Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена

Метод биолистической трансформации был использован для генетического усовершенствования трех коммерческих сортов ячменя отечественной селекции (Оксамытовый, Водограй и Гетьман). Для трансформации использовали конструкцию pHLFTuBA, содержащую ген интереса, ген человеческого лактоферрина (hLF) под кон...

Ausführliche Beschreibung

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Veröffentlicht in:	Цитология и генетика
Datum:	2011
Hauptverfasser:	Танасиенко, И.В., Емец, А.И., Пирко, Я.В., Корховой, В.И., Абумхади, Н., Блюм, Я.Б.
Format:	Artikel
Sprache:	Russian
Veröffentlicht:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2011
Schlagworte:	Оригинальные работы
Online Zugang:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66817
Tags:	Tag hinzufügen Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Zitieren:	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена / И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко, В.И. Корховой, Н. Абумхади, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 3-10. — Бібліогр.: 30 назв. — рос.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66817
record_format	dspace
spelling	Танасиенко, И.В. Емец, А.И. Пирко, Я.В. Корховой, В.И. Абумхади, Н. Блюм, Я.Б. 2014-07-22T18:23:32Z 2014-07-22T18:23:32Z 2011 Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена / И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко, В.И. Корховой, Н. Абумхади, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 3-10. — Бібліогр.: 30 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66817 Метод биолистической трансформации был использован для генетического усовершенствования трех коммерческих сортов ячменя отечественной селекции (Оксамытовый, Водограй и Гетьман). Для трансформации использовали конструкцию pHLFTuBA, содержащую ген интереса, ген человеческого лактоферрина (hLF) под контролем глютелинового В-1 (GluB-1) промотора риса. В качестве селективного маркерного гена использовали ген мутантного a-тубулина, обеспечивающего устойчивость к трифлюралину (гербицид динитроанилинового ряда). Для установления селективной концентрации трифлюралина был проведен скрининг его разных концентраций в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ. После 2–3 месяцев селекции на 10 мкМ трифлюралина были получены две трансгенные линии растений ячменя сорта Оксамытовый и каллусная линия сорта Гетьман. Для подтверждения стабильной интеграции гена hLF был проведен ПЦР-анализ листьев растений-регенерантов после их адаптации в грунте. В обеих линиях ячменя был амплифицирован фрагмент гена hLF размером 734 п.н. Метод біолістичної трансформації використовували для генетичного вдосконалення трьох комерційних сортів ячменю вітчизняної селекції (Оксамитовий, Водограй і Гетьман). Для трансформації використовували конструкцію pHLFTuBA, що містила ген інтересу, ген людського лактоферину (hLF) під контролем глютелінового В 1 (GluB 1) промотору рису. Як селективний маркерний ген використовували ген мутантного α-тубуліну, що забезпечував стійкість до трифлюраліну (гербіцид динітроанілінового ряду). Для встановлення селективної концентрації агенту було проведено скринінг різних концентрацій трифлюраліну в діапазоні від 0,1 до 30 мкМ. Після 2–3 місяців селекції на 10 мкМ трифлюраліну було отримано дві трансгенні лінії рослин ячменю сорту Оксамитовий та калусну лінію сорту Гетьман. Для підтвердження стабільної інтеграції гена hLF було проведено ПЦР аналіз листків рослин-регенерантів після їх адаптації в грунті. В обох лініях було ампліфіковано фрагмент гена розміром 734 п.н. Method of biolistic transformation was used for genetic improvement of commercial barley cultivars (Oksamitoviy, Vodogray and Getman). The plasmid pHLFTuBA was used for particle bombardment that consists of the hLF gene under the control of the barley glutelin B-1 promoter and a selectable marker gene, α-tubulin conferring resistance to trifluralin (dinitroanilinr herbicide). Preliminary screening of different trifluralin concentration range from 0,1 to 30 μM was tested for determination of effective selective agent concentration. Two transgenic barley line of genotype Oksamitiviy and transgenic callus line of cultivar Getman were obtained after selection on 10 μM of trifluralin. To confirm the transgenic nature of regenerated plants, the PCR analysis was carried out. The 734bp length fragment of hLF gene was amplified from both regenerated plants. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена Отримання трансгенних ліній ячменю, що продукують лактоферрин людини, із використанням мутантного гена альфа тубуліну як селективного маркерного гена Production of transgenic barley lines producing human lactoferrin using mutant alfa-tubulin gene as selective marker gene Article published earlier
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
title	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
spellingShingle	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена Танасиенко, И.В. Емец, А.И. Пирко, Я.В. Корховой, В.И. Абумхади, Н. Блюм, Я.Б. Оригинальные работы
title_short	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
title_full	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
title_fullStr	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
title_full_unstemmed	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
title_sort	получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена
author	Танасиенко, И.В. Емец, А.И. Пирко, Я.В. Корховой, В.И. Абумхади, Н. Блюм, Я.Б.
author_facet	Танасиенко, И.В. Емец, А.И. Пирко, Я.В. Корховой, В.И. Абумхади, Н. Блюм, Я.Б.
