Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6

Определены условия трансформации цикория Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 из Mycobacterium tuberculosis, которые обеспечивают наибольшую частоту регенерации зеленых растений с трансформированной ДНК. При культивировании семядолей в течение 3 сут без цефотаксима и затем 1 сут без канамицина...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Опубліковано в: :	Цитология и генетика
Дата:	2011
Автори:	Матвеева, Н.А., Василенко, М.Ю., Шаховский, А.М., Банникова, М.А., Кваско, О.Ю., Кучук, Н.В.
Формат:	Стаття
Мова:	Російська
Опубліковано:	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України 2011
Теми:	Оригинальные работы
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66818
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6 / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, М.А. Банникова, О.Ю. Кваско, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 11-17. — Бібліогр.: 46 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

_version_	1859665098521444352
author	Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Банникова, М.А. Кваско, О.Ю. Кучук, Н.В.
author_facet	Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Банникова, М.А. Кваско, О.Ю. Кучук, Н.В.
citation_txt	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6 / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, М.А. Банникова, О.Ю. Кваско, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 11-17. — Бібліогр.: 46 назв. — рос.
collection	DSpace DC
container_title	Цитология и генетика
description	Определены условия трансформации цикория Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 из Mycobacterium tuberculosis, которые обеспечивают наибольшую частоту регенерации зеленых растений с трансформированной ДНК. При культивировании семядолей в течение 3 сут без цефотаксима и затем 1 сут без канамицина частота трансформации составляла 86 %. По результатам ПЦР-анализа все растения имели как селективный ген nptII, так и ген esxA туберкулезного антигена ESAT6. В то же время анализ обратных транскриптов показал, что хотя ген nptII транскрибировался у всех восьми анализированных растений, обратные транскрипты целевого гена esxA обнаружены только у пяти. The conditions of high efficient chicory transformation with Mycobacterium tuberculosis antigene ЕSAT6 have been determined. Transformation frequency was up to 86 % when the cotyledons were cultivated within 3 days without cefotaxime and then 1 day without kanamycine. DNA PCR-analysis has shown the presence both of selective nptII and target esxA genes in all analysed plants. At the same time RT-PCR has shown the presence of nptII transcripts for eight analysed lines and esxA transcripts for only five analysed lines. Визначено умови трансформації цикорію Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 Mycobacterium tuberculosis, що забезпечують найбільшу частоту регенерації зелених рослин із трансформованою ДНК. При культивуванні сім’ядоль протягом 3 діб без цефотаксиму та потім одну добу без канаміцину частота трансформації становила 86 %. За результатами ПЛР-аналізу рослини мали як селективний ген nptII, так і ген esxА туберкульозного антигена ESAT6. У той же час аналіз зворотних транскриптів показав, що хоча ген nptII транскрибувався у всіх восьми аналізованих рослин, зворотні транскрипти цільового гена esxА виявлені тільки у п’яти рослин.
first_indexed	2025-11-30T10:30:01Z
format	Article
fulltext	УДК 575.222.7:581.1 Н.А. МАТВЕЕВА, М.Ю. ВАСИЛЕНКО, А.М. ШАХОВСКИЙ, М.А. БАННИКОВА, О.Ю. КВАСКО, Н.В. КУЧУК Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев E(mail: joyna56@gmail.com ЭФФЕКТИВНАЯ АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ ЦИКОРИЯ (CICHORIUM INTYBUS L.) ВЕКТОРОМ С ГЕНОМ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ЕSAT6 Определены условия трансформации цикория Cicho� rium intybus L. геном антигена ESAT6 из Mycobacterium tuberculosis, которые обеспечивают наибольшую частоту регенерации зеленых растений с трансформированной ДНК. При культивировании семядолей в течение 3 сут без цефотаксима и затем 1 сут без канамицина частота трансформации составляла 86 %. По результатам ПЦР� анализа все растения имели как селективный ген nptII, так и ген esxA туберкулезного антигена ESAT6. В то же время анализ обратных транскриптов показал, что хотя ген nptII транскрибировался у всех восьми анализирован� ных растений, обратные транскрипты целевого гена esxA обнаружены