Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis
Методом трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens были получены трансформированные растения Lactuca sativa с генами, кодирующими синтез туберкулезных антигенов. Исходным материалом являлись семядольные листья салата сортов Ералаш, Рубиновое кружево и Снежинка. Векторные конструкции содержали...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Цитология и генетика |
|---|---|
| Дата: | 2009 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2009
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66630 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2009. — Т. 43, № 2. — С. 27-32. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859816805522997248 |
|---|---|
| author | Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. |
| author_facet | Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. |
| citation_txt | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2009. — Т. 43, № 2. — С. 27-32. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Цитология и генетика |
| description | Методом трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens были получены трансформированные растения Lactuca sativa с генами, кодирующими синтез туберкулезных антигенов. Исходным материалом являлись семядольные листья салата сортов Ералаш, Рубиновое кружево и Снежинка. Векторные конструкции содержали селективный ген неомицинфосфотрансферазы II nptII и целевые гены ESAT6, Ag85B (-TMD), ESAT6:Ag85B (-TMD). ПЦР-анализ геномной ДНК показал наличие как селективных, так и целевых генов во всех анализированных растениях. В то же время ПЦР-анализ обратных транскриптов выявил, что возможно как наличие, так и отсутствие транскрипции гена ESAT6 при стабильной транскрипции гена nptII.
Методом трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens отримано трансформовані рослини Lactuca sativa з генами, що кодують синтез туберкульозних антигенів. Вихідним матеріалом були сім’ядольні листки салату сортів Єралаш, Рубінове мереживо та Сніжинка. Векторні конструкції мали селективний ген неоміцинфосфотрансферази II nptII та цільові гени ESAT6, Ag85B(-TMD), ESAT6:Ag85B(-TMD). ПЛР-аналіз геномної ДНК виявив наявність як селективних, так і цільових генів у всіх проаналізованих рослинах. В той же час ПЛР-аналіз зворотних транскриптів показав, що можливі як присутність, так і відсутність транскрипції гена ESAT6 при стабільній транскрипції гена nptII.
Transgenic plants of lettuce Lactuca sativa L. cv. Eralash, Sniezinka, Rubinovoje kruzevo with genes coding synthesis of tuberculosis antigenes have been obtained by Agrobacterium-mediated transformation. Cotyledons of in vitro seedlings were used as the initial material for transformation with plasmids pСB063 (genes ESAT6, nptII) and pСB064 (genes ESAT6:Ag85B(-TMD), nptII). PCR-analysis has shown the presence both selective and target genes in all plants analyzed. At the same time, the RT-PCR has shown that both the presence and the absence of a transcription of gene ESAT6 at a stable transcription of a gene nptII is possible.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:22:42Z |
| format | Article |
| fulltext |
ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 2 27
УДК 575.222.7:581.1
Н.А. МАТВЕЕВА, М.Ю. ВАСИЛЕНКО,
А.М. ШАХОВСКИЙ, Н.В. КУЧУК
Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины,
03143, Киев'143, ул. Акад. Заболотного, 148
E'mail: joyna56@gmail.com
АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ
ТРАНСФОРМАЦИЯ САЛАТА
(LACTUCA SATIVA L.)
КОНСТРУКЦИЯМИ, НЕСУЩИМИ
ГЕНЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ
ИЗ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Методом трансформации с помощью Agrobacterium
tumefaciens были получены трансформированные растения
Lactuca sativa с генами, кодирующими синтез туберку!
лезных антигенов. Исходным материалом являлись семя!
дольные листья салата сортов Ералаш, Рубиновое круже!
во и Снежинка. Векторные конструкции содержали селек!
тивный ген неомицинфосфотрансферазы II nptII и целе!
вые гены ESAT6, Ag85B (!TMD), ESAT6:Ag85B (!TMD).
ПЦР!анализ геномной ДНК показал наличие как селек!
тивных, так и целевых генов во всех анализированных
растениях. В то же время ПЦР!анализ обратных транс!
криптов выявил, что возможно как наличие, так и от!
сутствие транскрипции гена ESAT6 при стабильной
транскрипции гена nptII.
