Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360

Успішне перенесення досліджувальних плазмід в клітини S. nogalater IMET43360 за допомогою міжродової кон’югації в системі E. coli – Streptomyces робить цей метод зручним інструментом для конструювання даного штаму. За допомогою ДНК–ДНК гібридизації визначено характер інтеграції плазмід pVWB і pRT801...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Цитология и генетика
Дата:	2007
Автори:	Климишин, Д.О., Громико, О.М., Федоренко, В.О.
Формат:	Стаття
Мова:	Українська
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2007
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66587
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360 / Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 5. — С. 3-8. — Бібліогр.: 17 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860044224735477760
author	Климишин, Д.О. Громико, О.М. Федоренко, В.О.
author_facet	Климишин, Д.О. Громико, О.М. Федоренко, В.О.
citation_txt	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360 / Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 5. — С. 3-8. — Бібліогр.: 17 назв. — укр.
collection	DSpace DC
container_title	Цитология и генетика
description	Успішне перенесення досліджувальних плазмід в клітини S. nogalater IMET43360 за допомогою міжродової кон’югації в системі E. coli – Streptomyces робить цей метод зручним інструментом для конструювання даного штаму. За допомогою ДНК–ДНК гібридизації визначено характер інтеграції плазмід pVWB і pRT801 та досліджено їхній вплив на біосинтез ногаламіцину. Результати наших досліджень дають змогу більш детально вивчати функціонування генів біосинтезу ногаламіцину у S. nogalater IMET43360. Використовування кон’югації для заміщення, руйнування генів та гетерологічної експресії дозволить отримувати нові «гібридні» антибіотики, що зможуть продукуватися цим штамом. Успешное перенесение исследуемых плазмид в клетки S. nogalater IMET43360 с помощью межродовой конъюгации в системе E. coli – Streptomyces делает этот метод удобным инструментом для конструирования указанного штамма. Использование ДНК– ДНК гибридизации позволило определить характер интеграции плазмид pVWB и pRT801, а также исследовать их влияние на биосинтез ногаламицина. Результаты наших исследований позволяют более детально изучать функционирование генов биосинтеза ногаламицина у S. nogalater IMET43360, а использование конъюгации для замещения, разрушения генов и гетерологичной экспрессии позволит получить новые «гибридные» антибиотики, которые могут продуцироваться этим штаммом. Successful transfer of the studied plasmids into S. nogalater IMET43360 cells using bacterial conjugation in the system E. coli – Streptomyces is an appropriate method for constructing this strain. Using DNA–DNA hybridization the character of integration of pVWB and pRT801 plasmids has been studied. The influence of these plasmids on nogalamycin biosynthesis has been investigated as well. The obtained results enable detailed study of nogalamycin gene functioning in S. nogalater IMET43360. The use of conjugation for substitution, destruction of genes, and heterological expression allows to get new «hybrid» antibiotics produced by this strain.
