Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака

Проведено клонирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК, выделенной из 17 трансгенных растений табака методом «инвертированной» ПЦР. В результате анализа первичных последовательностей 34 клонированных фрагментов ДНК установлено, что 10 из них имели 100%-ную гомологию с векторными последо...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Цитология и генетика
Дата:	2007
Автори:	Филипенко, Е.А., Филипенко, М.Л., Дейнеко, Е.В., Шумный, В.К.
Формат:	Стаття
Мова:	Російська
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2007
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66564
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака / Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 3-8. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859594905313083392
author	Филипенко, Е.А. Филипенко, М.Л. Дейнеко, Е.В. Шумный, В.К.
author_facet	Филипенко, Е.А. Филипенко, М.Л. Дейнеко, Е.В. Шумный, В.К.
citation_txt	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака / Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 3-8. — Бібліогр.: 24 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Цитология и генетика
description	Проведено клонирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК, выделенной из 17 трансгенных растений табака методом «инвертированной» ПЦР. В результате анализа первичных последовательностей 34 клонированных фрагментов ДНК установлено, что 10 из них имели 100%-ную гомологию с векторными последовательностями, не входящими в Т-ДНК область. Девять полученных нуклеотидных последовательностей имели гомологию с повторяющимися последовательностями в геноме табака. Процент гомологии варьировал от 70 до 90 %, причем идентифицированные повторы принадлежали к разным типам. Для большей части проанализированных фрагментов не выявлено гомологий с последовательностями, депонированными в базах данных. Выравнивание усеченных в процессе встраивания последовательностей левой и правой границ Т-ДНК инсерций выявило значительную кластеризацию (в районе десяти нуклеотидов) сайтов усечения для левой границы. Необходимо отметить, что пять последовательностей имели идентичные сайты усечения +23Т, что свидетельствовало о предпочтительном использовании этого нуклеотида. АТ-содержание варьировало от 51 до 72 %, что было близко к суммарному проценту АТ пар в геноме табака. Проведено клонування прилеглих до трансгена регіонів геномної ДНК, виділеної з 17 трансгенних рослин тютюну методом «інвертованої» ПЛР. У результаті аналізу первинних послідовностей 34 клонованих фрагментів ДНК встановлено, що 10 з них мали 100%-ну гомологію з векторними послідовностями, які не входять у Т-ДНК область. Дев'ять отриманих нуклеотидних послідовностей мали гомологію з повторювальними послідовностями в геномі тютюну. Відсоток гомології варіював від 70 до 90 %, причому ідентифіковані повтори належали до різних типів. Для більшої частини проаналізованих фрагментів не виявлено гомологій з послідовностями, депонованими в базах даних. Вирівнювання усічених у процесі вбудовування послідовностей лівої та правої границь Т-ДНК інсерцій виявило значну кластеризацію (у районі десяти нуклеотидів) сайтів усікання для лівої границі. Необхідно зазначити, що п'ять послідовностей мали ідентичні сайти усікання +23Т, що свідчило про переважне використання цього нуклеотиду. АТ-вміст варіював від 51 до 72 %, що було близько до сумарного відсотку АТ пар в геномі тютюну. From the total DNA of 17 transgenic tobacco plants the DNA fragments containing T-DNA/plant DNA junctions were amplified using inverse polymerase chain reaction. Comparison of the nucleotide sequences of 34 fragments with the GENEBANK sequences revealed homology with vector sequences outside T-DNA in 10 cases and no homology with the known nucleotide sequences in most clones. The AT-content varied from 51 up to 72 % that is close to the total percentage of АТ pairs in tobacco genome. Alignment of the sequences truncated during embedding of the left and the right borders has shown that for the left border significant clusterization (10 bp region) of truncation sites was observed, and five sequences had identical sites of truncation (+23 Т) that showed the preferable use of this nucleotide. Nine created nucleotide sequences were homologous to the repeating sequences in tobacco genome. The percentage of homology varied from 70 up to 90 %. The identified repeats belong to different types.
