Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс

Исследовано влияние липидов на активность нейтральной цистеиновой протеиназы – кальпаина – в субклеточных фракциях головного мозга крыс. Удаление из грубой митохондриальной фракции мозга до 23 % мембранного холестерина не приводило к изменению удельной активности кальпаина в этой фракции. Детергенты...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2009
Автори:	Колчинская, Л.И., Трикаш, И.О., Гуменюк, В.П., Малышева, М.К.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України 2009
Назва видання:	Нейрофизиология
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68270
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс / Л.И. Колчинская, И.О. Трикаш, В.П. Гуменюк, М.К. Малышева // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 37 назв. — рос.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68270
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-682702025-02-09T23:12:11Z Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс Вплив ліпідів на активність кальпаїну в субклітинних фракціях головного мозку щурів Effect of Lipids on the Activity of Calpain in Subcellular Fractions Obtained from the Rat Brain Колчинская, Л.И. Трикаш, И.О. Гуменюк, В.П. Малышева, М.К. Исследовано влияние липидов на активность нейтральной цистеиновой протеиназы – кальпаина – в субклеточных фракциях головного мозга крыс. Удаление из грубой митохондриальной фракции мозга до 23 % мембранного холестерина не приводило к изменению удельной активности кальпаина в этой фракции. Детергенты дигитонин и Тритон Х-100 в концентрации 0.3 % повышали активность кальпаина в грубой митохондриальной фракции. Результаты исследования влияния препаратов различных фосфолипидов на активность кальпаина в цитоплазме мозга показали, что только фосфатидилхолин, но не фосфатидилсерин и кардиолипин незначительно увеличивал активность кальпаина (независимо от размера и структуры фосфолипидных везикул). Высказано предположение, что механизмы взаимодействия кальпаина с липидами не универсальны: в нативной клетке и модельных опытах они могут заметно различаться и изменяются в зависимости от условий. Досліджено вплив ліпідів на активність нейтральної цистеїнової протеїнази кальпаїну в субклітинних фракціях головного мозку щурів. Видалення з грубої мітохондріальної фракції мозку до 23 % мембранного холестерину не призводило до зміни питомої активності кальпаїну в цій фракції. Детергенти дигітонін та Тритон Х-100 у концентрації 0.3 % підвищували активність кальпаїну в грубій мітохондріальній фракції. Результати дослідження впливу препаратів різних фосфоліпідів на активність кальпаїну в цитоплазмі мозку показали, що тільки фосфатидилхолін, але не фосфатидилсерін і кардіоліпін незначно підвищував активність кальпаїну (незалежно від розміру та структури фосфоліпідних везикул). Висловлено припущення, що механізми взаємодії кальпаїну з ліпідами не є універсальними; у нативній клітині та модельних дослідах вони можуть помітно розрізнятись і змінюються залежно від умов. We studied the effect of lipids on the activity of a neutral cysteine proteinase, calpain, in subcellular fractions obtained from the rat brain. Extraction of nearly 23% of membrane cholesterol from the coarse mitochondrial fraction did not result in modifications of specific activity of calpain in this fraction. Detergents (digitonin or Triton Х-100) used in 0.3% concentration enhanced the activity of calpain in the coarse mitochondrial fraction. Examination of the effects of preparations of different phospholipids on the activity of calpain in the cytoplasm demonstrated that only phosphatidylcholine, but not phosphatidylserine and/or cardiolipin, insignificantly increased the activity of calpain (independently of the size and structure of phospholipid vesicles). We hypothesize that the mechanisms underlying interaction between calpain and lipids are not universal; in native cells and model experiments, they can differ noticeably from each other and are modified depending on the corresponding conditions. 2009 Article Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс / Л.И. Колчинская, И.О. Трикаш, В.П. Гуменюк, М.К. Малышева // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 37 назв. — рос. 0028-2561 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68270 577.152.3+612.822 ru Нейрофизиология application/pdf Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
description	Исследовано влияние липидов на активность нейтральной цистеиновой протеиназы – кальпаина – в субклеточных фракциях головного мозга крыс. Удаление из грубой митохондриальной фракции мозга до 23 % мембранного холестерина не приводило к изменению удельной активности кальпаина в этой фракции. Детергенты дигитонин и Тритон Х-100 в концентрации 0.3 % повышали активность кальпаина в грубой митохондриальной фракции. Результаты исследования влияния препаратов различных фосфолипидов на активность кальпаина в цитоплазме мозга показали, что только фосфатидилхолин, но не фосфатидилсерин и кардиолипин незначительно увеличивал активность кальпаина (независимо от размера и структуры фосфолипидных везикул). Высказано предположение, что механизмы взаимодействия кальпаина с липидами не универсальны: в нативной клетке и модельных опытах они могут заметно различаться и изменяются в зависимости от условий.