Введение. В последнее десятилетие наблю�
дался значительный прогресс как в разработке
способов, так и возможных путей практическо�
го применения генетической трансформации
растений. Научный и практический интерес
представляет использование достижений гене�
тической инженерии в медицине и ветерина�
рии. Помимо возможности использования
трансгенных растений в качестве фабрики для
синтеза бактериальных антигенов, растения,
не подвергаемые термообработке, могут стать
естественным готовым продуктом для профи�
лактики и лечения заболеваний [1, 2]. Разрабо�
таны подходы, позволяющие инициировать в
растениях синтез бактериальных антигенов для
их использования в качестве вакцин [3]. Работы
в этом направлении были начаты еще в 1990 г.,
однако до настоящего времени практическое
использование так называемых биовакцин от�
сутствует. Это связано как с трудностями техни�
ческого характера, не позволяющими получать
достаточное количество продукта, так и с не�
изученными последствиями применения таких
вакцин (аллергические реакции и т.д.) [4]. Тем
не менее разработки в этом направлении про�
должаются. Так, показана возможность высоко�
го уровня экспрессии в хлоропластах растений
антигена TetC, определяющего устойчивость к
столбнячной инфекции [5].
Интерес представляет и создание растений,
продуцирующих белки – индукторы иммунной
защиты от туберкулеза. Это заболевание, вы�
зываемое Mycobacterium tuberculosis, несмотря
на разработанные схемы химиотерапевтичес�
кого лечения и вакцинацию, до сих пор пред�
ставляет большую угрозу не только для жизни
населения, но и приводит к убыткам в живот�
новодстве. Вакцина БЦЖ (Bacille Calmette�
Guérin), созданная в 20�х годах прошлого ве�
ка, не является полноценной защитой взрос�
лых от туберкулеза легких. Альтернативой мо�
гут быть новые вакцины на основе антигенов
ESAT6 и Ag85 [6–8]. Внимание исследователей
привлекает возможность создания вакцины,
содержащей одновременно два антигена, на�
пример, Ag85B и MPT64 [9]. Основой для по�
лучения таких вакцин могут стать трансфор�
мированные растения [10].
Широко распространенным методом транс�
формации растений является использование
Agrobacterium tumefaciens, основанное на при�
родной способности почвенной бактерии пе�
© Н.А. МАТВЕЕВА, М.Ю. ВАСИЛЕНКО, А.М. ШАХОВСКИЙ,
Н.В. КУЧУК, 2009
ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 228
Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук
реносить в растительный геном собственные
гены. Это объясняется его простотой и эффек�
тивным применением так называемого метода
«листовых дисков» для широкого спектра ви�
дов класса двудольных [11]. Именно этот ме�
тод был использован нами для трансформа�
ции растений салата Lactuca sativa L. трех сор�
тов с целью создания растений с антитуберку�
лезными генами.
Материалы и методы. Исходным материа�
лом были семена салата L. sativa сортов Сне�
жинка, Рубиновое кружево и Ералаш. Семена
стерилизовали последовательно в 70%�ном
этаноле (1 мин) и 25%�ном растворе «Белиз�
на» (10 мин), после чего промывали в дистил�
лированной воде (60 мин). Проращивали се�
мена на агаризованной среде MS [12] при 16�
часовом световом фотопериоде и температуре
24 °С. Для трансформации использовали се�
мядольные листья 7�дневных проростков.
При создании векторных конструкций для
агробактериальной трансформации был ис�
пользован бинарный вектор, содержащий ген
nptII с регуляторными последовательностями
NOS промотора и терминатора. В участок Т�
ДНК под контролем 35S промотора и OCS
терминатора клонированы структурные пос�
ледовательности гена ESAT6 (плазмида pСB063)
и объединенной последовательности ESAT6:
Ag85(!ТМД) (плазмида pСB064), кодирующие
синтез туберкулезных антигенов (рис. 1). Эти
гены были любезно предоставлены проф.
Ю.Л. Дороховым (Институт физико�химичес�
кой биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ
им. М.В. Ломоносова).
Конструкцию pCB064 использовали для
трансформации салата сортов Снежинка, Руби�
новое кружево, Ералаш, конструкцию pCB063 –
сорта Ералаш.