first_indexed	2025-11-27T19:39:26Z
format	Article
fulltext	Проведено клонирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК, выделенной из 17 трансгенных растений табака методом «инвертированной» ПЦР. В результате анализа первичных последовательностей 34 клонированных фрагментов ДНК установлено, что 10 из них имели 100%$ную гомологию с векторными последо$ вательностями, не входящими в Т$ДНК область. Де$ вять полученных нуклеотидных последовательностей имели гомологию с повторяющимися последователь$ ностями в геноме табака. Процент гомологии варьи$ ровал от 70 до 90 %, причем идентифицированные пов$ торы принадлежали к разным типам. Для большей час$ ти проанализированных фрагментов не выявлено гомо$ логий с последовательностями, депонированными в базах данных. Выравнивание усеченных в процессе встраивания последовательностей левой и правой границ Т$ДНК инсерций выявило значительную кластеризацию (в районе десяти нуклеотидов) сайтов усечения для левой границы. Необходимо отметить, что пять последова$ тельностей имели идентичные сайты усечения +23Т, что свидетельствовало о предпочтительном использо$ вании этого нуклеотида. АТ$содержание варьировало от 51 до 72 %, что было близко к суммарному проценту АТ пар в геноме табака. Введение. Для генетической модификации растений, и в особенности двудольных, в нас� тоящее время широко используется метод агро� бактериальной трансформации, основанный на переносе в растительный геном Т�ДНК области Ti�плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Ti�плаз� мида содержит гены вирулентности (vir�гены), продукты которых участвуют в вырезании и пе� реносе Т�ДНК в растительную клетку. Выреза� ние происходит по двум несовершенным пря� мым повторам, правой и левой бордерным по� следовательностям, фланкирующим Т�ДНК. Белок VirD2 в присутствии VirD1�белка произ� водит одноцепочечные разрывы ДНК в области бордерных последовательностей и ковалентно присоединяется к 5'�концу правого бордера. Т� ДНК переносится в растительное ядро в виде одноцепочечной молекулы, по всей длине свя� занной с агробактериальными белками Е2 и белком VirD2 на 5'�конце. Интеграция Т�ДНК в растительный геном осуществляется посредст� вом образования разрывов растительной ДНК по механизму негомологичной («незаконной») рекомбинации [1]. Анализ и накопление данных о первичной структуре границ Т�ДНК инсерций и приле� жащих к ним областей растительной ДНК у трансгенных растений является необходимым элементом изучения молекулярных механиз� мов встраивания Т�ДНК в растительный ге� ном. Наличие микрогомологий между Т�ДНК и эндогенной ДНК необходимо для процесса встраивания трансгена [2, 3]. Предполагается, что контекст ДНК, ее АТ�содержание, а также некоторые другие характеристики могут опре� делять предпочтительность встраивания транс� гена в растительный геном [4]. Цель настоящей работы – структурный ана� лиз первичных последовательностей прилежа� щих к трансгену областей геномной ДНК у трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L., линия SR1). Материалы и методы. Для анализа районов встраивания Т�ДНК инсерций использовали 17 независимо полученных нами ранее методом агробактериального переноса трансгенных рас� тений табака (N. tabacum L., линия SR1). Кло� нирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК проводили методом «инверти� рованной» ПЦР [5]. Так как генетические конструкции для получения трансгенных расте� ний были созданы на основе бинарного векто� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 3 Оригинальные работы УДК 575.111:575.224:633.71:602.6 Е.А. ФИЛИПЕНКО 1, М.Л. ФИЛИПЕНКО 2, Е.В. ДЕЙНЕКО 1, В.К. ШУМНЫЙ 1 1 Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, пр(т Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090 E(mail: deineko@bionet.nsc.ru, filipenko@bionet.nsc.ru 2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, пр(т Лаврентьева, 8, Новосибирск, 630090 АНАЛИЗ САЙТОВ ВСТРАИВАНИЯ Т�ДНК ИНСЕРЦИЙ У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА © Е.А. ФИЛИПЕНКО, М.Л. ФИЛИПЕНКО, Е.В. ДЕЙНЕКО, В.