format	Article
author	Колчинская, Л.И. Трикаш, И.О. Гуменюк, В.П. Малышева, М.К.
spellingShingle	Колчинская, Л.И. Трикаш, И.О. Гуменюк, В.П. Малышева, М.К. Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс Нейрофизиология
author_facet	Колчинская, Л.И. Трикаш, И.О. Гуменюк, В.П. Малышева, М.К.
author_sort	Колчинская, Л.И.
title	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
title_short	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
title_full	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
title_fullStr	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
title_full_unstemmed	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
title_sort	влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс
publisher	Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
publishDate	2009
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68270
citation_txt	Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс / Л.И. Колчинская, И.О. Трикаш, В.П. Гуменюк, М.К. Малышева // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 1. — С. 3-9. — Бібліогр.: 37 назв. — рос.
series	Нейрофизиология
work_keys_str_mv	AT kolčinskaâli vliânielipidovnaaktivnostʹkalʹpainavsubkletočnyhfrakciâhgolovnogomozgakrys AT trikašio vliânielipidovnaaktivnostʹkalʹpainavsubkletočnyhfrakciâhgolovnogomozgakrys AT gumenûkvp vliânielipidovnaaktivnostʹkalʹpainavsubkletočnyhfrakciâhgolovnogomozgakrys AT malyševamk vliânielipidovnaaktivnostʹkalʹpainavsubkletočnyhfrakciâhgolovnogomozgakrys AT kolčinskaâli vplivlípídívnaaktivnístʹkalʹpaínuvsubklítinnihfrakcíâhgolovnogomozkuŝurív AT trikašio vplivlípídívnaaktivnístʹkalʹpaínuvsubklítinnihfrakcíâhgolovnogomozkuŝurív AT gumenûkvp vplivlípídívnaaktivnístʹkalʹpaínuvsubklítinnihfrakcíâhgolovnogomozkuŝurív AT malyševamk vplivlípídívnaaktivnístʹkalʹpaínuvsubklítinnihfrakcíâhgolovnogomozkuŝurív AT kolčinskaâli effectoflipidsontheactivityofcalpaininsubcellularfractionsobtainedfromtheratbrain AT trikašio effectoflipidsontheactivityofcalpaininsubcellularfractionsobtainedfromtheratbrain AT gumenûkvp effectoflipidsontheactivityofcalpaininsubcellularfractionsobtainedfromtheratbrain AT malyševamk effectoflipidsontheactivityofcalpaininsubcellularfractionsobtainedfromtheratbrain
first_indexed	2025-12-01T15:43:15Z
last_indexed	2025-12-01T15:43:15Z
_version_	1850321191623983104
fulltext	НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 1 3 УДК 577.152.3+612.822 Л. И. КОЛЧИНСКАЯ1, И. О. ТРИКАШ2, В. П. ГУМЕНЮК2, М. К. МАЛЫШЕВА1 ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ НА АКТИВНОСТЬ КАЛЬПАИНА В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС Поступила 15.12.08 Исследовано влияние липидов на активность нейтральной цистеиновой протеиназы – кальпаина – в субклеточных фракциях головного мозга крыс. Удаление из грубой мито- хондриальной фракции мозга до 23 % мембранного холестерина не приводило к изме- нению удельной активности кальпаина в этой фракции. Детергенты дигитонин и Тритон Х-100 в концентрации 0.3 % повышали активность кальпаина в грубой митохондриаль- ной фракции. Результаты исследования влияния препаратов различных фосфолипидов на активность кальпаина в цитоплазме мозга показали, что только фосфатидилхолин, но не фосфатидилсерин и кардиолипин незначительно увеличивал активность каль- паина (независимо от размера и структуры фосфолипидных везикул). Высказано пред- положение, что механизмы взаимодействия кальпаина с липидами не универсальны: в нативной клетке и модельных опытах они могут заметно различаться и изменяются в зависимости от условий. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: кальпаин, холестерин, фосфолипиды, активация фермента. 1 Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев (Украина). 