14, 15]:
1) застосовуваність методу — можливість застосування певного ме-
тоду для чітко дібраних аналітів, матриць, необхідних концен-
трацій;
2) доступність — простота використання, відтворюваність та ефек-
тивність, найменша собівартість;
3) середній лінійний розмір нативної молекули ДНК;
4) структурна цілісність;
5) хімічна чистота екстрагованої ДНК;
6) концентрація ДНК;
7) стан фрагментації ДНК.
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ КУЛЬТ. РАСТЕНИЙ. 2010. Т. 42. № 3
251
© К.Є. ШАВАНОВА, Д.О. КИСЕЛЬОВ, Т.М. ЧЕЧЕНЄВА, 2010
Метою досліджень був порівняльний аналіз різних методів, умов ек-
страгування й ампліфікації ДНК гіркокаштанів, підбір праймерів для по-
дальшого використання в молекулярно-генетичному аналізі для уточ-
нення їх систематичного положення.
Методика
Дослідження проводили на базі Національного університету біоресурсів
і природокористування України протягом 2007—2008 рр. Вихідним ма-
теріалом для експериментів слугували 7—10-добові етіольовані пагони
п’яти видів гіркокаштана (Aesculus L.): гіркокаштани звичайний, восьми-
тичинковий, забутий, дрібноквітковий, голий.
Дослідження виконували трьома методами екстрагування ДНК з
порівнянням їх за такими параметрами: кінцева концентрація ДНК в
розчині, наявність домішок, розмір молекули нативної ДНК. З літера-
турних даних відомо, що лізат клітин деревних культур характеризується
високим вмістом поліфенолів, що не відповідає вимогам проведення
ПЛР [1, 3].
Перший метод екстрагування ДНК передбачає використання це-
тилетиламоній броміду (ЦТАБ) [8]. Зразки (0,1 г тканини) гомогенізува-
ли у ступці зі 100 мкл ЦТАБ-буфера. Після цього додавали ще 500 мкл
цього буфера, який містив 20 мМ динатрієвої солі етилендіамінтетраоц-
тової кислоти (ЕДТА), 100 мМ трис-НСl (рН 8,0), 1,4 М NaCl, 2 %
ЦТАБ та 2 % полівінілпіролідону (ПВП) й інкубували протягом 1 год за
температури 65 оС. Суміш екстрагували таким самим об’ємом фенолу і
двічі — таким самим об’ємом суміші хлороформ : ізоаміловий спирт (24 : 1
за об’ємом). Далі з водної фази осаджували ДНК одним об’ємом ізо-
пропілового спирту. Зразки витримували 1 год за температури 20 оС,
після чого центрифугували 15 хв при 14 000 g (центрифуга Micro22R
ETTICH). Осад промивали 70 %-м етанолом і розчиняли в деіонізованій
воді.
Другим був метод лужного лізису [13]. Зразки (0,1 г тканини) роз-
тирали у ступці з додаванням 700 мкл 10 М гідроксиду натрію (NaOH)
та інкубували 20 хв за температури 65 оС. Після цього суміш центрифу-
гували 15 хв при 14 000 g i відбирали водну фазу, в якій були розчинені
нуклеїнові кислоти.
Третій метод — сорбція ДНК на оксиді силіцію (SiO2) [10]. Зразки
розтирали у ступці з додаванням 1 мл лізувального буфера, який містив
100 мМ трис-НСl (рН 8,0), 50 мМ ЕДТA (рН 8,0), 500 мМ хлориду
натрію (NaCl + 0,07 % 2-меркаптоетанолу), додавали 130 мкл 10 %-го
натрію додецилсульфату (ДСН) й інкубували 15 хв за температури 65 оС.
Для преципітації білків додавали 300 мкл ацетату калію (СН3СООК) й
інкубували протягом 30 хв на льоду. Центрифугували 5 хв при 7000 g,
потім 300 мкл надосадової рідини відбирали в іншу пробірку, додавали
900 мкл 5 М йодиду натрію (NaI), 20 мкг SiO2 та інкубували за кімнат-
ної температури протягом 5 хв. Центрифугували 5 хв при 7000 g, злива-
ли водну фазу, осад двічі промивали етанолом, підсушували, додавали
деіонізовану воду, інкубували протягом 5 хв за 50 оС, знову центрифугу-
вали 5 хв при 7000 g i зливали водну фазу, яка була розчином ДНК.
