Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo

Зроблено огляд сучасних досягнень у галузі дослідження сайт-специфічних рекомбіназ (ССР) та їхнього практичного використання для маніпуляцій геномами про- та еукаріотів. Розглянуто принципи функціонування ССР та основні типи каталізованих ними генетичних перебудов. Приклади, наведені у цьому огляді,...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Цитология и генетика
Дата:	2010
Автор:	Осташ, Б.
Формат:	Стаття
Мова:	Українська
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2010
Теми:	Обзорные статьи
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66787
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo / Б. Осташ // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 61-69. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1860205988186947584
author	Осташ, Б.
author_facet	Осташ, Б.
citation_txt	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo / Б. Осташ // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 61-69. — Бібліогр.: 24 назв. — укр.
collection	DSpace DC
container_title	Цитология и генетика
description	Зроблено огляд сучасних досягнень у галузі дослідження сайт-специфічних рекомбіназ (ССР) та їхнього практичного використання для маніпуляцій геномами про- та еукаріотів. Розглянуто принципи функціонування ССР та основні типи каталізованих ними генетичних перебудов. Приклади, наведені у цьому огляді, демонструють потенціал ССР для розв’язання широкого кола фундаментальних та практичних проблем, вирішення яких іншими методами було б набагато складнішим або й неможливим. Застосування ССР для ширшого кола біологічних систем, створення ССР, експресія яких суворо контролюється у часі і просторі, та пошук рекомбіназ із новою субстратною специфічністю є основними напрямами подальшого розвитку технології сайт-специфічної рекомбінації. Current advances in the field of site-specific recombinases (SSR) and their application for pro- and eukaryotic genomics are reviewed. Functions of SSR and main types of the genetic rearrangements they catalyze are outlined. Examples described in the review show the potential of SSR for studies of a diverse array of fundamental and applied problems, which are not easily solved (or not solved at all) with the help of other experimental approaches. Use of SSR for wider set of biological systems, generation of recombinases with a strict temporal and spatial control of their activity and search for SSR displaying new substrate specificity are major directions of development of SSR-based technology.
first_indexed	2025-12-07T18:12:22Z
format	Article
fulltext	УДК: 615.33:577.182. Б. ОСТАШ Львівський національний університет імені Івана Франка boast0@yahoo.com САЙТ�СПЕЦИФІЧНІ РЕКОМБІНАЗИ У ГЕНЕТИЧНІЙ ІНЖЕНЕРІЇ: НОВІТНІ ТЕХНОЛОГІЇ IN VIVO Зроблено огляд сучасних досягнень у галузі дослід� ження сайт�специфічних рекомбіназ (ССР) та їхнього практичного використання для маніпуляцій геномами про� та еукаріотів. Розглянуто принципи функціонуван� ня ССР та основні типи каталізованих ними генетичних перебудов. Приклади, наведені у цьому огляді, демонст� рують потенціал ССР для розв’язання широкого кола фундаментальних та практичних проблем, вирішення яких іншими методами було б набагато складнішим або й неможливим. Застосування ССР для ширшого кола біо� логічних систем, створення ССР, експресія яких суворо контролюється у часі і просторі, та пошук рекомбіназ із новою субстратною специфічністю є основними на� прямами подальшого розвитку технології сайт�специ� фічної рекомбінації. Вступ Маніпуляції ДНК in vitro з використанням ендонуклеаз рестрикції, полімераз та ДНК�лі� газ були основою генетичної інженерії ХХ сто� ліття [1]. Стрімкий розвиток технології секве� нування ДНК [2] призвів до накопичення ве� личезного масиву даних про первинну структу� ру цілих геномів, зокрема і кількох людських [3–5]. На момент написання цього огляду у базі даних GenBank зареєстровано 5229 геномів (з них третина – еукаріотичні), приблизно стіль� ки ж геномів є у процесі секвенування (див. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes). Поступ структурної геноміки призвів до появи бібліо� тек геномів на основі космід, бактеріальних та дріжджових штучних хромосом, що містять надзвичайно великі фрагменти ДНК (до 300 тис. п.