first_indexed	2025-12-07T16:57:17Z
format	Article
fulltext	Успішне перенесення досліджувальних плазмід в клі� тини S. nogalater IMET43360 за допомогою міжродової кон’югації в системі E. coli – Streptomyces робить цей ме� тод зручним інструментом для конструювання даного штаму. За допомогою ДНК–ДНК гібридизації визначено характер інтеграції плазмід pVWB і pRT801 та дослід� жено їхній вплив на біосинтез ногаламіцину. Результати наших досліджень дають змогу більш детально вивчати функціонування генів біосинтезу ногаламіцину у S. noga� later IMET43360. Використовування кон’югації для замі� щення, руйнування генів та гетерологічної експресії до� зволить отримувати нові «гібридні» антибіотики, що зможуть продукуватися цим штамом. Вступ. Актиноміцети є одними з основних продуцентів біологічно активних речовин. Ни� ми синтезується біля двох третин усіх відомих сполук, що мають антибіотичну та протипух� линну активність [1–4]. Найбільше таких спо� лук продукують представники роду Streptomyces. Серед широкого спектра продуктів вторинно� го метаболізму цих мікроорганізмів значний ін� терес становлять речовини з протипухлинними властивостями [1, 5]. Streptomyces nogalater IMET 43360 є проду� центом промислово важливого антрацикліно� вого антибіотика ногаламіцину. На його основі одержано більше 60 сполук, які характеризу� ються високою протипухлинною активністю. Серед них є й такі, що ефективно використо� вуються у медичній практиці [5, 6]. З огляду на те, що у світі постійно зростає потреба в но� вих протипухлинних препаратах, вивчення їх біосинтезу та розробка генно�інженерних під� ходів набуває все більшої актуальності. Для успішного використання сучасних ме� тодів генетичної інженерії щодо штамів акти� номіцетів необхідно володіти ефективними ме� тодами введення рекомбінантних ДНК в їхні клітини, проте існуючі методики трансформа� ції протопластів екзогенною ДНК для цілого ряду штамів актиноміцетів ще недостатньо ефективні. Одним із таких штамів є S. nogalater [5, 7]. Альтернативою до трансформації протоплас� тів актиноміцетів екзогенною ДНК може бути перенесення рекомбінантних плазмід в їхні клітини за допомогою кон’югації з E. coli [7–12]. У деяких випадках показана ефектив� ність цієї методики [7–9, 12]. Метою даної роботи було створення ефек� тивної системи перенесення рекомбінантних молекул ДНК в клітини штаму S. nogalater за до� помогою кон’югаційних схрещувань з E. coli. Матеріали і методи У роботі використано штами S. nogalater IMET43360 – продуцент но� галаміцину, E. coli DH5α (F�(ϕ80dΔ (lacZ) M15 recA1endA1gyrA96thi1deoR(lacZYA�argF) U169, E. coli ET12567(pUB307) (dam�13::Tn9 (Cmr) dcm�6 hsdM), що містить плазміду pUB 307. Як тест�культуру для визначення антибіо� тичної активності S. nogalater використовували Sarcina lutea. Плазміди для кон’югаційного пе� ренесення представлені в таблиці. Штами S. no� galater IMET43360 вирощували на соєвому, мінімальному та рідкому середовищі TSB [2] ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5 3 УДК 575.224+577.21 Д.О. КЛИМИШИН, О.М. ГРОМИКО, В.О. ФЕДОРЕНКО Львівський національний університет імені Івана Франка вул. Грушевського 4, Львів 79005, Україна E&mail: dedima@rambler.ru ВИКОРИСТАННЯ МІЖРОДОВОЇ КОН’ЮГАЦІЇ ESCHERICHIA COLI – STREPTOMYCES ДЛЯ ПЕРЕНЕСЕННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК В ШТАМ S. NOGALATER IMET43360 © Д.О. КЛИМИШИН, О.М. ГРОМИКО, В.