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
publishDate	2011
language	Russian
container_title	Цитология и генетика
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
format	Article
title_alt	Отримання трансгенних ліній ячменю, що продукують лактоферрин людини, із використанням мутантного гена альфа тубуліну як селективного маркерного гена Production of transgenic barley lines producing human lactoferrin using mutant alfa-tubulin gene as selective marker gene
description	Метод биолистической трансформации был использован для генетического усовершенствования трех коммерческих сортов ячменя отечественной селекции (Оксамытовый, Водограй и Гетьман). Для трансформации использовали конструкцию pHLFTuBA, содержащую ген интереса, ген человеческого лактоферрина (hLF) под контролем глютелинового В-1 (GluB-1) промотора риса. В качестве селективного маркерного гена использовали ген мутантного a-тубулина, обеспечивающего устойчивость к трифлюралину (гербицид динитроанилинового ряда). Для установления селективной концентрации трифлюралина был проведен скрининг его разных концентраций в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ. После 2–3 месяцев селекции на 10 мкМ трифлюралина были получены две трансгенные линии растений ячменя сорта Оксамытовый и каллусная линия сорта Гетьман. Для подтверждения стабильной интеграции гена hLF был проведен ПЦР-анализ листьев растений-регенерантов после их адаптации в грунте. В обеих линиях ячменя был амплифицирован фрагмент гена hLF размером 734 п.н. Метод біолістичної трансформації використовували для генетичного вдосконалення трьох комерційних сортів ячменю вітчизняної селекції (Оксамитовий, Водограй і Гетьман). Для трансформації використовували конструкцію pHLFTuBA, що містила ген інтересу, ген людського лактоферину (hLF) під контролем глютелінового В 1 (GluB 1) промотору рису. Як селективний маркерний ген використовували ген мутантного α-тубуліну, що забезпечував стійкість до трифлюраліну (гербіцид динітроанілінового ряду). Для встановлення селективної концентрації агенту було проведено скринінг різних концентрацій трифлюраліну в діапазоні від 0,1 до 30 мкМ. Після 2–3 місяців селекції на 10 мкМ трифлюраліну було отримано дві трансгенні лінії рослин ячменю сорту Оксамитовий та калусну лінію сорту Гетьман. Для підтвердження стабільної інтеграції гена hLF було проведено ПЦР аналіз листків рослин-регенерантів після їх адаптації в грунті. В обох лініях було ампліфіковано фрагмент гена розміром 734 п.н. Method of biolistic transformation was used for genetic improvement of commercial barley cultivars (Oksamitoviy, Vodogray and Getman). The plasmid pHLFTuBA was used for particle bombardment that consists of the hLF gene under the control of the barley glutelin B-1 promoter and a selectable marker gene, α-tubulin conferring resistance to trifluralin (dinitroanilinr herbicide). Preliminary screening of different trifluralin concentration range from 0,1 to 30 μM was tested for determination of effective selective agent concentration. Two transgenic barley line of genotype Oksamitiviy and transgenic callus line of cultivar Getman were obtained after selection on 10 μM of trifluralin. To confirm the transgenic nature of regenerated plants, the PCR analysis was carried out. The 734bp length fragment of hLF gene was amplified from both regenerated plants.
issn	0564-3783
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66817
citation_txt	Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена / И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко, В.И. Корховой, Н. Абумхади, Я.Б. Блюм // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 3-10. — Бібліогр.: 30 назв. — рос.