н.). Разом з тим з’явилась і потреба в інженерії цих гігантських молекул ДНК, а також цілих хромосом бактерій, рослин та тварин. Нові завдання дуже складно, а інколи й не� можливо вирішити за допомогою традиційних методів генетичної інженерії in vitro з двох при� чин. По�перше, ці методи є ефективними для маніпуляцій відносно невеликими молекула� ми ДНК (плазміди). По�друге, значно зросла потреба у багаторазових модифікаціях тієї ж молекули ДНК (косміди, хромосоми тощо). Тому «засмічення», наприклад, досліджуваної хромосоми залишками векторних молекул ДНК (що використовувались для експресії чи мутагенезу) є небажаним, а деколи й не� припустимим, і ускладнює подальші маніпу� ляції цією хромосомою. Обмеження, які притаманні традиційним методам генетичної інженерії, стимулювали розробку нових, точніших і ефективніших підходів, що практично не залежать від мані� пуляцій in vitro, і засновані на природних про� цесах сайт�специфічної рекомбінації in vivo. Розроблені методи дозволяють маніпулювати молекулами ДНК будь�якого розміру та вно� сити зміни різноманітного характеру в їхню структуру. Цей огляд присвячено прикладним аспек� там біології сайт�специфічних рекомбіназ (ССР), що відносно недавно (10–15 років) стали популярним, а деколи і незамінним зна� ряддям функціональних досліджень геномів про� та еукаріотів. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 61 © Б. ОСТАШ, 2010 Обзорные статьи Сайт�специфічні рекомбінази Cre та Flp – походження та принципи функціонування Білок Cre (343 амінокислотних залишки (ак); cyclization�recombination protein) коду� ється геном cre, який виявили у геномі фага Р1. Cre належить до сайт�специфічних реком� біназ родини Int (надродина λ�інтеграз), які здійснюють сайт�специфічну рекомбінацію ДНК за єдиним механізмом, що включає гід� роліз ланцюгів ДНК із використанням залиш� ку тирозину в активному центрі білка, їхній обмін та лігування [6]. Білок Cre розпізнає специфічну послідовність завдовжки 34 п.н., яка отримала назву loxP (locus of crossingover (X) in P1). Cre та loxP у життєвому циклі фага Р1 забезпечують циклізацію лінійної фагової ДНК у перші хвилини інфекції кишкової па� лички [1]. Сайт loxP містить дві паліндромні послідовності розміром 13 п.н. (інвертовані повтори), які розділені асиметричною ділян� кою розміром 8 п.н. (кор, або спейсер; рис. 1). За наявності двох ділянок loxP мономери білка Cre зв’язуються з інвертованими повто� рами і стимулюють формування синаптичного комплексу та рекомбінацію між двома loxP (рис. 2). Розрив ДНК, обмін ланцюгів та їхнє лігування відбуваються у межах спейсерів. Оскільки спейсери асиметричні, то обмін нитками ДНК можливий тільки тоді, коли два loxP з’єднані синапсом у одній орієнтації. То� му орієнтація двох ділянок loxP визначає ре� зультат рекомбінації. Так, рекомбінація між loxP у тій самій орі� єнтації призведе до вирізання (делеції) ДНК між loxP�сайтами, а рекомбінація між двома інвертованими ділянками loxP – до інверсії ДНК. Крім того, Cre може інтегрувати кільце� ву молекулу ДНК у лінійну ДНК, якщо кожна з них містить loxP, або зумовлювати обмін ді� лянками ДНК на двох лінійних loxP�вмісних молекулах, наприклад негомологічних хромо� сомах (рис. 2). Висока точність Cre�залежної рекомбінації, її незалежність від додаткових білків чи кофакторів та активність у різних біологічних системах (прокаріоти, рослини, комахи, лінії клітин ссавців) зумовлюють цін� ність Cre�loxP в екпериментах з маніпуляцій ДНК in vivo, які будуть розглянуті докладніше далі. Ген, що кодує іншу ССР – Flp, та ділянка FRT (Flp recombination target), яку Flp розпіз� нає, були виявлені у складі 2 мкм плазміди у Saccharomyces cerevisiae. Ця плазміда складаєть� ся з малого та великого районів, які розділені двома інвертованими повторами розміром 599 п.н. [7]. В межах цих повторів знаходяться ділянки FRT. Білок Flp (423 ак) забезпечує ре� комбінацію між двома FRT, що зумовлює пе� ретворення 2 мкм плазміди з А�ізоформи у В� ізоформу і навпаки. Розмір FRT – 48 п.н. Він складається з трьох паліндромів (кожен 13 п.н. завдовжки, позначених як a, b, c) та централь� ної ділянки (спейсера) розміром 8 п.н., що містить сайт для ЕР XbaI (рис. 1). Елементи с і b ідентичні та розташовані однокерунково, то� ді як елементи а та b є, фактично, інвертова� ними повторами, які розділені спейсером. Елемент с не є необхідним для активності Flp, тому мінімальний біологічно активний сайт FRT, як і loxP, складається з 34 п.н. – двох ін� вертованих повторів (а і b, 13 п.н. кожен) та спейсера (8 п.