2 Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев (Украина). Эл. почта: luko@biph.kiev.ua (Л. И. Колчинская). ВВЕДЕНИЕ Кальпаины – семейство широко распространенных нейтральных цистеиновых протеиназ, которые в большинстве случаев представлены двумя основны- ми подгруппами (µ- и m-кальпаины). Для оптималь- ной активности ферментов, относящихся к этим под- группам, необходимы соответственно микро- либо миллимолярные концентрации кальция. Результаты многочисленных исследований показали, что каль- паины играют важную роль в опосредовании каль- циевых сигналов в клетках различных тканей [1–3]. Субстратами для указанных ферментов являются белки цитоскелета, различные иные ферменты (ки- назы, фосфатазы, фосфолипазы), белки мембранных рецепторов и транспортеров [4]. Кальпаины обнару- живаются как в цитоплазматической, так и в мем- бранных клеточных фракциях, однако данные об их количестве и соотношении в таких фракциях про- тиворечивы; по-видимому, эти показатели в разных тканях различны [5–7]. Кальпаины задействованы во многие процессы, проходящие в клетках нервной ткани в нормальных условиях (структурная и функ- циональная реорганизация синапсов, обусловлен- ная длительной потенциацией синаптической пе- редачи, регуляция выброса нейропередатчиков) [8, 9]. Изменения активности кальпаинов отмечают- ся и при различных патологиях нервной системы (болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, нейро- токсикоз, церебральная ишемия) [2, 10–12]. В по- следние годы появились работы, посвященные воз- можному применению ингибиторов кальпаинов для коррекции ряда патологических состояний, в том числе для лечения заболеваний нервной системы [13, 14]. Необходимо, однако, признать, что меха- низмы действия протеолитических ферментов этой группы все еще недостаточно выяснены. Известно, что концентрации кальция, необходи- мые для активации обеих основных форм кальпаина (3–50 и 400 – 800 мкМ для полумаксимальной акти- вации µ- и m-кальпаина соответственно), многократ- но превышают концентрацию названного иона в цито плазме клеток даже в моменты максимального повышения данного показателя, например при вы- бросе нейротрансмиттеров [4, 15]. Учитывая посто- янное присутствие в клетках белкового ингибитора кальпаина – кальпастатина, можно предположить, что активация кальпаина осуществляется достаточ- НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 14 но сложным образом. По-видимому, соответствую- щий путь должен включать в себя разделение (по- стоянное или временное) фермента и ингибитора в клетке и либо наличие в последней компартментов с повышенной концентрацией кальция, достаточной для активации фермента, либо временное повыше- ние его сродства к кальцию. Точный молекулярный механизм активации кальпаина до сих пор не ясен. Первоначально было выдвинуто предположение, что кальпаин обычно находится в цитоплазме в не- активном состоянии и переходит в функционирую- щее состояние только после развития аутолиза (в ре- зультате чего значительно снижается концентрация кальция, необходимая для активации фермента [16]) и (или) связывания кальпаина с клеточными мем- бранными структурами [15, 17]. Однако в других ра- ботах [5, 18], было показано, что кальпаин активен и в растворимом состоянии. m-Кальпаин, выделенный из скелетных мышц, связывается с фосфолипидны- ми везикулами в отсутствие кальция [19], а для µ- кальпаина присоединение к мембранам не приводит к снижению концентрации кальция, необходимой для активации [20]. Высказывается предположение, что связывание кальпаина с мембранами и его акти- вация происходят за счет изменений конформации молекул фермента, благодаря которым гидрофобные участки в активном центре становятся более доступ- ными для взаимодействия с мембранами [20]. При поисках факторов, способных влиять на срод- ство фермента к кальцию, возникло логичное пред- положение, что одним из таких факторов являются липиды, входящие в состав клеточных мембран [4, 15]. Однако изучение влияния на активность кальпа- ина различных фосфолипидов – основных компонен- тов биологических мембран – до сих пор не привело к однозначным выводам. Если, согласно данным од- них авторов, необходимая для активации кальпаина концентрация кальция в присутствии фосфатидил- инозитола, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина снижалась [21], то в других работах эффект повыше- ния сродства фермента к кальцию наблюдали в при- сутствии только фосфатидилинозитола [22], а также полифосфоинозитидов [23]. Как показали некоторые авторы, весьма эффективными в этом аспекте могут быть многокомпонентные смеси липидов, в состав которых входят ганглиозиды и фосфатидилинозитол, способные стимулировать активность кальпаина при концентрациях кальция, близких к нормальным вну- триклеточным [24]. Недавно появились данные, сви- детельствующие о том, что активность