work_keys_str_mv	AT tanasienkoiv polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT emecai polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT pirkoâv polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT korhovoivi polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT abumhadin polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT blûmâb polučenietransgennyhliniiâčmenâproduciruûŝihlaktoferrinčelovekasispolʹzovaniemmutantnogoalʹfatubulinavkačestveselektivnogomarkernogogena AT tanasienkoiv otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT emecai otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT pirkoâv otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT korhovoivi otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT abumhadin otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT blûmâb otrimannâtransgennihlíníiâčmenûŝoprodukuûtʹlaktoferrinlûdiniízvikoristannâmmutantnogogenaalʹfatubulínuâkselektivnogomarkernogogena AT tanasienkoiv productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene AT emecai productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene AT pirkoâv productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene AT korhovoivi productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene AT abumhadin productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene AT blûmâb productionoftransgenicbarleylinesproducinghumanlactoferrinusingmutantalfatubulingeneasselectivemarkergene
first_indexed	2025-11-27T02:53:37Z
last_indexed	2025-11-27T02:53:37Z
_version_	1850792817387896832
fulltext	И.В. ТАНАСИЕНКО 1, А.И. ЕМЕЦ 1, Я.В. ПИРКО 1, В.И. КОРХОВОЙ 1, Н. АБУМХАДИ 2, Я.Б. БЛЮМ 1 1 Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины, Киев 2 AgroBioInstitute, Sofia, Bulgaria E-mail: alyemets@univ.kiev.ua ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЛИНИЙ ЯЧМЕНЯ, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ЛАКТОФЕРРИН ЧЕЛОВЕКА, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МУТАНТНОГО ГЕНА АЛЬФА�ТУБУЛИНА В КАЧЕСТВЕ СЕЛЕКТИВНОГО МАРКЕРНОГО ГЕНА Метод биолистической трансформации был исполь� зован для генетического усовершенствования трех ком� мерческих сортов ячменя отечественной селекции (Окса� мытовый, Водограй и Гетьман). Для трансформации использовали конструкцию pHLFTuBA, содержащую ген интереса, ген человеческого лактоферрина (hLF) под контролем глютелинового В�1 (GluB�1) промотора риса. В качестве селективного маркерного гена использовали ген мутантного α�тубулина, обеспечивающего устойчи� вость к трифлюралину (гербицид динитроанилинового ряда). Для установления селективной концентрации трифлюралина был проведен скрининг его разных кон� центраций в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ. После 2–3 ме� сяцев селекции на 10 мкМ трифлюралина были получены две трансгенные линии растений ячменя сорта Оксамы� товый и каллусная линия сорта Гетьман. Для подтвер� ждения стабильной интеграции гена hLF был проведен ПЦР�анализ листьев растений�регенерантов после их адаптации в грунте. В обеих линиях ячменя был амп� лифицирован фрагмент гена hLF размером 734 п.н. Введение. Биолистическая трансформация – один из важных методов генетического усо� вершенствования злаковых, поскольку позво� ляет привносить ген интереса в растительный материал независимо от его генетического ста� туса. Но несмотря на широкий спектр одно� дольных, используемых для различных моди� фикаций в процессе трансформации микро� частицами, одним из немаловажных аспектов эффективности генетических манипуляций является подбор оптимального исходного ма� териала. Для решения этой задачи ранее нами было осуществлено введение в культуру in vitro ряда коммерческих сортов ячменя отечествен� ной и зарубежной селекции, районированных на территории Украины, которые могут эф� фективно использоваться для выращивания в зонах Полесья, Лесостепи и Степи [1]. Кроме того, были разработаны эффективные методы регенерации этих сортов для последующей ге� нетической трансформации наиболее перс� пективных генотипов [1]. Поскольку злако� вые, в том числе и ячмень, занимают ведущие позиции на рынке зерна и являются неотъем� лемой частью рациона человека, а также в све� те острого дефицита продуктов продовольствия во многих странах мира, основными направле� ниями усовершенствования сельскохозяйствен� ных признаков данной культуры стало привне� сение устойчивости ячменя к ряду гербицидов [2–4], болезней [5, 6] и абиотическим стрес� сам [7]. Возможность же использования этого злака для производства рекомбинантных про� теинов, несмотря на перспективность данного подхода [8, 9], изучена незначительно. Предлагаемая в нашей работе система пред� полагает использование зерновки ячменя в ка� честве биореактора для накопления и хране� ния рекомбинантного человеческого белка лактоферрина. Этот протеин (известный так� же как лактотрансферрин), представитель се� мейства трансферринов [10], впервые был вы� делен из коровьего молока [11]. Дальнейшие исследования показали его наличие в грудном молоке, бронхиальных выделениях, слюне, но� совой и вагинальной слизи, сперме и желу� дочно�кишечном соке человека. Для этого мультифункционального белка характерен ши� рокий спектр биологической активности, в частности он проявляет антимикробное, проти� вовоспалительное и иммуномодулирующее дей� ствие. Большое значение имеют исследования ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 3 Оригинальные работы © А.