О. ФЕДОРЕНКО, 2007 Оригинальные работы при 28–30 °С, а E. coli – на середовищах LB та ТA [2, 4]. Для проведення схрещування E. coli � S. no� galater донорний штам E. coli ET12567(pUB307) вирощували до середини логарифмічної фази росту на середовищі LA 16–18 год. Суспензії клітин реципієнта та донора готували в середо� вищі LB. Концентрація клітин донора станови� ла ~108 кл/мл. Суспензію клітин реципієнта в концентрації ~107 спор/мл піддавали тепловому шоку при 50 °С протягом 10 хв. Кон’югаційну суміш (100 мкл суспензії клітин реципієнта і 200 мкл суспензії спор донора у титрах, вказа� них вище) розподіляли на поверхні чашок з вів� сяним середовищем [2]. Інкубували протягом 12–18 год при температурі 28 °С і заливали 1 мл водного розчину, що містив апраміцин для селекції стрептоміцетів і налідиксову кис� лоту в кінцевих концентраціях 50 та 200 мкл/мл відповідно. У контролі визначали частоту утво� рення спонтанних апраміцин�стійких мутан� тів S. nogalater IMET43360. Для дослідження динаміки перенесення плазмід в клітини S. nogalater спори реципієнт� ного штаму піддавали термічній обробці при 50 °С (міцелій в таких умовах гине) і змішували з клітинами донора. Переривали проходжен� ня схрещування заливаючи чашки Петрі роз� чинами апраміцину для селекції екскон’юган� тів та налідиксової кислоти для пригнічення росту донора в кінцевих концентраціях 50 та 200 мкг/мл відповідно. Для кількісного аналізу продукції ногаламі� цину штами S. nogalater вирощували на соєво� му середовищі протягом 24 год та проводили екстракцію антибіотика сумішшю хлороформ� ацетон (2 : 1). Концентрацію ногаламіцину в спиртових розчинах визначали спектрофото� метрично. Спектри резистентності екскон’юган� тів S. nogalater до антибіотиків визначали шля� хом дифузії в агар з використанням дисків з антибіотиками. Виділення плазмідної та хромо� сомної ДНК із штамів S. nogalater та E. coli, об� робку ендонуклеазами рестрикції, ДНК–ДНК гібридизацію, електрофорез в агарозному гелі проводили згідно з рекомендаціями Hopwood et al. [2]. Результати досліджень та їх обговорення. Бе� ручи до уваги те, що трансформація протоплас� тів S. nogalater IMET43360 плазмідною ДНК відбувається з низькою ефективністю [4, 5], ми вирішили зробити спробу використати ме� тодику міжродової кон’югації для перенесення плазмід з E. coli в цей штам. Спочатку як донор ми використали штам E. coli ET12567(pUB037), що містить кон’югативну плазміду pSET152. Однією з особливостей цього вектора є те, що він містить attP�сайт і ген int актинофага ϕС31, Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко 4 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5 Характеристика використаних в роботі плазмід pSET152 pVWB pCHZ101 pSOK101 pKC1218 pKC1139 pRT801 Кон’югаційна інтегративна плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR, ген int і attP сайт фага ϕС31, 5,5 тис. п.н. Кон’югаційна інтегративна плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR, ген int і attP сайт фага VWB, 9,3 тис. п.н. Кон’югаційна човникова плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR та тіостриптону tsrR, реплікон плазміди pHZ1351, 7,3 тис. п.н. Кон’югаційна човникова плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR та тіостриптону tsrR, реплікон плазміди pIJ101, 7,2 тис. п.н. Кон’югаційна човникова плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR та тіостриптону tsrR, 5,8 тис. п.н. Кон’югаційна човникова плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR та тіостриптону tsrR, реплікон плазміди pSG5, 6,5 тис. п.н. Кон’югаційна інтегративна плазміда, що містить ген стійкості до апраміцину aрmR, систему інтеграції фага ϕBT1, 5,2 тис. п.