кальпаина в клетке регулируется связыванием фосфоинозитидов с цитоскелетными белками, являющимися субстра- тами для указанного фермента [25]. Известно, что в структуре биологических мем- бран присутствуют отдельные нерастворимые в не- ионных детергентах микродомены, обогащенные холестерином и сфинголипидами, – так называе- мые рафты («плоты») [26]. Наличие таких доме- нов представляется очень существенным; вероят- но, оно обеспечивает избирательную локализацию в мембране определенных клеточных белков, а так- же пространственное разделение и регуляцию раз- личных процессов, происходящих в клетке, в том числе процессов клеточной сигнализации, мем- бранного транспорта и экзоцитоза. Было показано, что m-кальпаин локализован в обогащенных хол- естерином микродоменах мембран Т-клеток [27], в кавеолах мышечных клеток [28]; он появляется в подобных участках мембран при хемотаксисе [29]. В то же время, как было обнаружено [30], кальпа- ин расщепляет аннексины гладких мышц именно в тех участках плазматической мембраны, где ми- кродомены отсутствуют. Таким образом, сведения о роли мембранного холестерина в функциониро- вании кальпаина, как и данные об активации этого фермента фосфолипидами, весьма противоречивы. Ранее мы исследовали распределение активно- сти кальпаина в субклеточных фракциях, которые были получены из ткани головного мозга крыс в условиях, близких к существующим в норме в нерв- ных клетках, т. е. без отделения кальпаина от каль- пастатина [18]. Было показано, что основная часть (87 %) суммарной ферментативной активности кальпаина выявлялась в цитоплазматической фрак- ции; в то же время заметная активность этого фер- мента наблюдалась и в исследованных мембранных фракциях (грубой митохондриальной фракции, ми- кросомах и миелине). Наиболее высокая удельная активность кальпаина, которая значительно воз- растала после его отделения от кальпастатина и по- давлялась в присутствии ингибитора кальпаина І, регистрировалась в цитоплазматической фракции. Представляло очевидный интерес выяснить, влия- ет ли на активность кальпаина в указанной фрак- ции присутствие фосфолипидов в среде для опре- деления этой активности. В настоящей работе мы исследовали также действие детергентов на актив- ность кальпаина и изучали влияние извлечения хол- естерина из мембран (и, как следствие, разруше- ния липидных рафтов) на активность кальпаина в мембранной (грубой митохондриальной) фракции из ткани головного мозга крыс. Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, И. О. ТРИКАШ, В. П. ГУМЕНЮК, М. К. МАЛЫШЕВА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 1 5 МЕТОДИКА Получение субклеточных фракций из ткани голов- ного мозга крыс. Взрослых крыс-самцов декапити- ровали, выделяли головной мозг и помещали его на лед. Все дальнейшие процедуры проводили при 4 °С. Ткань измельчали скальпелем и гомогенизи- ровали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в растворе А (1 г ткани в 10 мл раство- ра). В состав раствора входили (в миллимолях на 1 л): сахароза – 320, трис-Cl – 20 (рН 7.4), этиленди- аминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 2, дитиотреи- тол (ДТТ) – 2, фенилметилсульфонилфторид – 0.1. Гомогенат центрифугировали 10 мин при 750g; осадок удаляли, а надосадочную жидкость (Н1) цен- трифугировали 20 мин при 12000g. Полученную по- сле этого надосадочную жидкость (Н2) центрифуги- ровали 60 мин при 100000g для получения фракции цитоплазмы. Осадок грубой митохондриальной фракции (О2), полученный после центрифугирова- ния при 12000g, суспендировали в растворе А, полу- чая так называемую мембранную фракцию. Удаление кальпастатина и получение очищенного препарата m-кальпаина из растворимой фракции проводили по методу Такеучи и соавт. [5]. Содержание белка в пре- паратах определяли по методу Лоури [31]. Определение активности кальпаина в субкле- точных фракциях. Активность кальпаина опреде- ляли, используя в качестве субстрата казеин, ме- ченный флуоресцентной меткой (ФИТЦ). Мечение казеина осуществляли по ранее описанному методу [32], элюируя меченый субстрат с колонки Сефадекс G-50 раствором следующего состава (в миллимолях на 1 л): трис-Cl – 10 (pH 7.0), NaCl – 150. Активность кальпаина в субклеточных фракциях определяли в пробах объемом 100 мкл, содержащих в себе суб- стратный раствор