только у пяти. Введение. Туберкулез занимает среди инфек� ционных болезней одно из первых мест в мире по показателям заболеваемости и смертности. Разработаны химиотерапевтические методы лечения туберкулеза, однако регистрируются случаи резистентности микобактерий к ис� пользуемым лекарственным средствам [1]. Поэтому проблема профилактики заболевания стоит достаточно остро. Эффективным сред� ством профилактики туберкулеза служит вак� цинация. В 1919 г. Альберт Кальметт и Ка� миль Герен впервые создали вакцину против туберкулеза (Bacillus Calmette� Guerin, BCG), использовав Mycobacterium bovis, однако эта вакцина не всегда эффективна [2]. Поэтому значительный интерес представляет создание новых антитуберкулезных вакцин, разработка которых активно проводится в последние 15 лет [3–6]. К ним относятся, в частности, вакцины, созданные на основе мутантных штаммов, аттенуированные, рекомбинантные, ДНК�вакцины [1, 7]. Создаваемые вакцины содержат белки М. tuberculosis (30�kD�секре� торный белок, ESAT6, Ag85А, Ag85B, CFP10), отсутствующие в вакцине БЦЖ [8–10], кото� рые обеспечивают возникновение стойкого иммунитета [1, 11]. Эффективность вакцин, содержащих указанные белки, подтверждена рядом исследований. Показано, что иммуни� зация мышей антигенами Ag85A и Ag85B из культуры M. tuberculosis приводила к увели� чению концентрации интерлейкина IL�2 и γ� интерферона, а также к существенной защите легких от микобактерий [12]. Лечение инфи� цированных M. tuberculosis мышей ДНК�вак� циной с белками Ag85B и MPT64 приводило к повышению содержания γ�интерферона и TNF�α, причем поражение тканей легких у иммунизированных мышей было незначи� тельным [13]. Бактериальные и вирусные антигены могут синтезироваться в растениях, что было пока� зано еще в конце 90�х годов XX ст., в частности, на трансгенных растениях табака, экспресси� рующих поверхностный антиген вируса гепа� тита В [14], а также другими исследованиями [15–18]. Антигены растительного происхож� дения идентичны бактериальным и обладают высокой иммуногенной активностью [19–21]. В желудочно�кишечном тракте они не подвер� гаются действию протеолитических фермен� тов, так как защищены клеточными стенками. ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 11 © Н.А. МАТВЕЕВА, М.Ю. ВАСИЛЕНКО, А.М. ШАХОВСКИЙ, М.А. БАННИКОВА, О.Ю. КВАСКО, Н.В. КУЧУК, 2011 Показано, например, что белок LTB�ESAT6, синтезированный в растениях, индуцировал ан� тиген�специфический ответ [22]. Создание так называемых съедобных вак� цин на основе трансгенных растений представ� ляет одно из направлений биотехнологии. Преимуществами этих вакцин являются отно� сительно низкая стоимость производства, воз� можность длительного хранения (например, в семенах трансформированных растений), от� сутствие дорогостоящих этапов выделения и очистки [23]. Съедобные вакцины могут найти применение как в медицине, так и ветерина� рии [21, 24–28]. В ряде работ приведены иссле� дования возможности синтеза туберкулезных антигенов в растительных системах, напри� мер, в растениях табака [29] и арабидопсиса [30], причем количество синтезируемого белка может быть достаточно высоким. Например, концентрация туберкулезного антигена Ag85B в Nicotiana benthamiana составляла 800 мг на 1 кг массы листьев [31]. Растительным объектом, который может быть использован для создания съедобных вакцин, является цикорий. Листовой цикорий Cichorium intybus L. var. foliosum является не только пищевой культурой, содержащей вита� мины, микроэлементы, но и лекарственным растением, антигепатотоксические, притиво� язвенные, противовоспалительные, кардиото� нические свойства которого обусловлены на� личием инулина, кумаринов, флавоноидов [32–34]. В культуре in vitro показана высокая регене� рационная способность цикория [35– 37], что дает возможность с высокой эффективностью осуществлять процесс генетической транс� формации [38, 39]. Нами цикорий сорта Пала росса был ис� пользован в качестве объекта для получения трансгенных растений с геном туберкулезного антигена ESAT6. Материалы и методы. Исходным материа� лом для исследований являлись семена цико� рия сорта Пала росса (агрофирма «Елітсортна� сіння», Украина). Семена стерилизовали в те� чение 1 мин в 70%�ном этаноле и 10 мин в 25%�ном растворе коммерческого препарата «Білизна» (НПФ «Біолайт», Украина), промы� вали дистиллированной водой (60 мин). Сте� рильные семена проращивали на агаризован� ной среде MS [40] при 16�часовом световом фотопериоде и температуре 24 °С. Для создания бинарного вектора с геном секреторного белка ESAT6 (рис. 1) использова� ли вектор pCambia1300 с клонированной пос� ледовательностью esxA, который был любезно предоставлен д�ром биол. наук Ю.