Розмір нативної ДНК аналізували методом електрофорезу в 0,8 %-
му агарозному гелі, що містив 0,5 мкг/мл бромистого етидію в однократ-
ному ТВЕ-буфері за напруги 3—4 В/см протягом 4—5 год.
252
Е.Е. ШАВАНОВА, Д.А. КИСЕЛЕВ, Т.Н. ЧЕЧЕНЕВА
Физиология и биохимия культ. растений. 2010. Т. 42. № 3
У дослідженнях використано 10 мікросателітних праймерів (ISSR-
праймери), які наведені в табл. 1.
Результати та обговорення
Для отримання високоспецифічних спектрів ампліфіконів потрібно пі-
дібрати відповідні умови ампліфікації (температура відпалу праймерів,
кількість циклів, тривалість циклів) та концентрацію іонів магнію [9].
Оптимальну температуру відпалу праймерів розраховували за
формулою, запропонованою Ричликом [12]:
Та
пр = 0,3Тм
пр + 0,7Тм
прод — 14,9,
де Та
пр — оптимальна температура відпалу праймера; Тм
пр — температу-
ра плавлення праймера; Тм
прод — температура плавлення продуктів ПЛР.
Температуру плавлення праймера за стандартних умов визначали за
формулою
Тм
пр = —К (dG/lo
3,3/13),
де К = 2,913682, якщо концентрація іонів К+ в розчині 50 мМ; lо — дов-
жина олігонуклеотиду в нуклеотидах.
За першим методом екстрагування ми отримали розчин із концен-
трацією ДНК 2,5—2,7 мкг/г тканини, великого розміру фрагменти (40—
50 тпн) з незначним забрудненням, що не інгібує ПЛР.
За екстрагування другим методом концентрація ДНК в розчині стано-
вила до 2,0 мкг/г тканини із фрагментами невеликого розміру (1—5 тпн),
вона була сильно забруднена поліфенолами і пігментами, які є інгібіто-
рами, що не відповідає вимогам проведення ПЛР.
За третього методу екстрагування концентрація ДНК в розчині бу-
ла невисокою (до 0,5 мкг/г тканини), розмір фрагментів невеликий
(2—7 тпн), забрудненість поліфенолами, які частково інгібують ПЛР і
впливають на вірогідність аналізу — середня (табл. 2).
Оптимальну концентрацію іонів магнію визначали емпірично, почи-
наючи від 2 до 4 мМ. Кращою для ПЛР виявилась концентрація 3,5 мМ
MgCl2.
Після добору умов проведено ампліфікацію в 25 мкл реакційної
суміші, яка складалась із 10 мМ трис-НСl, 50 мМ KСl, 3,5 мМ MgCl2,
253
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСТРАКЦИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2010. Т. 42. № 3
ТАБЛИЦЯ 1. Мікросателітні праймери, використані в дослідженні
Номер Назва Послідовність Довжина нуклеотиду
1 ISSR 3-4 (ACC)6C 19
2 ISSR 3-5 (GTC)7A 22
3 ISSR 3-6 (AGC)6C 19
4 ISSR 3-7 (GTG)7C 22
5 ISSR 3-8 (CTC)6C 19
6 ISSR 2-9 (AC)9C 19
7 ISSR 2-10 (TG)9A 19
8 ISSR 2-11 (AC)9T 19
9 ISSR 2-12 (AC)9C 19
10 ISSR 2-13 (GA)9C 19
2 мМ кожного дезоксинуклеозидтрифосфату, 0,2 мкл праймера, 1 од.
акт. Taq ДНК-полімерази та 100—120 нг ДНК. Умови ПЛР для динуклео-
тидних праймерів передбачали початкову денатурацію за 95 оС — 5 хв і
послідовно 35 циклів: 95 оС — 30 с, 55 оС — 30 с, 72 оС — 2 хв 30 с.
Кінцева елонгація за 72 оС — 7 хв. Для тринуклеотидних праймерів умо-
ви ампліфікації були ті ж самі за винятком температури відпалу — 58 оС,
а для праймерів ISSR 3-5 та ISSR 3-7 — 60 оС.
На рисунку наведено електрофореграму продуктів ампліфікації ДНК
5 видів гіркокаштана (рід Aesculus L.) із тринуклеотидними праймерами
ISSR 3-4 (1—5) тa ISSR 3-8 (6—10). Усі смуги є чіткими, що підтверджує
оптимальність підібраних умов ампліфікації.
