Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению
Методом 2D-электрофореза (изоэлектрофокусирование на IPG-стрипах и электрофорез в денатурирующей системе в щелочных условиях) в хлоропластах 168-часовых проростков озимой ржи обнаружено около 250 легкорастворимых и 100 труднорастворимых хлоропластных белков. Некоторые из них первично идентифицирован...
Saved in:
| Published in: | Физиология и биохимия культурных растений |
|---|---|
| Date: | 2011 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України
2011
|
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66356 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению / А.А. Кузовкова, Е.В. Спиридович, В.Н. Решетников // Физиология и биохимия культурных растений. — 2011. — Т. 43, № 2. — С. 105-113. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860070527963496448 |
|---|---|
| author | Кузовкова, А.А. Спиридович, Е.В. Решетников, В.Н. |
| author_facet | Кузовкова, А.А. Спиридович, Е.В. Решетников, В.Н. |
| citation_txt | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению / А.А. Кузовкова, Е.В. Спиридович, В.Н. Решетников // Физиология и биохимия культурных растений. — 2011. — Т. 43, № 2. — С. 105-113. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Физиология и биохимия культурных растений |
| description | Методом 2D-электрофореза (изоэлектрофокусирование на IPG-стрипах и электрофорез в денатурирующей системе в щелочных условиях) в хлоропластах 168-часовых проростков озимой ржи обнаружено около 250 легкорастворимых и 100 труднорастворимых хлоропластных белков. Некоторые из них первично идентифицированы.
Методом 2D-електрофорезу (ізоелектрофокусування на IPG-стрипах та електрофорез у денатурувальній системі за лужних умов) у хлоропластах 168-годинних проростків озимого жита виявлено близько 250 легкорозчинних і 100 важкорозчинних хлоропластних білків. Деякі з них первинно ідентифіковано.
It was detected near 250 readily soluble and 100 hardly soluble proteins in the chloroplasts of 168- hours winter rye seedlings by 2D-electrophoresis (isoelectric focusing on the IPG-strips and SDS — electrophoresis). Some of detected proteins were identified.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:10:32Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 582.542.1:577.112:547.96:581.174.1
ПЕРВИЧНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
ОЗИМОЙ РЖИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ЕГО
ПРОВЕДЕНИЮ
А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ
Государственное научное учреждение «Центральный ботанический сад Национальной
академии наук Беларуси»
220012 Минск, ул. Сурганова, 2В
e-mail: fioraia@nm.ru
Методом 2D-электрофореза (изоэлектрофокусирование на IPG-стрипах и элек-
трофорез в денатурирующей системе в щелочных условиях) в хлоропластах 168-
часовых проростков озимой ржи обнаружено около 250 легкорастворимых и 100
труднорастворимых хлоропластных белков. Некоторые из них первично иденти-
фицированы.
Ключевые слова: озимая рожь, хлоропласты, протеомный анализ.
В настоящее время логическим продолжением проектов по секвени-
рованию геномов растений (геномика растений) является определение
белковых продуктов генов (протеомика растений) [3]. Сегодня активно
исследуются протеомные вариации как между различными геномами
растений, так и внутри одного генома. По характеру спектра идентифи-
цированных белков проанализированы изменения в экспрессии генов
растений в различных тканях, органах, органеллах и субклеточных ком-
партментах в процессе их роста и развития [9, 13] в ответ на воздейст-
вие внутренних и внешних факторов (обработка гормонами, химичес-
кими соединениями, биотический, абиотический стрессы) [11, 16, 18].
Анализ специфических белков, связанных с определенными биоло-
гическими процессами, составляет суть «функциональной протеомики».
Она сконцентрирована на идентификации индивидуальных белков, ко-
торые модифицируются или синтезируются с генов, дифференциально
экспрессирующихся в ответ на внешнее воздействие или вследствие вну-
триклеточных структурно-функциональных процессов. Современными
методами «функциональной протеомики» можно проанализировать бел-
ковые фракции лимитированной сложности из-за широкого круга ограни-
чений, присущих применяемым сегодня протеомным методам исследова-
ния. Одним из главных ограничений, например для 2D-электрофореза,
является доминирование в окрашенном геле мажорных белков, тогда как
минорные трудно детектировать, а значит, и идентифицировать [4, 5].