Для трансформации использовали A. tume!
faciens (штамм GV3101) с векторными конструк�
циями pCB063, pCB064. Бактерии выращива�
ли на среде LB [13] с антибиотиками (100 мг/л
карбенициллина, 50 мг/л рифампицина, 25 мг/л
гентамицина) 48 ч при температуре 27 °С. Бак�
териальные клетки осаждали центрифугиро�
ванием (3000 об/мин, 10 мин), осадок ресус�
пендировали в растворе 10 мМ MgSO4. Семя�
дольные листья с предварительно сделанны�
ми насечками инкубировали в бактериальной
суспензии 30 мин, промокали фильтроваль�
ной бумагой и культивировали на агаризован�
ной среде MS в течение 2 сут. Затем эксплан�
ты переносили на среду S1 с добавлением ан�
тибиотиков канамицина (25 мг/л) и цефо�
таксима (500 мг/л).
Для регенерации растений семядольные
листья культивировали на средах S1 (модифи�
цированная среда MS с добавлением 0,5 мг/л
α�нафтилуксусной кислоты, 3 мг/л кинетина,
300 мг/л гидролизата казеина, 1 г/л 2�морфоли�
но�этансульфоновой кислоты, 30 г/л сахарозы),
S3 (модифицированная среда MS с 0,05 мг/л α�
нафтилуксусной кислоты, 0,5 мг/л кинетина,
100 мг/л гидролизата казеина, 1 г/л 2�морфо�
лино�этансульфоновой кислоты, 30 г/л сахаро�
зы). Образовавшиеся побеги укореняли на сре�
де S4 (модифицированная среда MS с 1 г/л
2�морфолино�этансульфоновой кислоты, 1 мг/л
индолилмасляной кислоты, 20 г/л сахарозы).
Геномную ДНК выделяли из зеленых лис�
тьев стерильных растений СТАВ�методом [14].
Суммарную РНК выделяли по методике [15].
Материалом служили свежесрезанные зеле�
ные листья стерильних и тепличних растений.
Концентрацию РНК измеряли спектрофото�
метрически. Чистоту препаратов РНК также
контролировали спектрофотометрически, из�
Рис. 1. Схемы плазмидных векторов: а – рСВ063, б – рСВ064; LB, RB – левая и правая границы Т�ДНК; nptII –
ген неомицинфосфотрансферазы II (NOS промотор и терминатор); ESAT6 и ESAT6:Ag85В (!TMD) – целевые ге�
ны, кодирующие синтез туберкулезных антигенов (35S промотор и OCS терминатор)
ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 2 29
Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены
меряя параметры А260 : А280 и А260 : А230, где А230,
А260, А280 – оптическая плотность при длине
волны 230, 260, 280 нм соответственно. Полу�
ченные препараты РНК имели удовлетвори�
тельные спектрофотометрические характе�
ристики (А260 : А280 1,9–2,0 и А260 : А230 2,3–2,5),
что указывало на отсутствие примесей поли�
фенолов, полисахаридов и ДНК [16].
Предварительно обработанные ДНКазой I,
свободной от РНКазы, препараты суммарной
РНК использовали в качестве матрицы для син�
теза первой цепи кДНК (обратных транскрип�
тов). Синтез осуществляли с помощью набора
реактивов «Fermentas» (Литва) по инструкции
фирмы�изготовителя. При этом для каждой
пробы РНК проводили две параллельные ре�
акции – в присутствии и в отсутствие (отри�
цательный контроль) обратной транскриптазы.
ПЦР�амплификацию геномной ДНК и син�
тезированных обратных транскриптов осущест�
вляли на амплификаторе Mastercycler personal
5332 (Eppendorf) с термостатированной крыш�
кой в пробирках с ультратонкими стенками.
Реакционная смесь состояла из однократного
ПЦР�буфера с сульфатом аммония, 0,2 мкМ
соответствующих праймеров, 200 мкМ каждого
из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 ед. Taq�
полимеразы, 10–50 нг ДНК�пробы. Общий
объем реакцинной смеси составлял 20 мкл.
При этом использовали праймеры, специфич�
ные к кодирующей части генов nptII, ESAT6,
Ag85B(!ТМД), ESAT6:Ag85В(!TMD) (таблица).
Результаты исследований и их обсуждение.
Вакцины, созданные на основе бактерий, дав�
но применяются для предупреждения многих
заболеваний, в том числе и туберкулеза. Одна�
ко они имеют целый ряд недостатков, которых
лишены вакцины на основе рекомбинантных
белков. Такие вакцины являются синтетичес�
кими молекулами с антигенами (целевыми бел�
ками), стимулирующими образование Т� и В�
лимфоцитов.