И. ЕМЕЦ, И.В. ТАНАСИЕНКО, Я.В. ПИРКО, В.И. КОРХОВОЙ, Н. АБУМХАДИ, Я.Б. БЛЮМ, 2011 лактоферрина в области его использования как противоракового препарата для лечения лейкемии [12], фибросаркомы, меланомы и колонокарциномы [13]. На сегодняшний день с помощью методов генетической инженерии удалось получить экспрессию рекомбинант� ного лактоферрина человека (hLF) в микроб� ных [5, 14], животных [15] и растительных [16, 17] системах. Несмотря на столь широкий спектр иссле� дований этого белка, эффективную систему экспрессии удалось получить лишь у Aspergillus [18], однако она требует дополнительных ис� следований в области очистки целевого про� дукта, и у растений риса [19]. Что касается жи� вотных систем экспрессии, то они имеют ряд недостатков, таких как длительный процесс получения трансформантов, потенциальная возможность вирусного заражения, сложное материально�техническое обеспечение, доро� гостоящий процесс очистки [20]. Таким обра� зом, остается актуальным дальнейший поиск эффективной системы продукции лактофер� рина человека. Семена ячменя для этого отве� чают многим критериям, в частности накап� ливают большое количество белков и обеспе� чивают их длительное хранение. Важным аспектом получения большого ко� личества трансформированных целевым ге� ном растений является эффективная система селекции трансформантов. Первые работы по генетической трансформации ячменя были сфокусированы на использовании легко детек� тируемых маркерных генов, таких как gus ген, и селективных маркерных генов, обеспечива� ющих устойчивость к различным антибиоти� кам и гербицидам [28]. Несмотря на эффек� тивность данных систем селекции и длитель� ную историю их применения, использование подобных маркеров, несущих устойчивость к антибиотикам, в настоящее время подверже� но общественной критике. В связи с возник� шей ситуацией многие исследования были на� правлены на разработку новых методик селек� ции, исключающих внедрение в клетки�ре� ципиенты генов устойчивости к антибиоти� кам. Было рассмотрено два основных подхода: 1) удаление маркерных генов из генома транс� формированных растений после их регенера� ции; 2) разработка новых маркерных систем, базирующихся на альтернативных селектив� ных агентах [21]. Первый подход не нашел широкого приме� нения ввиду значительной трудоемкости и от� сутствия прогнозируемого результата [21]. Второй подход базировался на принципе мо� дификации селективного агента продуктом маркерного гена в компоненты, позитивно влияющие на трансформированные клетки, сопутствуя, таким образом, росту и развитию трансформированных регенерантов в сравне� нии с нетрансформированным материалом [21]. Совсем недавно нами была разработана принципиально новая система селекции, основанная на использовании исключительно генетической информации, изначально при� сутствующей в растительном геноме [22]. Бы� ли созданы векторные конструкции, где в ка� честве селективного маркерного гена исполь� зовали ген мутантного α�тубулина из гусиной травы (Eleusine indica L.), который обеспечива� ет устойчивость к динитроанилинам [22]. Эта система была успешно апробирована для по� лучения трансгенных линий табака, льна, пальчатого проса и сои [22]. В нашей работе была проведена биолисти� ческая трансформация коммерческих сортов ячменя Водограй, Гетьман и Оксамытовый ге� ном лактоферрина человека (hLF). В качестве селективного маркерного гена также был ис� пользован мутантный ген α�тубулина, обеспе� чивающий устойчивость к трифлюралину (гер� бицид динитроанилинового ряда). В качестве исходного материала для получения культуры эмбриогенного каллуса брали зрелые зароды� ши ячменя, что позволило интенсифициро� вать работу и избежать сезонной зависимости проведения экспериментов. Материалы и методы. Растительный мате� риал. В качестве эксплантов для получения эм� бриогенного каллуса использовали зрелые заро� дыши семян ячменя сортов Гетьман, Оксамы� товый и Водограй, любезно предоставленные сотрудниками Института земледелия НААН Украины. Введение в культуру in vitro и полу� чение каллусной ткани проводили согласно протоколу, разработанному нами ранее [1]. Создание конструкции. Для биолистичес� кой трансформации использовали плазмиду pHLFTuBA (рис. 1), содержащую ген человечес� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 14 И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко и др. кого лактоферрина hLF и селективный