Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу
Розроблено два варіанти детекції однонуклеотидних поліморфізмів у кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу (МТБ), мутації в якому асоційовані з резистентністю до ізоніазиду – протитуберкульозного препарату першого ряду. Два набори праймерів, кожний з яких містить додатковий конкурентний блокую...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Цитология и генетика |
|---|---|
| Дата: | 2011 |
| Автори: | , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Українська |
| Опубліковано: |
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України
2011
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66871 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу / О.Ю. Лиманська, О.П. Лиманський // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 6. — С. 34-47. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859484652573556736 |
|---|---|
| author | Лиманська, О.Ю. Лиманський, О.П. |
| author_facet | Лиманська, О.Ю. Лиманський, О.П. |
| citation_txt | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу / О.Ю. Лиманська, О.П. Лиманський // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 6. — С. 34-47. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Цитология и генетика |
| description | Розроблено два варіанти детекції однонуклеотидних поліморфізмів у кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу (МТБ), мутації в якому асоційовані з резистентністю до ізоніазиду – протитуберкульозного препарату першого ряду. Два набори праймерів, кожний з яких містить додатковий конкурентний блокуючий праймер з 3’термінальною фосфатною групою (для елімінації неспецифічної ампліфікації), дозволяють у кодоні 315 гена katG виявляти точкові мутації AGC→ACC та AGC→AGA, що найчастіше зустрічаються. Проведення ПЛР з набором із двох праймерів, один з яких містить п’ять LNAмономерів, дозволяє встановити наявність будьякого з шести відомих варіантів мутацій у кодоні 315 гена katG, тобто диференціювати чутливі та резистентні до ізоніазиду МТБ. Чистоту та будову праймерів довжиною 17 нуклеотидів, що містять LNAмодифіковані нуклеотиди, охарактеризовано часопролітною мас-спектрометрією з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією, а 17мірний дуплекс, утворений двома комплементарними олігонуклеотидами з LNAмономерами, – методом термічної денатурації. Створені молекулярногенетичні тестсистеми для виявлення ізолятів дикого типу та резистентних МТБ до протитуберкульозного препарату першого ряду ізоніазиду можуть застосовуватися у клінічних лабораторіях зі стандартним ПЛРобладнанням та дозволяють скоротити визначення резистентності МТБ до ізоніазиду з 1–3 місяців стандартними бактеріологічними методами до 1–3 днів шляхом ПЛР.
Разработаны два варианта детекции однонуклеотидных полиморфизмов в кодоне 315 гена katG микобактерий туберкулеза (МТБ), мутации в котором ассоциированы с устойчивостью к изониазиду – противотуберкулезному препарату первого ряда. Два набора праймеров, каждый из которых содержит дополнительный конкурентный блокирующий праймер с 3’-терминальной фосфатной группой (для элиминации неспецифической амплификации), позволяют выявлять наличие наиболее часто встречающихся точечных мутаций AGC→ACC и AGC→AGA в кодоне 315 гена katG. Проведение ПЦР с набором из двух праймеров, один из которых содержит пять LNA-мономеров, позволяет определить наличие любого из шести известных вариантов мутаций в кодоне 315 гена katG, т.е. дифференцировать чувствительные и резистентные к изониазиду МТБ. Чистота и строение праймеров длиной 17 нуклеотидов, содержащих LNA-модифицированные нуклеотиды, охарактеризованы времяпролетной масс спектрометрией с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF), а 17-мерный дуплекс, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами с LNA-мономерами, – методом термической денатурации.
Two types of techniques for detection of single nucleotide polymorphism in 315 codon of katG gene of MTB are developed. Isoniazid resistance of MTB is associated with point mutations in the mentioned codon. Two primer sets with additional competitive blocking primer containing 3’-terminal phosphate group (for elimination of unspecific amplification) allow detecting the most frequent point mutations AGC ACC and AGC AGA in 315 codon of katG gene. PCR with primer set of two primers one of which contains five LNA-monomers allows to determine an occurrence of any type from six known mutations in 315 codon of katG gene, i.e. to differentiate wild type and isoniazid-resistant MTB. Purity and structure of 17 bp long primers with LNA-modified nucleotides were characterized by time-of-flight MALDI-mass spectrometry. Duplex of 17 bp length formed by two complementary oligonucleotides with LNA-monomers was studied using melting.
|
| first_indexed | 2025-11-24T15:43:06Z |
| format | Article |
| fulltext |
34 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
УДК 579:579.873.2:615.015.8
О.Ю. ЛИМАНСЬКА 1,2, О.П. ЛИМАНСЬКИЙ 1
1 ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова
НАМН України», Харків
Е-mail: olga.limanskaya@mail.ru
2 Національний науковий центр «Інститут експериментальної
і клінічної ветеринарної медицини», Харків
МОЛЕКУЛЯРНІ ТЕХНОЛОГІЇ
В ДЕТЕКЦІЇ ЧУТЛИВИХ ТА СТІЙКИХ
ДО ІЗОНІАЗИДУ МІКОБАКТЕРІЙ
ТУБЕРКУЛЬОЗУ
Ðîçðîáëåíî äâà âàð³àíòè äåòåêö³¿ îäíîíóêëåîòèäíèõ
ïîë³ìîðô³çì³â ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ì³êîáàêòåð³é
òóáåðêóëüîçó (ÌÒÁ), ìóòàö³¿ â ÿêîìó àñîö³éîâàí³ ç
ðåçèñòåíòí³ñòþ äî ³çîí³àçèäó – ïðîòèòóáåðêóëüîç-
íîãî ïðåïàðàòó ïåðøîãî ðÿäó. Äâà íàáîðè ïðàéìåð³â,
êîæíèé ç ÿêèõ ì³ñòèòü äîäàòêîâèé êîíêóðåíòíèé
áëîêóþ÷èé ïðàéìåð ç 3’-òåðì³íàëüíîþ ôîñôàòíîþ
ãðóïîþ (äëÿ åë³ì³íàö³¿ íåñïåöèô³÷íî¿ àìïë³ô³êàö³¿),
äîçâîëÿþòü ó êîäîí³ 315 ãåíà katG âèÿâëÿòè òî÷-
êîâ³ ìóòàö³¿ AGC ACC òà AGC AGA, ùî íàé÷àñ-
ò³øå çóñòð³÷àþòüñÿ. Ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç íàáîðîì ³ç
äâîõ ïðàéìåð³â, îäèí ç ÿêèõ ì³ñòèòü ï’ÿòü LNA-
ìîíîìåð³â, äîçâîëÿº âñòàíîâèòè íàÿâí³ñòü áóäü-ÿêîãî
ç øåñòè â³äîìèõ âàð³àíò³â ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà
katG, òîáòî äèôåðåíö³þâàòè ÷óòëèâ³ òà ðåçèñ-
òåíòí³ äî ³çîí³àçèäó ÌÒÁ. ×èñòîòó òà áóäîâó ïðàé-
ìåð³â äîâæèíîþ 17 íóêëåîòèä³â, ùî ì³ñòÿòü LNA-
ìîäèô³êîâàí³ íóêëåîòèäè, îõàðàêòåðèçîâàíî ÷àñîïðî-
ë³òíîþ ìàñ-ñïåêòðîìåòð³ºþ ç ìàòðè÷íî-àêòèâîâàíîþ
ëàçåðíîþ äåñîðáö³ºþ/³îí³çàö³ºþ, à 17-ì³ðíèé äóïëåêñ,
óòâîðåíèé äâîìà êîìïëåìåíòàðíèìè îë³ãîíóêëåîòè-
äàìè ç LNA-ìîíîìåðàìè, – ìåòîäîì òåðì³÷íî¿ äå-
íàòóðàö³¿. Ñòâîðåí³ ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷í³ òåñò-
ñèñòåìè äëÿ âèÿâëåííÿ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó òà
ðåçèñòåíòíèõ ÌÒÁ äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî ïðåïà-
ðàòó ïåðøîãî ðÿäó ³çîí³àçèäó ìîæóòü çàñòîñîâóâà-
òèñÿ ó êë³í³÷íèõ ëàáîðàòîð³ÿõ ç³ ñòàíäàðòíèì ÏËÐ-
îáëàäíàííÿì òà äîçâîëÿþòü ñêîðîòèòè âèçíà÷åííÿ
ðåçèñòåíòíîñò³ ÌÒÁ äî ³çîí³àçèäó ç 1–3 ì³ñÿö³â
ñòàíäàðòíèìè áàêòåð³îëîã³÷íèìè ìåòîäàìè äî 1–3
äí³â øëÿõîì ÏËÐ.
Âñòóï. ²íôåêö³éí³ õâîðîáè ïðîäîâæóþòü
ÿâëÿòè ñåðéîçíó çàãðîçó ëþäñòâó: ñåðåä 51 ìëí
ëþäåé, ÿê³ ùîð³÷íî âìèðàþòü ó ñâ³ò³, ìàé-
æå 17 ìëí ãèíóòü â³ä ³íôåêö³éíèõ òà ïà-
ðàçèòàðíèõ õâîðîá [1]. Íà îñîáëèâó óâàãó
çàñëóãîâóº òóáåðêóëüîç (ÒÁ), ÿêèé, ÿê ³ ðà-
í³øå, çàëèøàºòüñÿ îäí³ºþ ç àêòóàëüíèõ ïðî-
áëåì îõîðîíè çäîðîâ’ÿ â óñüîìó ñâ³ò³. Çã³ä-
íî ç äàíèìè ÂÎÎÇ çà 2009 ð. [2], íåçâàæà-
þ÷è íà òå, ùî ò³ëüêè ó íåâåëèêî¿ ÷àñòèíè
³íô³êîâàíèõ ëþäåé ðîçâèâàºòüñÿ àêòèâíà
ôîðìà çàõâîðþâàííÿ, çàãàëüíà ñåðåäíüî-
ð³÷íà ñìåðòí³ñòü, îáóìîâëåíà òóáåðêóëüî-
çîì, ñòàíîâèòü áëèçüêî 2 ìëí âèïàäê³â, à
ó 2007 ð. â óñüîìó ñâ³ò³ ñòàëîñÿ 9,27 ìëí
âèïàäê³â çàõâîðþâàííÿ íà ÒÁ. Ó òîé æå ÷àñ
â ðîáîò³ Ñåð㳺âà òà ³í. [1] ï³äêðåñëþºòüñÿ,
ùî ê³ëüê³ñòü õâîðèõ íà òóáåðêóëüîç ÿâíî
íåäîâðàõîâóºòüñÿ. ³äïîâ³äíî äî åêñïåðòíèõ
îö³íîê çàãàëüíà ê³ëüê³ñòü õâîðèõ ñòàíîâèòü
áëèçüêî 1,3 ìëðä.
 Óêðà¿í³, ÿê ³ ó á³ëüøîñò³ êðà¿í ÑÍÄ
(òàáë. 1), ïîêàçíèêè çàõâîðþâàíîñò³ òà ñìåðò-
íîñò³ â³ä òóáåðêóëüîçó ó äåê³ëüêà ðàç³â ïåðå-
âèùóþòü âêàçàí³ çíà÷åííÿ äëÿ êðà¿í Çàõ³ä-
íî¿ ªâðîïè (áàçà äàíèõ ªâðîïåéñüêîãî ðåã³î-
íàëüíîãî êîì³òåòó ÂÎÎÇ, http://data. euro.
who.int/hfadb/). Óêðà¿íà ðàçîì ç ³íøèìè êðà¿-
íàìè ÑÍÄ íàëåæèòü äî ÷èñëà êðà¿í ç âèñî-
êèìè ð³âíÿìè çàõâîðþâàíîñò³ íà òóáåðêóëüîç
(87,5 íà 100 òèñ. íàñåëåííÿ – 2006 ð., 89,7 íà
100 òèñ. íàñåëåííÿ – 2007 ð.) òà ñìåðòíîñò³
(21,4 íà 100 òèñ. íàñåëåííÿ – 2004 ð.) (http://
data.euro.who.int/hfadb/).
Ïîðÿä ç ðîñòîì çàõâîðþâàíîñò³ íà òóáåð-
êóëüîç íå ìåíø ãëîáàëüíîþ ïðîáëåìîþ º
øèðîêå ðîçïîâñþäæåííÿ ìóëüòèðåçèñòåíòíèõ
øòàì³â ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó (ÌÒÁ).