Трансгенные растения, в клетках которых
экспрессируются антигены, могут быть недо�
рогим источником целевых белков�антигенов,
а растения, не подвергаемые термообработке –
готовым профилактическим средством. В ка�
честве такого растения для возможного ис�
пользования в качестве профилактики тубер�
кулеза нами был выбран салат L. sativa. Это
растение отличается быстрым приростом зе�
леной биомассы и не требует термообработки
перед употреблением в пищу.
Метод трансформации с помощью A. tumefa!
ciens широко используется в генетической ин�
женерии растений. Что касается такого расте�
ния, как салат, то этим методом, например, бы�
ли получены трансгенные растения салата,
устойчивые к гербицидам [17, 18]. Агробактери�
альная трансформация была также использо�
вана с целью получения растений салата с улуч�
шенными свойствами [19], устойчивыми к пов�
реждению тлей [20], для получения съедобных
вакцин против вируса гепатита В [21].
Праймеры, использованные для подтверждения присутствия генов nptII, ESAT6, Ag85В ("ТМД)
и ESAT6:Ag85В ("ТМД)
Ген Праймеры
Размер амплифицированного
фрагмента, п.н.
nptII
ESAT6
Ag85В(!ТМД)
ESAT6:Ag85В(!ТМД)
5'�cctgaatgaactccaggacgaggca�3'
5'�gctctagatccagagtcccgctcagaag�3'
5'�ctgaccatggcagagcagcagtggaatttcgc�3'
5'�gagaattctgcgaacatcccagtgctcg�3'
5'�tctacagcgactggtacagc�3'
5'�tcaggttgctgctacgaacg�3'
5'agcagtccctgaccaagctc�3'
5'�tcaggttgctgctacgaacg�3'
622
299
484
1033
Примечание. Условия амплификации: первичная денатурация – 94 °С, 3 мин, затем 30 циклов амплификации
(94 °С, 30 с – 62 °С, 30 с – 72 °С, 30 с), окончательная полимеризация – 72 °С, 3 мин.
ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 230
Залогом успешной трансформации растений
является высокий регенерационный потенци�
ал исходного материала. В связи с этим нами
был оптимизирован протокол регенерации рас�
тений из семядольных листьев салата сортов
Ералаш, Рубиновое кружево и Снежинка. В
качестве эксплантов использовали семядоль�
ные листья 7–14�дневных проростков, на ко�
торых делали надрезы. Экспланты культивиро�
вали в течение 2–3 нед на среде S1, содержа�
щей фитогормоны кинетин и НУК. Высоким
регенерационным потенциалом обладали прок�
симальные части семядольных листьев. При
их культивировании на среде S1 наблюдалась
прямая регенерация растений, причем коли�
чество растений составляло 10–15 на эксплант
размером 5 � 3 мм. Время, необходимое для
инициации регенерации растений разных
сортов, варьировало от 7–8 дней (Ералаш, Ру�
биновое кружево) до 2 нед (Снежинка). При
более длительном (до 3 нед) росте эксплантов
из дистальной и средней части котиледонов на
этой среде формировалась каллусная ткань с
последующей регенерацией растений. Таким
образом, прямая регенерация на среде S1 су�
щественно сокращала время культивирования
эксплантов. Сформированные растения разме�
ром от 5 мм переносили на среду S3 с после�
дующим укоренением на среде S4.
Эффективность регенерации растений сор�
тов Снежинка, Рубиновое кружево и Ералаш
была различна и составляла соответственно
60, 86, 95 % (эффективность регенерации выра�
жали отношением количества эксплантов, на
которых образовались побеги, к общему числу
эксплантов). Высокая эффективность прямой
регенерации растений салата из проксимальных
частей семядольных листьев стала предпосыл�
кой успешной работы по получению трансген�
ных растений.