мар� керный ген мутантного α�тубулина. Ген лакто� феррина человека находился под контролем глютелинового В�1 (GluB�1) промотора риса, а также глютелинового терминатора, ген му� тантного α�тубулина (TuАm) гусиной травы – под контролем убихитинового (Ubi) промото� ра кукурузы. Трансформация и селекция. В работе ис� пользовали прибор для бомбардмента, кото� рый был собран в нашей лаборатории в соот� ветствии с ранее опубликованной схемой [23]. Для биолистической трансформации исполь� зовали эмбриогенный каллус ячменя. Для трансформации брали вольфрамовые частицы диаметром 0,7 мкм (Duchefa M10). Трансфор� мацию проводили согласно ранее разработан� ному протоколу [24]. Трансформированный материал высаживали на среду для каллусоге� неза и регенерации [1], дополненную 10 мкМ трифлюралина. Селективная концентрация агента была установлена в результате предва� рительного тестирования чувствительности клеточных линий к различным концентраци� ям указанного соединения в диапазоне от 0,1 до 30 мкМ. Для каждой концентрации ве� щества высаживали по 25 эксплантов (каллус� ная ткань) в трех повторностях. Спустя 45 дней снимали показатели относительного прироста массы ткани ячменя. Статистичес� кую обработку данных проводили согласно методу Лакина [25]. Молекулярно�генетический анализ. ПЦР�ана� лиз использовали для подтверждения транс� генной природы отселектированных линий ячменя. Для этого геномную ДНК из листьев трансгенных растений выделяли с помощью набора G2N10–1KT («Sigma», США). Наличие hLF�гена фиксировали в результате амплифи� кации фрагмента этого гена размером 734 п.н., используя пары праймеров GL�F (5’�TGTCTTC� CTCGTCCTGCTGTTCC�3’) и GL�R (5’�CAT� ACTCGTCCCTTTCAGCCTCG�3’). ПЦР про� водили на амплификаторе Thermal Cycler 2720 («Applied Biosystems», США). Реакционная смесь (объемом 25 мкл) содержала пяти� кратный ПЦР�буфер с сульфатом аммония («Helicon», Россия), 10–50 нг растительной ДНК, по 0,2 мкМ праймеров, по 200 мкМ dNTPs, 0,5 ед. Taq�полимеразы («Fermentas», Литва). Амплификацию проводили при сле� дующих условиях: первичная денатурация: один цикл – 94 °С (3 мин); 45 циклов при 94 °С (30 с), 62 °С (30 с), 72 °С (60 с); оконча� тельная полимеризация – 72 °С (7 мин). Про� дукты ПЦР разделяли в 1%�ном агарозном ге� ле и окрашивали этидиум бромидом. Результаты исследований и их обсуждение. Для биолистической трансформации исполь� зовали каллус, полученный из зрелых зароды� шей ячменя, что позволило значительно упростить и ускорить процесс получения и на� ращивания исходного материала. Эмбриоген� ный каллус ячменя трансформировали геном человеческого лактоферрина (hLF), который находился под контролем глютелинового В�1 промотора риса, что предположительно обес� печивает экспрессию упомянутого гена иск� лючительно в зерновках злака. Такой подход должен обеспечить высокий уровень экспрес� сии и накопления протеина, так как семена ячменя способны запасать значительные объе� мы белков (около 15 % массы зерновки) [9]. Другим немаловажным аспектом применения этой системы для продукции рекомбинантных белков является возможность длительного хра� нения целевого материала без потери его на� тивных свойств [9]. В связи с тем, что эффективность трансфор� мации растений напрямую связана с возмож� ностью эксплантов продуцировать эмбриоген� ную каллусную ткань и ее способностью к ре� генерации полноценных растений, были отоб� раны три сорта ячменя, характеризующихся высоким уровнем каллусообразования и реге� нерации полноценных растений (рис. 2). ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 5 Получение трансгенных линий ячменя Рис. 1. Схема Т�ДНК конструкции pHLFTuBA. LB и RB – левая и правая границы Т�ДНК, GluB�1 – глютелино� вый В�1 промотор риса, hLF – ген лактоферрина человека, Tglut – глютелиновый терминатор, PUbi – убихитино� вый промотор кукурузы, TuАm – ген мутантного α�тубулина, Nos3’– нопалиновый терминатор В качестве селективного маркерного гена использовали ген мутантного альфа�тубули� на, обеспечивающего устойчивость к герби� цидам динитроанилинового ряда. Ввиду того, что трифлюралин как один из самых выра� женных представителей этого класса герби� цидов отличается высоким сродством к рас� тительному тубулину в сравнении с животным [22], именно он был использован в качестве селективного агента. Несмотря на то, что рассматриваемая система селекции была ус� пешно протестирована на ряде модельных и представляющих коммерческую ценность объектов [22], нами был проведен скрининг концентраций трифлюралина в диапазоне от 0,1–30 мкМ (рис. 3 и 4) для селекции транс� форментов ячменя. В результате проведенных экспериментов было отмечено сильное ингибирование про� цессов регенерации и образование свеллинга корней и стеблей ячменя при высоких кон� центрациях трифлюралина (от 15 мкМ и вы� ше). Оптимальная концентрация для дальней� шего отбора трансформированного материала составляла 10 мкМ. При такой концентрации трифлюралина