Îñíîâíèì âèð³øåííÿì ïðîáëåìè êîíòðîëþ
ðîçïîâñþäæåííÿ ñò³éêèõ äî ë³ê³â ôîðì çà-
õâîðþâàííÿ º ¿õíÿ ñâîº÷àñíà äåòåêö³ÿ íà
ðàíí³õ ñòàä³ÿõ çàõâîðþâàííÿ, ÿêà äîçâîëèòü
êîíòðîëþâàòè ïîøèðåííÿ êîíêðåòíîãî øòà-
ìó òà êîðèãóâàòè ñõåìó õ³ì³îòåðàﳿ äëÿ êîæ-
íîãî õâîðîãî. ²ñíóº ðÿä òðàäèö³éíèõ êëà-
ñè÷íèõ (ÿê ïðÿìèõ, òàê ³ íåïðÿìèõ) ìåòîä³â
âèçíà÷åííÿ ðåçèñòåíòíîñò³ ì³êîáàêòåð³é äî
ïðîòèòóáåðêóëüîçíèõ ïðåïàðàò³â, çàòâåðäæå-
íèõ ÂÎÎÇ. Ïðè öüîìó âèçíà÷åííÿ ñïåêòðà
ë³êàðñüêî¿ ñò³éêîñò³ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêó-
ëüîçó çàéìຠâ³ä 1 äî 3 ì³ñÿö³â, ïðîòÿãîì
ÿêèõ ïåðâèííèì õâîðèì ïðèçíà÷àþòü êóðñ © Î.Þ. ËÈÌÀÍÑÜÊÀ, Î.Ï. ËÈÌÀÍÑÜÊÈÉ, 2011
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 35
òåðàﳿ ñòàíäàðòíèìè ïðîòèòóáåðêóëüîçíè-
ìè ïðåïàðàòàìè ïåðøîãî ðÿäó. Îñê³ëüêè
ðåçèñòåíòí³ñòü êë³í³÷íèõ ³çîëÿò³â ÌÒÁ äî
ïðèçíà÷åíèõ ïðåïàðàò³â âïðîäîâæ öüîãî
ïåð³îäó çàëèøàºòüñÿ íåç’ÿñîâàíîþ, ³ñíóº
â³ðîã³äí³ñòü, ùî ïðèéîì ïðåïàðàò³â âèÿâè-
òüñÿ íååôåêòèâíèì. Øâèäêå âèçíà÷åííÿ
ñò³éêîñò³ òà îñîáëèâî ìíîæèííî¿ ë³êàðñü-
êî¿ ñò³éêîñò³ ÌÒÁ º íàäçâè÷àéíî âàæëè-
âèì äëÿ âèáîðó åôåêòèâíî¿ ìåòîäèêè ïðîòè-
òóáåðêóëüîçíî¿ òåðàﳿ. Âèð³øåííÿ äàíî¿ ïðî-
áëåìè óÿâëÿºòüñÿ ìîæëèâèì íà ð³âí³ ãåíî-
òèïó, ùî äîçâîëèòü ñêîðîòèòè ÷àñ ïðîâå-
äåííÿ â³äïîâ³äíîãî àíàë³çó äî 1–3 äí³â.
Íà ñüîãîäí³ â ë³òåðàòóð³ îïèñàíî áåçë³÷
ìîëåêóëÿðíî-á³îëîã³÷íèõ ìåòîä³â äëÿ äåòåê-
ö³¿ ñò³éêèõ øòàì³â ÌÒÁ [3–6]. Äîñë³äæåííÿ
ìîëåêóëÿðíèõ ìåõàí³çì³â ðåçèñòåíòíîñò³ ïî-
êàçàëè, ùî ñò³éê³ñòü ÌÒÁ äî òîãî ÷è ³íøî-
ãî ïðåïàðàòó îáóìîâëåíà ïîîäèíîêèìè ìóòà-
ö³ÿìè â ïåâíèõ ãåíàõ. Äëÿ âèÿâëåííÿ òàêèõ
òî÷êîâèõ ìóòàö³é, àáî îäíîíóêëåîòèäíèõ ïîë³-
ìîðô³çì³â, ìîæëèâå âèêîðèñòàííÿ ð³çíèõ
âàð³àíò³â ÏËÐ, à ñàìå: ç âèêîðèñòàííÿì
ïðàéìåðà, ùî ìຠíåêîìïëåìåíòàðíèé ïî
â³äíîøåííþ äî ÄÍÊ-ìàòðèö³ äèêîãî òèïó
íóêëåîòèä íà 3’-ê³íö³ [7]; ç âèêîðèñòàííÿì
äîäàòêîâîãî ïðàéìåðà ç áëîêîâàíèì 3’-ê³í-
öåì [8]; ç âèêîðèñòàííÿì LNA-ìîäèô³êî-
âàíîãî ïðàéìåðà (LNA – locked nucleic acid,
àáî çàìêíåíà íóêëå¿íîâà êèñëîòà) [9]; íàðåø-
ò³, ç âèêîðèñòàííÿì äîäàòêîâîãî êîíêóðåíò-
íîãî LNA-ìîäèô³êîâàíîãî îë³ãîíóêëåîòèäà,
ùî ïåðåäáà÷ຠçàñòîñóâàííÿ Stoffel ôðàã-
ìåíòà Taq ÄÍÊ-ïîë³ìåðàçè (ìóòàíòíî¿ ôîð-
ìè ÄÍÊ-ïîë³ìåðàçè (ÄÍÊÏ), ó ÿêî¿ â³äñóòíÿ
5’ 3’ åêçîíóêëåàçíà àêòèâí³ñòü) [10] (ðèñ. 1).
³äîìî, ùî íàéâàãîì³øèé âíåñîê ó ðîç-
âèòîê ðåçèñòåíòíîñò³ ÌÒÁ äî ïðîòèòóáåðêó-
ëüîçíèõ ïðåïàðàò³â ïîðÿä ç ðåçèñòåíòí³ñòþ
äî ñòðåïòîì³öèíó âíîñèòü ðåçèñòåíòí³ñòü äî
³çîí³àçèäó (²ÇÍ), ÿêà îáóìîâëåíà â îñíîâ-
íîìó ìóòàö³ÿìè, ëîêàë³çîâàíèìè â êîäîí³
315 ãåíà katG, ùî êîäóº ñèíòåç êàòàëàçè-
ïåðîêñèäàçè. Ðåçèñòåíòí³ñòü äî ²ÇÍ àñîö³-
éîâàíà ç ìóòàö³ÿìè â êîäîí³ 315 ç éìîâ³ð-
í³ñòþ 50 – ïîíàä 90 % [11, 12].
Ñó÷àñíà ñòðàòåã³ÿ äåòåêö³¿ òà òèïóâàííÿ
ïàòîãåí³â ëþäèíè ³ òâàðèí ïîëÿãຠó ðîç-
ðîáö³ òåõíîëîã³é, çàñíîâàíèõ íà ìîëåêóëÿð-
íî-ãåíåòè÷íîìó àíàë³ç³ ç âèêîðèñòàííÿì
ïîë³ìåðàçíî¿ ëàíöþãîâî¿ ðåàêö³¿ (ÏËÐ) òà
¿¿ ìîäèô³êàö³é, à òàêîæ ÿâèùà ÄÍÊ-ïîë³-
ìîðô³çìó. Íà ðèíêó ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷-
Òàáëèöÿ 1
ʳëüê³ñòü îö³íåíèõ âèïàäê³â òóáåðêóëüîçó (ÒÁ) ç ìíîæèííîþ ë³êàðñüêîþ ñò³éê³ñòþ (N, ÌËÑ) ó 2007 ð.
â êðà¿íàõ ÑÍÄ, âèïàäê³â ÒÁ ç ÌËÑ, ïðî ÿê³ ïîâ³äîìëåíî (K) çà 2007 ð., à òàêîæ î÷³êóâàíå ÷èñëî âèïàäê³â,
â ÿêèõ ïåðåäáà÷àëîñü ïðîâåäåííÿ êóðñó õ³ì³îòåðàﳿ (P) ó 2008 òà 2009 ðð.
Ïðèì³òêà. SS+ – âèïàäêè ç ïîçèòèâíèì àíàë³çîì ìîêðîòè; «–» – ³íôîðìàö³þ íå íàäàíî. * Êðà¿íè, ÿê³
íå íàäàëè äàíèõ ùîäî âèïàäê³â ÒÁ ç ÌËÑ òà ïðî ïåðåäáà÷óâàíó õ³ì³îòåðàï³þ.
Êðà¿íà
ʳëüê³ñòü îö³íåíèõ âèïàäê³â
ó 2007 ð.
Ïîâ³äîìëåíî
Î÷³êóâàíà ê³ëüê³ñòü
âèïàäê³â ïðîâåäåííÿ
õ³ì³îòåðàﳿ, Ð
% N SS+ Ê, 2007 ð. SS+, 2007 ð. 2008 ð. 2009 ð.
Ðîñ³ÿ
Óêðà¿íà *
Óçáåêèñòàí
Ðåñïóáë³êà Ìîëäîâà
Á³ëîðóñ³ÿ
Òàäæèêèñòàí *
Êèðãèçñòàí
³ðìåí³ÿ
21
19
24
29
16
23
17
17
42 969
9 835
9 450
2 231
1 101
4 688
1 290
486
31 397
5 568
6 936
1 656
758
3 286
813
373
5 297
–
484
896
870
–
322
123
17
–
7
54
115
–
40
33
4 221
–
334
466
–
–
–
–
9 897
–
720
490
–
–
–
–
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
36 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
íî¿ ïðîäóêö³¿ ïîñò³éíî ç’ÿâëÿþòüñÿ íîâ³ ìåòî-
äè äåòåêö³¿ òî÷êîâèõ ìóòàö³é (â îñíîâíîìó äëÿ
ÏËÐ ó ðåàëüíîìó ÷àñ³). Êîæíèé ç öèõ ìåòîä³â
ìຠÿê ïåâí³ ïåðåâàãè, òàê ³ äåÿê³ íåäîë³êè.
Ïðèéìàþ÷è äî óâàãè ë³òåðàòóðí³ äàí³ ùîäî
ïîð³âíÿëüíîãî àíàë³çó ð³çíèõ ìîäèô³êàö³é
ÏËÐ [13], à òàêîæ âðàõîâóþ÷è, ùî á³ëüø³ñòü
êë³í³÷íèõ ëàáîðàòîð³é ìàþòü ñòàíäàðòíå
ÏËÐ-îáëàäíàííÿ, ó äàí³é ðîáîò³ ðîçðîáëåíî
äâà âàð³àíòè ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷íèõ òåñò-
ñèñòåì äëÿ äåòåêö³¿ ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà
katG ÌÒÁ. Ó ïåðøîìó âàð³àíò³ äåòåêö³þ òî÷-
êîâèõ ìóòàö³é â ãåí³ katG ÌÒÁ ïðîâîäèëè íà
îñíîâ³ âèêîðèñòàííÿ ïðàéìåð³â, ùî ì³ñòÿòü
LNA-ìîäèô³êîâàí³ íóêëåîòèäè. Äðóãèé âàð³-
àíò øëÿõîì ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç äîäàòêîâèì
êîíêóðåíòíèì áëîêóþ÷èì ïðàéìåðîì ç 3’-
òåðì³íàëüíîþ ôîñôàòíîþ ãðóïîþ äîçâîëÿº
âèçíà÷àòè ó êîäîí³ 315 ãåíà katG òèï òî÷êî-
âèõ ìóòàö³é AGC ACC òà AGC AGA, ùî
íàé÷àñò³øå çóñòð³÷àþòüñÿ.
Ïðàéìåðè ç LNA-ìîäèô³êîâàíèìè ìîíî-
ìåðàìè îõàðàêòåðèçîâàíî ìåòîäîì ÷àñî-
ïðîë³òíî¿ ìàñ-ñïåêòðîìåò𳿠ç ìàòðè÷íî-àêòè-
âîâàíîþ ëàçåðíîþ äåñîðáö³ºþ/³îí³çàö³ºþ, à
óòâîðåíèé íèìè äóïëåêñ – ìåòîäîì òåðì³÷íî¿
äåíàòóðàö³¿. Ðîçðîáëåí³ íàìè ìîëåêóëÿðíî-
ãåíåòè÷í³ íàáîðè ç âèêîðèñòàííÿì LNA-ìî-
äèô³êîâàíèõ ïðàéìåð³â äîçâîëÿþòü çà äîïî-
ìîãîþ ïîñòàíîâêè îäí³º¿ ðåàêö³¿ âñòàíîâèòè
íàÿâí³ñòü áóäü-ÿêîãî ç øåñòè ìîæëèâèõ âà-
ð³àíò³â ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà katG, à îòæå,
äèôåðåíö³þâàòè ÷óòëèâ³ òà ðåçèñòåíòí³ ÌÒÁ
äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî ïðåïàðàòó ïåðøîãî
ðÿäó ³çîí³àçèäó â³äïîâ³äíî.
Ìàòåð³àëè ³ ìåòîäè. Ïðîâåäåííÿ ÏËÐ. Äëÿ
êîìï’þòåðíîãî àíàë³çó âèêîðèñòîâóâàëè ñåê-
âåíîâàí³ íóêëåîòèäí³ ïîñë³äîâíîñò³ ãåíà katG
õðîìîñîìíî¿ ÄÍÊ 62 ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó
òà ðåçèñòåíòíèõ äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî
ïðåïàðàòó ïåðøîãî ðÿäó ³çîí³àçèäó ÌÒÁ ç
áàçè äàíèõ GenBank. Ìíîæèííå âèð³âíþ-
âàííÿ òà íàñòóïíèé ñòàòèñòè÷íèé àíàë³ç
ïðîâîäèëè çà äîïîìîãîþ ïàêåòà ïðèêëàä-
íèõ ïðîãðàì GeneBee [14].