К. ШУМНЫЙ, 2007 Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный ра pBI121, то концевые последовательности Т� ДНК этого вектора были использованы для син� теза олигонуклеотидных праймеров. Геномную ДНК трансгенных растений та� бака выделяли, как описано ранее [6]. ДНК (100–200 нг) гидролизовали эндонуклеазами TaqI или MspI, смесь экстрагировали фено� лом, ДНК из смеси осаждали этанолом. ДНК растворяли в лигазном буфере (1–2 нг/мкл) и подвергали самолигированию в течение ночи при 8 °С. ДНК осаждали этанолом, растворяли в воде и использовали в качестве матрицы для ПЦР [7]. ПЦР проводили в 50 мкл буфера, со� держащего 67 мМ трис�HCl (рН 8,9), 16 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween 20, 10 мМ β�меркаптоэтанола, 100 мкМ dNTP, 1 мкМ праймеры, 2 ед. акт. Taq�ДНК�полиме� разы. Амплификацию осуществляли в течение 32 циклов в следующем режиме: денатурация – 1 мин при 94 °С, отжиг праймеров – 1 мин при 52 °С для первого цикла и 0,5 мин при 62 °С для всех последующих циклов, элонгация – 3 мин при 72 °С. Далее 1/10 амплификационных смесей использовали для второго раунда амплификации с «внутренними» праймерами в аналогичных условиях ПЦР. Для клониро� вания амплифицированные фрагменты ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой PstI (для праймеров 1 и 3) или BamHI (для праймеров 5 и 7) и лигировали с плазмидой pBluscriptKSII, линеаризованной соответствующей эндонукле� азой рестрикции. Нуклеотидные последовате� льности клонированных фрагментов ДНК определяли с использованием ABI PRISM BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit («Amersham», Англия) в соответ� ствии с инструкциями фирмы�производителя. Для ПЦР использовали следующие струк� туры олигонуклеотидных праймеров («Биосан», Новосибирск): рbi 1: GACCTGCAGTCTCATATTCACTCTCAATCC pbi 2: GATGGATCCATAAATTCCCCTCGGTATCCA pbi 3: GACCTGCAGTCGTTTCCCGCCTTCAGT pbi 4: GATGGATCCTTAATTCTCCGCTCATGATC pbi 5: GACGGATCCACTACGTGAACCATCAC pbi 6: CACGGATCCGTCTATCAGGGCGATGG pbi 7: GACGGATCCAACGTCCGCAATGTGTTATTAAG pbi 8: CACAAGCTTGCCCGTCTCACTGGTGA Результаты исследований и их обсуждение. Результаты анализа первичных последовате� льностей клонированных нами фрагментов ДНК у 17 трансгенных растений табака приве� 4 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 10,48 16,70 121,41 121,57 121,76 121,83 121,86 Res60 Res66 Res36 Res47 Res79 Hep Res91 10,18 121, 89 Res73 139 224 130 163 190 211 223 350 230 550 480 320 313 320 434 538 430 92 300 171 133 212 103 166 300 165 169 279 164 256 270 318 320 200 65 52 58 74 51 66 61 53 71 70 65 67 66 69 56 61 62 64 55 54 68 70 56 70 * Вектор D17456 * * * * Y08010 Z73149 * * Y12534 * X80829, PAR� ген Вектор * Вектор Вектор Вектор * * Вектор * * X59606 Вектор * Вектор X79006 Вектор M77826 X14059 AB058958 AJ416574 X14593 AJ131837 * Z73149 Вектор № Транс� генное растение Размер секвени� рованного района растительной ДНК, п.н. правый бордер (RB) A/T, % Наличие гомологии с последова� тельностями из GENEBANK Описание нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК * – гомологии не выявлено. левый бордер (RB) Анализ сайтов встраивания Т#ДНК инсерций у трансгенных растений табака дены в таблице. Как видно из представленных данных, для 10 фрагментов ДНК, принадлежа� щих восьми растениям, выявлена 100%�ная го� мология с векторными последовательностями, не входящими в Т�ДНК область. Доля растений, несущих в геноме фрагменты векторных ДНК, составила 47,1 % от общего числа проанализи� рованных трансформантов табака. Полученные результаты хорошо согласуются с опубликован� ными нами ранее данными о частоте встраива� ния векторных последовательностей в геном трансгенных растений [8]. По данным других авторов, при агробактериальной трансформации частота встраивания векторных последователь� ностей в геном двудольных растений варьирует в широких пределах – от 1,3 [9] до 75,0 % [10]. Причины и механизмы образования фраг� ментов, состоящих из Т�ДНК и векторной ДНК, к настоящему времени еще до конца не ясны. Известно, что мутации по VirD2�белку могут приводить к неэффективным узнаванию и разрезанию данным белком пограничных повторов и их «проскакиванию», что влечет встраивание в геном растения длинных кон� катамеров плазмидной ДНК [11, 12]. Как и ожидалось, большинство проанализи� рованных последовательностей не имели боль� шой гомологии с последовательностями, депо� нированными в GENEBANK. Найденные нами гомологии приведены в таблице. В основном они связаны с повторяющимися последова� тельностями в геноме табака. Процент гомоло� гии варьирует