Л. Дорохо� вым (Институт физико�химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломо� носова, РФ). ДНК исходных плазмид гидро� лизовали эндонуклеазами NcoI и XbaI. После электрофоретического разделения продуктов гидролиза в агарозном геле осуществляли эк� страгирование и очистку фрагментов 7886 и 306 п.н., которые соответствуют NcoI�XbaI фрагментам линейного вектора pICBV16 и последовательности ESAT6. Далее проводили реакцию лигирования Т4�ДНК лигазой очи� щенных фрагментов векторов pICBV16 и ESAT6 и получали бинарный вектор pCB063. Частью лигазной смеси трансформировали компетентные клетки E. coli штамма XL1� Blue, из полученных колоний выделяли плаз� мидную ДНК и проводили ее анализ. Векто� ром, проверенным рестриктным картировани� ем, трансформировали бактерии Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101, которые в даль� нейшем использовали для трансформации растений (рис. 1). Трансформацию проводили путем инкуби� рования семядолей цикория (по 30 в каждом варианте) в суспензии Agrobacterium tumefa� ciens штамма GV3101. Бактерии предваритель� ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 112 Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский и др. Рис. 1. Схема Т�ДНК плазмидного вектора рСВ063: LB, RB – левая и правая границы Т�ДНК; nptII – ген неоми� цинфосфотрансферазы II; esxA – ген esxA туберкулезного антигена ESAT6; NOSpro – промотор гена нопалинсин� тазы; NOSter – терминатор гена нопалинсинтазы; 35Spro – промотор гена 35S�белка из генома вируса мозаики цветной капусты; OCSter – терминатор гена октопинсинтазы но выращивали на среде LB [41] с антибиоти� ками (100 мг/л карбенициллина, 50 мг/л риф� ампицина) на ротационном шейкере (200 об./ мин) при температуре 28 °С. Клетки осаждали центрифугированием (300 g, 10 мин), ресус� пендировали в 10 мМ растворе MgSO4. Семя� доли инкубировали в суспензии 30 мин, промо� кали фильтровальной бумагой и культивиро� вали в чашках Петри на агаризованной среде MS в течение 2 сут. Затем экспланты переноси� ли на агаризованную среду MS с 2,5 мг/л кине� тина (DUCHEFA Biochemie B.V., Нидерланды) и 0,5 мг/л α�нафтилуксусной кислоты (НУК) (DUCHEFA Biochemie B.V., Нидерланды) (сре� да S�1) с 25 мг/л канамицина («Киевмедпрепа� рат», Украина) и 500 мг/л цефотаксима («Дар� ница», Украина), а через 1 мес – на среду MS с 0,5 мг/л кинетина, 0,05 мг/л НУК (среда S�2), 25 мг/л канамицина (Km) и 500 мг/л цефотак� сима (Cf). Регенерированные растения укоре� няли на среде MS с антибиотиками в тех же концентрациях. Частоту трансформации услов� но определяли как процентное отношение ко� личества эксплантов с регенерированными на селективной среде зелеными растениями к об� щему количеству эксплантов. Геномную ДНК выделяли по стандартной методике из листьев асептических растений [42]. Для ПЦР�анализа присутствия гена nptII (размер амплифицированного фрагмента 622 п.н.) использовали праймеры 5'�cctgaat� gaactccaggacgaggca�3' и 5'�gctctagatccagagtcccgctca� gaag�3', гена esxA (299 п.н.) – 5'�ctgaccatggcagagcag� cagtggaatttcgc�3', 5'�gagaattctgcgaacatcccagtgctcg� 3'. Амплификацию осуществляли на амплифи� каторе Mastercycler personal 5332 (Eppendorf). Реакционная смесь общим объемом 20 мкл со� держала однократный ПЦР�буфер с сульфатом аммония, 10–50 нг растительной ДНК, по 0,2 мкМ праймеров, по 200 мкМ нуклеозидтри� фосфатов, 0,5 ед. Taq�полимеразы. Амплифи� кацию проводили в таких условиях: первичная денатурация – 94 °С, 3 мин, 30 циклов (94 °С, 30 с; 60 °С, 30 с; 72 °С, 30 с), окончательная полимеризация – 72 °С, 5 мин [43]. Предварительно обработанные ДНКазой I, свободной от РНКазы, препараты суммарной РНК использовали в качестве матрицы для синтеза первой цепи кДНК (обратных транс� криптов). Синтез осуществляли с помощью на� бора реактивов «Fermentas» (Литва) по инст� рукции фирмы�изготовителя, при этом для каждой пробы РНК проводили две параллель� ные реакции – в присутствии обратной транс� криптазы и в ее отсутствие. Результаты исследований и их обсуждение. Для трансформации, которую осуществляли путем кокультивирования эксплантов с A. tumefaciens, использовали семядоли 10–12�дневных про� ростков, на которых предварительно делали по� перечные надрезы. Векторная конструкция pCB063 имела селективный ген nptII (не� омицинфосфотрансферазы II), определяющий устойчивость