Äëÿ ïåðåâ³ðêè ðîçðîáëåíèõ íàáîð³â ïðàé-
ìåð³â äëÿ äåòåêö³¿ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó òà
ìóòàíòíèõ (ðåçèñòåíòíèõ äî ³çîí³àçèäó) ÌÒÁ
Ðèñ. 1. Ñõåìà ìîæëèâèõ ìîäèô³êàö³é ÏËÐ-àíàë³çó äëÿ äåòåêö³¿ ³çîëÿò³â ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó äèêîãî
òà ìóòàíòíîãî (ðåçèñòåíòíîãî äî ³çîí³àçèäó) òèï³â. Ìåòîäè 1–3 âèêîðèñòîâóâàëè â äàí³é ðîáîò³
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 37
âèêîðèñòîâóâàëè ÄÍÊ, åêñòðàãîâàíó ç 43 ³çî-
ëÿò³â ÌÒÁ äèêîãî òèïó (WT) òà ìóòàíòíèõ
(MT), ùî ì³còÿòü òî÷êîâ³ ìóòàö³¿ â êîäîí³
315 ãåíà katG. Òåñòóâàííÿ íàáîð³â ïðàéìåð³â
ïðîâîäèëè íà ÄÍÊ ³çîëÿò³â ÌÒÁ ç òî÷êî-
âèìè ìóòàö³ÿìè AGC ACC, AGC ACG òà
AGC AGA ó êîäîí³ 315 ãåíà katG, ùî õàðàê-
òåðèçóâàëèñÿ ð³âíåì ðåçèñòåíòíîñò³ äî ³çî-
í³àçèäó 1–25 ìêã/ìêë. Êîëåêö³þ ÄÍÊ ÌÒÁ
ëþá’ÿçíî íàäàíî ä-ðîì Â.Ì. Ñòåïàíøèíîþ
(Äåðæàâíèé íàóêîâèé öåíòð ïðèêëàäíî¿
ì³êðîá³îëî㳿 òà á³îòåõíîëî㳿, ÐÔ). Ãåíîìíó
ÄÍÊ âèä³ëÿëè ìåòîäîì ôåíîë-õëîðîôîðìíî¿
åêñòðàêö³¿.
Äëÿ ïåðåâ³ðêè íàáîð³â ïðàéìåð³â My-
kat4 – Mykat5 – Mykat5P òà Mykat4 –
Mykat9 – Mykat9P, ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç ÿêè-
ìè äîçâîëÿº âèçíà÷àòè âàð³àíòè òî÷êîâèõ
ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ÌÒÁ
AGC ACC òà AGC AGA â³äïîâ³äíî, âè-
êîðèñòîâóâàëè òðè ÄÍÊ-ìàòðèö³: ÄÍÊ
M. tuberculosis øòàìó HB385, ùî ì³ñòèòü
ìóòàö³þ AGC AGA ó êîäîí³ 315 ãåíà katG;
ÄÍÊ M. tuberculosis øòàìó HB125 ç ìóòàö³ºþ
AGC ACC; ÄÍÊ M. tuberculosis øòàìó
H37Rv, íåãàòèâíèé êîíòðîëü àìïë³ô³êàö³¿
(êîäîí 315 ì³ñòèòü ïîñë³äîâí³ñòü AGC).
Ïðàéìåðè ç â³äïîâ³äíèìè ïîçèö³ÿìè íà ãåí³ katG,
ïîâíà ïîñë³äîâí³ñòü ÿêîãî ñòàíîâèòü 2223 ï.í.
Ë7 (739–762) 5'-gacattcgcgagacgtttcggcgc-3'
Ë8LNA(952–936) 5'-cgatgcCGCTGgtgatc-3'
(âèä³ëåíî LNA-ìîíîìåðè)
Mykat4 (739–758) 5'-gacattcgcgagacgtttcg-3'
Mykat5 (962–944) 5'-catacgacctcgatgccgg-3'
Mykat5P (962–944) 5'-catacgacctcgatgccgc-3'-PO4
Mykat9 (962–943) 5'-tccatacgacctcgatgcct-3'
Mykat9P (962–943) 5'-tccatacgacctcgatgccg-3'-PO4
Mykat10 (895–918) 5'-ggctggttcagctcgtatggcacc-3'
Mykat11 (1045–1023) 5'-cagcagggctcttcgtcagctcc-3'.
ÏËÐ ïðîâîäèëè ç âèêîðèñòàííÿì ñóõî-
ãî íàáîðó ðåàãåíò³â äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ÄÍÊ
(«²çîãåí», ÐÔ) â îá’ºì³ ðåàêö³éíî¿ ñóì³ø³
20–50 ìêë, ùî ì³ñòèëà 4 ìM NaCl, 50 ìM
KCl, 12 ìM òðèñ-HCl (pH 8,0), 2,5 ìM
MgCl2, 200 ìêÌ äåçîêñèíóêëåîòèä³â, 0,1–
0,5 ìêÌ êîæíîãî ïðàéìåðà, 1 îä. Taq ÄÍÊ-
ïîë³ìåðàçè, ³íã³áîâàíî¿ àíòèò³ëàìè, ùî äàº
ìîæëèâ³ñòü ïîñòàíîâêè ÏËÐ ç ãàðÿ÷èì ñòàð-
òîì. Ñèíòåçîâàí³ òà î÷èùåí³ øëÿõîì åëåê-
òðîôîðåçó â ÏÀÀà ïðàéìåðè îäåðæàíî â³ä
êîìïàí³¿ «Ñèíòîë» (ÐÔ). LNA-ìîäèô³êîâàí³
ïðàéìåðè («Ñèíòîë», ÐÔ) ì³ñòèëè ïî ï’ÿòü
LNA-íóêëåîòèä³â âèðîáíèöòâà ô³ðìè «Exiqon»
(Äàí³ÿ; http://www.exiqon.com/lna-technology).
Ñòàíäàðòíó ÏËÐ ïðîâîäèëè íà àìïë³-
ô³êàòîð³ ÍÂÎ «Òî÷í³ñòü» (Òóëà, ÐÔ) çà
íàñòóïíèõ òåìïåðàòóðíèõ òà ÷àñîâèõ ïàðà-
ìåòð³â: ïî÷àòêîâà ³íêóáàö³ÿ – 95 Ñ, 4 õâ;
äåíàòóðàö³ÿ – 95 Ñ, 40 ñ; â³äïàë – 58–
71 Ñ, 60 ñ; ñèíòåç – 70–74 Ñ, 60 ñ;
ê³ëüê³ñòü öèêë³â – 38–45. Òåìïåðàòóðó â³ä-
ïàëó ïðàéìåð³â (Òan) îïòèì³çóâàëè øëÿõîì
ïîñòàíîâêè ðÿäó ðåàêö³é ïðè çá³ëüøåíí³
òåìïåðàòóðè ç êðîêîì 2–0,5 Ñ äî ïîâíî¿
åë³ì³íàö³¿ ñìóãè íåñïåöèô³÷íîãî àìïë³êîíà.
Äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ âèêîðèñòîâóâàëè 0,05 ìêã
ãåíîìíî¿ ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó.
Äëÿ â³çóàë³çàö³¿ àìïë³êîí³â 10–20 ìêë ÏËÐ-
ïðîäóêòó ðîçä³ëÿëè çà äîïîìîãîþ åëåêòðî-
ôîðåçó â 1,5–2%-íîìó àãàðîçíîìó ãåë³, ùî
ì³ñòèâ åòèä³é áðîìèñòèé çà íàïðóæåíîñò³
ïîëÿ 10 Â/ñì.
Òåìïåðàòóðó ïëàâëåííÿ êîìïëåêñó îë³ãî-
íóêëåîòèä ç LNÀ-ìîíîìåðàìè – îäíîíèò-
êîâà ÄÍÊ ðîçðàõîâóâàëè çà äîïîìîãîþ
ïðîãðàìè, ùî º ó â³ëüíîìó äîñòóï³ íà ñàéò³
http://lna-tm.com, à òåðìîäèíàì³÷íèé àíàë³ç
ïðàéìåð³â òà àìïë³êîí³â – çà äîïîìîãîþ
ïðîãðàìè MeltCalc [15].
ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòðîìåòð³ÿ îë³ãîíóêëåîòè-
ä³â. Õàðàêòåðèçàö³þ LNA-ìîäèô³êîâàíèõ
îë³ãîíóêëåîòèä³â ïðîâîäèëè ìåòîäîì ÷àñî-
ïðîë³òíî¿ ìàñ-ñïåêòðîìåò𳿠ç ìàòðè÷íî-
àêòèâîâàíîþ ëàçåðíîþ äåñîðáö³ºþ òà ³îí³-
çàö³ºþ (ÌÀËIJ). Ïðèíöèï ìåòîäó ïîëÿãàº
â ³îí³çàö³¿ á³îîðãàí³÷íèõ ìîëåêóë, ïðè ÿêî-
ìó êîðîòêèì ïîòóæíèì ³ìïóëüñîì ëàçåðà
âèïàðîâóâàþòüñÿ òà ³îí³çóþòüñÿ ìîëåêóëè
ï³äêëàäèíêè-ìàòðèö³, ÿê³ çàõîïëþþòü ìî-
ëåêóëè, ùî äîñë³äæóþòüñÿ, ïåðåäàþ÷è ¿ì
åëåêòðè÷íèé çàðÿä äëÿ ïîäàëüøîãî ¿õíüîãî
ðîçãîíó â åëåêòðè÷íîìó ïîë³.  ÷àñîïðî-
ë³òí³é ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòðîìåò𳿠âèêîðè-
ñòîâóþòü ÷àñîïðîë³òíèé äåòåêòîð, ïðèíöèï
䳿 ÿêîãî áàçóºòüñÿ íà ô³êñàö³¿ ð³çíèö³ ÷àñó
äîñÿãíåííÿ ñåíñîðà ³îíàìè ð³çíî¿ ìàñè.
Àë³êâîòè îë³ãîíóêëåîòèä³â (0,5 ìêë), î÷è-
ùåíèõ çà äîïîìîãîþ åëåêòðîôîðåçó â ÏÀÀÃ,
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
38 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
íàíîñèëè íà ìàòðè÷í³ êðèñòàëè, îòðèìà-
í³ øëÿõîì âèñóøóâàííÿ âîäíîãî ìàòðè÷-
íîãî ðîç÷èíó, ùî ì³ñòèòü 3-ã³äðîêñèï³êîë³-
íî âó êèñëîòó (50 ìã/ìë) òà öèòðàò àìîí³þ
(2 ìã/ìë), íà ì³øåí³ ç íåðæàâ³þ ÷î¿ ñòàë³.
̳øåíü âèñóøóâàëè çà ê³ìíàòíî¿ òåìïåðà-
òóðè äî ïîâíîãî âèïàðîâóâàííÿ ðîç÷èí-
íèê³â òà ïîì³ùàëè ó äæåðåëî ÷àñîïðîë³òíîãî
ìàñ-ñïåêòðîìåòðà Autoflex II (Bruker Dalton-
ics Inc., ͳìå÷÷èíà), îáëàäíàíîãî àçîòíèì
ëàçåðîì, ùî äîçâîëÿº ïðîâîäèòè ³ìïóëüñíå
äîáóâàííÿ ³îí³â. Ìàñ-ñïåêòðè îë³ãîíóêëåî-
òèä³â îòðèìàíî ó ðåæèì³ ðåºñòðàö³¿ ïîçè-
òèâíèõ ³îí³â. ²îí³çàö³þ çðàçê³â ïðîâîäèëè
ÓÔ-ëàçåðîì ç äîâæèíîþ õâèë³ 337 íì ó
³ìïóëüñíîìó ðåæèì³, òðèâàë³ñòþ ³ìïóëüñó 3
íñ òà ÷àñòîòîþ 20 Ãö. Âèêîðèñòîâóâàëè ÷àñ
çàòðèìêè åêñòðàêö³¿ ³îí³â 30 íñ. Ïîçèòèâíî
çàðÿäæåí³ ³îíè äåòåêòóâàëè ó ðåæèì³ ðî-
áîòè ðåôëåêòðîíó. Äëÿ îòðèìàííÿ ðåçóëü-
òàòèâíîãî ìàñ-ñïåêòðà çä³éñíþâàëè ï³äñó-
ìîâóâà ííÿ òà óñåðåäíåííÿ 100 ³íäèâ³äóàëü-
íèõ ñïåêòð³â.
ÓÔ-ñïåêòðîñêîï³ÿ îë³ãîíóêëåîòèäíèõ äóï-
ëåêñ³â. Äëÿ õàðàêòåðèçàö³¿ îë³ãîíóêëåîòèä-
íèõ äóïëåêñ³â, ùî ì³ñòèëè ïî ï’ÿòü êîìïëå-
ìåíòàðíèõ LNA-ìîäèô³êîâàíèõ íóêëåîòè-
ä³â, âèêîðèñòîâóâàëè òåðì³÷íó äåíàòóðàö³þ
ç ðåºñòðàö³ºþ îïòè÷íî¿ ù³ëüíîñò³ çà òèïî-
âîãî çíà÷åííÿ äîâæèíè õâèë³ 260 íì. ÓÔ-
ñïåêòðîñêîï³÷í³ äîñë³äæåííÿ ïðîâîäèëè íà
ñïåêòðîôîòîìåòð³ Specord M40 («Carl Zeiss
Jena», ͳìå÷÷èíà), ùî ì³ñòèâ òåðìîñòàòî-
âàíó êàìåðó. Îïòè÷íó ù³ëüí³ñòü ðåºñòðóâà-
ëè ç êðîêîì çì³íè òåìïåðàòóðè 0,05 Ñ çà
øâèäêîñò³ íàãð³âó 0,5 Ñ/õâ. Ïëàâëåííÿ ïðî-
âîäèëè â 10–3 Ì, 10–2 Ì òà 5 · 10–2 Ì íà-
òð³é-êàêîäèëàòíîìó áóôåð³ (ðÍ 7,0) çà êîí-
öåíòðàö³¿ ÄÍÊ 20–30 ïêìîëü/ìêë. Äèôåðåí-
ö³éí³ ïðîô³ë³ ïëàâëåííÿ îòðèìóâàëè ÷åðåç
äèôåðåíö³þâàííÿ ³íòåãðàëüíîãî ïðîô³ëþ
ïëàâëåííÿ çà äîïîìîãîþ ïðîãðàìè Origin
(âåðñ³ÿ 7.0, ÑØÀ).
Ðåçóëüòàòè äîñë³äæåíü òà ¿õ îáãîâîðåííÿ.