от 70 до 90 %, причем идентифи� цированные повторы принадлежат к разным типам повторов (рис. 1). Выравнивание усеченных в процессе встра� ивания последовательностей левого и правого бордеров приведено на рис. 2. Для левого бор� дера наблюдается значительная кластеризация (в районе десяти нуклеотидов) сайтов усече� ния, причем пять последовательностей имели идентичные сайты усечения +23 Т, что говорит о предпочтительном использовании этого нук� леотида. Сайт усечения правого бордера не имеет выраженного предпочтения. В настоящее время в литературе существует мнение о том, что встраивание Т�ДНК проис� ходит в АТ�богатые области [13]. Данные об АТ�содержании секвенированных нами приле� жащих к трансгену областей приведены в таб� 5ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Рис. 1. Пример выравнивания нуклеотидных клонированных последовательностей прилежащих к трансгену областей растительной ДНК с нуклеотидными последовательностями, которые найдены в GENEBANK: а – фрагмент T12R с Y12534 (N. tabacum unknown DNA fragment, clone H59) 87 % гомологии; б – фрагмент T25R Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный лице. АТ�содержание варьирует от 51 до 72 % при общем АТ�содержании в геноме табака 64 % [14]. Таким образом, в нашем исследовании та� кая тенденция не наблюдалась. Более того, Бру� но c cоавт. [15] в процессе анализа большого количества Т�ДНК инсерций предположили, что сайту интеграции в районе левого бордера часто предшествует поли�Т�тракт, чего мы не наблюдаем при анализе наших последователь� ностей. Скорое опубликование данных о сек� венировании генома табака должно добавить информативности нашему анализу. Роль последовательностей ДНК так же, как и топологическая структура генома вокруг сайта встраивания Т�ДНК, еще до конца не изучена. Сравнительная характеристика сай� тов встраивания в Arabidopsis thaliana не пока� зала преимущественной интеграции в специ� 6 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Рис. 2. Выравнивание «усеченных» последовательностей «левого» (а) и «правого» (б) бордеров в исследуемых прилежащих к трансгену областях ДНК Анализ сайтов встраивания Т#ДНК инсерций у трансгенных растений табака фические генные структуры хромосом [16]. Тем не менее у Arabidopsis thaliana показан по� вышенный процент Т в позиции, расположен� ной выше сайта встраивания, что наводит на мысль о влиянии нуклеотидного состава на место встраивания. Этим можно объяснить наблюдаемое повышенное Т�содержание и предпочтительность интеграции в район гена выше стартового кодона, а также большее ко� личество встроек в интронах по сравнению с экзонами [15]. Известно, что АТ�последовательности явля� ются районами с низкой стабильностью ДНК� дуплекса [17] и стерическим изгибом хромо� сомной структуры [18]. Вероятно, узнавание пространственной структуры ДНК является важным фактором при интеграции чужеродной ДНК в геном [19]. Повышенное АТ�содержа� ние в сайтах встраивания трансгенной ДНК показано также для табака [20] и риса [18]. Такой нуклеотидный состав характерен для районов ядерного матрикса, посредством ко� торых хроматиновая структура крепится к оболочке ядра, образуя петлевые функцио� нальные домены [21, 22]. Предполагают, что указанные районы играют важную роль в регу� лировании экспрессии интегрированных ге� нов [23]. Кроме того, топоизомераза II, фер� мент, делающий двухцепочечные разрывы в ДНК, имеет высокую аффинность к сайтам ядерного матрикса [24]. Закономерно пред� положение о том, что такие сайты могут быть предпочтительнее для проявления механизма незаконной рекомбинации. Бруно c cоавт. [15] показали, что у A. thaliana трансгены в равной мере распределены во всех пяти хромосомах, причем встраивание проис� ходило реже в район центромер. Около 40 % трансгенов встраивалось в районы генов (опре� деленных по базе данных AGI), что включает 54 % генома. Было показано, что у A. thaliana встраивание происходит преимущественно в 5'UTR, 3'UTR и промоторные области. Воз� можно, раскрученная спираль ДНК во время инициации транскрипции и терминации транс� крипции на этих участках способствует боль� шой доступности для встраивания Т�ДНК. Не было выявлено определенной категории генов, обладающих более или менее других преимуществами для встраивания чужерод� ных генов. При анализе наших последователь� ностей у восьми мы наблюдали гомологию с последовательностями повторов табака. В на� стоящий момент мы не можем делать выводов о предпочтительности встраивания Т�ДНК в область повторов, так как известно, что геном табака содержит большое количество этих пос� ледовательностей. Но и отвергать эту гипотезу не имеет смысла до момента появления в от� крытом доступе результатов секвенирования генома табака, которые позволят подсчитать встречаемость повторяющихся элементов. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 05$04$48925. SUMMARY. From the total DNA of 17 transgenic to� bacco plants the DNA fragments containing T�DNA/plant DNA junctions were amplified using inverse polymerase chain reaction. Comparison of the nucleotide sequences of 34 fragments with the GENEBANK sequences revealed homology with vector sequences outside T�DNA in 10 cases and no homology with the known nucleotide sequences in most clones. The AT�content varied from 51 up to 72 % that is close to the total percentage of АТ pairs in tobacco genome. Alignment of the sequences truncated during embedding of the left and the right borders has shown that for the left border significant clusterization (10 bp region) of truncation sites was observed, and five sequences had identical sites of truncation (+23 Т) that showed the preferable use of this nucleotide. Nine created nucleotide sequences were homologous to the repeating se� quences in tobacco genome. The percentage of homology varied from 70 up to 90 %. The identified repeats belong to different types. РЕЗЮМЕ. Проведено клонування прилеглих до трансгена регіонів геномної ДНК, виділеної з 17 трансгенних рослин тютюну методом «інвертованої» ПЛР. У результаті аналізу первинних послідовностей 34 клонованих фрагментів ДНК встановлено, що 10 з них мали 100%�ну гомологію з векторними послідов� ностями, які не входять у Т�ДНК область. Дев'ять отриманих нуклеотидних послідовностей мали гомо� логію з повторювальними послідовностями в геномі тютюну. Відсоток гомології варіював від 70 до 90 %, причому ідентифіковані повтори належали до різних типів. Для більшої частини проаналізованих фраг� ментів не виявлено гомологій з послідовностями, депонованими в базах даних. Вирівнювання усічених у процесі вбудовування послідовностей лівої та правої границь Т�ДНК інсерцій виявило значну класте� ризацію (у районі десяти нуклеотидів) сайтів усікання для лівої границі. Необхідно зазначити, що п'ять 7ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4 Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный послідовностей мали ідентичні сайти усікання +23Т, що свідчило про переважне використання цього нуклеотиду. АТ�вміст варіював від 51 до 72 %, що було близько до сумарного відсотку АТ пар в геномі тютюну. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Tinland B. The integration of T�DNA into plant geno� mes // Trends Plant Sci. USA. – 1996. – 1, № 6. – P. 178–184. 2. Gheysen G., Van Montagu M.V., Zambryski P. Integration of Agrobacterium tumefaciens transfer DNA (T�DNA) involves rearrangements of target plant DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1987. – 84. – P. 6169–6173. 3. Matsumoto S., Ito Y., Hosoi T., Takahashi Y., Mashida Y. Integration of Agrosbacterium T�DNA into a tobac� co chromosome: possible involvement of DNA homol� ogy between T�DNA and plant DNA // Mol. Gen. Genet. – 1990. – 224. – P. 309–316. 4. Shimizu K., Takahashi M., Goshima N. et al. Presence of SAR�like sequence in junction regions between an introduced transgene and genomic DNA of cultured tobacco cells: its effect on transformation frequency // Plant J. – 2001. – 26. – P. 375–384. 5. Ochman H., Ajioka J.W., Garza D., Hartl D.L. PCR technology: principles and applications for DNA ampli� fication // Biotechnology. – 1990. – 8. – P. 759–760. 6. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version 2 // Plant Mol. Biol. Rep. – 1983. – 1. – P. 19–22. 7. Филипенко Е.А., Филипенко М.Л., Мурашева С.В., Дейнеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В., Шумный В.К. Анализ сайтов встраивания Т�ДНК у трансген� ных растений ДНК с мутантным фенотипом // Докл. АН РАН. – 2000. – 370, № 2. – P. 273–276. 8. Пухначева Н.В., Новоселя Т.В., Зоткевич Е.А., Дей$ неко Е.