Проблему идентификации белков, содержащихся в низких количе-
ствах, можно обойти, если анализировать специфические субпротеомы,
например, в хлоропластах субпротеомы системы мембран оболочки или
системы тилакоидных мембран [7, 17]. Мы описали методические под-
ходы к широкомасштабному протеомному анализу хлоропластов озимой
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ КУЛЬТ. РАСТЕНИЙ. 2011. Т. 43. № 2
105
© А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ, 2011
ржи с использованием 2D-электрофореза, включающего изоэлектричес-
кое фокусирование (ИЭФ) и электрофорез в денатурирующей системе в
щелочных условиях, представили 2D-электрофореграммы легко- и труд-
норастворимых хлоропластных белков озимой ржи сорта Верасень, а
также попытались первично проанализировать протеом хлоропластов
данного вида злаковых с использованием программы 2D Phoretix и со-
поставить его с представленными в литературных источниках данными
о протеомах других видов растений.
Методика
Объектом исследований были 168-часовые проростки озимой ржи (Se-
cale cereale L.) сорта Верасень. Зерновки ржи промывали в растворе хо-
зяйственного мыла, обеззараживали в растворе перманганата калия. Про-
ростки выращивали в лабораторных условиях на покрытых марлей
решетках на водопроводной воде при +22 С, освещенности 3—5 клк, фо-
топериоде — 16 ч. Выделение хлоропластов осуществляли по Гавриленко
и др. [1] с некоторыми модификациями. Все процедуры проводили на хо-
лоде. В качестве среды выделения использовали 0,25 М трис-НСl буфер
(рН 7,8) с 0,4 М сахарозы, 4 мМ цистеина, 10 мМ этилендиаминтетрааце-
тата и 0,01 М MgCl2 (буфер А) [2]. Хлоропласты подвергали очистке в гра-
диенте сахарозы: верхний слой — 25 % (м/м), средний — 34, нижний —
51 %. Полученный осадок хлоропластов хранили при температуре —20 С.
Хлоропластные белки разделяли на 2 фракции по степени раствори-
мости (условно обозначенные как легко- и труднорастворимые). Заморо-
женные хлоропласты лизировали в двойном объеме 0,25 М трис-НСl бу-
фера (рН 7,8) с 4 мМ цистеина, 10 мМ этилендиаминтетраацетата, 0,01 М
MgCl2 и 0,8 мМ ингибитора сериновых протеаз диизопропилфлуорофос-
фата (буфер Б) в холодильнике в течение 30 мин. Лизированные хлоро-
пласты центрифугировали 10 мин при 10 000 g, надосадочную жидкость
(легкорастворимые белки) сливали в пробирку, осадок вновь заливали
буфером. Процедуру повторяли 3—4 раза для полного выхода легкорас-
творимых белков. Для выделения труднорастворимых белков к осадку до-
бавляли двойной объем буфера Б с 1 % (о/о) тритона Х-100. Далее сле-
довали алгоритму выделения легкорастворимых белков. Из надосадочной
жидкости белки осаждали 5 объемами 100 %-го ацетона в течение ночи,
после чего центрифугировали 20 мин при 10 000 g. Полученные осадки
легко- и труднорастворимых белков отмывали от хлорофилла, залив 5 E
g. Процедуру повторяли до полной экстракции хлорофилла. Полученные
осадки белков растворяли в 100—200 мкл буфера Б.
Легко- и труднорастворимые хлоропластные белки очищали от при-
месей, мешающих ИЭФ (соли, детергенты и др.), с помощью набора ре-
агентов 2D Clean-Up Kit (GE Healthcare, США). Очищенный и сконцен-
трированный осадок растворяли в 50 мкл регидратирующего раствора
(GE Healthcare, США), содержащего 0,5 % (о/о) буфера IPG 3—11 NL
(GE Healthcare, США). Количество вносимого белка и тип буфера IPG
в регидратирующем растворе определяется типом сухих полиакриламид-
ных гелевых полосок (стрипов) с иммобилизованным градиентом рН
(GE Healthcare, США), на которых проводится ИЭФ. Для исследования
хлоропластных белков озимой ржи сорта Верасень использовали стрипы
рН 3—11 NL длиной 11 см (GE Healthcare, США). Нагрузка белка на
данный тип стрипов составляла 30—100 мкг. Легко- и труднораствори-
мые хлоропластные белки озимой ржи нагружали в количестве соот-
106
А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
ветственно 70 и 60 мкг, что было установлено эмпирически. Содержа-
ние белка в образце определяли с помощью набора реагентов 2D Quant
Kit (GE Healthcare, США), который позволяет оценить концентрацию
белка в микроколичествах образца (1—50 мкл). При этом содержание
белка в выбранном объеме образца должно быть >0,5 и <50 мкг.