н.). Механізми каталізу та типи рекомбінаційних реакцій є ідентичними для Flp та Cre (рис. 2). Застосування ССР для індукування делецій ДНК Типовим генно�інженерним експеримен� том є конструювання організмів, що містять «нокаут» певного гена X – інсерцію у його по� слідовність маркерного гена Y (наприклад дер� мінанта стійкості до антибіотика тощо), що порушує функціонування X. Очевидно, що кожен маркерний ген можна використати ли� ше один раз для модифікації певного організ� му, і це значно обмежує кількість змін, які можна ввести у досліджуваний геном. Вико� ристання ССР дозволяє отримувати немарко� вані мутації, як зображено на рис. 3. Для цьо� го застосовують маркерні гени, фланковані сайтами FRT чи loxP у прямій орієнтації. У мутанті після отримання очікуваної мутації в хромосомі, екпресують Flp чи Cre, що зумовлює вирізання маркерного гена. По завершенні ре� комбіназної реакції у хромосомі залишається одна із ділянок FRT чи loxP – так звана «шра� мова послідовність» (scar sequence), розмір якої залежить від типу використаної плазміди, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 462 Б. Осташ однак зазвичай не перевищує 90 п.н. Показано, що ця послідовність переважно не спричинює полярних ефектів на експресію сусідніх генів. На сьогодні ССР успішно використали для от� римання комерційно важливих генетично мо� дифікованих рослин, що виявляють підвищену соле� та посухостійкість [8–10]. Очевидно, що ССР можна використати для отримання умов� но�летальних мутацій, на кшталт ts�мутацій у генах фага λ [1]. Однак у випадку ССР�за� лежних делецій умовним фактором є індукція гена рекомбінази, що контролює вирізання чи інверсію певного життєво важливого гена. Зараз створено низку ліній мишей, що є умов� но�летальними мутантами за певними генами [11]; до появи ССР не існувало технологічної бази для конструювання таких організмів. Хоча одну і ту ж маркерну касету, фланкова� ну ділянками FRT/loxP, можна використати для конструювання багатьох мутацій в одній хромосомі, присутність багатьох сайтів FRT/ loxP може мати небажані побічні ефекти, такі як інверсії та делеції між цими ділянками. На� приклад, в Pseudomonas aeruginosa Flp�залежна рекомбінація між двома мутантними локусами спричинила інверсію ділянки геному розмі� ром 1,59 млн п.н. [12]. Однак такі події є рід� кісними, і нині описано випадки отримання п’яти немаркованих делецій в одній хромосомі без небажаних наслідків. Ключовим моментом у конструюванні мутанта є повна елімінація плазміди, що кодує ССР, зразу ж після отриман� ня запланованої рекомбінаційної події. Слід зазначити, що частота рекомбінаційних подій залежить від багатьох факторів, зокрема актив� ності ССР та відстані між сайтами рекомбіна� ції. Так, із збільшенням відстані між FRT/loxP зменшується частота рекомбінації. На сьогодні продемонстровано можливість делеції фраг� ментів ДНК розміром до 100 тис. п.н. [13]. Застосування ССР для інтеграції та інверсії ДНК Оскільки ССР каталізують рекомбінацію між ділянками FRT/loxP навіть коли вони зна� ходяться на різних репліконах, то їх можна ви� користати не тільки для ексцизії ДНК, але й у зворотному напрямі, як зображено на рис. 2. У такий спосіб можна ввести чужорідну ДНК у ге� ном. Першим кроком у цьому підході є вве� дення однієї ділянки FRT/loxP у досліджуваний геном. Для цього використовують транспозон� ний мутагенез або спрямовану інсерцію за до� помогою гомологічної рекомбінації; у випадку деяких ентеробактерій можна також скориста� тись λRED�залежною рекомбінацією [14, 15]. В той час як реакція вирізання ДНК між двома сайтами FRT/loxP є незворотною, інсер� ція чи інверсія ДНК внаслідок рекомбінації між FRT/loxP знаходиться під постійною за� грозою реверсії. На сьогодні розроблено стра� тегії, що дозволяють отримати незворотні ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 63 Сайт�специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo Рис. 1. Структура сайтів, що розпізнаються рекомбіназами: А – сайт loxP; Б – сайт FRT. Нуклеотиди пронумеровані з центра сайта. Інвертовані повтори у loxP є ідентичними, а елементи b і a у FRT відрізняються 1 п.н. (підкреслено) FRT/loxP�залежні інсерції та інверсії. В основі цих стратегій є здатність Cre та Flp розпізнава� ти змінені (альтернативні) ділянки FRT/loxP, але рекомбінувати тільки певні пари цих аль� тернативних ділянок. Альтернативні ділянки FRT/loxP поділя� ються на два класи: спейсерні варіанти та ва� ріанти зі зміненою будовою інвертованих по� вторів. Перший клас містить нуклеотидні за� міни у послідовності спейсера і базується на спостереженні, що розмір спейсера (8 п.