наблюдали значительное сни� жение уровня пролиферации клеток, но при этом отсутствовал свеллинг тканей. Воздействие селективного агента на транс� формированный материал становилось замет� ным только к концу первого месяца культиви� рования эксплантов на соответствующей среде. Наблюдалась также задержка развития корне� вой системы, в связи с чем после образования первых корешков трансгенных растений се� лективное давление на регенеранты убирали. После 2–3 месяцев селекции в присутствии 10 мкМ трифлюралина были получены три трансгенные линии растений ячменя сорта Оксамытовый (одна линия была утеряна во время адаптации) и каллусная линия сорта Гетьман. Клетки каллуса сорта Гетьман, полу� ченные после длительной селекции на три� флюралине, приобретали желтоватый оттенок (по сравнению с нативной культурой), сохра� няя при этом пролиферативную активность (рис. 5). В процессе дальнейшего культивиро� вания на каллусе указанного сорта формиро� вались зеленые почки с корнеподобными струк� турами (рис. 5). Данные морфологические образования сохраняли свою жизнеспособ� ность длительное время, однако полноценных фертильных растений не формировали. Кал� лусная ткань, не формирующая каких�либо морфологических образований, отличалась до� вольно сильной пролиферативной активнос� тью, однако образование побегов на ней не наблюдалось. Те полноценные растения�регенеранты, на которых формировалась развитая корневая система, высаживали в грунт и выращивали в условиях 16�часового фотопериода (рис. 6). Для подтверждения стабильной интеграции привнесенного гена был проведен ПЦР�ана� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 16 И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко и др. Рис. 2. Эффективность каллусообразования и регенера� ции растений (по вертикали, %) трех коммерческих сортов ячменя Рис. 3. Определение оптимальной концентрации селек� тивного агента трифлюралина (по горизонтали, мкМ); по вертикали – относительный прирост массы эксплан� тов, % лиз листьев растений�регенерантов, адапти� рованных в грунте. ПЦР�анализ подтвердил наличие фрагмента гена hLF в клетках�мише� нях (рис. 5). Ввиду присутствия в злаковых нативного глютелинового промотора была проведена амплификация специфического фрагмента гена hLF, чтобы исключить воз� можность неспецифической амплификации промотора. Сходные данные по эффективности транс� формации материала, полученного из зрелых семян, были опубликованы ранее. Так, было получено два полноценных трансформанта сорта Харрингтон, несущих ген bar [16]. Не� сколькими годами ранее были получены два трансформанта коммерческого сорта Харуна Найо и четыре растения сорта Дисса из незре� лых зародышей ячменя [26]. Более высокая эффективность трансформации была у сорта Баронесса (пять трансгенных растений), в то время как модельный сорт Голден Промис про� демонстрировал сравнительно низкий уровень трансформации (два трансгенных растения) [27]. Был опубликован протокол получения трансформированных растений�регенерантов из незрелых зародышей ячменя с использова� нием сорта Харингдон, эффективность транс� формации которого также не превышала двух трансгенных растений, и сорта Голден Промис, эффективность трансформации которого сос� тавляла четыре трансгенных регенеранта [28]. Сходная эффективность регенерации бы� ла получена и на модельном сорте Конлон ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 7 Получение трансгенных линий ячменя Рис. 4. Влияние различных концентраций трифлюралина на рост каллусной культуры сор� та Гетьман: а – контроль, б – 0,1 мкМ, в – 5 мкМ, г – 10 мкМ, д – 20 мкМ, е – 30 мкМ. Бар – 1 см Биолистическая трансформация разных сортов ячменя геном лактоферрина человека Сорта эксплан� тов устойчи� вых к трифлю� ралину линий регенери� ровавших растений растений, экспрес� сирующих ген hLF Оксамытовый Водограй Гетьман 100 100 100 3 – 10 2 – – 2 – * * Каллусные линии сорта Гетьман не были тестированы с помощью ПЦР�анализа, ввиду низкого выхода кон� центрации ДНК при выделении китом G2N10�1KT («Sigma», США). Количество, шт. [29]. Трансформация каллусной ткани, полу� ченной из незрелых зародышей модельного сорта Голден Промис, также не отличалась вы� соким уровнем эффективности трансфор� мации (три растения�регенеранта), при этом наблюдали образование значительного коли� чества хлорофилл�дефектных растений [30]. Обойти проблему регенерации хлорофилл� дефектных растений удалось несколькими го� дами позже путем изменения концентрации селективного агента или при использовании метода ступенчатой селекции [28]. В нашей работе не было зафиксировано хлорофилл� дефектных растений ни во время изучения регенерационного потенциала используемых в работе сортов [1], ни во время трансформа� ции и селекции трансгенных линий. Таким образом, в настоящей работе осущест� влена эффективная биолистическая трансфор� мация ячменя целевым геном лактоферрина (hLF) с применением новой системы селекции, базирующейся на использовании мутантного гена α�тубулина в качестве селективного мар� керного гена. Результаты ПЦР�анализа подтвер� дили стабильную интеграцию гена (hLF) в клетки мишени. І.V. Таnasienko, А.