Стрипы предварительно регидратировали в специальной кювете (GE
Healthcare, США) в течение 20 ч при комнатной температуре в 200 мкл
регидратирующего раствора (описан выше), содержащего 70 или 60 мкг
образца. Изофокусирование на стрипах проводили при комнатной тем-
пературе на приборе Multiphor II (Amersham Pharmacia, Швеция), исполь-
зовав дополнительно специальные аксессуары для стрипов (GE Health-
care, США). Источником тока служил прибор ECSP 2000/300 (Amersham
Pharmacia, Швеция). Изофокусирование проводили в следующем режи-
ме: 1-й шаг — 300 В в течение 4 ч (1200 В · ч), 2-й шаг — 1200 В в те-
чение 14,5 ч (17 400 В · ч).
После ИЭФ белков стрипы уравновешивали с буферными система-
ми для вертикального электрофореза белков в денатурирующих услови-
ях в щелочной системе. С этой целью стрипы инкубировали дважды по
15 мин (со сменой раствора) при покачивании в кювете с 15 мл 0,05 М
трис-НСl буфера (рН 6,8), содержащего 30 % глицерина и 1 % (о/о) до-
децилсульфата натрия. Вертикальный электрофорез белков в денатури-
рующих условиях в щелочной системе по методу Леммли [12] проводи-
ли на пластинках размером 18 24 см, где полиакриламидный гель (60 %
(м/о) акриламидметилен-бис-акриламид, С = 3) имел толщину 0,1 см с
концентрацией мономеров в разделяющем геле 12 % (о/о), в концентри-
рующем — 6 % (о/о). При заливке концентрирующего геля использова-
ли препаративную гребенку. Электрофорез проводили в буфере, содер-
жащем 0,025 М трис-НСl, 0,192 М глицина (рН 8,3) и 0,1 % (о/о)
додецилсульфата натрия, при постоянной силе тока 20 мА в течение
40 мин и далее 30 мА в течение 4 ч 50 мин. После разделения белки фик-
сировали и окрашивали раствором серебра, используя набор реагентов
PageSilverTM (Fermentas, Литва). Параллельно с исследуемым образцом
разделяли белки-маркеры диапазона мол. м. 116—14,4 кД (Fermentas,
Литва). Окрашенные гели фотографировали цифровой фотокамерой и
обрабатывали в программе 2D Phoretix.
Результаты и обсуждение
Благодаря расшифровке генома Arabidopsis thaliana стала возможной пер-
вичная оценка протеома хлоропластов методами предсказывания белков.
С использованием компьютерных программ TargetP или ChloroP и спе-
цифических N-концевых последовательностей ядернокодируемых бел-
ков, облегчающих их импорт в хлоропласт (так называемые транзитные
пептиды), предсказано существование в хлоропластах более 3600 протеи-
нов (http://mips.gsf.de) [4, 6]. По другим данным предполагается, что
пластиды всех типов содержат от 2000 до 4000 различных белков, среди
которых приблизительно 550 — -спиральные, интегрированные в тила-
коиды и мембраны внутренней оболочки. Количество периферических
белков, связанных с этими мембранами, пока неизвестно. Строма, веро-
ятно, содержит больше 1000 протеинов [19]. Однако оценка протеома
органелл на основе компьютерного предсказывания локализации белков
дает далеко не полные и недостаточно надежные данные, поэтому важ-
ным дополнительным подходом к получению новой информации о бел-
107
ПЕРВИЧНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
ках пластид является применение таких методов протеомного анализа,
как 2D-электрофорез, аффинная хроматография и масс-спектрометрия.