н.) є визначальним для ефективної рекомбінації, в той час як його послідовність не є критичною, якщо вона ідентична в двох FRT/loxP, які бе� руть участь у реакції. Таким чином, ССР�за� лежна рекомбінація відбудеться між парою го� мотипових (наприклад, FRT�FRT чи F3–F3), але не гетеротипових (FRT�F3) ділянок. Цю ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 464 Б. Осташ Рис. 2. Реакції рекомбінації, що каталі� зуються білками Cre чи Flp. Заштрихо� вані стрілки вказують на напрям реак� цій властивість використовують у підході, що отри� мав назву «обмін касети опосередкований ре� комбіназою» (RMCE – recombinase�mediated cassette exchange; рис. 4) і застосовується для інсерцій ДНК та у стратегії інверсії ДНК, що називається FLEx (flip excision) [11]. В RMCE селективний маркер, фланкований ге� теротиповими ділянками, вводиться у геном за допомогою гомологічної рекомбінації. По� тім потрібна ДНК вводиться у район інсерції маркерного гена, замінюючи його у ССР�за� лежній рекомбіназній реакції. Кінцевий про� дукт обміну не здатний вступати у нові раунди рекомбінації, оскільки його фланкують гете� ротипові (несумісні) ділянки. У стратегії FLEx фрагмент ДНК, який планують інвертувати, фланкований двома парами сумісних гетеро� типових сайтів. Рекомбінація між будь�якою з цих двох пар призводить до інверсії ДНК, включно з інверсією внутрішнього сайту FRT/ loxP. Це в свою чергу розташовує гомотипові ділянки у одній орієнтації і зумовлює ексци� зію ДНК між ними. Кінцевим продуктом є ін� вертована касета, фланкована двома гетероти� повими ділянками, що не здатні рекомбінувати. Інший клас альтернативних FRT/loxP діля� нок – із змінами у структурі інвертованих по� вторів – також використовують для конструю� вання стабільних інсерцій та інверсій. У цьому випадку ділянки FRT/loxP містять нуклеотид� ні заміни у межах інвертованих повторів, що порушує здатність рекомбінази зв’язуватись із ДНК. Ділянка FRT/loxP, що містить нукле� отидну заміну у лівому інвертованому повторі (LE мутантний сайт), може рекомбінувати з низькою ефективністю із ділянкою FRT/loxP, що містить аналогічну заміну у правому інвер� тованому повторі (RE мутантний сайт). Про� дукт рекомбінації між LE та RE мутантними ділянками міститиме одну ділянку FRT/loxP дикого типу та одну мутантну – LE+RE, що не є субстратом для рекомбіназної реакції [11]. Цей клас мутантних ділянок FRT/loxP за� звичай використовують для введення плазмід у хромосому чи отримання стабільних інверсій. RIVET – ССР�залежний підхід до виявлення генів, що експресуються in vivo RIVET (recombinase�mediated in vivo expres� sion technology) застосовується для виявлення генів, які не експресуються за лабораторних умов культивування (in vitro), але специфічно індукуються in vivo, наприклад при інвазії/ко� лонізації тваринних чи рослинних тканин мікроорганізмами тощо. Таку групу генів по� значають як ivi гени (in vivo induced genes). Ідентифікація ivi генів є важливим кроком у розробці нових методів боротьби з патогена� ми, вдосконалених штамів для харчової про� мисловості, сільського та лісового господарств тощо. Хоча існують і інші методи виявлення ivi генів (транскрипційний аналіз за допомо� гою RT�ПЛР, секвенування бібліотек кДНК тощо), RIVET є мабуть найгнучкішим та най� чутливішим посеред них, оскільки дозволяє ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 65 Сайт�специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo Рис. 3. Конструювання немаркованих делецій за допо� могою ССР: X, Y, Z – гени у хромосомі (косміді, плаз� міді); МG1 – маркерний ген 1 (наприклад, ген стійкос� ті до хлорамфеніколу), яким заміщували ген Y; МG2 – маркерний ген 2 (наприклад, ген стійкості до канамі� цину) на векторній ДНК. Чорний трикутник позначає ділянки рекомбінації FRT чи loxP для Flp чи Cre від� повідно; а – вихідна хромосома; б – плазміда для деле� ції гена Y; в – хромосома, в якій ген Y заміщений на МG1, фланкований FRT чи loxP; г – хромосома, в якій маркерний ген 1 (МG1) зазнав ексцизії внаслідок активності Flp чи Cre. На місці гена Y залишається «шрам» – одна ділянка FRT чи loxP виявляти навіть ті гени, які експресувалися в клітинах господаря тимчасово, протягом ко� роткого проміжку часу [16]. RIVET складаєть� ся з кількох етапів. Спочатку маркерний ген (зазвичай детермінант стійкості до певного антибіотика) інтегрують у хромосому мікро� організма, що є об’єктом дослідження. Далі геномну ДНК вихідного мікроорганізму об� робляють ЕР, фракціонують і фрагменти роз� міром 1–2 тис. п.