к канамицину [44]. Селекцию ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 13 Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория Таблица 1 Время роста эксплантов на среде без антибиотиков в вариантах эксперимента Время роста, сут без цефотаксима без канамицина Номер варианта эксперимента 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 7 14 1 7 14 1 7 14 трансгенных растений проводили на среде, содержавшей 25 мг/л канамицина, так как ра� нее нами было показано, что такая концентра� ция антибиотика является селективной [39]. Процесс трансформации с помощью A. tume� faciens состоит из нескольких этапов: прикреп� ление бактерии к стенке растительной клетки, проникновение Т�ДНК внутрь клетки расте� ния, интеграция Т�ДНК в геном и экспрессия Т�ДНК. Факторами, определяющими частоту и эффективность трансформации, являются время культивирования с агробактерией в отсутствие антибиотика, подавляющего ее рост (в данном случае цефотаксима), время, в течение которого отсутствует селективное давление (культивирова� ние без канамицина), а также регенерацион� ная способность трансформируемого растения. Известно, что чем больше частота регенера� ции, тем больше вероятность получения рас� тений с трансформированной ДНК. В частнос� ти, ранее нами было показано, что частота трансформации салата конструкциями рСВ063 и рСВ064 зависит от регенерационной способ� ности растений [43]. В связи с этим в экспери� ментах нами был использован сорт листового цикория Пала росса, частота регенерации рас� тений у которого составляла 100 % [39]. Для определения условий, дающих возмож� ность с максимальной эффективностью прово� дить трансформацию вектором рСВ063, после культивирования в бактериальной суспензии экспланты переносили на среду без цефотакси� ма на 1, 2, 3 сут и далее на среду без канамици� на – на 1, 7, 14 сут (варианты № 1–9, табл. 1). Показано, что наименьшая частота регене� рации зеленых растений наблюдается при ми� нимальном времени культивирования без ан� тибиотиков в вариантах № 1 и 4 (рис. 2). При увеличении времени роста эксплантов без селективного давления с 1 до 7 или 14 сут количество эксплантов с регенерировавшими зелеными растениями увеличивалось, причем эта величина практически не зависела от вре� мени культивирования на среде без цефотакси� ма – 1 или 2 сут (рис. 2, варианты 2, 3, 5, 6). Увеличение времени роста в отсутствие це� фотаксима, подавляющего рост агробактерий, с 1 до 3 сут (вариант № 7) приводило к значи� тельному повышению частоты регенерации зе� леных растений (с 0 до 86 %). Очевидно, при� чина такого явления в том, что при этом сущес� твенно увеличивается вероятность проникнове� ния агробактерий в клетку, последующего пере� носа трансформирующей ДНК и ее встраивания в растительный геном. В то же время при уве� личении продолжительности периода, в котором ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 114 Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский и др. Рис. 2. Зависимость частоты регенерации зеленых рас� тений от условий трансформации: по вертикали – час� тота регенерации зеленых растений, %; по горизонта� ли – варианты эксперимента Рис. 3. Зависимость количества зеленых растений, ко� торые регенерировали после трансформации вектором рСВ063, от условий трансформации: по вертикали – количество зеленых растений, шт.; по горизонтали – варианты эксперимента Рис. 4. Регенерация трансгенных растений, устойчивых к канамицину, в вариантах эксперимента № 1 (а) и № 7 (б, в) отсутствует селективное давление, частота ре� генерации зеленых растений уменьшалась, при� чем наблюдался также рост белых (чувствитель� ных к канамицину) растений. Аналогичную тенденцию наблюдали в изме� нении количества зеленых растений. Так, ми� нимальное количество (0–11 растений) сформи� ровалось в вариантах № 1 и 4, а максимальное (85) – в варианте № 7 (рис. 3 и 4). Для каждого из вариантов эксперимента анализировали по 2–3 зеленых растения. По� казано, что все растения были трансгенными, имели как целевой, так и селективный гены (рис. 4, табл. 2). На присутствие обратных транскриптов вы� борочно анализировали 8 растений, имевших селективный и целевой гены. Ген nptII транс� крибировался во всех растениях, в то время как в трех из восьми растений транскрипция целе� вого гена не детектировалась (рис. 5). Так называемое «молчание генов» встреча� ется при трансформации ядерной ДНК и может возникнуть в случае присутствия в раститель� ном геноме последовательности ДНК, гомоло� гичной переносимому