С помощью данных методов в течение последних 5 лет получена ценная
информация о количестве и локализации хлоропластных белков по суб-
клеточным компартментам [4, 8]. Так, Клеффман и др. [10] установили,
что полный протеом хлоропластов А. thaliana включает всего 636 белков,
при этом 604 белка кодируются ядерной ДНК и 32 — хлоропластной.
На рисунке представлены 2D-электрофореграммы легко- и трудно-
растворимых хлоропластных белков 168-часовых проростков озимой
ржи сорта Верасень, полученные при проведении ИЭФ на стрипах рН
3—11 NL длиной 11 см (GE Healthcare, США) с нагрузкой белка соот-
ветственно 70 и 60 мкг. Проведение ИЭФ в полиакриламидном геле с
иммобилизованным градиентом рН позволило преодолеть проблемы вос-
производимости результатов, разрешения и разделения сильнокислых и
(или) основных белков, определяемые амфолитами, формирующими
градиент рН [20]. Выбор стрипов с иммобилизованным градиентом рН
в диапазоне 3—11 был оптимальным для проведения широкомасштабно-
го протеомного анализа хлоропластов, поскольку диапазон рI и легко-,
и труднорастворимых хлоропластных белков очень широк, хотя большая
часть белков имеет рI от 4 до 6. Эмпирически подобранная нагрузка бел-
ка на стрип также представляется оптимальной, так как позволила по-
лучить достаточно четкую 2D-электрофореграмму, несмотря на содержа-
ние ряда белков в больших количествах.
В ходе первичного протеомного анализа во фракции легкораствори-
мых хлоропластных белков 168-часовых проростков озимой ржи выявлено
около 250 белков (см. рисунок, а). Некоторые группы белков, содержа-
щихся в больших количествах, были предположительно идентифициро-
ваны на основании представленных в литературе 2D-электрофореграмм
хлоропластных белков Arabidopsis [14], гороха [15] и кукурузы [13] (таб-
лица). В частности, это изоформы полифенолоксидазы (РРО), большие
субъединицы рибулозо-бис-фосфаткарбоксилазы (RbcL), белки АТФ-
синтетазного (CF , -cluster) и кислородвыделяющего (ОЕС 33-cluster,
ОЕС 23-cluster, ОЕС 16) комплексов, пластоцианины (PLAS) и белок
PsaN фотосистемы I. Во фракции труднорастворимых хлоропластных бел-
ков 168-часовых проростков озимой ржи выявлено около 100 белков (см.
рисунок, б). Из них первично идентифицированы RbcL, CF , -cluster,
OEC 33-cluster, OEC 23-cluster, OEC 16, PLAS и PsaN, т.е. те же белки,
что и во фракции легкорастворимых белков, за исключением РРО. Од-
нако, как видно из 2D-электрофореграмм, представленных на рисунке,
при меньшем количестве вносимого в ПААГ белка (60 против 70 мкг)
содержание ОЕС 33-cluster, ОЕС 16 и PsaN во фракции труднораствори-
мых хлоропластных белков выше, что свидетельствует о сильной связи
этих белков с хлоропластными мембранами. Подобное перекрывание
2D-электрофореграмм — частое явление. Например, Пелтиер и др. [15],
исследовав люменные и периферические тилакоидные белки хлоропла-
стов гороха, установили 39 % перекрывания люменной и периферичес-
кой 2D-электрофореграмм. Неустойчивая связь белков с тилакоидной
мембраной может быть частью их функции (например, как у пластоци-
анина) или наблюдаться во время биогенеза тилакоида и сборки белко-
вых комплексов (например, как у белков ОЕС). Однако при анализе 2D-
электрофореграмм всегда можно четко различить белки, легко
переходящие в раствор и преимущественно связанные с мембранами.
При 2D-электрофорезе с ИЭФ в качестве 1-го направления для боль-
108
А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
шинства белков экспе-
риментально определен-
ные молекулярные мас-
сы совпадают с
теоретически рассчитан-
ными. Однако в некото-
рых случаях (например,
для ферредоксина, плас-
тоцианина, СF1 один и
тот же белок имеет фак-
тическую молекулярную
массу больше теоретиче-
ской. В работе Пелтиера
и соавт. [15] ферредок-
син с мол. м. 11 кД пред-
ставлен слабо выражен-
ным пятном на уровне
30 кД и рI 5,0. Во время
ИЭФ молекулы ферре-
доксина агрегируют, что
модифицирует как значе-
ние молекулярной мас-
сы, так и эксперименталь-
но полученное значение
рI (теоретическое значе-
ние рI мономерного
ферредоксина ниже 4,0).