н. лігують з плазмідою, що містить безпромоторний репортерний ген ре� комбінази Cre/Flp. Таким чином, експресія гена рекомбінази буде залежати від промотор� ної активності клонованого фрагмента геному мікроорганізму. Лігазною сумішшю (що, в ідеа� лі, має репрезентувати усі промотори дослід� жуваного штаму) трансформують бактерію, отримуючи бібліотеку клонів (або RIVET�біб� ліотека). Для контрселекції клонів, що експре� сують ген рекомбінази за лабораторних умов, RIVET�бібліотеку вирощують впродовж кіль� кох десятків генерацій у присутності антибіо� тика, стійкість до якого забезпечується марке� ром у геномі мікроорганізма. Після цього RIVET�бібліотеку вводять у господаря (орга� нізм, що має індукувати ivi гени), інкубують протягом певного часу та відбирають бактерії (з певних органів/тканин у певні моменти часу). У популяції мікроорганізмів, які виділили з господаря, відбирають клони, що втратили стій� кість до антибіотика внаслідок ексцизії мар� керного гена. Саме втрата маркерного гена є свідченням активності ivi промотора, що інду� кував експресію рекомбінази, у відповідь на певний сигнал (індуктор), який генерував гос� подар. Виділення плазміди із транскрипцій� ним злиттям ivi промотора і гена рекомбінази та її молекулярно�генетичний аналіз завершу� ють скринінг ivi генів. RIVET не потребує постійного селективного тиску на репортерний ген під час експеримен� тів in vivo, оскільки активація ivi промотора, ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 466 Б. Осташ Рис. 4. Заміна касети опосередкована рекомбінацією (RMCE). У хромосомі (косміді, BAC, YAC тощо) міститься маркерний ген (МG), фланкований парою гетеротипових ділянок рекомбінації для ССР (чорний та білий три� кутники). Плазміда містить чужорідну ДНК (трансген; ТG), фланковану ідентичною парою гетеротипових діля� нок. ССР каталізуватиме заміну МG на ТG в один етап (одночасна рекомбінація між двома парами ділянок) або в два етапи, як зображено на рисунку. Оскільки ССР�залежна реакція є зворотною, то приблизно 50 % молекул ДНК міститимуть очікувану заміну, яку можна буде відібрати за втратою навіть якщо вона була нетривалою, незворот� но «фіксується» у геномі мікроорганізму у ви� гляді ексцизії маркерного гена, яка стабільно успадковується усіма нащадками цієї клітини і може бути виявлена після їхнього виділення з господаря. Описана схема RIVET заснована на негативній селекції потрібних клонів; на сьогодні відомі підходи з позитивною се� лекцією ivi генів. Для цього у геном бактерії інтегрують касету, що містить маркерний ген, ген репресора LacIq та сайти рекомбінації на кінцях касети. В інший локус геному бакте� рії інтегрують ген зеленого флуоресцентного білка GFP під контролем промотора lac оперо� ну. При активації рекомбінази з геному бакте� рії вирізається маркерний ген разом з геном репресора lacIq, що дерепресує ген gfp. Кліти� ни, в яких відбулася індукція гена рекомбіна� зи, легко виявити за флуоресценцією [17]. Застосування ССР для вирізання та клонування фрагментів ДНК in vivo Продемонстровано, що Flp�FRT можна ви� користати для ексцизії та подальшого клону� вання in vivo великих фрагментів генома в E. coli. Процедура полягає у введенні сайтів ре� комбінації та плазмідного реплікону на кінці ділянки ДНК, яку планують клонувати. Далі у клітини вводиться в trans положенні плазміда з геном, що кодує Flp, експресія якого зумовлює вирізання та FRT�залежну циклізацію фрагмен� та геному. Так вдалося клонувати геномний острів патогенності LEE розміром 35 тис. п.н. із E. coli [12]. Контроль активності ССР На сьогодні відпрацьовано ряд підходів, що дають змогу контролювати активність реком� біназ у часі. Наприклад, описано метод тимча� сової реверсії фенотипу E. coli від RecA– до RecA+ , що дозволяє трансдукцію у RecA– шта� мах. Для цього безпромоторний ген recА кло� нують у плазміду між двох конвергентно орі� єнтованих ділянок FRT таким чином, щоб ін� дуцибельний промотор tetAp прилягав до стоп� кодона recА. При додаванні хлортетрацикліну індукується експресія рекомбінази Flp (ген якої знаходиться під контролем tetAp на тій самій плазміді, де є recА), яка інвертує recА, що запус� кає продукцію RecA. Найвитонченіші страте� гії часового контролю експресії рекомбіназ використовуються у дослідженнях генетики розвитку еукаріотів [18]. Наприклад, сконст� руйовано ген, що кодує злитий білок Flpe� LBD, де Flpe – це рекомбіназа Flp, оптимізо� вана для експресії в еукаріотах, а LBD – ре� цептор певного стероїдного гормона. За від� сутності гормона білок Flpe�LBD захоплюєть� ся комплексом білків теплового шоку Hsp90, тоді як взаємодія гормона з Flpe�LBD вивіль� няє білок з Hsp90. Після цього рекомбіназа проникає в ядро клітини і каталізує реакцію. Для транскрипційного контролю експресії ге� нів рекомбіназ в еукаріотах використовують тетрациклін�залежні регуляторні системи, що базуються на регуляторних елементах E. coli – tetR�tetO. Властивості та застосування ССР PhiC31 ССР PhiC31 (68 кДа), що належить до ро� дини резольваз�інвертаз, походить із помірного актиноміцетного фага ϕC31 і широко застосо� вується у генетиці актиноміцетів для констру� ювання стабільних вставок у їхні геноми [19]. PhiC31 успішно функціонує в клітинах ссав� ців та рослин, що робить цю ССР цінним зна� ряддям у генетиці вищих організмів [8, 20]. PhiC31 опосередковує рекомбінацію тільки між гетеротиповими сайтами attB (34 п.