гену, при встраивании большого числа копий гена на геном, метилиро� вании перенесенной последовательности ДНК, образовании ДНК�дуплекса повторяю� щихся генов [45, 46]. Вместе с тем транскрипция как целевого, так и селективного генов более чем у 50 % анализированных растений позволя� ет считать возможным использование метода агробактериальной трансформации для полу� чения растений цикория с геном туберкулез� ного антигена ESAT6. Таким образом, определены условия транс� формации цикория конструкцией рСВ063, обеспечивающие наибольшую частоту регене� рации зеленых растений и наибольшее коли� чество растений с трансформированной ДНК. Эффективная трансформация достигалась при культивировании семядольных эксплан� тов в течение 3 сут без цефотаксима и затем 1 сут без канамицина. При этом частота транс� формации составляла 86 %, а количество транс� генных растений – 4–5 на эксплант. Прове� денный ПЦР�анализ показал, что как селек� тивный, так и целевой гены присутствовали во всех анализированных растениях. В то же время в результате анализа обратных транс� криптов оказалось, что хотя ген nptII транс� крибировался у всех восьми анализированных растений, обратные транскрипты целевого ге� на esxA обнаружены только у пяти растений. N.A. Matvieieva, M.Y. Vasylenko, А.М. Shahovsky, M.O. Bannykova, O.Y. Kvasko, N.V. Kuchuk EFFECTIVE AGROBACTERIUM�MEDIATED TRANSFORMATION OF CHICORY (CICHORIUM INTYBUS L.) WITH MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ANTIGENE ЕSAT6 The conditions of high efficient chicory transformation with Mycobacterium tuberculosis antigene ЕSAT6 have been ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 15 Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория Таблица 2 Результаты ПЦР�анализа растений цикория, которые получены после трансформирования плазмидой рСВ063 Вари� ант эк� спери� мента Получено Всего ПЦР– esxAnptII ПЦР+ esxAnptII Количество зеленых растений 0 20 ± 3,3 15 ± 2,4 3,67 ± 0,5 14 ± 2,8 15 ± 5,6 28,3 ± 2,1 13 ± 2,4 15,3 ± 7,7 – 2 2 – 2 2 3 3 3 – 2 2 – 2 2 3 3 3 – 2 2 – 2 2 3 3 3 – 0 0 – 0 0 0 0 0 – 0 0 – 0 0 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Рис. 5. ПЦР�анализ обратных транскриптов и геномной ДНК растений цикория, трансформированных векто� ром pCB063: М – маркер; DNA – ДНК трансгенного растения; К – ДНК контрольного растения; RT– и RT+ – от�ПЦР в отсутствие ревертазы и при ее нали� чии; nptII – ген неомицинфосфотрансферазы II; esxA – ген туберкулезного антигена ESAT6 determined. Transformation frequency was up to 86 % when the cotyledons were cultivated within 3 days without cefo� taxime and then 1 day without kanamycine. DNA PCR� analysis has shown the presence both of selective nptII and target esxA genes in all analysed plants. At the same time RT�PCR has shown the presence of nptII transcripts for eight analysed lines and esxA transcripts for only five analysed lines. Н.А. Матвєєва, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховський, М.О. Банникова, О.Ю. Кваско, М.В. Кучук ЕФЕКТИВНА АГРОБАКТЕРІАЛЬНА ТРАНСФОРМАЦІЯ РОСЛИН ЦИКОРІЮ (CICHORIUM INTYBUS L.) ВЕКТОРОМ З ГЕНОМ ТУБЕРКУЛЬОЗНОГО АНТИГЕНА ЕSAT6 Визначено умови трансформації цикорію Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 Mycobacterium tubercu� losis, що забезпечують найбільшу частоту регенерації зелених рослин із трансформованою ДНК. При куль� тивуванні сім’ядоль протягом 3 діб без цефотаксиму та потім одну добу без канаміцину частота трансформа� ції становила 86 %. За результатами ПЛР�аналізу рос� лини мали як селективний ген nptII, так і ген esxА ту� беркульозного антигена ESAT6. У той же час аналіз зворотних транскриптів показав, що хоча ген nptII транскрибувався у всіх восьми аналізованих рослин, зворотні транскрипти цільового гена esxА виявлені тільки у п’яти рослин. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Orme I.M. Tuberculosis vaccines : Current progress // Drugs. – 2005. – 65, № 17. – Р. 2437–2444. 2. Colditz G.A., Brewer T.F., Berkey C.S. et al. Efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis // J. Amer. Med. Ass. – 1994. – 271, № 9. – Р. 698–702. 3. McMurray D.N. Recent progress in the development and testing of vaccines against human tuberculosis // Int. J. Parasitol. – 2003. – 33, № 5/6. – P. 547–554. 4. Doherty T.M., Andersen P. Vaccines for tuberculosis: Novel concepts and recent progress // Clin. Microbiol. Rev. – 2005. – 18, № 4. – Р. 687–702. 5. Orme I.M. Current progress in tuberculosis vaccine devel� opment // Vaccine. – 2005. – 23, № 17/18. – P. 2105– 2108. 