Ó ðîáîò³ âèêîðèñòàíî äâ³ òåõíîëî㳿 äåòåêö³¿
òî÷êîâèõ ìóòàö³é: 1) àëåëü-ñïåöèô³÷íó ÏËÐ
ç êîíêóðåíòíèì áëîêóþ÷èì ïðàéìåðîì;
2) ñòàíäàðòíó ÏËÐ ç âèêîðèñòàííÿì LNA-
ìîäèô³êîâàíèõ ïðàéìåð³â äëÿ äèôåðåíö³à-
ö³¿ ÷óòëèâèõ òà ðåçèñòåíòíèõ äî ³çîí³àçèäó
ì³êî-áàêòåð³é òóáåðêóëüîçó. Äëÿ ïðîâå-
äåííÿ àëåëü-ñïåöèô³÷íî¿ ÏËÐ îäèí àáî
îáèäâà ïðàéìåðè êîíñòðóþþòü òàêèì ÷è-
íîì, ùî âîíè â³äïàëþþòüñÿ íà ñàéòàõ
ç òî÷êîâèìè ìóòàö³ÿìè.  ³äåàë³, êîì-
ïëåìåíòàðíèé ñïåöèô³÷í³é ïîñë³äîâíîñò³
ïðàéìåð âåäå äî àìïë³ô³êàö³¿ ò³ëüêè îä-
íîãî âàð³àíòà, àëå íà ïðàêòèö³ â³äáóâàºòüñÿ
çíà÷íà àìïë³ô³êàö³ÿ âàð³àíò³â ³ç â³äïàëîì
ïðàéìåð³â ç ì³øåíÿìè, ùî ì³ñòÿòü íåêîì-
ïëåìåíòàðí³ íóêëåîòèäè.
Ïðè ðîçðîáö³ íàáîð³â ïðàéìåð³â íà ïåð-
øîìó åòàï³ ïðîâîäèëè àíàë³ç ïîâíîâèì³ð-
íîãî ãåíà katG òà éîãî ôðàãìåíò³â ³çîëÿ-
ò³â ÌÒÁ ç áàçè äàíèõ ñåêâåíîâàíèõ íóêëåî-
òèäíèõ ïîñë³äîâíîñòåé GenBank. Êîìï’þ-
òåðíèé àíàë³ç ãåíà katG õðîìîñîìíî¿ ÄÍÊ
ðåçèñòåíòíèõ äî ³çîí³àçèäó ³çîëÿò³â ÌÒÁ ç
âàð³àíòàìè òèïîâèõ òî÷êîâèõ ìóòàö³é ïî-
êàçàâ, ùî ìóòàö³þ â êîäîí³ 315 ìîæíà âè-
êîðèñòîâóâàòè äëÿ äåòåêö³¿ ÿê ìóòàíòíèõ
(ðåçèñòåíòíèõ äî ³çîí³àçèäó), òàê ³ ³çîëÿò³â
äèêîãî òèïó ÌÒÁ.
Ìåòîä àëåëü-ñïåöèô³÷íî¿ ÏËÐ, â îñíîâ³
ÿêîãî ëåæèòü âèêîðèñòàííÿ àëåëü-ñïåöè-
ô³÷íèõ ïðàéìåð³â òà áëîêóþ÷îãî îë³ãîíó-
êëåîòèäà, ïåðåäáà÷ຠíàÿâí³ñòü, êð³ì ïàðè
çâè÷àéíèõ ïðàéìåð³â, äîäàòêîâîãî êîíêó-
ðåíòíîãî îë³ãîíóêëåîòèäà, ïîñë³äîâí³ñòü
ÿêîãî º êîìïëåìåíòàðíîþ äî äèêîãî òèïó
ÄÍÊ òà ì³ñòèòü ñàéò ïîòåíö³éíî¿ ìóòàö³¿
(ðèñ. 2, à). Êîíêóðåíòíèé îë³ãîíóêëåîòèä
áëîêîâàíèé íà 3’-ê³íö³ òàê, ùî ïîäàëüøà
åëîíãàö³ÿ íåìóòàíòíîãî ëàíöþãà çà äîïî-
ìîãîþ ÄÍÊ-ïîë³ìåðàçè ñòຠíåìîæëèâîþ,
à ñïîñòåð³ãàºòüñÿ ò³ëüêè ñåëåêòèâíà àìïë³-
ô³êàö³ÿ ìóòàíòíî¿ ÄÍÊ. Âèêîðèñòîâóþ÷è
öåé âàð³àíò ÏËÐ äëÿ äåòåêö³¿ ðåçèñòåíòíèõ
äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó,
áëîêóâàííÿ ñèíòåçó ÄÍÊÏ çä³éñíþâàëè çà
äîïîìîãîþ ïðàéìåðà, ùî ì³ñòèâ íà 3’-
ê³íö³ ôîñôàòíó ãðóïó, ÿêà ïðèçâîäèëà äî
òåðì³íàö³¿ ñèíòåçó ÄÍÊÏ.
Ó ðîáîò³ ñòâîðåíî äâà íàáîðè ïðàéìå-
ð³â – Mykat4–Mykat5–Mykat5P òà Mykat4–
Mykat9–Mykat9P ç âèêîðèñòàííÿì íóêëåî-
òèäà ç ïðèºäíàíîþ ÐÎ4-ãðóïîþ íà 3’-ê³íö³,
ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç ÿêèìè äîçâîëÿº âèçíà÷à-
òè òèï òî÷êîâèõ ìóòàö³é AGC ACC (ðèñ. 2,
â) òà AGC ACA, AGC AGA â³äïîâ³äíî.
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 39
Ïðî òå, ùî êîíêóðåíòíèé ïðàéìåð Ìyêat5P
ä³éñíî áëîêóº ñèíòåç ÄÍÊÏ, ñâ³ä÷èòü â³ä-
ñóòí³ñòü àìïë³êîíà ïðè ïðîâåäåíí³ àìïë³-
ô³êàö³¿ ç öèì ïðàéìåðîì òà ïðàéìåðîì Ìy-
kat4 (ðèñ. 2, â). ³äñóòí³ñòü áëîêóþ÷îãî
ïðàéìåðà Ìykat5P ïðèçâîäèëà äî íåñåëåê-
òèâíî¿ àìïë³ô³êàö³¿ ôðàãìåíò³â ÄÍÊ ì³êî-
áàêòåð³é òóáåðêóëüîçó ÿê äèêîãî òèïó, òàê
³ òèõ, ùîì³ñòÿòü ð³çí³ ìîæëèâ³ ìóòàö³¿ â
êîäîí³ 315 ãåíà katG (äîð³æêè 5 òà 7,
ðèñ. 2, â). Ââåäåííÿ áëîêóþ÷îãî ïðàé-
ìåðà ïðèçâîäèëî ò³ëüêè äî ñèíòåçó àì-
ïë³êîíà, ùî ì³ñòèòü ìóòàö³þ AGC ACC
(äîð³æêà 2, ðèñ. 2, â), òà äî íåìîæëèâîñò³
àìïë³ô³êàö³¿ íåñïåöèô³÷íèõ ôðàãìåíò³â.
Àíàëîã³÷í³ ðåçóëüòàòè îòðèìàíî äëÿ íàáîðó
ïðàéìåð³â Mykat4–Mykat9–Mykat9P, ÿêèé
äîçâîëÿº âèçíà÷àòè ìóòàö³þ AGC AGA
ó êîäîí³ 315 ãåíà katG (ðåçóëüòàòè íå ïî-
êàçàíî).
Àëåëü-ñïåöèô³÷íà ÏËÐ ç LNA-ìîäèô³êî-
âàíèìè ïðàéìåðàìè îñíîâàíà íà òîìó,
ùî òåìïåðàòóðà ïëàâëåííÿ (à îòæå, ³ òåì-
ïåðàòóðà â³äïàëó) êîìïëåêñó ïðàéìåð –
îäíîíèòêîâà ÄÍÊ-ìàòðèöÿ äëÿ ìóòàíò-
íîãî òèïó íèæ÷å òåìïåðàòóðè ïëàâëåííÿ
äîñêîíàëîãî äóïëåêñà. Öå îçíà÷àº, ùî çà
íàÿâíîñò³ òî÷êîâî¿ ìóòàö³¿ ó ñàéò³, ùî
ì³ñòèòü LNA-íóêëåîòèä, êîìïëåêñ ïðàé-
ìåð – îäíîíèòêîâà ÄÍÊ-ìàòðèöÿ áóäå
ìàòè á³ëüø íèçüêó òåìïåðàòóðó ïëàâëåííÿ
(Òm) ïîð³âíÿíî ç äîñêîíàëèì äóïëåêñîì.
Ðèñ. 2. Ñõåìà àëåëü-ñïåöèô³÷íî¿ ÏËÐ äëÿ âèçíà÷åííÿ òî÷êîâî¿ ìóòàö³¿: AGC ACC â êîäîí³ 315 ãåíà
katG ç âèêîðèñòàííÿì äîäàòêîâîãî áëîêóþ÷îãî êîíêóðåíòíîãî çâîðîòíîãî ïðàéìåðà ç 3’-òåðì³íàëüíîþ
ôîñôàòíîþ ãðóïîþ (äëÿ åë³ì³íàö³¿ àìïë³ô³êàö³¿ ÄÍÊ àëåëÿ äèêîãî òèïó). 3’-ê³íöåâèé íóêëåîòèä
cïåöèô³÷íîãî äî ìóòàö³¿ ïðàéìåðà Mykat5 º êîìïëåìåíòàðíèì (à) òà íåêîìïëåìåíòàðíèì (á) äî íóêëåî-
òèäà ó äðóã³é ïîçèö³¿ êîäîíó 315; â – äåòåêö³ÿ òî÷êîâî¿ ìóòàö³¿ AGC ACC ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ÄÍÊ
ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó, àñîö³éîâàíî¿ ç ðåçèñòåíòí³ñòþ äî ³çîí³àçèäó, ï³ñëÿ ïðîâåäåííÿ ïîë³ìåðàçíî¿
ëàíöþãîâî¿ ðåàêö³¿ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â Mykat4–Mykat5–Mykat5P òà åëåêòðîôîðåçó â 2%-íîìó àãàðîç-
íîìó ãåë³; 1, 5, 9 – ÄÍÊ M. tuberculosis øòàìó HB385, ùî ì³ñòèòü ìóòàö³þ AGC AGA; 2, 6, 10 – ÄÍÊ M.
tuberculosis øòàìó HB125, ùî ì³ñòèòü ìóòàö³þ AGC ACC; 3, 7, 11 – ÄÍÊ M. tuberculosis øòàìó H37Rv,
íåãàòèâíèé êîíòðîëü àìïë³ô³êàö³¿ (êîäîí 315 – AGC); 4, 8, 12 – âîäà, íåãàòèâíèé êîíòðîëü àìïë³ô³êàö³¿.
Çà óìîâè âèáîðó îïòèìàëüíî¿ òåìïåðàòóðè â³äïàëó íàá³ð ïðàéìåð³â Mykat4–Mykat5–Mykat5P äîçâîëÿº
äèôåðåíö³þâàòè ìóòàö³þ AGC ACC (äîð³æêà 2) â³ä ìóòàö³¿ AGC AGA (äîð³æêà 1) òà ïîñë³äîâíîñò³
AGC ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é (äîð³æêà 3). ϳäêðåñëåíî ïîçèö³¿ òî÷êîâèõ ìóòàö³é
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
40 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
Ñòîñîâíî ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó ìîëå-
êóëè ÄÍÊ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó º äîñêîíà-
ëèìè äóïëåêñàìè, à ÄÍÊ ðåçèñòåíòíèõ äî
³çîí³àçèäó ³çîëÿò³â õàðàêòåðèçóºòüñÿ íàÿâ-
í³ñòþ ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà katG, òà,
îòæå, ìຠá³ëüø íèçüêó òåìïåðàòóðó ïëàâ-
ëåííÿ. Âàæëèâî çàçíà÷èòè, ùî âåëè÷èíà
çì³íè Òm êîìïëåêñó LNA-ïðàéìåð – ÄÍÊ-
ìàòðèöÿ çà íàÿâíîñò³ îäíîíóêëåîòèäíîãî
ïîë³ìîðô³çìó çàëåæèòü ÿê â³ä ê³ëüêîñò³ LNA-
ìîíîìåð³â, òàê ³ â³ä äîâæèíè ïðàéìåðà.
Ââåäåííÿ LNA-íóêëåîòèä³â äîçâîëÿº çá³ëü-
øèòè äèñêðèì³íóþ÷ó ïîòóæí³ñòü ïðàéìåðà.
 LNA-ìîäèô³êîâàíèõ ïðàéìåðàõ äåÿê³
Ðèñ. 3. Locked nucleic acid, àáî çàìêíåíà íóêëå¿íîâà êèñëîòà (ÇÍÊ), õ³ì³÷íèé àíàëîã ìîíîìåðà ÄÍÊ
(à), ÿêèé ìîæå çàì³ùóâàòè íóêëåîòèäè ó ïîñë³äîâíîñòÿõ ÄÍÊ òà ÐÍÊ (á). Ëîêàë³çàö³ÿ ïðàéìåð³â íà ãåí³
katG ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó â³äíîñíî êîäîíà 315, ìóòàö³¿ â ÿêîìó ç÷åïëåí³ ç ðåçèñòåíòí³ñòþ
äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî ïðåïàðàòó ïåðøîãî ðÿäó ³çîí³àçèäó. Íàáîðè ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA òà Mykat24–
Mykat25LNA äîçâîëÿþòü àìïë³ô³êóâàòè ôðàãìåíòè ãåíà katG, ùî ì³ñòèòü êîäîí 315, äîâæèíîþ 214 òà
110 ï.í. Ïðàéìåðè Ë8LNA òà Mykat25LNA ì³ñòÿòü ïî ï’ÿòü LNA-ìîäèô³êîâàíèõ íóêëåîòèä³â, äâà ç ÿêèõ
ôëàíêóþòü, à òðè º êîìïëåìåíòàðíèìè äî «+»-íèòêè (â) òà «–» -íèòêè (ã) â ä³ëÿíö³ êîäîíà 315 ãåíà katG.