н.) та attP (39 п.н.) із використанням залишку серину в активному центрі білка. Обидва сайти реком� бінації містять недосконалі інвертовані повтори, з якими, мабуть, взаємодіють гомодимери PhiC31. Продукти рекомбіназної реакції – attL та attR – не здатні вступати у гомологічну чи PhiC31�залежну рекомбінації, що робить реак� цію однобічною та незворотною. Під час ви� вчення особливостей функціонування PhiC31 у клітинах ссавців показано, що attB�вмісна ДНК зазнає інсерції у геномний attP сайт швидше, ніж attP�вмісна ДНК у геном з attB сайтом. Тому у типовому випадку attP сайт спочатку поміщають у певний локус геному за допомогою гомологічної рекомбінації, а потім вводять attB�вмісну конструкцію, яка завдяки PhiC31 зазнає рекомбінації між attB та attP. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 67 Сайт�специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo Крім інтеграції чужорідної ДНК, PhiC31 можна використати для генних заміщень. Принципову можливість цього продемонстро� вано для Schizosaccharomyces pombe. На кінці лінійного фрагменту ДНК, яким планують за� мінити певну ділянку геному, вводять сайти attB в одній орієнтації. Цим фрагментом ДНК трансформують штам S. pombe, що містить пару attP сайтів у одній орієнтації, які оточують ді� лянку геному. ССР PhiC31 (знаходиться на плазміді) каталізуватиме утворення коінтегра� тів різного типу, серед яких буде і заміщення ДНК між attP сайтами лінійним фрагментом ДНК, яким трансформували штам [21]. Слід зазначити, що в лініях клітин людини та мишей виявлено багато псевдо�attP сайтів (тобто ділянок, які подібні, але не ідентичні до attP дикого типу), а саме 31 та 57 відповідно [20]. У деяких лініях клітин людини та мишей ці ендогенні псевдо�attP здатні рекомбінувати із attB�вмісними конструкціями, навіть за на� явності сайту attP дикого типу. Таким чином, чужорідні гени можна вводити у відносно ви� падкові локуси людського геному, або, вико� ристовуючи особливі векторні системи, забез� печити точну інтеграцію ДНК у сайт attP ди� кого типу. Крім того, досвід використання PhiC31 показує, що зазвичай псевдо�attP не перешкоджають відбору потрібних рекомбіна� ційних подій за наявності відповідних схем се� лекції, і ще раз підкреслює першочергову важ� ливість молекулярно�генетичного аналізу от� риманих рекомбінантних організмів чи ліній клітин. Псевдо�attP також виявлено у багатьох мікроорганізмів, а псевдо�loxP – в геномі ми� ші [11], однак у цих випадках досі не виявлено негативного впливу таких сайтів на конструю� вання запланованих генетичних перебудов за умов нормальної експресії ССР. Інші відомі ССР та майбутні напрями досліджень Flp, Cre та PhiC31 є найвживанішими, од� нак не є єдиними ССР, які застосовуються для конструювання рекомбінантних ДНК in vivo. Нині у дослідженнях використовують також ССР із плазміди RP4 (система ParA�res), транс� позону γδ (система TnpR�res), плазміди SR1 Zygosaccharomyces rouxii (система R�RS), бак� теріофага Mu (система Gin�xis) та плазміди pSM19039 (система β�six) [8]. За принципом функціонування і використання усі згадані ССР подібні до Flp. На сьогодні ССР вже призвели до револю� ційних змін у підходах до інженерії рекомбі� нантних молекул ДНК та організмів. Однак слід зазначити, що ця революція наразі заче� пила в основному модельні організми (Escheri� chia, Pseudomonas, Drosophila, Arabidopsis, лінії клітин людини та миші, деякі роди дріжджів), а приклади застосування ССР для широкого спектра біологічних систем є нечисленними. Наприклад, потенціал ССР досі недостатньо розкритий у генетиці грам�позитивних бакте� рій, хоча принципових перешкод цьому, воче� видь, не існує. Найбільш серйозними пробле� мами у використанні ССР для деяких груп ор� ганізмів є особливості ініціації трансляції та вживання кодонів у їхніх геномах та у Flp/Cre, що значно знижує експресію останніх. Однак поступ у хімічному синтезі ДНК робить мож� ливим конструювання синтетичних генів, адаптованих до експресії у певному організмі. Так, на сьогодні сконструйовано ген cre, в яко� го модифіковано сайт ініціації трансляції, а вживання кодонів відображає