Наличие в векторных конструкциях селек�
тивного гена nptII дало возможность проводить
отбор трансформантов по признаку роста зе�
леных растений на среде, содержащей 25 мг/л
канамицина. При высокой регенерационной
Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук
Рис. 2. Прямая регенерация трансгенных растений са�
лата сорта Ералаш на селективной среде с 25 мг/л ка�
намицина: а – регенерация растений из проксималь�
ной части семядольного листка; б – трансгенное рас�
тение на селективной среде
Рис. 3. ПЦР�анализ обратных транскриптов (ОТ) и геномной ДНК салата L. sativa, трансформированных плаз�
мидой pCB064: М – маркер; 1 – геномная ДНК нетрансформированного растения; 2–7 – сорт Рубиновое кру�
жево, 8–13 – сорт Снежинка. Геномная ДНК трансгенных растений содержит как ген nptII (линии 6, 12), так
и ген ESAT6 (7, 13). Селективный ген nptII ожидаемо транскрибируется во всех случаях (линии 3, 9), в то время
как транскрипты гена ESAT6 детектируются для сорта Рубиновое кружево (линия 5) и не обнаружены для сорта
Снежинка (линия 11). Линии 2, 4, 8, 10 – отрицательный контроль (параллельный синтез обратных транскрип�
тов в отсутствие ревертазы)
Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены
способности эксплантов сорта Ералаш эффек�
тивность трансформации (отношение количес�
тва эксплантов с зелеными на селективной сре�
де побегами к общему количеству эксплантов)
составила 62 % (pCB063) и 44 % (pCB064).
Для сортов Рубиновое кружево и Снежинка
(pCB064) эти показатели составили соответст�
венно 32 и 18 %. Полученные растения укоре�
нялись на среде с канамицином и сохраняли
зеленую окраску листьев при длительном (бо�
лее 6 мес) культивировании на среде с антиби�
отиком. На селективной среде было получено
более 100 зеленых растений трех сортов (рис. 2).
ПЦР�анализ тотальной ДНК растений сор�
та Ералаш показал присутствие генов nptII и
ESAT6 после трансформации конструкцией
pCB063, а также генов nptII, ESAT6, Ag85В
(!ТМД) и объединенной последовательности
ESAT6:Ag85В(!ТМД) после трансформации
конструкцией pCB064 (данные не приведены).
Для растений сорта Рубиновое кружево (кро�
ме одного) и для всех анализированных расте�
ний сорта Снежинка (pCB064) также показано
присутствие как селективного гена nptII, так
и ESAT6, Ag85В(!ТМД), ESAT6:Ag85(!ТМД).
Результаты ПЦР�анализа тотальной ДНК на
присутствие генов nptII и ESAT6 в растениях
сортов Рубиновое кружево и Снежинка пред�
ставлены на рис. 3 (линии 6, 7, 12, 13).
Интересными оказались результаты ПЦР�
анализа обратных транскриптов. Как и следо�
вало ожидать, транскрипция гена nptII (при�
сутствие мРНК) осуществлялась во всех ана�
лизированных растениях (рис. 3, линии 3, 9).
В то же время ген ESAT6 транскрибировался
не во всех случаях. Так, для некоторых расте�
ний сорта Снежинка (pCB064) мы столкнулись
с явлением молчания генов. Обратные транс�
крипты гена ESAT6 не детектировались (линия
11), хотя в геномной ДНК ген ESAT6 присут�
ствовал (линия 13). В то же время для всех ана�
лизированных растений сортов Ералаш и Ру�
биновое кружево, а также части растений сор�
та Снежинка детектировались как гены nptII и
ESAT6 (линии 6, 7, 12, 13), так и обратные
транскрипты (линии 3 и 5).
В некоторых случаях мы столкнулись с от�
сутствием экспрессии при наличии трансгена
в растениях. Это явление, называемое «молча�
нием генов», встречается при ядерной транс�
формации и является одним из ее недостат�
ков. Такое явление может возникнуть в случае
присутствия гомологичной переносимому ге�
ну последовательности ДНК в растительном
геноме, при встраивании большого числа ко�
пий гена на геном, метилировании перенесен�
ной последовательности ДНК, образовании
ДНК�дуплекса повторяющихся генов [22, 23].
Тем не менее в ряде полученных после транс�
формации растений целевые гены транскри�
бировались, что позволяет считать возмож�
ным применение метода агробактериальной
трансформации для получения растений сала�
та с генами секреторных белков�антигенов
ESAT6 и Ag85В.
Таким образом, нами был оптимизирован
протокол прямой регенерации растений из се�
мядольных листьев салата. На основании по�
лученных результатов в качестве объекта были
выбраны сорта салата Ералаш, Рубиновое кру�
жево, Снежинка, характеризующиеся наиболь�
шим регенерационным потенциалом. В ре�
зультате агробактериальной трансформации
конструкциями рСВ063 и рСВ064 с селектив�
ным геном nptII и целевыми генами белков�
антигенов ESAT6 и Ag85В получены трансген�
ные растения трех сортов салата. ПЦР�анализ
геномной ДНК обнаружил наличие как селек�
тивных, так и целевых генов во всех анализи�
рованных растениях. В то же время ПЦР�ана�
лиз обратных транскриптов показал, что воз�
можно как наличие, так и отсутствие транс�
крипции гена ESAT6 при стабильной транс�
крипции гена nptII.