Íàá³ð ïðàéìåð³â Mykat10–Mykat11 âèêîðèñòàíî ÿê ìàðêåð ìîëåêóëÿðíî¿ ìàñè äëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ôðàãìåí-
òà äîâæèíîþ 151 ï.í., ùî ì³ñòèòü êîäîí 315
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 41
íóêëåîòèäè çàì³ùåí³ LNA-ìîíîìåðàìè –
àíàëîãàìè íóêëåîòèä³â, ùî ì³ñòÿòü ìåòèëå-
íîâèé ì³ñòîê 2’-Î,4’-Ñ (ðèñ. 3), ÿêèé îá-
ìåæóº êîíôîðìàö³éíó ãíó÷ê³ñòü äåçîêñè-
ðèáîçíîãî ê³ëüöÿ òà ïåðåâîäèòü ìîíîìåð ó
æîðñòêó ñòðóêòóðó. Öå ïðèçâîäèòü äî ïîñè-
ëåííÿ ã³áðèäèçàö³¿ íèòêè, ùî ì³ñòèòü LNA-
ìîíîìåðè, ç êîìïëåìåíòàðíîþ íèòêîþ äóï-
ëåêñà. Âáóäîâóâàííÿ LNA-íóêëåîòèä³â çíà÷íî
çá³ëüøóº òåðì³÷íó ñòàá³ëüí³ñòü äóïëåêñà ïî-
ð³âíÿíî ç íåìîäèô³êîâàíîþ ÄÍÊ. Äëÿ 20-
÷ëåííîãî äóïëåêñà ââåäåííÿ îäíîãî äîäàòêî-
âîãî LNA-ìîíîìåðà ïðèçâîäèòü äî çá³ëü-
øåííÿ Òm íà ~ 1 Ñ. Òîìó äëÿ çá³ëüøåííÿ
äèñêðèì³íóþ÷î¿ ïîòóæíîñò³ ïðàéìåðà, ç
îäíîãî áîêó, âì³ñò LNA-ìîíîìåð³â ïîâè-
íåí áóòè â³äíîñíî âèñîêèì. Ç ³íøîãî áî-
êó, çá³ëüøåííÿ äîâæèíè ïðàéìåðà (äëÿ ï³ä-
âèùåííÿ ñïåöèô³÷íîñò³) âåäå äî çìåíøåííÿ
â³äíîñíîãî âíåñêó LNA-ìîíîìåðà (ïðè çáå-
ðåæåíí³ ¿õíüî¿ ê³ëüêîñò³) òà, îòæå, äî çìåí-
øåííÿ äèñêðèì³íóþ÷î¿ ïîòóæíîñò³ ïðàéìåðà.
Ó äàí³é ðîáîò³ äëÿ äåòåêö³¿ òî÷êîâèõ
ìóòàö³é, àáî îäíîíóêëåîòèäíèõ ïîë³ìîð-
ô³çì³â, ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ÌÒÁ ðîç-
ðîáëåíî äâà íàáîðè ïðàéìåð³â (Ë7–Ë8LNA òà
Mykat24–Myêat25LNA), êîæíèé ç ÿêèõ ì³ñ-
òèâ ïî îäíîìó LNA-ìîäèô³êîâàíîìó ïðàé-
ìåðó. Îáèäâà ö³ LNA-ìîäèô³êîâàí³ ïðàé-
ìåðè (Mykat25LNA òà Ë8LNA) äîâæèíîþ 17
íóêëåîòèä³â (í.) ì³ñòÿòü ïî ï’ÿòü LNA-ìîíî-
ìåð³â, ïðè÷îìó òðè LNA-ìîíîìåðè êîæ-
íîãî ïðàéìåðà º êîìïëåìåíòàðíèìè äî êî-
äîíà 315 ãåíà katG, à äâà ³íøèõ ôëàíêóþòü
âêàçàíèé êîäîí. Ïðèíöèïîâîþ ð³çíèöåþ
öèõ íàáîð³â ïðàéìåð³â º ëîêàë³çàö³ÿ LNA-
ìîäèô³êîâàíîãî ïðàéìåðà – â îäíîìó íà-
áîð³ (Ë7–Ë8LNA) LNA-ïðàéìåð êîìïëåìåí-
òàðíèé äî «+»-íèòêè ÄÍÊ (ðèñ. 3, â), à â
³íøîìó (Mykat24–Myêat25LNA) – äî «–»-
íèòêè ÄÍÊ (ðèñ. 3, ã).
Àíàë³ç ÏËÐ-ïðîäóêò³â àìïë³ô³êàö³¿ ïî-
êàçóº, ùî íàá³ð ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA äîçâî-
ëÿº àìïë³ô³êóâàòè ôðàãìåíò ãåíà katG î÷³-
êóâàíî¿ äîâæèíè 214 ï.í. ïðè òåìïåðàòóðàõ
â³äïàëó (Òan), ÿê³ ñòàíîâèëè 66 Ñ (äîð³æ-
êà 3, ðèñ. 4, à) òà 71 Ñ (äîð³æêè 3, 4,
ðèñ. 4, á). Àíàë³ç ÏËÐ-ïðîäóêò³â àìïë³-
ô³êàö³¿ ÄÍÊ ÌÒÁ çà íèçüêî¿ òåìïåðàòóðè
â³äïàëó ïîêàçóº, ùî îáèäâà íàáîðè ïðàé-
ìåð³â äîçâîëÿþòü àìïë³ô³êóâàòè ôðàãìåíò
ãåíà katG î÷³êóâàíî¿ äîâæèíè – 214 ï.í.
äëÿ íàáîðó ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA òà 110 ï.í.
äëÿ íàáîðó ïðàéìåð³â Mykat24–Mykat25LNA
(ðåçóëüòàòè íå ïîêàçàíî). ²íòåíñèâí³ñòü ñìóãè
àìïë³êîíà äîâæèíîþ 110 ï.í. çà Òan = 58 Ñ
Ðèñ. 4. Äåòåêö³ÿ ïðîäóêò³â àìïë³ô³êàö³¿ ôðàãìåíòà ãåíà katG ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó äèêîãî òèïó
(WT) òà ðåçèñòåíòíèõ (ç ìóòàö³ºþ â êîäîí³ 315 ãåíà katG) äî ³çîí³àçèäó (ÌÒ) ï³ñëÿ ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç íà-
áîðîì ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA òà åëåêòðîôîðåçó â 1,5%-íîìó àãàðîçíîìó ãåë³. Ë8 LNA – ìîäèô³êîâàíèé ïðàé-
ìåð, ùî ì³ñòèòü LNA-íóêëåîòèäè: à – òåìïåðàòóðà â³äïàëó Tan ñòàíîâèòü 66 C; 1 – ìàðêåð ìîëåêóëÿðíî¿
ìàñè – ôðàãìåíò äîâæèíîþ 151 ï.í., ùî ì³ñòèòü êîäîí 315, ï³ñëÿ àìïë³ô³êàö³¿ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â
Mykat10–Mykat11; 2, 3 – àìïë³ô³êàö³ÿ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA, ìóòàíòíèõ çà êîäîíîì 315 ãåíà
katG ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó (2) òà äèêîãî òèïó (3); 4 – íåãàòèâíèé êîíòðîëü àìïë³ô³êàö³¿.
Íàÿâí³ñòü ìóòàö³¿ â êîäîí³ 315 âåäå äî â³äñóòíîñò³ ñìóãè àìïë³êîíà äîâæèíîþ 214 ï.í. (2), ÿêà º õàðàê-
òåðíîþ äëÿ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó (3); á – òåìïåðàòóðà â³äïàëó Tan ñòàíîâèòü 71 C. Àìïë³ô³êàö³ÿ ôðàã-
ìåíòà äîâæèíîþ 214 ï.í. ç íàáîðîì ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA äëÿ ÄÍÊ ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó, ñò³éêèõ äî
³çîí³àçèäó (1, 2), òà ÄÍÊ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó (3, 4)
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
42 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
Ðèñ. 5. Ìàñ-ñïåêòðè ÷àñîïðîë³òíî¿ ìàòðè÷íî-àêòèâîâàíî¿
ëàçåðíî¿ äåñîðáö³¿/³îí³çàö³¿ (ÌÀËIJ) îë³ãîíóêëåîòèä³â Ë8LNA
(à) òà Mykat25LNA (á) äîâæèíîþ 17 íóêëåîòèä³â ç ï’ÿòüìà
LNA-ìîíîìåðàìè. ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòðè ïðàéìåð³â Ë8LNA
(â) òà Mykat25LNA (ã) ç âèñîêîþ ðîçä³ëüíîþ çäàòí³ñòþ.
Äèôåðåíö³éíèé ïðîô³ëü ïëàâëåííÿ äóïëåêñà, óòâîðåíîãî
îë³ãîíóêëåîòèäàìè Ë8 LNA–Mykat25LNA. Ïëàâëåííÿ ïðîâåäå-
íî ó 1 ìÌ êàêîäèëàò³ íàòð³þ (pH 7,0) çà øâèäêîñò³ íàãð³âó
0,5 Ñ/õâ (ä)
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 43
áóëà âêðàé íèçüêîþ. Á³ëüø òîãî, çà òèõ
òåìïåðàòóð â³äïàëó (Òan = 66–71 Ñ), ïðè
ÿêèõ ìîæëèâîþ áóëà äèôåðåíö³àö³ÿ ìó-
òàíòíèõ òà äèêèõ ³çîëÿò³â ãåíà katG ÌÒÁ çà
äîïîìîãîþ ÏËÐ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â Ë7–
Ë8LNA, àìïë³ô³êàö³ÿ ôðàãìåíòà ãåíà katG ç
ïðàéìåðàìè Mykat24–Mykat25LNA íå â³äáó-
âàëàñü. Òîìó á³ëüø³ñòü åêñïåðèìåíò³â ïðî-
âåäåíà ò³ëüêè ç íàáîðîì ïðàéìåð³â Ë7–Ë8LNA.
Âèêîðèñòàííÿ ÏËÐ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â
Ë7–Ë8LNA äîçâîëÿº äèôåðåíö³þâàòè ìóòàíò-
íèé òà äèêèé òèïè ãåíà katG ÌÒÁ (äîð³æêè
2 òà 3, ðèñ. 4): äëÿ äèêîãî òèïó ãåíà katG
àìïë³ô³êóºòüñÿ ôðàãìåíò ãåíà äîâæèíîþ
214 ï.í., ó òîé ÷àñ ÿê äëÿ ìóòàíòíîãî ³çîëÿòó
ÌÒÁ àìïë³êîí â³äñóòí³é (õî÷à àìïë³ô³êàö³ÿ
â³äáóâàºòüñÿ, ïðî ùî ñâ³ä÷èòü ñìóãà íåñïå-
öèô³÷íîãî àìïë³êîíà, ÿêà óòâîðþºòüñÿ âíàñ-
ë³äîê âèáîðó ïðàéìåðà Ë8LNA íåâåëèêî¿ äîâ-
æèíè). ²íòåíñèâí³ñòü ñìóãè íåñïåöèô³÷íîãî
àìïë³êîíà çìåíøóºòüñÿ ïðè ï³äâèùåíí³ Òan
â³ä 66 äî 71 Ñ (ó öüîìó âèïàäêó ïðîâîäèëè
äâîêðîêîâó ÏËÐ, ÿêà äîçâîëÿëà íàä³éíî
äèôåðåíö³þâàòè ³çîëÿòè ÌÒÁ ìóòàíòíîãî òà
äèêîãî òèï³â).
ßê ïîçèòèâíèé êîíòðîëü âèêîðèñòîâóâà-
ëè íàá³ð ïðàéìåð³â Mykat10–Mykat11. Ïðî-
âåäåííÿ ÏËÐ ç öèì íàáîðîì äîçâîëÿº àì-
ïë³ô³êóâàòè ôðàãìåíò ãåíà katG äîâæèíîþ
151 ï.í., ùî ì³ñòèòü ëîêóñ ç êîäîíîì 315
(ðèñ. 4, à, äîð³æêà 1). Íàñòóïíå ñåêâåíó-
âàííÿ äàíîãî êîðîòêîãî ÏËÐ-ïðîäóêòó äîç-
âîëèòü âèçíà÷èòè éîãî ïîñë³äîâí³ñòü òà
³äåíòèô³êóâàòè òèï ìóòàö³¿ ó êîäîí³ 315 ãåíà
katG äëÿ öèðêóëþþ÷èõ ó ðåã³îí³ êë³í³÷íèõ
³çîëÿò³â M. tuberculosis.
Äëÿ êîíòðîëþ ÿêîñò³ õ³ì³÷íîãî ñèíòåçó
îäíîíèòêîâèõ îë³ãîíóêëåîòèä³â ç LNA-ìîíî-
ìåðàìè çàñòîñîâóâàëè ÷àñîïðîë³òíó ÌÀËIJ-
ìàñ-ñïåêòðîìåòð³þ. Çàðåºñòðîâàí³ ÌÀËIJ-
ìàñ-ñïåêòðè îë³ãîíóêëåîòèä³â Ë8LNA òà
Mykat25LNA (ðèñ. 5, à–ã) âèêîðèñòàíî äëÿ
êîíòðîëþ çíÿòòÿ çàõèñòó ç ðåàêö³éíèõ ãðóï
àçîòèñòèõ îñíîâ íóêëåîòèä³â, à òàêîæ äëÿ
âèÿâëåííÿ äîì³øêè îë³ãîíóêëåîòèä³â ç â³ä-
ñóòí³ìè ëàíêàìè.