Такая ситуация также ха-
рактерна для пластоциа-
нина [15]. Чтобы подсчи-
тать общее число
функционально различ-
ных белков среди наблю-
даемого числа пятен, не-
обходима поправка на
различные изоформы,
посттрансляционные мо-
дификации, РНК-редак-
тирование и протеолиз
белков, поскольку имен-
но вследствие этих про-
цессов некоторые белки
на 2D-электрофореграм-
мах формируют шлейф
или бусы из белковых
пятен (с различными
значениями рI, но с оди-
наковой молекулярной
массой). Это, например,
характерно для белков
ОЕС 33, ОЕС 23, CF1,
CF1, для шаперонов
БТШ 70, Срn 60 и др.
109
ПЕРВИЧНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
2D-электрофореграмма легкорастворимых (а) и труд-
норастворимых (б) хлоропластных белков 168-часовых
проростков озимой ржи сорта Верасень
а
б
110
А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
Идентифицированные белки из протеома хлоропластов различных растений, использованные
для первичного анализа протеома хлоропластов озимой ржи
Молекулярная
масса, кД
Белок Растение
Номер доступа в
базах NSBI, SWISS-
Prot, PIR, MIPS или
TIGR Zm
теоре-
тичес-
кая
по 2D-
электро-
форе-
грамме
рI
Литера-
турный
источ-
ник
ОЕС 16 Onobrychis
vicifolia
AF026400 (PIR) 25,4 17,1 9,3 [15]
OEC 16 Arabidopsis
thaliana
4583542 (NSBI)
At4g21280 (MIPS)
— 16,7 9,3 [14]
ОЕС 16
подобный
Arabidopsis
thaliana
7267278 (NSBI)
At4g05180 (MIPS)
— 16,7 9,1 [14]
OEC 23 Pisum sativum P16059 (SWISS-Prot) 28 21,9 5,7—6,4 [15]
OEC 23 Arabidopsis
thaliana
7443217 (NSBI)
At1g06680 (MIPS)
— 20,5 5,7—6,0 [14]
OEC 33 Pisum sativum P14226 (SWISS-Prot) 34,9 29,8—30,2 5,5—5,8 [15]
OEC 33 Pisum sativum P14226 (SWISS-Prot) 34,9 21,5 6,3 [15]
OEC 33 Arabidopsis
thaliana
3286693 (NSBI)
At5g66570 (MIPS)
— 28,5 5,1—5,6 [14]
OEC 33
(ФС I)
Zea mays 15912247 13926292
(NSBI)
35,128 — 5,55
(теорет.)
[13]
OEC 33
(ФС I)
Zea mays 1508655 (NSBI) 34,861 — 6,09
(теорет.)
[13]
OEC 33
(ФС II)
Zea mays TC81083
(TIGR Zm)
37,531 — 5,92
(теорет.)
[13]
PLAS Pisum sativum P16002 (SWISS-Prot) 17,1 9,8 4,7 [15]
PLAS Pisum sativum P16002 (SWISS-Prot) 17,1 26,9 4,7 [15]
PLAS 1 Arabidopsis
thaliana
1169201 (NSBI)
At1g20340 (MIPS)
— 14—35 4,4—4,9 [14]
PLAS 2 Arabidopsis
thaliana
130261 (NSBI)
At1g76100 (MIPS)
— 28,9 4,2 [14]
RbcL Pisum sativum P04717 (SWISS-Prot) 47,3 54,3 6,6 [15]
RbcL Arabidopsis
thaliana
1944432 (NSBI) 47,3 50,6 6,6 [14]
CF1 Pisum sativum 114522 (NSBI) 55,1 55—55,5 6,0—6,7 [15]
CF1 Pisum sativum 114522 (NSBI) 55,1 12,6 5,2 [15]
CF1 Arabidopsis
thaliana
5881679 (NSBI) 55,1 53,4 5,4—5,6 [14]
CF1 Zea mays TC90687
(TIGR Zm)
55,707 — 5,86
(теорет.)