н. Проф. П. Лідлей, Кембріджсь� кий ун�т, Великобританія [7] Проф. C. Зотчев, Університет м. Тронхейм, Норвегія Там же Проф. Ф. Ломбо, Університет м. Ов’єдо, Іспанія [2] Проф. Р. Тіл, Нотінгемський ун�т, Великобританія Плазміда Характеристика Джерело отримання що надає йому здатності до сайт�специфічної інтеграції в хромосому реципієнтних штамів актиноміцетів. Для забезпечення інтеграції не� обхідна наявність attB�сайту в хромосомі реци� пієнта. Здатність кон’югативних плазмід мобі� лізуватися в штамах E. coli (RP4) визначає фраг� мент oriT, який є структурним елементом плаз� міди. Як селективний маркер використовували ген стійкості до апраміцину (aac (3) IV). Вибір цього інтегративного вектора зумовлений тим, що автономні плазміди часто нестабільні в клі� тинах актиноміцетів і значною мірою підляга� ють структурним перебудовам [7, 10, 13]. У низці експериментів ми не отримали екскон’ю� гантів S. nogalater з даною плазмідою. Однією з можливих причин такого результату може бути те, що в хромосомі S. nogalater IMET43360 від� сутні сайти інтеграції актинофага ϕС31. Ми припустили, що таке ускладнення можна подо� лати, використовуючи вектори з системами інтеграції, відмінними від ϕС31. Встановлено, що помірний фаг VWB інтегрується в хромо� сому штаму S. venezuelae ETH14630 у результа� ті сайт�специфічної інтеграції. Інтеграція відбувається в attB�сайт, який є частиною гена аргінінової тРНК [14], тому для кон’югаційного перенесення в штам S. nogalater ми обрали інтегративний вектор pVWB (рис. 1, а), який містить attР�сайт і ген int фага VWB. Екскон’юганти з інтегративним вектором pVWB з’являлися на 3–4�ту добу. Частота ви� никнення екскон’югантів в середньому стано� вила (1,1 � 0,5)·10–5. Слід зазначити, що часто� та трансформації протопластів даного штаму (близько 10–1 при концентрації 1 мкг ДНК) є значно нижчою від частоти кон’югативного перенесення плазміди pVWB в проведених на� ми схрещуваннях [5, 8]. Як другий вектор, що може бути здатним до сайт�специфічної інтеграції в хромосому акти� номіцетних штамів, нами було обрано pRT801 (рис. 2, а) з attB�сайтом та геном int фага ϕBT1. Використання міжродової кон’югації Escherichia сoli – Streptomyces ... 5ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5 Рис. 1. Будова інтегративної плазміди pVWB (а) та ре� зультати ДНК–ДНК гібридизації (б): oriT – ділянка, що відповідає за ініціацію кон’югаційного перене� сення; int (VWB) – ген фага VWB, який забезпечує ін� теграцію плазміди в хромосому; apmR – ген стійкості до апраміцину; thR – ген стійкості до тіострептону; 1 – ДНК�маркер, 2 – сумарна ДНК S. nogalater pVWB+; 3 – сумарна ДНК S. nogalater; 4 – плазміда pVWB, розщеп� лена ендонуклеазою рестрикції EcoRI Рис. 2. Будова інтегративної плазміди pRT801 (а) та результати ДНК–ДНК гібридизації (б): oriT – ділянка, що відповідає за ініціацію кон’югаційного перенесен� ня; int (ϕBT1) – ген фага ϕBT1, який забезпечує інтег� рацію плазміди в хромосому; apmR – ген стійкості до апраміцину; 1 – ДНК�маркер, 2 – сумарна ДНК S. no� galater pRT801+, 3 – сумарна ДНК S. nogalater; 4 – плазміда pRT801, розщеплена ендонуклеазою рестрик� ції EcoRV Частота отримання екскон’югантів з цією плазмідою становила (4,0 ± 0,1) · 10–5. Факт інтеграції кон’югативних векторів у хромосому екскон’югантів S. nogalater IMET� 43360 було підтверджено шляхом ДНК–ДНК гібридизації (рис. 1, б та 2, б). Для цього су� марні ДНК штаму S. nogalater та екскон’юган� тів розщеплювали ендонуклеазами рестрикції EcoRI та EcoRV відповідно. Отримані фрагмен� ти фракціонували за допомогою гель�електро� форезу та переносили на нейлонові фільтри за методом Саузерна [2]. Як зонд нами було ви� користано мічений дігоксигеніновою міткою PstI�фрагмент розміром 800 п.н. З результатів гібридизації DIG�міченого зон� ду із фрагментами сумарної ДНК екскон’юган� тів S. nogalater pVWB+ (рис. 1, б) видно, що зонд гібридизується лише з одним фрагментом су� марної ДНК розміром 4 тис. п.н. При викори� станні фрагментів сумарної ДНК екскон’юган� тів S. nogalater pRT801+ показано, що зонд гіб� ридизується з двома фрагментами розмірами 9,5 та 5 тис. п.