следующего состава (в миллимо- лях на 1 л): трис-Cl – 50 (pH 7.4), дитиотреитол – 5, CaCl2 – 5(или ЭДТА – 5), а также 0.2 % ФИТЦ-казе- ина. Реакцию инициировали путем добавления 10– 500 мкг белкового препарата и после инкубации при 30 °С (если не указано иначе) останавливали, добав- ляя в пробу 50 мкл бычьего сывороточного альбуми- на (5 мг/мл) и 50 мкл охлажденной 12 %-ной трихлор- уксусной кислоты. Пробы выдерживали на льду 20 мин, после чего центрифугировали 8 мин при 5000g. 100 мкл надосадочной жидкости, содержащей в себе флуоресцирующие продукты гидролиза субстра- та, добавляли к 2 мл 0.2 М трис-Cl (pH 8.5). Интен- сивность флуоресценции проб измеряли при длинах волн 490 (возбуждение) и 525 (эмиссия) нм. Актив- ность кальпаина определяли как кальцийзависимый прирост флуоресценции, который представляет со- бой разность между величиной флуоресценции про- бы, содержащей в себе кальций, и величиной флуо- ресценции пробы, содержащей в себе ЭДТА. Получение фосфолипидных везикул (липосом). Растворы фосфолипидов (3 мг фосфатидилхоли- на, фосфатидилсерина или кардиолипина) в хло- роформ-метаноле высушивали в токе азота до пол- ного удаления растворителя. Полученную пленку фосфолипидов суспендировали в 1 мл буферно- го раствора, содержащего в себе 50 мМ трис-НCl (рН 7.4). Крупные многослойные липосомы раз- личного диаметра получали путем механического встряхивания суспензии фосфолипидов в течение 3 мин, а однослойные липосомы – посредством про- давливания фосфолипидной суспензии через поли- карбонатный фильтр с размером пор 100 нм. Извлечение холестерина из мембранной фракции головного мозга крыс. К 100 мкл суспензии грубой митохондриальной фракции О2 (4 мг белка /мл) до- бавляли раствор метил-β-циклодекстрина до конеч- ной концентрации 15 либо 30 мМ. В контрольную пробу добавляли дистиллированную воду. Пробы инкубировали 30 мин при 37 °С и постоянном пе- ремешивании, затем центрифугировали 5 мин при 3000g; полученный осадок промывали 1 мл рас- твора, содержащего в себе (в миллимолях на 1 л): сахарозу – 320 и трис-Cl – 10 (рН 7.5). Содержа- ние холестерина в полученном осадке определяли по методу Златкиса и соавт. [33]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение активности кальпаина соответственно расщеплению флуоресцентного субстрата препара- тами субклеточных фракций (в которых не прово- дилось отделения этого фермента от балластных белков и, более того, его отделения от постоянно присутствующего в клетке специфического белко- вого ингибитора кальпаина – кальпастатина) требу- ет длительной (в течение нескольких часов) инку- бации фермента с субстратом при наличии в среде кальция в миллимолярных концентрациях. Извест- но, что такая длительная инкубация кальпаина в присутствии ионов кальция может приводить к инактивации фермента [4]. Исследуя зависимость активности кальпаина от температуры, мы устано- вили, что инкубация при 30 °С в наших условиях является оптимальной. Так, из рисунка, А видно, ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ НА АКТИВНОСТЬ КАЛЬПАИНА В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 16 что количество образовавшихся флуоресцирующих продуктов расщепления ФИТЦ-казеина препарата- ми цитоплазмы из клеток головного мозга крыс в течение 1 ч было одинаковым в условиях темпера- тур 37 и 30 °С, но в случае более длительной инку- бации скорость образования продуктов гидролиза при 37 °С снижалась по сравнению с наблюдаемой при 30 °С. Близкая тенденция обнаруживалась и в процессе определения активности в мембранной фракции из клеток головного мозга крыс (Б). В этих препаратах количество образовавшихся флуоресци- рующих продуктов за 1 ч инкубации при 30 °С было меньшим, чем при 37 °С, и практически одинако- вым при обеих температурах в условиях инкубации на протяжении 2 ч. В случае инкубации в течение 3 ч количество образовавшихся продуктов флуорес- ценции при 37 °С оказывалось значительно мень- шим, чем при 30 °С. Таким образом, определение активности кальпаина в препаратах субклеточных фракций в условиях длительной инкубации наибо- лее корректно проводить при температуре 30 °С. Результаты исследования распределения актив- ности кальпаина в субклеточных фракциях голов- ного мозга крыс показали, что удельная активность кальпаина в растворимой фракции