Отже, на підставі проведених експериментальних досліджень можна
зробити такі висновки: оптимальним методом екстрагування ДНК гірко-
каштанів серед трьох тестованих є метод із використанням ЦТАБ, який
відповідає усім вимогам молекулярно-генетичного аналізу; з’ясовано
адекватні умови ампліфікації, підібрано праймери, розраховано темпера-
тури відпалу праймерів, що уможливило подальше використання цього
методу для уточнення систематики гіркокаштанів.
1. Анализ генома. Методы: Пер. с англ. / Под ред. К. Девиса. — М.: Мир, 1990. — 246 с.
2. Біологічний словник / Кол. авт. 2-е вид. — К.: Головна редакція УРЕ, 1980. — 680 с.
3. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: Пер. с англ. / Под ред. Дж.
Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уодлена. — М.: Мир, 1991. — 408 с.
254
Е.Е. ШАВАНОВА, Д.А. КИСЕЛЕВ, Т.Н. ЧЕЧЕНЕВА
Физиология и биохимия культ. растений. 2010. Т. 42. № 3
ТАБЛИЦЯ 2. Основні параметри ДНК, виділеної різними методами
Параметр/метод ЦТАБ Лужний лізис Сорбція на оксиді
силіцію
Застосовуваність методу + + +
Доступність + + +
Середня довжина
нативної молекули ДНК
40—50 тпн 1—5 тпн 2—7 тпн
Хімічна чистота
екстрагованої ДНК
Відносно
чиста
Наявні домішки, інгібітори
ферментативної активності
Taq-полімерази
Наявні домішки
Концентрація ДНК,
нг/мкл
250 200 50
Стан фрагментації ДНК Нефрагмен-
тована
Фрагментована Фрагментована
Електрофореграма продуктів ампліфікації ДНК гіркокаштанів (рід Aesculus L.) з праймера-
ми ISSR 3-4 та ISSR 3-8:
М — маркер молекулярних мас; 1, 6 — гіркокаштан звичайний; 2, 7 — гіркокаштан восьмитичинковий;
3, 8 — гіркокаштан забутий; 4, 9 — гіркокаштан дрібноквітковий; 5, 10 — гіркокаштан голий
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4. Доброгаева Д.Н., Котов М.И., Проскудин Ю.И. и др. Определитель высших растений Ук-
раины. — Киев: Наук. думка, 1987. — 548 с.
5. Саналатий А.В., Солоденько А.Е., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнеч-
ника украинской селекции при помощи SSRP-анализа // Цитология и генетика. —
2006. — 40, № 4. — С. 37—43.
6. Сиволап Ю.М. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях.
Научно-методическое руководство. — Киев: Аграрна наука, 1998. — 156 с.
7. Тахтаджян А.Л. Жизнь растений. — М.: Просвещение, 1981. — 5(2). — 511 с.
8. Bhat K.V., Lakhanpaul S., Chandel K.P.S. Molecular markers for characterization and identi-
fication of genetic resources of perennial crops // Molecular genetic techniques for plant
genetic resources. IPRGI report. — Rome, 1997. — P. 107—117.
9. Decort I. The polymerase chaine reaction: avaluable method for retroviral detection //
Lymphology. — 1990. — 23, N 2. — P. 92—97.
10. Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue // Focus. — 1990. — 12. —
P. 13—15.
11. Hemming E.S. Try to Chinese chestnut // Horticulture. — 1948. — 26, N 5. — P. 186—187.
12. Rychlik W., Spencer W.Y., Roads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA
amplification in vitro // Nucl. Acids Res. — 1990. — 18, N 21. — P. 92—97.
13. Tang S., Knapp S.J. Simple sequence repeat map of sunflower genome // Theor. Appl.
Genet. — 2002. — 105. — P. 1124—1136.
14. FAO-WHO. 2005. Codex Alimentarius Commission. Codex committee of methods of analysis
and sampling: consideration of methods for detection and identification of foods derived from
biotechnology. General approach and criteria of the methods. 26th Session, Hungary.
15. EN ISO 21 571. Foodstuffs — Method of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — nucleic acid extraction. — 2005.
Отримано 28.04.2009
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСТРАКЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ ДНК
КАШТАНОВ (РОД AESCULUS L.) ISSR-МЕТОДОМ
Е.Е. Шаванова,1 Д.А. Киселев,1 Т.Н. Чеченева1, 2
1Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев
2Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, Киев
Проведен сравнительный анализ разных методов, условий экстракции и амплификации
ДНК пяти видов каштана конского (Aesculus L.). Подобраны микросателлитные праймеры
с ди- и тринуклеотидными мотивами для дальнейшего использования при уточнении их
систематического положения.