таке у людському геномі [11]. Подібним чином синтезовано ге� ни ССР для оптимальної експресії в актиномі� цетах – одній з найбільших груп бактерій, що продукують багато відомих антибіотиків, про� типухлинних та імуносупресорних препаратів [22, 23]. Створення ССР, експресію яких можна контролювати у часі, є іншим важливим на� прямом досліджень. Розробляються нові версії ССР на основі згаданих стратегій, а також здійснюється пошук нових ССР, які значно розширять арсенал генетичної інженерії і спри� ятимуть вирішенню низки життєво важливих питань, що постали перед людством [24]. B. Ostash SITE�SPECIFIC RECOMBINASES IN GENETIC ENGINEERING: MODERN IN VIVO TECHNOLOGIES Current advances in the field of site�specific recombinas� es (SSR) and their application for pro� and eukaryotic genomics are reviewed. Functions of SSR and main types of the genetic rearrangements they catalyze are outlined. Examples described in the review show the potential of SSR ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 468 Б. Осташ for studies of a diverse array of fundamental and applied problems, which are not easily solved (or not solved at all) with the help of other experimental approaches. Use of SSR for wider set of biological systems, generation of recombinas� es with a strict temporal and spatial control of their activity and search for SSR displaying new substrate specificity are major directions of development of SSR�based technology. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. – New York : Cold Spring Harbor Lab. – 2001. 2. Mardis E.R. Next�generation DNA sequencing meth� ods // Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. – 2008. – 9. – P. 387–402. 3. Wheeler D.A., Srinivasan M., Egholm M. et al. The com� plete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing // Nature. – 2008. – 452. – P. 872–876. 4. Bentley D.R., Balasubramanian S., Swerdlow H.P. et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry // Nature. – 2008. – 456. – P. 53–59. 5. Wang J., Wang W., Li R. et al. The diploid genome sequence of an Asian individual // Nature. – 2008. – 456. – P. 60–65. 6. Yu B.J., Kim C. Minimization of the Escherichia coli genome using the Tn5�targeted Cre/loxP excision sys� tem // Meth. Mol. Biol. – 2008. – 416. – P. 261–277. 7. Sadowski P. The Flp recombinase of the 2�Мm plasmid of Saccharomyces cerevisiae // Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. – 1995. – 51. – P. 53–91. 8. Gidoni D., Srivastava V., Carmi N. Site�specific exci� sional recombination strategies for elimination of undesirable transgenes from crop plants // In Vitro Cell Dev. Biol.–Plant. – 2008. – 44. – P. 457–467. 9. Zhang Y., Liu H., Li B., Zhang J.T., Li Y., Zhang H. Generation of selectable marker�free transgenic toma� to resistant to drought, cold and oxidative stress using the Cre/loxP DNA excision system // Transgenic Res. – 2009. – DOI 10.1007/s11248–009–9251–6. 10. Moravcikova J., Vaculkova E., Bauer M., Libantova J. Feasibility of the seed specific cruciferin C promoter in the self excision Cre/loxP strategy focused on genera� tion of marker�free transgenic plants // Theor. Appl. Genet. – 2008. – 117. – P. 1325–1334. 11. Branda C.S., Dymecki S.M. Talking about a revolution: the impact of site�specific recombinases on genetic analyses in mice // Developmental Cell. – 2004. – 6. – P. 7–28. 12. Schweizer H.P. Applications of the Saccharomyces cere� visiae Flp�FRT system in bacterial genetics // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – 5. – P. 67–77. 13. Wild J., Sektas M., Hradecna Z., Szybalski W. Targeting and retrofitting pre�existing libraries of transposon insertions with FRT and oriV elements for in�vivo gen� eration of large quantities of any genomic fragment // Gene. – 1998. – 223. – P. 55–66. 14. Zhang Y., Buchholz F., Muyrers J.P.P., Stewart A.F. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli // Nat. Genet. – 1998. – 20. – P. 123– 128. 15. Sharan S.K., Thomason L.C., Kuznetsov S.G., Court D.L. Recombineering: a homologous recombination�based method of genetic engineering // Nat. Protocols. – 2009. – 4. – P. 206–223. 16. Bron P.A., Grangette C., Mercenier A., de Vos W.M., Kleerebezem M. Identification of Lactobacillus plan� tarum genes that are induced in the gastrointestinal tract of mice // J. Bacteriol. – 2004. – 186. – P. 5721– 5729. 17. Jackson R.W., Giddens S.R. Development and applica� tion of in vivo expression technology (IVET) for analysing microbial gene expression in complex envi� ronments // Infect. Disorders – Drug Targets. – 2006. – 6. – P. 207–240. 