В. Встраивание векторных последовательно� стей в геном трансгенных растений // Генетика. – 2005. – 41, № 9. – P. 1203–1209. 9. Ramanathan V., Veluthambi K. Transfer of non�T�DNA portions of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6 from the left terminus of TL�DNA // Plant. Mol. Biol. – 1995. – 28. – P. 1149–1154. 10. Kononov M., Bassuner B., Gelvin S. Integration of T� DNA binary vector «backbone» sequences into the to� bacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration // Plant J. – 1997. – 11. – P. 945–957. 11. Tinland B., Schoumacher F., Gloeckler V., Bravo$Angel A.M., Hohn B. The Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of T� DNA into the plant genome // EMBO J. – 1995. – 14, № 14. – P. 3585–3595. 12. Wolters A.$M.A., Trindade L.M., Jacobsen E., Visser R.G.F. Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres as a tool to analyse complex T�DNA loci in potato // Plant J. – 1998. – 13. – P. 837–847. 13. Daniels G.R., Deininger P.L. Integration sites preferences of the Alu family and similar repetitive DNA sequences // Nucl. Acids Res. – 1985. – 13. – P. 8939–8954. 14. Karlin S., Mrazek J. Compositional differences within and between eukariotic genomes // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1997. – 94. – P. 10227–10232. 15. Вrunaud V., Balzergue S., Dubreucq B., Aubourg S., Samson F. et al. T�DNA integration into the Arabidopsis genome depends on sequences of pre�insertion sites // EMBO Rep. – 2002. – 3, № 12. – P. 1152–1157. 16. Azpiroz$Leehan R., Feldmann K.A. T�DNA integration mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth // Trends Genet. – 1997. – 13. – P. 152–156. 17. Muller A., Kamisugi Y., Grunberg R., Niedenhof R., Hörold R.J., Meyer P. Palindromic sequences and A+T� rich DNA elements promote illegitimate recombination in Nicotiana tabacum // J. Mol. Biol. – 1999. – 291. – P. 28–46. 18. Takano M., Egawa H., Ikeda J$E., Wakasa K. The structures of integration sites in transgenic rice // Plant J. – 1997. – 11, № 3. – P. 353–361. 19. Sawasaki T., Takahashi M., Goshima N., Morikawa H. Structures of transgene loci in transgenic Arabidopsis plants obtained by particle bombardment : Junction regions can bind to nuclear matrices // Gene. – 1998. – 218. – P. 27–35. 20. Gheysen G., Herman L., Breyne P., Gielen J., Van Montagu M., Depicker A. Cloning and sequence analy� sis of truncated T�DNA inserts from Nicotiana tabacum // Gene. – 1990. – 94. – P. 155–163. 21. Amati B., Pick L., Laroche T., Gasser S. M. Nuclear scaff� old attachment stimulates, but is not essential for ARS activity in Saccharomyces cerevisiae: analysis of the Droso$ phila ftz SAR // EMBO J. – 1990. – 9. – P. 4007–4016. 22. Hall G.Jr., Allen G.C., Loser D.S., Thompson W.F., Spiker S. Nuclear scaffolds and scaffold�attachment regions in higher plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1991. – 88. – P. 9320–9324. 23. Thompson E.M., Adenot P., Tsuji F.L., Renard J.$P. Real time imaging of transcriptional activity in live mouse preimplantation embryos using a secreted lu� ciferase // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 92. – P. 1317–1321. 24. Sperry A.O, Blasquez V.C., Garrard W.T. Disfunction of chromosomal loop attachment sites : Illegitimate recom� bination linked to matrix association regions and topoiso� merase II // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1989. – 86. – P. 5497–5501. Поступила 10.10.06 8 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 4
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66564
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Russian
last_indexed	2025-11-27T19:39:26Z
publishDate	2007