н. (рис. 2, б), в той час як на кон� трольних доріжках (з фрагментами сумарної ДНК вихідного штаму) гібридизаційних сиг� налів не виявлено. Отримані результати дозво� ляють нам стверджувати про існування в хро� мосомі S. nogalater одного сайту інтеграції плазміди pVWB та двох сайтів інтеграції плаз� міди pRT801. В роботі також використані вектори, здат� ні до автономної реплікації в клітинах акти� номіцетів – pSOK101, pCHZ101, pKC1139 та pKC1 218. Вони мають різні реплікони, що по� ходять з плазмід pIJ101, pHZ1375, pSG5 та SCP2 відповідно (таблиця). Селекцію плазмід здійснювали за стійкістю до апраміцину. Часто� та появи екскон’югантів S. nogalater IMET43360, які містять плазміду pSOK101, становила в се� редньому (3,4 � 0,2) · 10–5. Екскон’юганти S. no� galater pCHZ101+ одержували з частотою (2,4 � � 0,2) · 10–5, а S. nogalater pKC1139+ та S. nogalater pKC1218+ – з частотою (2,0 � 0,3) · 10–5 та (2,8 � � 0,2) · 10–5 відповідно. Для підтвердження факту наявності репліка� тивних векторів в клітинах реципієнтного шта� му S. nogalater IMET43360 було здійснено трансформацію клітин штаму E. coli DH5α су� марною ДНК з клітин екскон’югантів. Транс� форманти E. coli, які містили кон’югативні плазміди pSOK101, pCHZ101, pKC1139 та pKC1218, виникали з приблизно однаковою частотою, яка коливалася в межах від (5,4 � � 0,3) · 10–6 до (3,2 � 0,4) · 10–5. З огляду на те, що селекцію одержаних в роботі екскон’югантів проводили за стійкістю до апраміцину, було вирішено дослідити, чи не виникають спонтанні апраміцин�резистентні мутанти S. nogalater. З цією метою спори S. no� galater IMET43360 в титрі 4,7 · 108 висівали на середовище з різними концентраціями апра� міцину (25, 50, 75 та 100 мкг/мл). На середо� вищі з вказаними концентраціями антибіоти� ка резистентних мутантів не виявлено. При перевірці екскон’югантів S. nogalater IMET43360, які містять плазміди pVWB та pRT801, виявлено, що присутність цих плазмід не впливала на культурально�морфологічні ха� рактеристики (динаміку росту, розмір колоній, споруляцію і пігментацію міцелію) екскон’ю� гантів досліджувального штаму. Дослідження стабільності успадкування кон’югативних плазмід екскон’югантами по� казало, що фенотип apmR, який забезпечується плазмідами pRT801 та pVWB, успадковувався зі 100 %�ною частотою у всіх досліджувальних клонів екскон’югантів S. nogalater pVWB+ та S. nogalater pRT801 після п’яти пересівів цього штаму у рідкому середовищі TSB без апрамі� цину. Рівень успадкування плазмід pKC1139, pKC1218, pCHZ101та pSOK101 в екскон’юган� тів S. nogalater ми дослідили після трьох пере� сівів у рідкому середовищі TSB без додавання антибіотика. За даних умов серед 117 pKC1139+ екскон’югантів 89 % втрачали плазміду. Всі досліджені екскон’юганти S. nogalater pKC1218+ (131 клон), pCHZ101+ (107 клонів) та pSOK101+ (120 клонів) втрачали плазміду, проте всі авто� номні плазміди стабільно успадковувалися за умови вирощування штамів екскон’югантів в присутності апраміцину в кінцевій концент� рації 50 мкг/мл, стійкість до якого забезпечу� ється зазначеними плазмідами. Відомо, що присутність екзогенних плазмід� них ДНК у клітинах реципієнтних штамів (особливо це стосується інтегративних векто� рів) може впливати на продукцію антибіоти� ків екскон’югантами та стійкість до антибіо� тиків [7]. Нами показано, що рівень продукції антибіотика у екскон’югантів з автономними Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко 6 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5 плазмідами та плазмідою pRT801 істотно не відрізняється від рівня біосинтезу ногаламіци� ну у S. nogalater (95–98 % в порівнянні з вихід� ним штамом). Екскон’югантам S. nogalater