 ìàñ-ñïåêòðàõ LNA-ìîäèô³êîâàíèõ îë³ãî-
íóêëåîòèä³â (ðèñ. 5, à, á) çàðåºñòðîâàíî
ï³êè ç³ ñï³ââ³äíîøåííÿì ìàñà/çàðÿä (m/z)
5373,8 (Ë8LNA) òà 5347,3 (Mykat25LNA), ùî
ï³äòâåðäæóþòü íàÿâí³ñòü LNA-ìîíîìåð³â ó
ïðàéìåðàõ (òàáë. 2).
ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòðè ç âèñîêîþ ðîçä³ëü-
íîþ çäàòí³ñòþ (ðèñ. 5, â, ã) äîçâîëèëè
âñòàíîâèòè íàÿâí³ñòü íåâèëó÷åíèõ çàõèñíèõ
ãðóï íà ðåàêö³éíèõ ãðóïàõ íóêëåîòèä³â. ³-
äîìî, ùî äëÿ çàïîá³ãàííÿ ðîçãàëóæåííÿ
íèòêè îë³ãîíóêëåîòèäà â ïðîöåñ³ åëîíãà-
ö³¿ àì³íîãðóïè îñíîâ ó ôîñôîðàì³äèòàõ íó-
êëåîòèäè dG, dA òà dC çàáëîêîâàí³ [16]. Çà
íàÿâíîñò³ íåçíÿòèõ çàõèñíèõ ãðóï â ìàñ-
ñïåêòð³ îë³ãîíóêëåîòèäà, êð³ì î÷³êóâàíî¿
îñíîâíî¿ ñìóãè, ç’ÿâëÿþòüñÿ äîäàòêîâ³ ï³êè
á³ëüøî¿ ìàñè. Íàïðèêëàä, ³çîáóòèðèë (äëÿ
dG) òà áåíçî¿ë (äëÿ dA òà dC), ùî âèêî-
ðèñòîâóþòüñÿ äëÿ çàõèñòó àì³íîãðóï, çá³ëü-
øóþòü ìàñó îë³ãîíóêëåîòèäà íà 70 òà 104 Äà
â³äïîâ³äíî [17].
 ìàñ-ñïåêòð³ îë³ãîíóêëåîòèäà Ë8LNA
(ðèñ. 5, à), êð³ì îñíîâíîãî ï³êà î÷³êóâàíî¿
ìàñè ç m/z 5373,8, çàðåºñòðîâàíèé ï³ê ìåíøî¿
ìàñè ç m/z 4755,7, ÿêèé ìîæå â³äïîâ³äàòè
Òàáëèöÿ 2
Ïàðàìåòðè îë³ãîíóêëåîòèä³â, ùî ì³ñòÿòü LNA-ìîäèô³êîâàí³ ìîíîìåðè, ÿê³ îõàðàêòåðèçîâàíî
çà äîïîìîãîþ ÷àñîïðîë³òíî¿ ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòðîìåòð³¿
Ïðèì³òêà. LNA-ìîäèô³êîâàí³ íóêëåîòèäè íàâåäåíî âåëèêèìè ë³òåðàìè òà ï³äêðåñëåíî. *Î÷³êóâàí³
ôîðìóëè òà ìîëåêóëÿðí³ ìàñè ñïîëóê.
Îë³ãîíóêëåîòèä Ïîñë³äîâí³ñòü
Ôîðìóëà/ìîëåêóëÿðíà ìàñà
íåìîäèô³êîâàíèé
îë³ãîíóêëåîòèä
îë³ãîíóêëåîòèä
ç LNA-ìîíîìåðàìè
Mykat25LNA
Ë8LNA
5’-gatcacCAGCGgcatcg-3’
5’-cgatgcCGCTGgtgatc-3’
C164H207N67O98P16 5180,4
C165H209N63O102P16 5202
C169H207N67O103P16 5320,4*
C170H209N63O107P16 5342*
-
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
44 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
á³ëüø êîðîòêîìó îë³ãîíóêëåîòèäó äîâæèíîþ
15 í. Äåòåêö³ÿ òàêîãî á³ëüø êîðîòêîãî
îë³ãîíóêëåîòèäà â ÌÀËIJ-ìàñ-ñïåêòð³ ïî-
ÿñíþº âèñîêó ³íòåíñèâí³ñòü íåñïåöèô³÷-
íîãî àìïë³êîíà, ùî óòâîðþºòüñÿ ïðè ïðî-
âåäåíí³ ÏËÐ ç ïðàéìåðàìè Ë7–Ë8LNA.
Ñï³ââ³äíîøåííÿ ïëîù ï³ä ãðóïîþ ï³ê³â î÷³-
êóâàíî¿ ìàñè (m/z 5373,8) òà ìåíøî¿ ìàñè
(m/z 4755,7) ïîêàçóº, ùî îë³ãîíóêëåîòèä
äîâæèíîþ 15 í. ñòàíîâèòü áëèçüêî 25 %
çàãàëüíî¿ ê³ëüêîñò³ Ë8LNA, ùî ö³ëêîì äî-
ñòàòíüî äëÿ ïðîâåäåííÿ ÏËÐ (êîíöåíòðàö³ÿ
ïðàéìåðà Ë8LNA ïðè ïðîâåäåíí³ ÏËÐ ñòà-
íîâèòü 0,5–1 ìêÌ).
²ñòîòíèì íåäîë³êîì ñèíòåçîâàíèõ îë³ãî-
íóêëåîòèä³â ç LNA-ìîíîìåðàìè º íàÿâí³ñòü
ãðóïè ï³ê³â çàì³ñòü îäíîãî ï³êà î÷³êóâàíî¿
ìàñè (òàáë. 2), ÿê öå ïîâèííî ìàòè ì³ñöå ó
âèïàäêó êîðåêòíîãî ñèíòåçó [18]. Á³ëüø³ñòü
öèõ äîäàòêîâèõ ï³ê³â, ìîæëèâî, º ðåçóëü-
òàòîì íåïîâíîãî çíåñîëåííÿ çðàçêà, ùî
ì³ñòèòü îë³ãîíóêëåîòèä.
Ïðàéìåðè Ë8LNA òà Myêat25LNA ç äâîõ
ð³çíèõ íàáîð³â ïðàéìåð³â ñêîíñòðóéîâàíî
òàêèì ÷èíîì, ùî âîíè º êîìïëåìåíòàð-
íèìè îäèí îäíîìó òà ìîæóòü óòâîðèòè äó-
ïëåêñ äîâæèíîþ 17 ï.í. Òåîðåòè÷íî ðîç-
ðàõîâàíå çíà÷åííÿ òåìïåðàòóðè ïëàâëåííÿ
(Òm) íåìîäèô³êîâàíîãî äóïëåêñà Ë8–
Mykat25 ñòàíîâèòü 45 Ñ çà ³îííî¿ ñèëè (I)
1 ìÌ Na+. Çàì³íà LNA-ìîíîìåðàìè ï’ÿòè
íóêëåîòèä³â ó êîæí³é íèòö³ ïðèçâîäèòü äî
ð³çêîãî çá³ëüøåííÿ (äî 88 Ñ) òåìïåðàòóðè
ïëàâëåííÿ äóïëåêñà Ë8LNA–Mykat25LNA
(ðèñ. 5, ä). Âèäíî, ùî âíåñîê îäí³º¿ ïàðè
LNA-ìîäèô³êîâàíèõ íóêëåîòèä³â ó ï³äâè-
ùåííÿ òåìïåðàòóðè ïëàâëåííÿ 17-÷ëåí-
íîãî äóïëåêñà ñòàíîâèòü 8,6 Ñ, à îäíîãî
LNA-íóêëåîòèäà – 4,3 Ñ.  òîé æå ÷àñ äëÿ
17-÷ëåííîãî îë³ãîíóêëåîòèäíîãî äóïëåêñà
L8LNA–Mykat25 ïðè ìîäèô³êàö³¿ íóêëåîòèä³â
ò³ëüêè îäí³º¿ íèòêè âèçíà÷åíà ç òåîðåòè÷íî
ðîçðàõîâàíîãî çíà÷åííÿ òåìïåðàòóðè ïëàâ-
ëåííÿ âåëè÷èíà Òm ñòàíîâèòü 2,8 Ñ (ðå-
çóëüòàòè íå ïîêàçàíî). Òàêèì ÷èíîì, LNA-
ìîäèô³êàö³ÿ ï’ÿòè íóêëåîòèä³â â îáîõ íèòêàõ
äóïëåêñà âåäå äî çíà÷íî ñèëüí³øî¿ ñòàá³ë³çàö³¿
äóïëåêñà, í³æ ìîæíà áóëî î÷³êóâàòè, âèõî-
äÿ÷è ç òåîðåòè÷íèõ ðîçðàõóíê³â, åêñòðàïî-
ëþþ÷è äàí³ îäíîíèòêîâî¿ LNA-ìîäèô³êàö³¿
íà âèïàäîê LNA-ìîäèô³êàö³¿ îáîõ íèòîê
äóïëåêñà. Çàçíà÷èìî, ùî òåîðåòè÷íå âèçíà-
÷åííÿ Òm çà äîïîìîãîþ ïðîãðàìè [15] ìîæ-
ëèâå ò³ëüêè äëÿ âèïàäêó LNA-ìîäèô³êàö³¿
íóêëåîòèä³â îäí³º¿ íèòêè äóïëåêñà.
Ïðîâåäåí³ åêñïåðèìåíòè ç ïëàâëåííÿ
îë³ãîíóêëåîòèäíîãî äóïëåêñà Ë8LNA –My-
kat25 LNA ïðè çíà÷åííÿõ ³îííî¿ ñèëè I =
= 5 ìM Na+ òà I = 50 ìM Na+ äîçâîëèëè
çàðåºñòðóâàòè ò³ëüêè ïî÷àòîê ³íòåðâàëó ïëàâ-
ëåííÿ ÷åðåç âèñîêó Òm äóïëåêñà (ðåçóëüòàòè
íå íàâåäåíî). Öå ïîÿñíþºòüñÿ ðîñòîì Òm
äóïëåêñà ç³ çá³ëüøåííÿì ³îííî¿ ñèëè ðîç-
÷èíó ïðèáëèçíî ïðîïîðö³éíî ëîãàðèôìó
êîíöåíòðàö³¿ êàò³îí³â [19].
Íà îñíîâ³ ðîçðîáëåíèõ òåõíîëîã³é äå-
òåêö³¿ ³çîëÿò³â äèêîãî/ìóòàíòíîãî òèïó ÌÒÁ
òà âèçíà÷åííÿ òèïó òî÷êîâèõ ìóòàö³é, ç÷å-
Ðèñ. 6. Ñõåìà àíàë³çó êë³í³÷íîãî çðàçêà íà íàÿâ-
í³ñòü ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó, âèçíà÷åííÿ ñò³é-
êîñò³/÷óòëèâîñò³ ³çîëÿòó ÌÒÁ ïî â³äíîøåííþ äî
³çîí³àçèäó òà òèïó òî÷êîâî¿ ìóòàö³¿ â êîäîí³ 315
ãåíà katG, àñîö³éîâàíî¿ ç ðåçèñòåíòí³ñòþ äî
³çîí³àçèäó
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 45
ïëåíèõ ç ðåçèñòåíòí³ñòþ äî ³çîí³àçèäó, íàìè
çàïðîïîíîâàíà ñõåìà àíàë³çó êë³í³÷íîãî çðàç-
êà íà íàÿâí³ñòü ÌÒÁ, âèçíà÷åííÿ ðåçèñòåíò-
íîñò³ äî ³çîí³àçèäó òà óòî÷íåííÿ, ó âèïàäêó
íàÿâíîñò³, òèïó òî÷êîâî¿ ìóòàö³¿ (ðèñ. 6). Õà-
ðàêòåðíîþ îñîáëèâ³ñòþ äàíî¿ ñõåìè, íà íàø
ïîãëÿä, º ìîæëèâ³ñòü øâèäêîãî âèçíà÷åííÿ
³çîëÿò³â äèêîãî òèïó ÌÒÁ (òîáòî ÷óòëèâèõ äî
³çîí³àçèäó), ùî äîçâîëÿº äëÿ ïåðâèííèõ õâî-
ðèõ íåãàéíî ïî÷àòè ïðîâåäåííÿ êóðñó õ³ì³î-
òåðàﳿ, ùî âêëþ÷ຠ³ ³çîí³àçèä. Äëÿ òîãî ùîá
âèçíà÷èòè íàëåæí³ñòü êë³í³÷íîãî ³çîëÿòó M.
tuberculosis äî äèêîãî àáî ìóòàíòíîãî òèïó,
íåîáõ³äíî ïðîâåñòè äåòåêö³þ øåñòè âàð³àíò³â
òî÷êîâèõ ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ÌÒÁ
çà äîïîìîãîþ ìóëüòèïëåêñíî¿ ÏËÐ ç âèêî-
ðèñòàííÿì øåñòè ïàð ïðàéìåð³â. Ó òîé æå
÷àñ âèêîðèñòàííÿ ñòàíäàðòíî¿ ÏËÐ ç LNA-
ìîäèô³êîâàíèìè ïðàéìåðàìè äîçâîëÿº çíà÷-
íî ñïðîñòèòè êîíñòðóþâàííÿ íàáîðó ïðàéìå-
ð³â.  îñòàííüîìó âèïàäêó äîñòàòíüî âèêî-
ðèñòàòè ò³ëüêè îäíó ïàðó ïðàéìåð³â, îäèí ç
ÿêèõ ì³ñòèòü 3–5 LNA-íóêëåîòèä³â, êîìïëå-
ìåíòàðíèõ (àáî êîìïëåìåíòàðíèõ òà ôëàíêó-
þ÷èõ) êîäîíó ç ìóòàö³ÿìè, ùî äîñë³äæóþòü.