OPTIMIZATION OF TERMS OF DNA EXTRACTION AND AMPLIFICATION FOR
AESCULUS L. USING ISSR-METHOD
K.E. Shavanova,1 D.O. Kyselyov,1 T.M. Checheneva1, 2
1National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine
15 Heroyiv Oborony, Kyiv, 03041, Ukraine
2Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine
31/17 Vasylkivska St., Kyiv, 03022, Ukraine
The authors have compared the different methods and conditions of the DNA extraction and
amplification for five species Aesculus L. Microsatellite primers for further use in the refinement
of their systematic position were selected.
Key words: Aesculus L., DNA, extraction, amplification.
255
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЭКСТРАКЦИИ
Физиология и биохимия культ. растений. 2010. Т. 42. № 3
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66295 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0522-9310 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-01T03:56:04Z |
| publishDate | 2010 |
| publisher | Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Шаванова, К.Є. Кисельов, Д.О. Чеченєва, Т.М. 2014-07-10T12:37:53Z 2014-07-10T12:37:53Z 2010 Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом / К.Є. Шаванова, Д.О. Кисельов, Т.М. Чеченєва // Физиология и биохимия культурных растений. — 2010. — Т. 42, № 3. — С. 251-255. — Бібліогр.: 15 назв. — укр. 0522-9310 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66295 575:582.746.56 Здійснено порівняльний аналіз різних методів, умов екстрагування та ампліфікації ДНК п’яти видів гіркокаштана (Aesculus L.). Підібрано мікросаелітні праймери з ди- і тринуклеотидними мотивами для подальшого використання при уточненні їх систематичного положення. Проведен сравнительный анализ разных методов, условий экстракции и амплификации ДНК пяти видов каштана конского (Aesculus L.). Подобраны микросателлитные праймеры с ди- и тринуклеотидными мотивами для дальнейшего использования при уточнении их систематического положения. The authors have compared the different methods and conditions of the DNA extraction and amplification for five species Aesculus L. Microsatellite primers for further use in the refinement of their systematic position were selected. uk Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України Физиология и биохимия культурных растений Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом Оптимизация условий экстракции и амплификации ДНК каштанов (род Aesculus L.) ISSR-методом Optimization of terms of DNA extraction and amplification for Aesculus L. using ISSR-method Article published earlier |
| spellingShingle | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом Шаванова, К.Є. Кисельов, Д.О. Чеченєва, Т.М. |
| title | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом |
| title_alt | Оптимизация условий экстракции и амплификации ДНК каштанов (род Aesculus L.) ISSR-методом Optimization of terms of DNA extraction and amplification for Aesculus L. using ISSR-method |
| title_full | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом |
| title_fullStr | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом |
| title_full_unstemmed | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом |
| title_short | Оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї ДНК гiркокаштанiв (рiд Aesculus L.) ISSR-методом |
| title_sort | оптимiзацiя умов екстрагування та амплiфiкацiї днк гiркокаштанiв (рiд aesculus l.) issr-методом |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66295 |
| work_keys_str_mv | AT šavanovakê optimizaciâumovekstraguvannâtaamplifikaciídnkgirkokaštanivridaesculuslissrmetodom AT kiselʹovdo optimizaciâumovekstraguvannâtaamplifikaciídnkgirkokaštanivridaesculuslissrmetodom AT čečenêvatm optimizaciâumovekstraguvannâtaamplifikaciídnkgirkokaštanivridaesculuslissrmetodom AT šavanovakê optimizaciâusloviiékstrakciiiamplifikaciidnkkaštanovrodaesculuslissrmetodom AT kiselʹovdo optimizaciâusloviiékstrakciiiamplifikaciidnkkaštanovrodaesculuslissrmetodom AT čečenêvatm optimizaciâusloviiékstrakciiiamplifikaciidnkkaštanovrodaesculuslissrmetodom AT šavanovakê optimizationoftermsofdnaextractionandamplificationforaesculuslusingissrmethod AT kiselʹovdo optimizationoftermsofdnaextractionandamplificationforaesculuslusingissrmethod AT čečenêvatm optimizationoftermsofdnaextractionandamplificationforaesculuslusingissrmethod |