[13]
CF1 Pisum sativum 114560 (NSBI) 53,1 51,5—52,5 5,6—5,8 [15]
CF1 Pisum sativum 114560 (NSBI) 53,1 37,3 5,6 [15]
CF1 Arabidopsis
thaliana
5881701 (NSBI) 53,1 51,3 5,7—6,0 [14]
CF1
Zea mays TC85581
(TIGR Zm)
54,041 — 5,31
(теорет.)
[13]
[15]. Такие фотосинтетические белки, как ОЕС 23, ОЕС 33 и ферредок-
син-НАДФН-редуктазы, в горохе, шпинате и табаке кодируются семейст-
вами генов, поэтому для них можно ожидать существование изоформ.
Многие хлоропластные белки после трансляции мофидицируются путем
фосфорилирования. Малая субъединица рибулозо-бис-фосфаткарбокси-
лазы (RbcS) подвергается метилированию и карбамилированию, большая
(RbcL) — карбамилированию. Белки CF1 из АТФ-синтетазного ком-
плекса гликозилируются, белок D1 модифицируется через пальмитоили-
рование. Две формы аскорбатпероксидазы — стромальная и связанная с
тилакоидами — дают альтернативный сплайсинг, к гетерогенности бел-
ков ведет также редактирование мРНК. Наконец, цепочки пятен могут
быть результатом карбамилирования в ходе приготовления образца из-за
содержания в буфере мочевины, даже если соблюдены все меры предо-
сторожности [15]. Указанное необходимо учитывать при подсчете обще-
го числа функционально различных белков.
Таким образом, в ходе анализа 2D-электрофореграмм хлоропласт-
ных белков 168-часовых проростков озимой ржи обнаружено около 250
легкорастворимых и около 100 труднорастворимых белков. Это число,
вероятно, занижено, так как ряд белков с низким содержанием может
маскироваться доминирующими белками ОЕС 16, ОЕС 23, ОЕС 33, СF1
или быть ниже порога чувствительности к красителю. Визуализация этих
белков может быть осуществлена после удаления протеинов ОЕС и СF1,
например, с помощью аффинной хроматографии и (или) 2D-электрофо-
реза в более узком диапазоне рI.
1. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии рас-
тений. Фотосинтез. Дыхание / Под ред. Б.А. Рубина. — М.: Высш. шк., 1975. — 392 с.
2. Техника биохимического исследования субклеточных структур и биополимеров расти-
тельной клетки / Под ред. А.С. Вечера. — Минск: Наука и техника, 1986. — 197 с.
3. Baginsky S., Gruissem W. Arabidopsis thaliana proteomics: from proteome to genome // J. Exp.
Bot. — 2006. — 57. — P. 1485—1491.
4. Baginsky S., Gruissem W. Chloroplast proteomics: potentials and challenges // Ibid. — 2004. —
55. — P. 1213—1220.
111
ПЕРВИЧНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
Окончание таблицы
Молекулярная
масса, кД
Белок Растение
Номер доступа в
базах NSBI, SWISS-
Prot, PIR, MIPS или
TIGR Zm
теоре-
тичес-
кая
по 2D-
электро-
форе-
грамме
рI
Литера-
турный
источ-
ник
CF1 Zea mays 629818 (NSBI) 59,249 — 5,56
(теорет.)
[13]
CF1 Zea mays 552857 (NSBI) 53,954 — 5,30
(теорет.)
[13]
CF1 Zea mays 6815115 (NSBI) 53,997 — 5,38
(теорет.)
[13]
CF1 Zea mays 874823 (NSBI) 53,717 — 5,20
(теорет.)
[13]
PsaN Hordeum
vulgare
P31093 (SWISS-Prot) 15,5 7,2 9,0 [по 15]
PsaN Arabidopsis
thaliana
1709825 (NSBI)
At5g64040 (MIPS)
— 12,1 9,6 [14]
5. Baginsky S., Kleffmann T., von Zychlinski A., Gruissem W. Analysis of shotgun proteomics and
RNA profiling data from Arabidopsis thaliana chloroplasts // J. Proteome Res. — 2005. — 4. —
P. 637—640.
6. Emanuelsson O., Nielsen H., Brunak S., Heijne G. Predicting subcellular localization of pro-
teins based on their N-terminal amino acid sequence // J. Mol. Biol. — 2000. — 300. —
P. 1005—1016.
7. Froehlich J.E., Wilkerson C.G., Ray W.K. et al. Proteomic study of the Arabidopsis thaliana
chloroplastic envelope membrane utilizing alternatives to traditional two dimensional elec-
trophoresis // J. Proteome Res. — 2003. — 2. — P. 413—425.