18. Sharma N., Moldt B., Dalsgaard T., Jensen T.G., Mik� kelsen J.G. Regulated gene insertion by steroid�induced ϕC31 integrase // Nucl. Acids. Res. – 2008. – 36. – P. 1–12. 19. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Gromyko O. et al. IncP plasmids are most effective in mediating conjugation between Escherichia coli and Streptomycetes // Rus. J. Genet. – 2006. – 42. – P. 476–481. 20. Keravala A., Calos M.P. Site�specific chromosomal integration mediated by ϕC31 integrase // Meth. Mol. Biol. – 435. – P. 165–173. 21. Thomason L.C., Calendar R., Ow D.W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage ϕC31 site� specific recombination system // Mol. Genet. Genom. – 2001. – 265. – P. 1031–1038. 22. Fedoryshyn M., Petzke L., Welle E. et al. Marker removal from actinomycete genomes using Flp recom� binase // Gene. – 2008. – 213. – P. 114–119. 23. Fedoryshyn M., Welle E., Bechthold A., Luzhetskyy A. Functional expression of the Cre recombinase in actin� omycetes // Appl. Microbiol Biotechnol. – 2008. – 78. – P. 1065–1070. 24. Блюм Я., Сиволап Ю., Рудий Р., Созінов О. Нова хвиля «зеленої революції». Перспективи застосування в Україні досягнень молекулярної біотехнології та геноміки // Вісн. НАН України. – 2006. – 3. – С. 21– 31. Надійшла 22.05.09 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2010. № 4 69 Сайт�специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66787
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Ukrainian
last_indexed	2025-12-07T18:12:22Z
publishDate	2010
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Осташ, Б. 2014-07-22T06:48:41Z 2014-07-22T06:48:41Z 2010 Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo / Б. Осташ // Цитология и генетика. — 2010. — Т. 44, № 4. — С. 61-69. — Бібліогр.: 24 назв. — укр. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66787 615.33:577.182 Зроблено огляд сучасних досягнень у галузі дослідження сайт-специфічних рекомбіназ (ССР) та їхнього практичного використання для маніпуляцій геномами про- та еукаріотів. Розглянуто принципи функціонування ССР та основні типи каталізованих ними генетичних перебудов. Приклади, наведені у цьому огляді, демонструють потенціал ССР для розв’язання широкого кола фундаментальних та практичних проблем, вирішення яких іншими методами було б набагато складнішим або й неможливим. Застосування ССР для ширшого кола біологічних систем, створення ССР, експресія яких суворо контролюється у часі і просторі, та пошук рекомбіназ із новою субстратною специфічністю є основними напрямами подальшого розвитку технології сайт-специфічної рекомбінації. Current advances in the field of site-specific recombinases (SSR) and their application for pro- and eukaryotic genomics are reviewed. Functions of SSR and main types of the genetic rearrangements they catalyze are outlined. Examples described in the review show the potential of SSR for studies of a diverse array of fundamental and applied problems, which are not easily solved (or not solved at all) with the help of other experimental approaches. Use of SSR for wider set of biological systems, generation of recombinases with a strict temporal and spatial control of their activity and search for SSR displaying new substrate specificity are major directions of development of SSR-based technology. uk Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Обзорные статьи Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo Site-specific recombinases in genetic engineering: modern in vivo technologies Article published earlier
spellingShingle	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo Осташ, Б. Обзорные статьи
title	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
title_alt	Site-specific recombinases in genetic engineering: modern in vivo technologies
title_full	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
title_fullStr	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
title_full_unstemmed	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
title_short	Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
title_sort	сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo
topic	Обзорные статьи
topic_facet	Обзорные статьи
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66787
work_keys_str_mv	AT ostašb saitspecifíčnírekombínaziugenetičníiínženeríínovítnítehnologííinvivo AT ostašb sitespecificrecombinasesingeneticengineeringmoderninvivotechnologies

Сайт-специфічні рекомбінази у генетичній інженерії: новітні технології in vivo

Репозитарії

Схожі ресурси