N.A. Matvieieva, M.Y. Vasylenko,
А.М. Shahovsky, N.V. Kuchuk
AGROBACTERIUM�MEDIATED
TRANSFORMATION OF LETTUCE (LACTUCA
SATIVA L.) WITH GENES
OF BACTERIAL ANTIGENES FROM
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Transgenic plants of lettuce Lactuca sativa L. cv.
Eralash, Sniezinka, Rubinovoje kruzevo with genes coding
synthesis of tuberculosis antigenes have been obtained by
Agrobacterium�mediated transformation. Cotyledons of in
vitro seedlings were used as the initial material for transfor�
mation with plasmids pСB063 (genes ESAT6, nptII) and
pСB064 (genes ESAT6:Ag85B(!TMD), nptII). PCR�analy�
sis has shown the presence both selective and target genes
in all plants analyzed. At the same time, the RT�PCR has
ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 2 31
ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2009. № 232
Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук
shown that both the presence and the absence of a tran�
scription of gene ESAT6 at a stable transcription of a gene
nptII is possible.
Н.А. Матвєєва, М.Ю. Василенко,
А.М. Шаховський, М.В. Кучук
АГРОБАКТЕРІАЛЬНА ТРАНСФОРМАЦІЯ
САЛАТУ (LACTUCA SATIVA L.) КОНСТРУКЦІЯМИ,
ЩО МАЮТЬ ГЕНИ БАКТЕРІАЛЬНИХ
АНТИГЕНІВ З MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Методом трансформації за допомогою Agrobacterium
tumefaciens отримано трансформовані рослини Lactuca
sativa з генами, що кодують синтез туберкульозних ан�
тигенів. Вихідним матеріалом були сім’ядольні листки
салату сортів Єралаш, Рубінове мереживо та Сніжинка.
Векторні конструкції мали селективний ген неомі�
цинфосфотрансферази II nptII та цільові гени ESAT6,
Ag85B(!TMD), ESAT6:Ag85B(!TMD). ПЛР�аналіз геном�
ної ДНК виявив наявність як селективних, так і цільо�
вих генів у всіх проаналізованих рослинах. В той же час
ПЛР�аналіз зворотних транскриптів показав, що мож�
ливі як присутність, так і відсутність транскрипції ге�
на ESAT6 при стабільній транскрипції гена nptII.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mason H.S., WarzechaH., Mor T., Arntzen C.J. Edible
plant vaccines: application for prophylactic and the�
rapeutic molecular medicine // Trend Mol. Med. –
2002. – 8, № 7. – P. 324–329.
2. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plant delivery of edible vac�
cines // Curr. Opin. Biotechnol. – 2000. – 11. – P. 126–
129.
3. Rice J., Ainley W.M., Shewen P. Plant�made vaccines:
biotechnology and immunology in animal health //
Anim. Res. Revs. – 2005. – 6. – Р. 199–209.
4. Kirk D.D., McIntosh K., Walmsley A.M., Peterson R.K.D.
Risk analysis for plant�made vaccines // Transgen.
Res. – 2005. – 14, № 4. – Р. 449–462.
5. Tregoning J., Maliga P., Dougan G., Nixon P.J. New
advances in the production of edible plant vaccines:
chloroplast expression of a tetanus vaccine antigen,
TetC // Phytochemistry. – 2004. – 65, № 8. – P. 989–
994.
6. Brodin P., Rosenkrands I., Andersen P., Cole S.T.,
Brosch R. ESAT�6 proteins: protective antigens and vir�
ulence factors? //Trends Microbiol. – 2004. – 12,
№ 11. – P. 500–508.
7. Dietrich J., Weldingh K., Andersen P. Prospects for a
novel vaccine against tuberculosis // Veterinary Micro�
biol. – 2006. – 112, № 2–4. – P. 163–169.
8. Orme I.M. Current progress in tuberculosis vaccine de�
velopment // Vaccine. – 2005. – 23, № 17/18. – P. 2105–
2108.
9. Tian X., Cai H., Zhu Y.X. Protection of mice with a
divalent tuberculosis DNA vaccine encoding antigens
Ag85B and MPT64 // Acta Biochim. Biophys. Sin.