8. Jarvis P. Organellar proteomics: Chloroplasts in the spotlight // Curr. Biol. — 2004. — 14. —
P. 317—319.
9. Kleffmann T., von Zychlinski A., Russenberger D. et al. Proteome dynamics during plastid diffe-
rentiation in rice // Plant Physiol. — 2007. — 143. — P. 919—923.
10. Kleffmann T., Russenberger D., von Zychlinski A. et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast pro-
teome reveals pathway abundance and novel protein functions // Curr. Biol. — 2004. — 14. —
P. 354—362.
11. Konishi H., Komatsu S. A proteomics approach to investigating promotive effects of brassino-
lide on lamina inclination and root growth in rice seedlings // Biol. Pharmacol. Bull. —
2003. — 26. — P. 401—408.
12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-
phage T4 // Nature. — 1970. — 227. — P. 680—685.
13. Lonosky P.M., Zhang X., Honavar V.G. et al. A proteomic analysis of maise chloroplast bio-
genesis // Plant Physiol. — 2004. — 134. — P. 560—574.
14. Peltier J.-B., Emanuelsson O., Kalume D.E. et al. Central functions of the lumenal and periphe-
rical thylakoid proteome of Arabidopsis thaliana determined by experimentation and genome-
wide prediction // Plant Cell. — 2002. — 14. — P. 211—236.
15. Peltier J.-B., Friso G., Kalume D.E. et al. Proteomics of the chloroplast: systematic identifica-
tion and targeting analysis of lumenal and peripheral thylakoid proteins // Ibid. — 2000. —
12. — P. 319—341.
16. Rakwal R., Komatsu S. Role of jasmonate in the rice (Oryza sativa L.) self-defense mechanism
using proteome analysis // Electrophoresis. — 2000. — 21. — P. 2492—2500.
17. Schubert M., Petersson U.A., Haas B.J. et al. Proteome map of the chloroplast lumen of Arabi-
dopsis thaliana // J. Biol. Chem. — 2002. — 277. — P. 8354—8365.
18. Shen S., Jing Y., Kuang T. Proteomics approach to identify wound-response related proteins
from rice leaf sheath // Proteomics. — 2003. — 3. — P. 527—535.
19. Van Wijk K.J., Peltier J.-B., Giacomelli L. Isolation of chloroplast proteins from Arabidopsis
thaliana for proteome analysis // Methods in molecular biology, 335: Plant proteomics: me-
thods and protocols / Ed. by H. Thiellement, M. Zivy, C. Damerval, V. Mechin. — Humana
Press Inc., Totowa, NJ, 2006. — P. 43—48.
20. Weiss W., Gorg A. Two-dimensional electrophoresis for plant proteomics // Ibid. — P. 121—143.
Получено 29.03.2010
ПЕРВИННИЙ ПРОТЕОМНИЙ АНАЛIЗ ХЛОРОПЛАСТIВ ОЗИМОГО ЖИТА
I МЕТОДИЧНI ПIДХОДИ ДО ЙОГО ПРОВЕДЕННЯ
Г.А. Кузовкова, О.В. Спиридович, В.М. Решетников
Державна наукова установа «Центральний ботанічний сад Національної академії наук
Білорусі», Мінськ
Методом 2D-електрофорезу (ізоелектрофокусування на IPG-стрипах та електрофорез у де-
натурувальній системі за лужних умов) у хлоропластах 168-годинних проростків озимого
жита виявлено близько 250 легкорозчинних і 100 важкорозчинних хлоропластних білків.
Деякі з них первинно ідентифіковано.