Ðîçðîáëåí³ ïðàéìåðè, ï³äñèëåí³ LNA-
ìîíîìåðàìè, îð³ºíòîâàí³ íà ñòàíäàðòíèé âà-
ð³àíò îáëàäíàííÿ êë³í³÷íî¿ ëàáîðàòîð³¿, áåç
çàñòîñóâàííÿ ÏËÐ ó ðåàëüíîìó ÷àñ³ (ÏËÐ-
Ð×). Àëå, âðàõîâóþ÷è âðàæàþ÷³ òåìïè ðîç-
âèòêó ìåäè÷íî¿ á³îòåõíîëî㳿 âçàãàë³ òà
øâèäêîãî ïîøèðåííÿ òåõíîëî㳿 ÏËÐ-Ð×
çîêðåìà, ìîæíà î÷³êóâàòè, ùî ó íàéáëèæ-
÷îìó ìàéáóòíüîìó â³äáóâàòèìåòüñÿ ìîäåðí³-
çàö³ÿ ä³àãíîñòè÷íèõ ëàáîðàòîð³é îáëàäíàí-
íÿì äëÿ ïðîâåäåííÿ ÏËÐ-Ð×. À äëÿ îòðè-
ìàííÿ îïòèìàëüíèõ ðåçóëüòàò³â çà äîïîìî-
ãîþ ÏËÐ-Ð× íåîáõ³äíèé âèñîêèé ð³âåíü
î÷èñòêè ïðàéìåð³â òà ïðîá ç ìåòîþ ì³í³-
ì³çàö³¿ ôîíîâîãî ñèãíàëó ôëóîðåñöåíö³¿.
Ç îãëÿäó íà öå î÷èñòêà îë³ãîíóêëåîòèä³â
çà äîïîìîãîþ ÏÀÀÃ (íà îñíîâ³ ¿õíüî¿ ìî-
ëåêóëÿðíî¿ ìàñè) äîçâîëÿº âèäàëèòè á³ëüø³ñòü
óêîðî÷åíèõ îë³ãîìåð³â, àëå ìຠòåíäåíö³þ çà-
íèæóâàòè çàãàëüíèé âèõ³ä îë³ãîíóêëåîòèäà.
Âèêîðèñòàííÿ ïîäâ³éíî¿ î÷èñòêè – çà äî-
ïîìîãîþ ÂÅÐÕ (âèñîêîåôåêòèâíî¿ ð³äèííî¿
õðîìàòîãðàô³¿) ï³ñëÿ ïðîâåäåííÿ ÏÀÀà –
äîçâîëÿº îòðèìàòè íàéâèùèé ð³âåíü î÷èñòêè,
àëå ïðè ì³í³ìàëüíîìó âèõîä³.  òîé æå ÷àñ çà
äîïîìîãîþ î÷èñòêè çâîðîòíî-ôàçîâîþ ÂÅÐÕ
ìîæíà îòðèìàòè âèñîêèé ð³âåíü î÷èñòêè òà
âèõîäó ïðîäóêòó.
Ïîÿâà ïåðøèõ âèñîêîòåõíîëîã³÷íèõ ñè-
ñòåì çàê³í÷åíîãî öèêëó, òàêèõ ÿê GeneX-
pert System (Cepheid Inc., ÑØÀ) [20], ùî
áàçóþòüñÿ íà ÏËÐ-Ð×, äîçâîëèëà ñêîðî-
òèòè ÷àñ ãåíîòèïóâàííÿ àáî àíàë³çó çðàçêà
íà íàÿâí³ñòü ³íôåêö³éíîãî çáóäíèêà äî 30–
45 õâ, à âèçíà÷åííÿ ðåçèñòåíòíîñò³ ³çîëÿò³â
ÌÒÁ äî ð³ôàìï³öèíó òà ³çîí³àçèäó – äî 2 ãîä.
Òàê³ ñèñòåìè ìîæóòü ñëóæèòè àëüòåðíàòèâîþ
âèñîêîâàðò³ñíèì ðåôåðåíñ-ëàáîðàòîð³ÿì, îñ-
ê³ëüêè íå ïîòðåáóþòü ñïåö³àë³çîâàíîãî ïåð-
ñîíàëó òà ëàáîðàòîðíèõ ïðèì³ùåíü. Âàæ-
ëèâî, ùî êë³í³÷íèé ìàòåð³àë (íàïðèêëàä,
êðàïëÿ êðîâ³) ïåðåíîñèòüñÿ äî îäíîðàçîâî-
ãî êàðòðèäæó, ÿêèé ì³ñòèòü ë³îô³ëüíî âèñó-
øåí³ êóëüêè ç êîìïîíåíòàìè äëÿ ÏËÐ (ÄÍÊ-
ïîë³ìåðàçà, íóêëåîòèäè, ïðàéìåðè, ñêîðï³î-
íîâ³ ïðîáè òà ïðàéìåðè äëÿ íîðìàëüíî¿ òà
ìóòàíòíî¿ ÄÍÊ).
Òàêèì ÷èíîì, ó ðîáîò³ ðîçðîáëåíî äâà ìå-
òîäè äåòåêö³¿ òî÷êîâèõ ìóòàö³é ó êîäîí³ 315
ãåíà katG ì³êîáàêòåð³é òóáåðêóëüîçó.  îäíî-
ìó ç íèõ ï³äâèùåííþ äèñêðèì³íóþ÷î¿ ïîòóæ-
íîñò³ íàáîðó ïðàéìåð³â ñïðèÿº çàñòîñóâàííÿ
ìîëåêóëÿðíî¿ òåõíîëî㳿 (íà îñíîâ³ ñòàíäàðò-
íî¿ ÏËÐ ç âèêîðèñòàííÿì äîäàòêîâîãî áëî-
êóþ÷îãî ïðàéìåðà ç 3’-ê³íöåâîþ ôîñôàòíîþ
ãðóïîþ) äëÿ âèçíà÷åííÿ âàð³àíò³â òî÷êîâèõ
ìóòàö³é ó êîäîí³ 315 ãåíà katG ì³êîáàêòåð³é
òóáåðêóëüîçó, ÿê³ àñîö³éîâàí³ ç ðåçèñòåíòí³ñòþ
äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî ïðåïàðàòó ïåðøîãî
ðÿäó ³çîí³àçèäó.  ðîáîò³ ñòâîðåíî äâà íà-
áîðè ïðàéìåð³â: Mykat4–Mykat5–Mykat5P òà
Mykat4–Mykat9–Mykat9P, ïðîâåäåííÿ ÏËÐ ç
ÿêèìè äîçâîëÿº äåòåêòóâàòè òî÷êîâ³ ìóòàö³¿
AGC ACC òà AGC ACA, AGC AGA
â³äïîâ³äíî. Äðóãèé ìåòîä ³ç çàñòîñóâàííÿì
ÏËÐ ç íàáîðîì ïðàéìåð³â, îäèí ç ÿêèõ ì³ñ-
òèòü LNA-ìîíîìåðè, ùî êîìïëåìåíòàðí³
ïîñë³äîâíîñò³ êîäîíà 315 ãåíà katG ÌÒÁ,
äîçâîëÿº äèôåðåíö³þâàòè ³çîëÿòè ì³êîáàêòå-
ð³é òóáåðêóëüîçó äèêîãî òà ìóòàíòíîãî òèï³â.
Ñòâîðåí³ ìîëåêóëÿðíî-ãåíåòè÷í³ òåñò-
ñèñòåìè äëÿ âèÿâëåííÿ ³çîëÿò³â äèêîãî òèïó òà
ðåçèñòåíòíèõ ÌÒÁ äî ïðîòèòóáåðêóëüîçíîãî
ïðåïàðàòó ïåðøîãî ðÿäó ³çîí³àçèäó ìîæóòü
çàñòîñîâóâàòèñÿ ó êë³í³÷íèõ ëàáîðàòîð³ÿõ ç³
Î.Þ. Ëèìàíñüêà, Î.Ï. Ëèìàíñüêèé
46 ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6
ñòàíäàðòíèì ÏËÐ-îáëàäíàííÿì òà, íà äóìêó
àâòîð³â, äîçâîëÿòü ñêîðîòèòè âèçíà÷åííÿ ðå-
çèñòåíòíîñò³ ÌÒÁ äî ³çîí³àçèäó ç 1–3 ì³ñÿö³â
òðàäèö³éíèìè áàêòåð³îëîã³÷íèìè ìåòîäàìè
äî 1–3 äí³â çà äîïîìîãîþ ÏËÐ.
Ðîáîòà ÷àñòêîâî ï³äòðèìàíà ãðàíòîì ÀÌÍ
95/2010 â³ä Íàö³îíàëüíî¿ àêàäå쳿 ìåäè÷íèõ íàóê
Óêðà¿íè, à òàêîæ Öåíòðîì êîëåêòèâíîãî êî-
ðèñòóâàííÿ ïðèëàäîì «Ìàñ-ñïåêòðîìåòðè÷íèé
êîìïëåêñ ç ëàçåðíîþ äåñîðáö³ºþ òà ³îí³çàö³ºþ
Autoflex II» ÍÀÍ Óêðà¿íè. Àâòîðè âèñëîâëþþòü
ïîäÿêó ä-ðó Â.Ì. Ñòåïàíøèí³é (Äåðæàâíèé íà-
óêîâèé öåíòð ïðèêëàäíî¿ ì³êðîá³îëî㳿 òà á³î-
òåõíîëî㳿, ÐÔ), ïðîô. X. Wu (²íñòèòóò äîñë³-
äæåííÿ òóáåðêóëüîçó, Êèòàé), Ò.Â. Ôåñåíêî
(²íñòèòóò õ³ì³¿ ïîâåðõí³ ³ì. Î.Î. ×óéêà ÍÀÍ
Óêðà¿íè) çà äîïîìîãó â ïðîâåäåíí³ äîñë³äæåíü.
O.Yu. Limanskaya, A.P. Limanskii
MOLECULAR TECHNOLOGIES
IN DETECTING SENSITIVE
AND ISONIAZID-RESISTANT
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Two types of techniques for detection of single
nucleotide polymorphism in 315 codon of katG gene
of MTB are developed. Isoniazid resistance of MTB
is associated with point mutations in the mentioned
codon. Two primer sets with additional competitive
blocking primer containing 3’-terminal phosphate
group (for elimination of unspecific amplification)
allow detecting the most frequent point mutations
AGC ACC and AGC AGA in 315 codon of katG
gene. PCR with primer set of two primers one of which
contains five LNA-monomers allows to determine an
occurrence of any type from six known mutations in
315 codon of katG gene, i.e. to differentiate wild type
and isoniazid-resistant MTB. Purity and structure of
17 bp long primers with LNA-modified nucleotides
were characterized by time-of-flight MALDI-mass
spectrometry. Duplex of 17 bp length formed by two
complementary oligonucleotides with LNA-monomers
was studied using melting.
Î.Þ. Ëèìàíñêàÿ, À.Ï. Ëèìàíñêèé
ÌÎËÅÊÓËßÐÍÛÅ ÒÅÕÍÎËÎÃÈÈ
 ÄÅÒÅÊÖÈÈ ×ÓÂÑÒÂÈÒÅËÜÍÛÕ
È ÓÑÒÎÉ×ÈÂÛÕ Ê ÈÇÎÍÈÀÇÈÄÓ
ÌÈÊÎÁÀÊÒÅÐÈÉ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ
Ðàçðàáîòàíû äâà âàðèàíòà äåòåêöèè îäíîíóêëåî-
òèäíûõ ïîëèìîðôèçìîâ â êîäîíå 315 ãåíà katG
ìèêîáàêòåðèé òóáåðêóëåçà (ÌÒÁ), ìóòàöèè â êî-
òîðîì àññîöèèðîâàíû ñ óñòîé÷èâîñòüþ ê èçîíèà-
çèäó – ïðîòèâîòóáåðêóëåçíîìó ïðåïàðàòó ïåðâîãî
ðÿäà. Äâà íàáîðà ïðàéìåðîâ, êàæäûé èç êîòîðûõ
ñîäåðæèò äîïîëíèòåëüíûé êîíêóðåíòíûé áëîêè-
ðóþùèé ïðàéìåð ñ 3’-òåðìèíàëüíîé ôîñôàòíîé
ãðóïïîé (äëÿ ýëèìèíàöèè íåñïåöèôè÷åñêîé àìïëè-
ôèêàöèè), ïîçâîëÿþò âûÿâëÿòü íàëè÷èå íàèáîëåå
÷àñòî âñòðå÷àþùèõñÿ òî÷å÷íûõ ìóòàöèé AGC ACC
è AGC AGA â êîäîíå 315 ãåíà katG. Ïðîâåäåíèå
ÏÖÐ ñ íàáîðîì èç äâóõ ïðàéìåðîâ, îäèí èç êî-
òîðûõ ñîäåðæèò ïÿòü LNA-ìîíîìåðîâ, ïîçâîëÿåò
îïðåäåëèòü íàëè÷èå ëþáîãî èç øåñòè èçâåñòíûõ
âàðèàíòîâ ìóòàöèé â êîäîíå 315 ãåíà katG, ò.å.