pVWB+ властиве зниження синтезу на 50 % від рівня біосинтезу у вихідного штаму S. nogalater IMET43360. Слід зазначити, що інгібувальний ефект інтеграції плазміди pVWB в хромосому реципієнтного штаму S. nogalater pVWB+ ство� рює певні труднощі у використанні цієї плаз� міди як вектора. Показано, що екскон’юганти, які містять інтегративні вектори pVWB та pRT801, є стій� кішими до гентаміцину та канаміцину порів� няно з вихідним штамом S. nogalater. Така під� вищена резистентність до канаміцину і гента� міцину може виникати в результаті експресії гена стійкості до апраміцину, що міститься у цих плазмідах [15]. З огляду на той факт, що частота перенесен� ня різних векторів в клітини актиноміцетів є неоднаковою [3, 7–9], було досліджено динамі� ку міжродового кон’югаційного процесу в сис� темі E. coli – S. nogalater IMET43360. Екско� н’юганти виникали вже на 12�ту годину після початку схрещування, а із збільшенням часу схрещування кількість екскон’югантів зроста� ла експоненціально. Максимальна частота от� римання екскон’югантів, що містять репліка� тивні плазміди, зафіксована на 14�ту годину від початку схрещування. Максимальну часто� ту отримання екскон’югантів S. nogalater pVWB+ та pRT801+ спостерігали на 15�ту годи� ну від початку схрещування. Одержані результати свідчать про те, що методика кон’югаційного перенесення в сис� темі E. coli – S. nogalater IMET43360 є ефектив� ною для введення екзогенних молекул ДНК в штам S. nogalater IMET43360, що відкриває широкі можливості для генно�інженерного конструювання цього штаму, а також вивчен� ня генетичного контролю біосинтезу ногала� міцину. На користь цього свідчить також те, що перенесення плазмідних ДНК в штам S. nogalater IME T43360 шляхом кон’югації про� ходить ефективніше порівняно з трансформа� цією протопластів. Цей метод є дешевшим і простішим у застосуванні, оскільки не вима� гає отримання протопластів актиноміцетних штамів. Він дозволяє використати широкий спектр як реплікативних, так і інтегративних плазмід для отримання рекомбінантних шта� мів [7, 11, 16, 17]. Mожливість такого ефектив� ного перенесення рекомбінантних плазмід в клітини S. nogalater дозволяє отримувати продуценти нових антибіотиків. SUMMARY. Successful transfer of the studied plasmids into S. nogalater IMET43360 cells using bacterial conjuga� tion in the system E. coli – Streptomyces is an appropriate method for constructing this strain. Using DNA–DNA hybridization the character of integration of pVWB and pRT801 plasmids has been studied. The influence of these plasmids on nogalamycin biosynthesis has been investigat� ed as well. The obtained results enable detailed study of nogalamycin gene functioning in S. nogalater IMET43360. The use of conjugation for substitution, destruction of genes, and heterological expression allows to get new «hybrid» antibiotics produced by this strain. РЕЗЮМЕ. Успешное перенесение исследуемых плаз� мид в клетки S. nogalater IMET43360 с помощью меж� родовой конъюгации в системе E. coli – Streptomyces де� лает этот метод удобным инструментом для конструи� рования указанного штамма. Использование ДНК– ДНК гибридизации позволило определить характер интеграции плазмид pVWB и pRT801, а также иссле� довать их влияние на биосинтез ногаламицина. Резуль� таты наших исследований позволяют более детально изучать функционирование генов биосинтеза ногала� мицина у S. nogalater IMET43360, а использование конъюгации для замещения, разрушения генов и ге� терологичной экспрессии позволит получить новые «гибридные» антибиотики, которые могут продуциро� ваться этим штаммом. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Baltz R.H. Genetic manipulation of antibiotic�produc� ing Streptomyces // Trends Microbiol. – 1998. – 6. – P. 76–83. 