6. Orme I.M., McMurray D.N., Belislea J.T. Tuberculosis vaccine development: recent progress // Trends in Microbiol. – 2001. – 9, № 3. – P. 115–118. 7. Palendira U., Spratt J.M., Britton W.J., Triccas J.A. Expanding the antigenic repertoire of BCG improves protective efficacy against aerosol Mycobacterium tuberculosis infection // Vaccine. – 2005. –23, № 14. – Р. 1680–1685. 8. Horwitz M.A., Lee B.W., Dillon B.J., Harth G. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 92, № 5. – Р. 1530–1534. 9. Sørensen A.L., Nagai S., Houen G. et al. Purification and characterization of a low�molecular�mass T�cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis // Infect. Immun. – 1995. – 63, № 5. – Р. 1710–1717. 10. Wang Bao�Lin, Ying Xu, Chao�Qun Wu et al. Cloning, expression, and refolding of a secretory protein ESAT� 6 of Mycobacterium tuberculosis // Protein Expres. and Purif. – 2005. – 39, № 2. – P. 184–188. 11. Young D., Dye C. The development and impact of tuber� culosis vaccines // Cell. – 2006. – 124, № 4. – Р. 683– 687. 12. Lozes E., Huygen K.1., Content J. et al. Immunogenicity and efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding the components of the secreted antigen 85 complex // Vaccine. – 1997. – 15, № 8. – Р. 830–833. 13. Daoyin Zhu, Shan Jiang, Xudong Luo. Therapeutic effects of Ag85B and MPT64 DNA vaccines in a murine model of Mycobacterium tuberculosis infection // Vaccine. – 2005. – 23, № 37. – P. 4619–4624. 14. Mason H.S., Lam D.M., Arntzen C.J. Expression of hep� atitis B surface antigen in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1992. – 89, № 24. – P. 11745– 11749. 15. Arakawa T., Chong D.K., Merritt J.L., Langridge W.H. Expression of cholera toxin B subunit oligomers in trans� genic potato plants // Transgenic Res. – 1997. – 6, № 6. – Р. 403–413. 16. Daniell H., Lee S.B., Panchal T. et al. Expression of the native cholera toxin B subunit gene and assembly as functional oligomers in transgenic tobacco chloroplasts // J. Mol. Biol. – 2001. – 311, № 5. – Р. 1001– 1009. 17. Franconi R., Di Bonito P., Dibello F. et al. Plant�derived human papillomavirus 16 E7 oncoprotein induces immune response and specific tumor protection // Cancer Res. – 2002. – 62, № 13. – Р. 3654–3658. 18. Arntzen C., Plotkin S., Dodet B. Plant�derived vaccines and antibodies: potential and limitations // Vaccine. – 2005. – 23, № 15. – Р. 1753–1756. 19. Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2001. – 98, № 20. – Р. 11539–11544. 20. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P. et al. Immunogeni� city of transgenic plant�derived hepatitis B surface anti� gen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1995. – 92, № 8. – Р. 3358–3361. 21. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S. et al. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 2005. – 102, № 9. – Р. 3378– 3382. ISSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 116 Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский и др. 22. Rigano M.M., Dreitz S., Kipnis A.P. et al. Oral immuno� genicity of a plant�made, subunit, tuberculosis vaccine // Vaccine. – 2006. – 24, № 5. – Р. 691–695. 23. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plant cell factories and mucosal vaccines // Curr. Opin. Biotechnol. – 2003. – 14, № 2. – Р. 145–150. 24. Streatfield S.J. Mucosal immunization using recombi� nant plant�based oral vaccines // Methods. – 2006. – 38, № 2. – Р. 150–157. 25. Rigano M.M., Walmsley A.M. Expression systems and developments in plant�made vaccines // Immunol. Cell Biol. – 2005. – 83, № 3. – Р. 271–277. 26. Floss D.M., Falkenburg D., Conrad U. Production of vaccines and therapeutic antibodies for veterinary applications in transgenic plants: an overview // Transgen. Res. – 2007. – 16, № 3. – P. 315–332. 27. Joensuu J.J., Niklander�Teeri V., Brandle J.E. Transgenic plants for animal health: plant�made vaccine antigens for animal infectious disease control // Phytochem. Rev. – 2008. – 7, № 3. – P. 553–577. 28. Aziz M.A., Singh S., Anand Kumar P., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // Biochem. Biophys. Res. Communs. – 2002. – 299, № 3. – P. 345–351. 29. Zelada A., Calamante G., de la Paz Santangelo M. et al. Expression of tuberculosis antigen ESAT�6 in Nicotiana tabacum using a potato virus X�based vector // Tuberculosis. – 2006. – 86, № 3. – P. 263–267. 