І. Yemets, Y.V. Pirko, V.І. Коrhkovyy, N. Аbumhadi, Ya.B. Blume PRODUCTION OF TRANSGENIC BARLEY LINES PRODUCING HUMAN LACTOFERRIN USING MUTANT ALFA�TUBULIN GENE AS SELECTIVE MARKER GENE Method of biolistic transformation was used for genetic improvement of commercial barley cultivars (Oksamitoviy, Vodogray and Getman). The plasmid pHLFTuBA was used for particle bombardment that consists of the hLF gene under the control of the barley glutelin B�1 promoter and a selectable marker gene, α�tubulin conferring resistance to trifluralin (dinitroanilinr herbicide). Preliminary screening of different trifluralin concentration range from 0,1 to 30 μM was tested for determination of effective selective agent concentration. Two transgenic barley line of genotype Oksamitiviy and transgenic callus line of cultivar Getman were obtained after selection on 10 μM of trifluralin. To confirm the transgenic nature of regenerated plants, the PCR analysis was carried out. The 734bp length fragment of hLF gene was amplified from both regenerated plants. І.В. Танасієнко, А.І. Ємець, Я.В. Пірко, В.І. Корховий, Н. Абумхаді, Я.Б. Блюм ОТРИМАННЯ ТРАНСГЕННИХ ЛІНІЙ ЯЧМЕНЮ, ЩО ПРОДУКУЮТЬ ЛАКТОФЕРРИН ЛЮДИНИ, ІЗ ВИКОРИСТАННЯМ МУТАНТНОГО ГЕНА АЛЬФА�ТУБУЛІНУ ЯК СЕЛЕКТИВНОГО МАРКЕРНОГО ГЕНА Метод біолістичної трансформації використовува� ли для генетичного вдосконалення трьох комерційних ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 18 И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко и др. Рис. 6. ПЦР�анализ трансгенных линий ячменя, не� сущих ген лактоферрина человека (hLF): М – маркер, «+» – плазмида pHLFTuBA (позитивный контроль), 1 – негативный контроль; 2 – нетрансформированный яч� мень (негативный контроль); 3, 5, 7 – трансформиро� ванные линии ячменя, полученные вследствие селекции на трифлюралине; 4, 6 – вода Рис. 5. Результаты селекции трансгенных линий яч� меня на 10 мкМ трифлюралина: а – каллусная линия сорта Гетьман с зелеными почкообразными структура� ми; б – селекция каллусной ткани сорта Оксамытовый; в – укоренение растения�регенеранта сорта Оксамыто� вый; г – трансгенное растение сорта Оксамытовый в условиях теплицы. Бар – 1 см сортів ячменю вітчизняної селекції (Оксамитовий, Во� дограй і Гетьман). Для трансформації використовували конструкцію pHLFTuBA, що містила ген інтересу, ген людського лактоферину (hLF) під контролем глютелі� нового В�1 (GluB�1) промотору рису. Як селективний маркерний ген використовували ген мутантного α�ту� буліну, що забезпечував стійкість до трифлюраліну (гербіцид динітроанілінового ряду). Для встановлення селективної концентрації агенту було проведено скри� нінг різних концентрацій трифлюраліну в діапазоні від 0,1 до 30 мкМ. Після 2–3 місяців селекції на 10 мкМ трифлюраліну було отримано дві трансгенні лінії рос� лин ячменю сорту Оксамитовий та калусну лінію сорту Гетьман. Для підтвердження стабільної інтеграції гена hLF було проведено ПЦР�аналіз листків рослин�реге� нерантів після їх адаптації в грунті. В обох лініях було ампліфіковано фрагмент гена розміром 734 п.н. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Танасиенко И.В., Емец А.И., Блюм Я.Б. Оценка эф� фективности каллусообразования и регенерации яровых сортов ячменя, районированных на терри� тории Украины // Цитология и генетика. – 2009. – 43, № 4. – C. 12–19. 2. Farago J., Nemcova, L. Regeneration of bialaphos resistant plants after biolistic transformation of two commercial cultivars of spring barley (Hordeum vulgare L.) grown in Slovakia // Vedecke�Prace. – 2001. – 30. – Р. 169–176. 3. Manoharan M., Dahleen L.S. Genetic transformation of commercial barley (Hordeum vulgare L.) cultivar Conlon by particle bombardment of callus // Plant Cell Rep. – 2002. – 21. – P. 76–80. 4. Assem S.K., Hussein Ebtissam H.A., Saad M.E., El�Itriby H.A., Madkour M.A. Comparison of the efficiency of some novel maize promoters in monocot and dicot plants // Arab J. Biotech. – 2002. – 5. – P. 57–66. 5. Wang M., Abbott D., Upadhyaya N., Jacobsen J., Waterhouse P. Agrobacterium tumefaciens�mediated transformation of an elite Australian barley cultivar with virus resistance and reporter genes // Aust. J. Plant Physiol. – 2001. – 28. – P. 149–156. 6. Sharma V., Monostori T., Gobel C., Hansch R., Bittner F., Wasternack C., Feussner I., Mendel R., Hause B., Schulze J. Transgenic barley overexpressing a 13�lipoxy� genase to modify oxylipin signature // Phytochemistry. – 2006. – 67. – P. 264–276. 7. Delhaize E., Ryan P., Hebb D., Yamamoto Y., Sasaki T., Matsumoto H. Engineering high�level aluminum toler� ance in barley with the ALMT1 gene // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2004. – 101. – P. 15249–15254. 