2. Hopwood D.A., Bibb M.J., Chater K.F., Kieser T., Bru� ton C.J., Kieser H.M., Lydiate D.J., Smith C.P., Ward J.M., Shrempf H. Genetic manipulation of Strepto� myces. A laboratory manual. – Norwich : John Innes Found., 1985. – 356 p. 3. Kieser T., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hop� wood D.A. Practical Streptromyces genetics. – Norwich : John Innes Found., 2000. – 634 p. 4. Sambrook J., Fristch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual // CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor. – New York, 1989. – 450 p. 5. Ylihonko K., Hakala J., Kunnary T. et al. Production of hybrid anthracycline antibiotics by heterologous expres� Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – Streptomyces ... 7ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5 sion of Streptomyces nogalater nogalamycin biosyntesis genes // Microbiology. – 1996. – P. 1965–1972. 6. Li H., Krueger W. The biochemical pharmacology of nogalamycin and its derivatives // Pharm. Therap. – 51. – P. 239–255. 7. Лужецький А., Мазепа А., Мар’їна О. Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – Streptomyces для введення генетичної інформації в штами Strepto� myces globisporus 1912 and Streptomyces kanamyceticus // Вісн. Львів. у�ту. Сер. біол. – 2000. – № 25. – С. 74–80. 8. Воейкова Т.А. Конъюгативный перенос плазмид из Escherichia coli в различные штаммы порядка Actinomycetales // Генетика. – 1999. – 35, № 12. – C. 1626–1633. 9. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межро� довая конъюгация Еscherichia coli – Streptomyces glo� bisporus 1912 с использованием интегративной плаз� миды pSET152 и ее производных // Генетика. – 2001. – 37, № 10. – С. 1340–1347. 10. Bates S., Cashmore A., Wilkins BM. IncP plasmids are unusually effective in mediating conjugation of Esche� richia coli and Saccharomyces cerevisiae: involvement of the tra2 mating system // J. Bacteriol. – 1998. – 180. – P. 6538–6543. 11. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Becht� hold A., Fedorenko V. A gene cloning system for Strepto� myces cyanogenus S136 // Вісн. Львів. у�ту. Сер. біол. – 2002. – № 29. – P. 62–68 12. Mazodier Ph., Peffer R., Thompson Ch. Intergeneric conjugation between Escherichia coli and Streptomyces species // J. Bacteriol. – 1989. – 171. – P. 3583. 13. Flett F., Mersinias V., Smith C.P. High efficiency inter� generic conjugal transfer of plasmid DNA from Esche� richia coli to methyl �DNA�restricting Streptomycetes // FEMS Microbiol. Lett. – 1997. – 155. – P. 223–229. 14. Bierman M., Logan R., O’Brien K., Seno E.T., Rao R.N., Schoner B.E. Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from E. coli to Streptomyces spp. // Gene. – 1992. – 116. – P. 43–49. 15. Гловер Д. Клонирование ДНК : Методы. – М.: Мир, 1988. – 538 с. 16. Giebelhaus L., Frost L., Lanka E., Gormley E.P., Da� vies J.E., Leskiw B. The Tra2 core of the IncP (alpha) plasmid RP4 is required for intergeneric mating between Escherichia coli and Streptomyces lividans // J. Bacteriol. – 1996. – 178. – P. 6378–6381. 17. Ylihonko K., Tuikkanen J., Jussila S. et al. A gene cluster involved in nogalamycin biosynthesis from S. nogalater: sequence analysis and complementation of early�block mutations in the antracycline pathway // Mol. Gen. Genet. – 1996. – 251. – P. 113–120. Надійшла 31.07.06 Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко 8 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2007. № 5
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66587
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T16:57:17Z
publishDate	2007