(Shanghai). – 2004. – 36, № 4. – Р. 269–276.
10. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y. et al. Super�
expression of tuberculosis antigens in plant leaves //
Tuberculosis. – 2007. – 87, № 3. – P. 218–224.
11. Horsch R.B., Fry J., Hoffman N. et al. A simple and gen�
eral method for transferring genes into plants //
Science. – 1985. – 227. – P. 1229–1231.
12. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid
growth and bioassay with tobacco tissue culture //
Phys. Plant. – 1962. – 15. – P. 473–497.
13. Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Методы ге�
нетической инженерии. Молекулярное клониро�
вание. – М.: Мир, 1984. – 480 с.
14. Дрейкер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых
кислот из клеток растений // Генная инженерия
растений. – М.: Мир, 1991. – С. 241–245.
15. Logemann J., Schell J., Willmitzer L. Improved method
for the isolation of RNA from plant tissues // Anal.
Biochem. – 1987. – 163. – P. 16–20.
16. Rapley R., Heptinstall J. UV spectrophotometric analy�
sis of ribonucleic acids // Methods in molecular biolo�
gy / Eds R. Rapley, D. Manning. – Totowa : Humans
Press Inc., 1998. – Vol. 86. – P. 65–68.
17. McCabe M.S., Schepers F. Arend A. et al. Increased sta�
ble inheritance of herbicide resistance in transgenic let�
tuce carrying a petE promoter�bar gene compared with
a CaMV 35S�bar gene // Theor. and Appl. Genet. –
1999. – 99, № 3/4. – P. 587–592.
18. Nagata R.T., Dusky J.A., Ferl R.J., Torres A.C., Cantlif!
fe D.J. Evaluation of glyphosate resistance in transgenic
lettuce // J. Amer. Soc. Hort. Sci. – 2000. – 125, № 6. –
Р. 669–672.
19. Goto F., Yoshihara T., Saiki H. Iron accumulation and
enhanced growth in transgenic lettuce plants express�
ing the iron�binding protein ferritin // Theor. and
Appl. Genet. – 2000. – 100, № 5. – Р. 658–664.
20. Ahmed M.B., Akhter M.S., Hossain M. et al. An efficient
Agrobacterium�mediated genetic transformation method
of lettuce (Lactuca sativa L.) with an aphidicidal gene,
pta (Pinella ternana agglutinin) // Middle�east J. Sci.
Res. – 2007. – 2, № 2. – Р. 155–160.
21. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M. et al. A plant�
derived edible vaccine against hepatitis B virus //
FASEB J. – 1999. – 13, № 13. – Р. 1796–1799.
22. Assaad F., Tucker K.L., Signer E.R. Epigenetic repeat�
induced gene silencing (RIGS) in Arabidopsis // Plant.
Mol. Biol. – 1993. – 22. – P. 1067–1085.
23. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants
inactivate homologous (trans) genes? // Plant Physiol. –
1995. – 107. – P. 679–685.
Поступила 02.04.08
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66630 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0564-3783 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:22:42Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. 2014-07-19T15:07:30Z 2014-07-19T15:07:30Z 2009 Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2009. — Т. 43, № 2. — С. 27-32. — Бібліогр.: 23 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66630 575.222.7:581.1 Методом трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens были получены трансформированные растения Lactuca sativa с генами, кодирующими синтез туберкулезных антигенов. Исходным материалом являлись семядольные листья салата сортов Ералаш, Рубиновое кружево и Снежинка. Векторные конструкции содержали селективный ген неомицинфосфотрансферазы II nptII и целевые гены ESAT6, Ag85B (-TMD), ESAT6:Ag85B (-TMD). ПЦР-анализ геномной ДНК показал наличие как селективных, так и целевых генов во всех анализированных растениях. В то же время ПЦР-анализ обратных транскриптов выявил, что возможно как наличие, так и отсутствие транскрипции гена ESAT6 при стабильной транскрипции гена nptII. Методом трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens отримано трансформовані рослини Lactuca sativa з генами, що кодують синтез туберкульозних антигенів. Вихідним матеріалом були сім’ядольні листки салату сортів Єралаш, Рубінове мереживо та Сніжинка. Векторні конструкції мали селективний ген неоміцинфосфотрансферази II nptII та