PRIMARY PROTEOMIC ANALYSIS OF WINTER RYE CHLOROPLASTS AND
METHODICAL APPROACHES FOR IT REALIZATION
A.A. Kuzovkova, E.V. Spiridovich, V.N. Reshetnikov
State Scientific Institution «Central Botanical Gardens of National Academy of Sciences of Belarus»
2V Surganov St., Minsk, 220012, Belarus
It was detected near 250 readily soluble and 100 hardly soluble proteins in the chloroplasts of 168-
hours winter rye seedlings by 2D-electrophoresis (isoelectric focusing on the IPG-strips and
SDS — electrophoresis). Some of detected proteins were identified.
Key words: winter rye, chloroplasts, proteomic analysis.
112
А.А. КУЗОВКОВА, Е.В. СПИРИДОВИЧ, В.Н. РЕШЕТНИКОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
113
ПЕРВИЧНЫЙ ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТОВ
Физиология и биохимия культ. растений. 2011. Т. 43. № 2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66356 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0522-9310 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:10:32Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Кузовкова, А.А. Спиридович, Е.В. Решетников, В.Н. 2014-07-11T07:03:22Z 2014-07-11T07:03:22Z 2011 Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению / А.А. Кузовкова, Е.В. Спиридович, В.Н. Решетников // Физиология и биохимия культурных растений. — 2011. — Т. 43, № 2. — С. 105-113. — Бібліогр.: 20 назв. — рос. 0522-9310 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66356 582.542.1:577.112:547.96:581.174.1 Методом 2D-электрофореза (изоэлектрофокусирование на IPG-стрипах и электрофорез в денатурирующей системе в щелочных условиях) в хлоропластах 168-часовых проростков озимой ржи обнаружено около 250 легкорастворимых и 100 труднорастворимых хлоропластных белков. Некоторые из них первично идентифицированы. Методом 2D-електрофорезу (ізоелектрофокусування на IPG-стрипах та електрофорез у денатурувальній системі за лужних умов) у хлоропластах 168-годинних проростків озимого жита виявлено близько 250 легкорозчинних і 100 важкорозчинних хлоропластних білків. Деякі з них первинно ідентифіковано. It was detected near 250 readily soluble and 100 hardly soluble proteins in the chloroplasts of 168- hours winter rye seedlings by 2D-electrophoresis (isoelectric focusing on the IPG-strips and SDS — electrophoresis). Some of detected proteins were identified. ru Iнститут фізіології рослин і генетики НАН України Физиология и биохимия культурных растений Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению Первинний протеомний аналіз хлоропластів озимого жита і методичні підходи до його проведення Primary proteomic analysis of winter rye chloroplasts and methodical approaches for it realization Article published earlier |
| spellingShingle | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению Кузовкова, А.А. Спиридович, Е.В. Решетников, В.Н. |
| title | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| title_alt | Первинний протеомний аналіз хлоропластів озимого жита і методичні підходи до його проведення Primary proteomic analysis of winter rye chloroplasts and methodical approaches for it realization |
| title_full | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| title_fullStr | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| title_full_unstemmed | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| title_short | Первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| title_sort | первичный протеомный анализ хлоропластов озимой ржи и методические подходы к его проведению |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66356 |
| work_keys_str_mv | AT kuzovkovaaa pervičnyiproteomnyianalizhloroplastovozimoiržiimetodičeskiepodhodykegoprovedeniû AT spiridovičev pervičnyiproteomnyianalizhloroplastovozimoiržiimetodičeskiepodhodykegoprovedeniû AT rešetnikovvn pervičnyiproteomnyianalizhloroplastovozimoiržiimetodičeskiepodhodykegoprovedeniû AT kuzovkovaaa pervinniiproteomniianalízhloroplastívozimogožitaímetodičnípídhodidoiogoprovedennâ AT spiridovičev pervinniiproteomniianalízhloroplastívozimogožitaímetodičnípídhodidoiogoprovedennâ AT rešetnikovvn pervinniiproteomniianalízhloroplastívozimogožitaímetodičnípídhodidoiogoprovedennâ AT kuzovkovaaa primaryproteomicanalysisofwinterryechloroplastsandmethodicalapproachesforitrealization AT spiridovičev primaryproteomicanalysisofwinterryechloroplastsandmethodicalapproachesforitrealization AT rešetnikovvn primaryproteomicanalysisofwinterryechloroplastsandmethodicalapproachesforitrealization |