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Климишин, Д.О. Громико, О.М. Федоренко, В.О. 2014-07-18T19:16:57Z 2014-07-18T19:16:57Z 2007 Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360 / Д.О. Климишин, О.М. Громико, В.О. Федоренко // Цитология и генетика. — 2007. — Т. 41, № 5. — С. 3-8. — Бібліогр.: 17 назв. — укр. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66587 575.224+577.21 Успішне перенесення досліджувальних плазмід в клітини S. nogalater IMET43360 за допомогою міжродової кон’югації в системі E. coli – Streptomyces робить цей метод зручним інструментом для конструювання даного штаму. За допомогою ДНК–ДНК гібридизації визначено характер інтеграції плазмід pVWB і pRT801 та досліджено їхній вплив на біосинтез ногаламіцину. Результати наших досліджень дають змогу більш детально вивчати функціонування генів біосинтезу ногаламіцину у S. nogalater IMET43360. Використовування кон’югації для заміщення, руйнування генів та гетерологічної експресії дозволить отримувати нові «гібридні» антибіотики, що зможуть продукуватися цим штамом. Успешное перенесение исследуемых плазмид в клетки S. nogalater IMET43360 с помощью межродовой конъюгации в системе E. coli – Streptomyces делает этот метод удобным инструментом для конструирования указанного штамма. Использование ДНК– ДНК гибридизации позволило определить характер интеграции плазмид pVWB и pRT801, а также исследовать их влияние на биосинтез ногаламицина. Результаты наших исследований позволяют более детально изучать функционирование генов биосинтеза ногаламицина у S. nogalater IMET43360, а использование конъюгации для замещения, разрушения генов и гетерологичной экспрессии позволит получить новые «гибридные» антибиотики, которые могут продуцироваться этим штаммом. Successful transfer of the studied plasmids into S. nogalater IMET43360 cells using bacterial conjugation in the system E. coli – Streptomyces is an appropriate method for constructing this strain. Using DNA–DNA hybridization the character of integration of pVWB and pRT801 plasmids has been studied. The influence of these plasmids on nogalamycin biosynthesis has been investigated as well. The obtained results enable detailed study of nogalamycin gene functioning in S. nogalater IMET43360. The use of conjugation for substitution, destruction of genes, and heterological expression allows to get new «hybrid» antibiotics produced by this strain. uk Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360 Article published earlier
spellingShingle	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360 Климишин, Д.О. Громико, О.М. Федоренко, В.О. Оригинальные работы
title	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360
title_full	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360
title_fullStr	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360
title_full_unstemmed	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360
title_short	Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360
title_sort	використання міжродової кон’югації escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних днк в штам s. nogalater imet43360
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66587
work_keys_str_mv	AT klimišindo vikoristannâmížrodovoíkonûgacííescherichiacolistreptomycesdlâperenesennârekombínantnihdnkvštamsnogalaterimet43360 AT gromikoom vikoristannâmížrodovoíkonûgacííescherichiacolistreptomycesdlâperenesennârekombínantnihdnkvštamsnogalaterimet43360 AT fedorenkovo vikoristannâmížrodovoíkonûgacííescherichiacolistreptomycesdlâperenesennârekombínantnihdnkvštamsnogalaterimet43360

Використання міжродової кон’югації Escherichia coli – streptomyces для перенесення рекомбінантних ДНК в штам S. nogalater IMET43360

Репозитарії

Схожі ресурси