8. Dahleen L.S., Manoharan M. Recent advances in barley transformation // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 2007. – 43. – P. 493–506. 9. Ritala A., Wahlstrom E., Holkeri H., Malkelainrn K., Baez J., Makinen K., Nuutila A. Production of recom� binant industrial protein using barley cell cultures // Protein Exp. Purif. – 2008. – 59. – P. 274–281. 10. Adlerova L., Bartoskova A., Faldyna M. Lactoferrin: a review // Vet. Med. – 2008. – 53. – P. 457–468. 11. Sorensen M., Sorensen S. The proteins in whey // Comptes�rendus des Travaux du Laboratoire Carlsberg. – 1939. – 23. – P. 55–99. 12. Yoo Y., Watanabe R., Koike Y., Mitobe M., Shimazaki K, Watanabe S. Apoptosis in human leukemic cells induced by lactofer�ricin, a bovine milk protein�derived peptide: involvement of reactive oxygen species. Biochem. Biophys. Res. Communs. – 1997. – 237. – P. 624–628. 13. Eliassen L.T., Berge G., Sveinbjornsson B., Svendsen J.S., Vorland L.H., Rekdal O. Evidence for a direct anti� tumor mechanism of action of bovine lactoferricin // Anticancer Res. – 2002. – 22. – P. 2703–2710. 14. Liang Q., Richardson T. Expression and characterization of human lactoferrin in yeast Saccharomyces cerevisiae // J. Agr. Food Chem. – 1993. – 41. – P. 1800– 1807. 15. Van Berkel H., Nuijens H., Van Veen A., Abrahams P., Thomassen J. The protein structure of recombinant human lactoferrin produced in the milk of transgenic cows closely matches the structure of human milk� derived lactoferrin // Transgenic Res. – 2005. – 14. – P. 397–405. 16. Zhang Z., Coyne P., Vidaver K., Mitra A. Expression of human lactoferrin cDNA confers resistance to Ralstonia solanacearum in transgenic tobacco plants // Phyto� pathology. – 1998. – 88. – P. 730–734. 17. Anzai H., Takaiwa F., Katsumata K. Production of human lactoferrin in transgenic plants // Lactoferrin: Structure, Function and Applications / Eds K. Shimaza� ki, H. Tsuda, M. Tomita, T. Kuwata, P. Perraudin. – Amsterdam : Elsevier, 2000. – P. 265–271. 18. Ward P., Piddington C., Cunningham G., Zhou X., Wyatt R., Conneely O. A system for production of commercial quantities of human lactoferrin: a broad spectrum natu� ral antibiotic // Biotechnol. – 1995. – 13. – P. 498–503. 19. Nandi S., Yalda D., Lu S., Nikolov Z., Fujiyama K., Huang N. Process development and economic evolution of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain // Transgenic Res. – 2005. – 14. – P. 237– 249. 20. Stefanova G., Vlahova M., Atanassov A. Production of recombinant human lactoferrin from transgenic plants // Biol. Plant. – 2008. – 52. – P. 423–428. 21. Chen I., Thiruvengadam V., Lin W.�D., Chang H.�H., Hsu W.�H. Lysine racemase: a novel non�antibiotic selectable marker for plant transformation // Plant Mol. Biol. – 2009. – 72. – P. 153–169. 22. Yemets A., Radchuk V., Bayer O., Bayer G., Pakhomov A., Vance Baird W., Blume Y.B. Development of transfor� mation vectors based upon a modified plant alpha�tubu� lin gene as the selectable marker // Cell Biol. Int. – 2008. – 32. – P. 566–570. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 9 Получение трансгенных линий ячменя 23. Finer J., Vain P., Jones M., McMullen M. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells // Plant Cell Rep. – 1992. – 11. – P. 232–238. 24. Abumhadi N., Trifonova A., Takumi S., Nakamura C., Todorovska E., Getov L., Christov N., Atanassov A. Development of the particle inflow gun and optimizing the particle bombardment method for efficient genetic transformation in mature embryos of cereals // Biotechnol. Biotec. Eq. – 2001. – 15. – P. 87–96. 25. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высшая школа, 1990. – C. 352. 26. Hagio T., Hirabayashi T., Machii H., Tomotsune H. Production of fertile transgenic barley (Hordeum vul� gare L.) plant using the hygromycin�resistance marker // Plant Cell Rep. – 1995. – 14. – P. 329–334. 27. Ahlandsberg S., Sathish P., Sun C., Jansson C. Green flu� orescent protein as a reporter system in the transforma� tion of barley cultivars // Physiol. Plant. – 1999. – 107. – P. 194–200. 28. Cho M.�J., Jiang W., Lemaux G. Transformation of recalcitrant barley cultivars through improvement of regenerability and decreased albinism // Plant Sci. – 1998. – 138. – P. 229–244 29. Tobias D., Manoharan M., Pritsch C., Dahleen L. Co� bombardment, integration and expression of rice chiti� nase and thaumatin�like protein genes in barley (Hordeum vulgare cv. Conlon) // Plant Cell Rep. – 2007. – 26. – P. 631–639. 30. Wan Y., Lemaux P.G. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plant // Plant Physiol. – 1994. – 104. – P. 37–48. Поступила 10.09.09 ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 110 И.В. Танасиенко, А.И. Емец, Я.В. Пирко и др.

Получение трансгенных линий ячменя, продуцирующих лактоферрин человека, с использованием мутантного альфа-тубулина в качестве селективного маркерного гена

Institution

Ähnliche Einträge