äèôôåðåíöèðîâàòü ÷óâñòâèòåëüíûå è ðåçèñòåíò-
íûå ê èçîíèàçèäó ÌÒÁ. ×èñòîòà è ñòðîåíèå ïðàé-
ìåðîâ äëèíîé 17 íóêëåîòèäîâ, ñîäåðæàùèõ LNA-
ìîäèôèöèðîâàííûå íóêëåîòèäû, îõàðàêòåðèçî-
âàíû âðåìÿïðîëåòíîé ìàññ-ñïåêòðîìåòðèåé ñ
ìàòðè÷íî-àêòèâèðîâàííîé ëàçåðíîé äåñîðáöèåé/
èîíèçàöèåé (MALDI-TOF), à 17-ìåðíûé äóïëåêñ,
îáðàçîâàííûé äâóìÿ êîìïëåìåíòàðíûìè îëèãîíó-
êëåîòèäàìè ñ LNA-ìîíîìåðàìè, – ìåòîäîì òåð-
ìè÷åñêîé äåíàòóðàöèè.
ÑÏÈÑÎÊ Ë²ÒÅÐÀÒÓÐÈ
1. Ñåðãèåâ Â.Ï., Ôèëàòîâ Í.Í. Èíôåêöèîííûå
áîëåçíè íà ðóáåæå âåêîâ. Îñîçíàíèå áèîëîãè-
÷åñêîé óãðîçû. – Ì.: Íàóêà, 2006. – 572 ñ.
2. Global tuberculosis control. Epidemiology, strategy,
financing. – Geneva : WHO Press, 2009. – P. 303.
3. Wu X., Zhang J., Liang J., Lu Y., Li H., Li C., Yue
J., Zhang L., Liu Z. Comparison of three methods
for rapid identification of mycobacterial clinical
isolates to the species level // J. Clin. Microbiol. –
2007. – 45, ¹ 6. – P. 1898–1903.
4. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A.,
Strizhkov B., Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O.,
Moroz A., Litvinov V., Vladimirskii M., Perelman M.,
Chernousova L., Erokhin V., Zasedatelev A., Mirz-
abekov A. Identification of rifampin-resistant My-
cobacterium tuberculosis strains by hybridization,
PCR, and ligase detection reaction on oligonucle-
otide microchips // J. Clin. Microbiol. – 2001. –
39, ¹ 7. – P. 2531–2540.
5. Wu X., Zhang J., Chao L., Liang J., Lu Y., Li
H., Yang Y., Liang Y., Li C. Identification of ri-
fampin-resistant genotypes in Mycobacterium tu-
berculosis by PCR-reverse dot blot hybridization //
Mol. Biotechnol. – 2009. – 41, ¹ 1. – P. 1–7.
6. Kolchinsky A., Mirzabekov A. Analysis of SNPs and
other genomic variations using gel-based chips //
Human Mutat. – 2002. – 19, ¹ 4. – P. 343–360.
7. Ëèìàíñêàÿ Î.Þ. Äåòåêöèÿ èçîëÿòîâ äèêîãî
òèïà è ðåçèñòåíòíûõ ê èçîíèàçèäó ìèêîáàêòå-
ðèé òóáåðêóëåçà // Òóáåðêóëåç è áîëåçíè ëåã-
êèõ. – 2010. – ¹ 9. – Ñ. 45–51.
Ìîëåêóëÿðí³ òåõíîëî㳿 â äåòåêö³¿ ÷óòëèâèõ òà ñò³éêèõ äî ³çîí³àçèäó ì³êîáàêòåð³é
ISSN 0564–3783. Öèòîëîãèÿ è ãåíåòèêà. 2011. ¹ 6 47
8. Orum H. PCR clamping // Curr. Issues Mol. Biol. –
2000. – 2, ¹ 11. – P. 27–30.
9. Strand H., Ingebretsen O., Nilssen O. Real-time
detection and quantification of mitochondrial
mutations with oligonucleotide primers containing
locked nucleic acid // Clin. Chim. Acta. – 2008. –
390, ¹ 1/2. – P. 126–133.
10. Dominguez P., Kolodney M. Wild-type blocking poly-
merase chain reaction for detection of single nucleo-
tide minority mutations from clinical specimens //
Oncogene. – 2005. – 24, ¹ 45. – P. 6830–6834.
11. Lipin M., Stepanshina V., Shemyakin I., Shinnick T.
Association of specific mutations in katG, rpoB, rpsL
and rrs genes with spoligotypes of multidrug-resistant
Mycobacterium tuberculosis isolates in Russia // Clin.
Microbiol. Infect. – 2007. – ¹ 13. – P. 620–626.
12. Nizova A.V., Stepanshina V.N., Majskaya N.V., Bo-
gun A.G., Majorov A.A., Shemyakin I.G. Analysis of
resistance for clinical strains of Mycobacterium tu-
berculosis to drug of the first and second lines //
Epidem. and Infec. Dis. – 2007. – ¹ 4. – P. 7–10.
13. Josefsen M., Lofstrom C., Sommer H., Hoorfar J.
Diagnostic PCR: Comparative sensitivity of four
probe chemistries // Mol. Cell Probes. – 2009. –
23, ¹ 3/4. – P. 201–203.
14. Áðîäñêèé Ë.È., Äðà÷åâ À.Ë., Òàòóçîâ Ð.Ë., ×ó-
ìàêîâ Ê.Ì. Ïàêåò ïðèêëàäíûõ ïðîãðàìì äëÿ
àíàëèçà ïîñëåäîâàòåëüíîñòåé áèîïîëèìåðîâ:
GeneBee // Áèîïîëèìåðû è êëåòêà. – 1991. –
7, ¹ 1. – Ñ. 10–14.
15. Von Ahsen N., Wittwer C., Schutz E. Oligonucle-
otide melting temperatures under PCR conditions:
nearest-neighbour corrections for Mg2+, deoxynu-
cleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide con-
centrations with comparison to alternative empirical
formulas // Clin. Chem. – 2001. – 47, ¹ 11. –
P. 1956–1961.
16. Èëüèíà Å.Í., Ãîâîðóí Â.Ì. Ìàññ-ñïåêòðîìåòðèÿ
íóêëåèíîâûõ êèñëîò â ìîëåêóëÿðíîé ìåäèöèíå //
Áèîîðãàí. õèìèÿ. – 2009. – 35, ¹ 2. – Ñ. 149–
164.
17. Sauer S. The essence of DNA sample preparation
for MALDI mass spectrometry // J. Biochem.
Biophys. Meth. – 2007. – 70, ¹ 2. – Ð. 311–
318.
18. Humeny A., Bonk T., Berkholz A.,Wildt L., Becker
C.-M. Genotyping of thrombotic risk factors by
MALDI-TOF mass spectrometry // Clin. Bio-
chem. – 2001. – 34, ¹ 6. – Ð. 531–536.
19. Âîëüêåíøòåéí Ì.Â. Áèîôèçèêà. – Ì.: Íàóêà,
1981. – 576 ñ.
20. Helb D., Jones M., Story E., Boehme C., Wallace
E., Ho K., Kop J., Owens M., Rodgers R., Banada
P., Safi H., Blakemore R., Lan N., Jones-Lo´pez
E., Levi M., Burday M., Ayakaka I., Mugerwa R.,
McMillan B., Winn-Deen E., Christel L., Dailey
P., Perkins M., Persing D., Alland D. Rapid detec-
tion of Mycobacterium tuberculosis and rifampin
resistance by use of on-demand, near-patient
technology // J. Clin. Microbiol. – 2010. – 48,
¹ 1. – P. 229–237.
Íàä³éøëà 29.10.10
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-66871 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0564-3783 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-11-24T15:43:06Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Лиманська, О.Ю. Лиманський, О.П. 2014-07-24T10:12:07Z 2014-07-24T10:12:07Z 2011 Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу / О.Ю. Лиманська, О.П. Лиманський // Цитология и генетика. — 2011. — Т. 45, № 6. — С. 34-47. — Бібліогр.: 20 назв. — укр. 0564-3783 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66871 579:579.873.2:615.015.8 Розроблено два варіанти детекції однонуклеотидних поліморфізмів у кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу (МТБ), мутації в якому асоційовані з резистентністю до ізоніазиду – протитуберкульозного препарату першого ряду. Два набори праймерів, кожний з яких містить додатковий конкурентний блокуючий праймер з 3’термінальною фосфатною групою (для елімінації неспецифічної ампліфікації), дозволяють у кодоні 315 гена katG виявляти точкові мутації AGC→ACC та AGC→AGA, що найчастіше зустрічаються. Проведення ПЛР з набором із двох праймерів, один з яких містить п’ять LNAмономерів, дозволяє встановити наявність будьякого з шести відомих варіантів мутацій у кодоні 315 гена katG, тобто диференціювати чутливі та резистентні до ізоніазиду МТБ. Чистоту та будову праймерів довжиною 17 нуклеотидів, що містять LNAмодифіковані нуклеотиди, охарактеризовано часопролітною мас-спектрометрією з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією, а 17мірний дуплекс, утворений двома комплементарними олігонуклеотидами з LNAмономерами, – методом термічної денатурації. Створені молекулярногенетичні тестсистеми для виявлення ізолятів дикого типу та резистентних МТБ до протитуберкульозного препарату першого ряду ізоніазиду можуть застосовуватися у клінічних лабораторіях зі стандартним ПЛРобладнанням та дозволяють скоротити визначення резистентності МТБ до ізоніазиду з 1–3 місяців стандартними бактеріологічними методами до 1–3 днів шляхом ПЛР. Разработаны два варианта детекции однонуклеотидных полиморфизмов в кодоне 315 гена katG микобактерий туберкулеза (МТБ), мутации в котором ассоциированы с устойчивостью к изониазиду – противотуберкулезному препарату первого ряда. Два набора праймеров, каждый из которых содержит дополнительный конкурентный блокирующий праймер с 3’-терминальной фосфатной группой (для элиминации неспецифической амплификации), позволяют выявлять наличие наиболее часто встречающихся точечных мутаций AGC→ACC и AGC→AGA в кодоне 315 гена katG. Проведение ПЦР с набором из двух праймеров, один из которых содержит пять LNA-мономеров, позволяет определить наличие любого из шести известных вариантов мутаций в кодоне 315 гена katG, т.е. дифференцировать чувствительные и резистентные к изониазиду МТБ. Чистота и строение праймеров длиной 17 нуклеотидов, содержащих LNA-модифицированные нуклеотиды, охарактеризованы времяпролетной масс спектрометрией с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF), а 17-мерный дуплекс, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами с LNA-мономерами, – методом термической денатурации. Two types of techniques for detection of single nucleotide polymorphism in 315 codon of katG gene of MTB are developed. Isoniazid resistance of MTB is associated with point mutations in the mentioned codon. Two primer sets with additional competitive blocking primer containing 3’-terminal phosphate group (for elimination of unspecific amplification) allow detecting the most frequent point mutations AGC ACC and AGC AGA in 315 codon of katG gene. PCR with primer set of two primers one of which contains five LNA-monomers allows to determine an occurrence of any type from six known mutations in 315 codon of katG gene, i.e. to differentiate wild type and isoniazid-resistant MTB. Purity and structure of 17 bp long primers with LNA-modified nucleotides were characterized by time-of-flight MALDI-mass spectrometry. Duplex of 17 bp length formed by two complementary oligonucleotides with LNA-monomers was studied using melting. Робота частково підтримана грантом АМН 95/2010 від Національної академії медичних наук України, а також Центром колективного користування приладом «Мас-спектрометричний комплекс з лазерною десорбцією та іонізацією Autoflex II» НАН України. Автори висловлюють подяку д-ру В.М. Степаншиній (Державний науковий центр прикладної мікробіології та біотехнолог ії, РФ), проф. X. Wu (Інститут дослідження туберкульозу, Китай), Т.В. Фесенко (Інститут хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України) за допомогу в проведенні досліджень. uk Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України Цитология и генетика Оригинальные работы Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу Молекулярные технологии в детекции чувствительных и устойчивых к изониазиду микобактерий туберкулеза Molecular technologies in detecting sensitive and isoniazidresistant mycobacterium tuberculosis Article published earlier |
| spellingShingle | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу Лиманська, О.Ю. Лиманський, О.П. Оригинальные работы |
| title | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| title_alt | Молекулярные технологии в детекции чувствительных и устойчивых к изониазиду микобактерий туберкулеза Molecular technologies in detecting sensitive and isoniazidresistant mycobacterium tuberculosis |
| title_full | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| title_fullStr | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| title_full_unstemmed | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| title_short | Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| title_sort | молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу |
| topic | Оригинальные работы |
| topic_facet | Оригинальные работы |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/66871 |
| work_keys_str_mv | AT limansʹkaoû molekulârnítehnologíívdetekcííčutlivihtastíikihdoízoníazidumíkobakteríituberkulʹozu AT limansʹkiiop molekulârnítehnologíívdetekcííčutlivihtastíikihdoízoníazidumíkobakteríituberkulʹozu AT limansʹkaoû molekulârnyetehnologiivdetekciičuvstvitelʹnyhiustoičivyhkizoniazidumikobakteriituberkuleza AT limansʹkiiop molekulârnyetehnologiivdetekciičuvstvitelʹnyhiustoičivyhkizoniazidumikobakteriituberkuleza AT limansʹkaoû moleculartechnologiesindetectingsensitiveandisoniazidresistantmycobacteriumtuberculosis AT limansʹkiiop moleculartechnologiesindetectingsensitiveandisoniazidresistantmycobacteriumtuberculosis |