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Филипенко, Е.А. Филипенко, М.Л. Дейнеко, Е.В. Шумный, В.К. 2014-07-18T16:28:33Z 2014-07-18T16:28:33Z 2007 Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака / Е.А. Филипенко, М.Л. Филипенко, Е.В. Дейнеко, В.К. Шумный // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 4. — С. 3-8. — Бібліогр.: 24 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66564 575.111:575.224:633.71:602.6 Проведено клонирование прилежащих к трансгену областей геномной ДНК, выделенной из 17 трансгенных растений табака методом «инвертированной» ПЦР. В результате анализа первичных последовательностей 34 клонированных фрагментов ДНК установлено, что 10 из них имели 100%-ную гомологию с векторными последовательностями, не входящими в Т-ДНК область. Девять полученных нуклеотидных последовательностей имели гомологию с повторяющимися последовательностями в геноме табака. Процент гомологии варьировал от 70 до 90 %, причем идентифицированные повторы принадлежали к разным типам. Для большей части проанализированных фрагментов не выявлено гомологий с последовательностями, депонированными в базах данных. Выравнивание усеченных в процессе встраивания последовательностей левой и правой границ Т-ДНК инсерций выявило значительную кластеризацию (в районе десяти нуклеотидов) сайтов усечения для левой границы. Необходимо отметить, что пять последовательностей имели идентичные сайты усечения +23Т, что свидетельствовало о предпочтительном использовании этого нуклеотида. АТ-содержание варьировало от 51 до 72 %, что было близко к суммарному проценту АТ пар в геноме табака. Проведено клонування прилеглих до трансгена регіонів геномної ДНК, виділеної з 17 трансгенних рослин тютюну методом «інвертованої» ПЛР. У результаті аналізу первинних послідовностей 34 клонованих фрагментів ДНК встановлено, що 10 з них мали 100%-ну гомологію з векторними послідовностями, які не входять у Т-ДНК область. Дев'ять отриманих нуклеотидних послідовностей мали гомологію з повторювальними послідовностями в геномі тютюну. Відсоток гомології варіював від 70 до 90 %, причому ідентифіковані повтори належали до різних типів. Для більшої частини проаналізованих фрагментів не виявлено гомологій з послідовностями, депонованими в базах даних. Вирівнювання усічених у процесі вбудовування послідовностей лівої та правої границь Т-ДНК інсерцій виявило значну кластеризацію (у районі десяти нуклеотидів) сайтів усікання для лівої границі. Необхідно зазначити, що п'ять послідовностей мали ідентичні сайти усікання +23Т, що свідчило про переважне використання цього нуклеотиду. АТ-вміст варіював від 51 до 72 %, що було близько до сумарного відсотку АТ пар в геномі тютюну. From the total DNA of 17 transgenic tobacco plants the DNA fragments containing T-DNA/plant DNA junctions were amplified using inverse polymerase chain reaction. Comparison of the nucleotide sequences of 34 fragments with the GENEBANK sequences revealed homology with vector sequences outside T-DNA in 10 cases and no homology with the known nucleotide sequences in most clones. The AT-content varied from 51 up to 72 % that is close to the total percentage of АТ pairs in tobacco genome. Alignment of the sequences truncated during embedding of the left and the right borders has shown that for the left border significant clusterization (10 bp region) of truncation sites was observed, and five sequences had identical sites of truncation (+23 Т) that showed the preferable use of this nucleotide. Nine created nucleotide sequences were homologous to the repeating sequences in tobacco genome. The percentage of homology varied from 70 up to 90 %. The identified repeats belong to different types. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 05-04-48925. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака Article published earlier
spellingShingle	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака Филипенко, Е.А. Филипенко, М.Л. Дейнеко, Е.В. Шумный, В.К. Оригинальные работы
title	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака
title_full	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака
title_fullStr	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака
title_full_unstemmed	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака
title_short	Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака
title_sort	анализ сайтов встраивания т-днк инсерций у трансгенных растений табака
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66564
work_keys_str_mv	AT filipenkoea analizsaitovvstraivaniâtdnkinserciiutransgennyhrasteniitabaka AT filipenkoml analizsaitovvstraivaniâtdnkinserciiutransgennyhrasteniitabaka AT deinekoev analizsaitovvstraivaniâtdnkinserciiutransgennyhrasteniitabaka AT šumnyivk analizsaitovvstraivaniâtdnkinserciiutransgennyhrasteniitabaka

Анализ сайтов встраивания Т-ДНК инсерций у трансгенных растений табака

Репозитарії

Схожі ресурси