30. Rigano M.M., Alvarez M. L., Pinkhasov J. et al. Production of a fusion protein consisting of the entero� toxigenic Escherichia coli heat�labile toxin B subunit and a tuberculosis antigen in Arabidopsis thaliana // Plant Cell Rep. – 2004. – 22, № 7. – P. 502–508. 31. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y. et al. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves // Tuberculosis (Edinb.). – 2007. – 87, № 3. – Р. 218–224. 32. Gadgoli C., Mishra S.H. Antihepatotoxic activity of Cichorium intybus // Ethanopharmacology. – 1997. – 58, № 2. – P. 131–134. 33. Hughes R., Rowland I.R. Stimulation of apoptosis by two prebiotic Chicory fructans in the rat colon // Carcino� genesis. – 2001. – 22, № 1. – P. 43–47. 34. Ahmad K.D., Gilani S.N., Akhtar A.H., Khan L. Antiulcerogenic evaluation of aqueous extracts of Cichorium intybus and Phyllanthus emblica in normal and aspirin�treated rats // Pakistan J. Sci. and Industrial Res. – 1998. – 41, № 2. – P. 92–96. 35. Rehman R.U., Israr M., Srivastava P.S. et al. In vitro regeneration of witloof chicory (Cichorium intybus L.) from leaf explants and accumulation of esculin // In Vitro Cell. and Develop. Biol. – 2003. – 39, № 2. – Р. 142–146. 36. Profumo P., Gastaldo P., Caffaro L. et al. Callus induc� tion and plantlet regeneration in Cichorium intybus L. 2. Effect of different hormonal treatments // Protoplas� ma. – 1985. – 126, № 3. – P. 215–220. 37. Buhara Yucesan, Arzu Ucar Turker, Ekrem Gurel. TDZ� induced high frequency plant regeneration through multiple shoot formation in witloof chicory (Cichorium intybus L.) // Plant Cell, Tissue. and Organ Culture. – 2007. – 91, № 3. – Р. 243–250. 38. Cheng LinMei, Cao QiuFen, Huang Jing et al. Establish� ment of a highly efficient genetic transformation sys� tem in Cichorium intybus // Acta Pratacult. Sin. – 2004. – 13, № 6. – Р. 112–116. 39. Матвєєва Н.А., Шаховський А.М., Герасименко І.М. та ін. Перенесення гена біосинтезу інтерферону� α2b в рослини цикорію (Cichorium intybus L.) мето� дом агробактеріальної трансформації // Біополіме� ри і клітина. – 2009. – 25, № 2. – С. 120–125. 40. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio�assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1962. – 15, № 3. – P. 473–497. 41. Маниатис Т., Фрич Е.Ф., Сэмбрук Дж. Молекуляр� ное клонирование. – М.: Мир, 1984. – 480 с. 42. Дрейпер Дж., Скотт Р. Выделение нуклеиновых кис� лот из клеток растений // Генная инженерия расте� ний : Пер. с англ. / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скот� та, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. – М.: Мир, 1991. – С. 241–245. 43. Матвеева Н.А., Василенко М.Ю., Шаховский А.М., Кучук Н.В. Агробактериальная трансформация са� лата Lactuca sativa L. конструкциями, несущими ге� ны бактериальных антигенов из Mycobacterium tuberculosis // Цитология и генетика. – 2009. – 43, № 2. – С. 27–32. 44. Block De M., Herrera�Estrella L., Van Montagu M. et al. Expression of foreign genes in regenerated plants and in their progeny // EMBO J. – 1984. – 3, № 8. – Р. 1681–1689. 45. Assaad F., Tucker K.L., Signer E.R. Epigenetic repeat� induced gene silencing (RIGS) in Arabidopsis // Plant. Mol. Biol. – 1993. – 22, № 6. – P. 1067–1085. 46. Matzke M.A., Matzke A.J.M. How and why do plants inactivate homologous (trans) genes? // Plant Physiol. – 1995. – 107, № 3. – P. 679–685. Поступила 31.03.10 ІSSN 0564–3783. Цитология и генетика. 2011. № 1 17 Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория
id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66818
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn	0564-3783
language	Russian
last_indexed	2025-11-30T10:30:01Z
publishDate	2011
publisher	Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
record_format	dspace
spelling	Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Банникова, М.А. Кваско, О.Ю. Кучук, Н.В. 2014-07-22T18:26:18Z 2014-07-22T18:26:18Z 2011 Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6 / Н.А. Матвеева, М.Ю. Василенко, А.М. Шаховский, М.А. Банникова, О.Ю. Кваско, Н.В. Кучук // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 1. — С. 11-17. — Бібліогр.: 46 назв. — рос. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66818 575.222.7:581.1 Определены условия трансформации цикория Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 из Mycobacterium tuberculosis, которые обеспечивают наибольшую частоту регенерации зеленых растений с трансформированной ДНК. При культивировании семядолей в течение 3 сут без цефотаксима и затем 1 сут без канамицина частота трансформации составляла 86 %. По результатам ПЦР-анализа все растения имели как селективный ген nptII, так и ген esxA туберкулезного антигена ESAT6. В то же время анализ обратных транскриптов показал, что хотя ген nptII транскрибировался у всех восьми анализированных растений, обратные транскрипты целевого гена esxA обнаружены только у пяти. The conditions of high efficient chicory transformation with Mycobacterium tuberculosis antigene ЕSAT6 have been determined. Transformation frequency was up to 86 % when the cotyledons were cultivated within 3 days without cefotaxime and then 1 day without kanamycine. DNA PCR-analysis has shown the presence both of selective nptII and target esxA genes in all analysed plants. At the same time RT-PCR has shown the presence of nptII transcripts for eight analysed lines and esxA transcripts for only five analysed lines. Визначено умови трансформації цикорію Cichorium intybus L. геном антигена ESAT6 Mycobacterium tuberculosis, що забезпечують найбільшу частоту регенерації зелених рослин із трансформованою ДНК. При культивуванні сім’ядоль протягом 3 діб без цефотаксиму та потім одну добу без канаміцину частота трансформації становила 86 %. За результатами ПЛР-аналізу рослини мали як селективний ген nptII, так і ген esxА туберкульозного антигена ESAT6. У той же час аналіз зворотних транскриптів показав, що хоча ген nptII транскрибувався у всіх восьми аналізованих рослин, зворотні транскрипти цільового гена esxА виявлені тільки у п’яти рослин. ru Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6 Ефективна агробактеріальна трансформація рослин цикорію (Cichorium intybus L.) вектором з геном туберкульозного антигена ЕSAT6 Effective agrobacterium-mediated transformation of chicory (Cichorium intybus L.) with Mycobacterium tuberculosis antigene ESAT6 Article published earlier
spellingShingle	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6 Матвеева, Н.А. Василенко, М.Ю. Шаховский, А.М. Банникова, М.А. Кваско, О.Ю. Кучук, Н.В. Оригинальные работы
title	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6
title_alt	Ефективна агробактеріальна трансформація рослин цикорію (Cichorium intybus L.) вектором з геном туберкульозного антигена ЕSAT6 Effective agrobacterium-mediated transformation of chicory (Cichorium intybus L.) with Mycobacterium tuberculosis antigene ESAT6
title_full	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6
title_fullStr	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6
title_full_unstemmed	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6
title_short	Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6
title_sort	эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (cichorium intybus l.) вектором с геном туберкулезного антигена еsat6
topic	Оригинальные работы
topic_facet	Оригинальные работы
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66818
work_keys_str_mv	AT matveevana éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT vasilenkomû éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT šahovskiiam éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT bannikovama éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT kvaskooû éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT kučuknv éffektivnaâagrobakterialʹnaâtransformaciârasteniicikoriâcichoriumintybuslvektoromsgenomtuberkuleznogoantigenaesat6 AT matveevana efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT vasilenkomû efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT šahovskiiam efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT bannikovama efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT kvaskooû efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT kučuknv efektivnaagrobakteríalʹnatransformacíâroslincikoríûcichoriumintybuslvektoromzgenomtuberkulʹoznogoantigenaesat6 AT matveevana effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6 AT vasilenkomû effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6 AT šahovskiiam effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6 AT bannikovama effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6 AT kvaskooû effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6 AT kučuknv effectiveagrobacteriummediatedtransformationofchicorycichoriumintybuslwithmycobacteriumtuberculosisantigeneesat6

Эффективная агробактериальная трансформация растений цикория (Cichorium intybus L.) вектором с геном туберкулезного антигена ЕSAT6

Репозитарії

Схожі ресурси