цільові гени ESAT6, Ag85B(-TMD), ESAT6:Ag85B(-TMD). ПЛР-аналіз геномної ДНК виявив наявність як селективних, так і цільових генів у всіх проаналізованих рослинах. В той же час ПЛР-аналіз зворотних транскриптів показав, що можливі як присутність, так і відсутність транскрипції гена ESAT6 при стабільній транскрипції гена nptII. Transgenic plants of lettuce Lactuca sativa L. cv. Eralash, Sniezinka, Rubinovoje kruzevo with genes coding synthesis of tuberculosis antigenes have been obtained by Agrobacterium-mediated transformation. Cotyledons of in vitro seedlings were used as the initial material for transformation with plasmids pСB063 (genes ESAT6, nptII) and pСB064 (genes ESAT6:Ag85B(-TMD), nptII). PCR-analysis has shown the presence both selective and target genes in all plants analyzed. At the same time, the RT-PCR has shown that both the presence and the absence of a transcription of gene ESAT6 at a stable transcription of a gene nptII is possible. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis Агробактеріальна трансформація салату (Lactuca sativa L.) конструкціями, що мають гени бактеріальних антигенів з Mycobacterium tuberculosis Agrobacterium-mediated transformation of lettuce (Lactuca sativa L.) with genes of bacterial antigenes from Mycobacterium tuberculosis Article published earlier |
| spellingShingle | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Кучук, Н.В. Оригинальные работы |
| title | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis |
| title_alt | Агробактеріальна трансформація салату (Lactuca sativa L.) конструкціями, що мають гени бактеріальних антигенів з Mycobacterium tuberculosis Agrobacterium-mediated transformation of lettuce (Lactuca sativa L.) with genes of bacterial antigenes from Mycobacterium tuberculosis |
| title_full | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis |
| title_fullStr | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis |
| title_full_unstemmed | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis |
| title_short | Агробактериальная трансформация салата (Lactuca sativa L.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis |
| title_sort | агробактериальная трансформация салата (lactuca sativa l.) конструкциями, несущими гены бактериальных антигенов из mycobacterium tuberculosis |
| topic | Оригинальные работы |
| topic_facet | Оригинальные работы |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66630 |
| work_keys_str_mv | AT matveevana agrobakterialʹnaâtransformaciâsalatalactucasativalkonstrukciâminesuŝimigenybakterialʹnyhantigenovizmycobacteriumtuberculosis AT vasilenkomû agrobakterialʹnaâtransformaciâsalatalactucasativalkonstrukciâminesuŝimigenybakterialʹnyhantigenovizmycobacteriumtuberculosis AT šahovskiiam agrobakterialʹnaâtransformaciâsalatalactucasativalkonstrukciâminesuŝimigenybakterialʹnyhantigenovizmycobacteriumtuberculosis AT kučuknv agrobakterialʹnaâtransformaciâsalatalactucasativalkonstrukciâminesuŝimigenybakterialʹnyhantigenovizmycobacteriumtuberculosis AT matveevana agrobakteríalʹnatransformacíâsalatulactucasativalkonstrukcíâmiŝomaûtʹgenibakteríalʹnihantigenívzmycobacteriumtuberculosis AT vasilenkomû agrobakteríalʹnatransformacíâsalatulactucasativalkonstrukcíâmiŝomaûtʹgenibakteríalʹnihantigenívzmycobacteriumtuberculosis AT šahovskiiam agrobakteríalʹnatransformacíâsalatulactucasativalkonstrukcíâmiŝomaûtʹgenibakteríalʹnihantigenívzmycobacteriumtuberculosis AT kučuknv agrobakteríalʹnatransformacíâsalatulactucasativalkonstrukcíâmiŝomaûtʹgenibakteríalʹnihantigenívzmycobacteriumtuberculosis AT matveevana agrobacteriummediatedtransformationoflettucelactucasativalwithgenesofbacterialantigenesfrommycobacteriumtuberculosis AT vasilenkomû agrobacteriummediatedtransformationoflettucelactucasativalwithgenesofbacterialantigenesfrommycobacteriumtuberculosis AT šahovskiiam agrobacteriummediatedtransformationoflettucelactucasativalwithgenesofbacterialantigenesfrommycobacteriumtuberculosis AT kučuknv agrobacteriummediatedtransformationoflettucelactucasativalwithgenesofbacterialantigenesfrommycobacteriumtuberculosis |