головного моз- га почти на два порядка превышает удельную ак- тивность этого фермента во всех изученных нами мембранных фракциях головного мозга [18]. Ранее было обнаружено [6], что активность кальпаина в присутствии Тритона Х-100 увеличивается только в нервной ткани и не изменяется во всех остальных исследованных тканях крыс. В наших опытах Три- тон Х-100 и дигитонин в концентрации 0.3 % не ока- зывали влияния на активность кальпаина в цитоплаз- матической фракции головного мозга крыс и заметно повышали данную активность (Тритон Х-100 – на 23, а дигитонин – на 20 %) в мембранной фракции. По-видимому, исследованные нами неионные де- тергенты в относительно небольших количествах не оказывают ингибирующего влияния на фермент (на это указывает отсутствие подавления его актив- ности в цитоплазматической фракции). Возможно, однако, что активный центр молекулы кальпаина в присутствии «мягких» детергентов становится бо- лее доступным для субстрата. Чтобы выяснить роль холестерина в регуляции активности кальпаина, мы использовали такой агент, как метил-β-циклодекстрин (МЦД), который связывает холестерин и экстрагирует его из мем- бран. Известно, что в результате такого удаления структура микродоменов мембраны нарушается. Это, в свою очередь, приводит к нарушению функ- ционирования мембранных белков [34]. Для удале- ния холестерина из мембранной фракции головного мозга крыс мы использовали МЦД в концентраци- ях 15 или 30 мМ. В табл. 1 представлены данные о количестве холестерина и удельной активности кальпаина в мембранной фракции мозга, обрабо- танной упомянутым агентом в различных концен- трациях. Видно, что с увеличением концентрации 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 1 2 3 0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 Влияние температуры на активность кальпаина в цитоплазматической (А) и мембранной (Б) фракциях головного мозга крыс. По оси абсцисс – время определения активности кальпаина, ч; по оси ординат – нормированная интенсивность флуоресценции, ед. фл./мг белка. 1 – при температуре 30, 2 – 37 °С. Вплив температури на активність кальпаїну в цитоплазматичній (А) та мембранній (Б) фракціях головного мозку щурів. 1 ед. фл. / мг белка А Б ч ч Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, И. О. ТРИКАШ, В. П. ГУМЕНЮК, М. К. МАЛЫШЕВА 2 1 2 2 1 1 2 2 2 1 1 ед. фл. / мг белка НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 1 7 МЦД количество удаленного холестерина возрас- тает; соответственно, его концентрация в мембра- нах снижается. Из этих данных следует, что уда- ление порядка 23 % мембранного холестерина не влияло на величину удельной активности кальпа- ина в мембранах нервных клеток; она практически не изменялась по сравнению с соответствующим значением в контрольных препаратах. Таким обра- зом, можно предположить, что нарушение струк- туры и целостности липидных рафтов не является критичным для активности кальпаина в мембранах нервных окончаний. Ранее было показано [30], что в гладких мышцах кальпаин локализован в тех участках мембраны, где отсутствуют микродомены, обогащенные холе- стерином. В некоторых же других клетках кальпаин обнаруживали только в этих микродоменах [27–29, 35]. Возможно, что локализация кальпаина в обога- щенных холестерином микродоменах мембраны не является постоянной; указанная локализация зави- сит от типа, функции и состояния клетки [29, 36]. Фосфолипиды рассматривают как один из воз- можных факторов, обеспечивающих активацию кальпаина in vivo [4, 15], тем не менее данные о влиянии отдельных фосфолипидов и их смесей на активность фермента in vitro немногочисленны и противоречивы [21–24]. Мы изучали воздействие отрицательно заряженных фосфолипидов (кардио- липина и фосфатидилсерина), нейтрального липи- да фосфатидилхолина, а также их смесей на актив- Т а б л и ц а 1. Влияние удаления холестерина на активность кальпаина в мембранной (грубой митохондриальной) фракции головного мозга крыс Т а б л и ц я 1. Вплив видалення холестерину на активність кальпаїну в мембранній (грубій мітохондріальній) фракції головного мозку щурів Концентрация метил-β- циклодекстрина (МЦД), мМ Содержание холестерина Удельная активность кальпаина мкМ/мг белка % относительно контроля ед. фл./мг белка/ч % относительно контроля 0 (контроль) 0.519 100 31.0 100 15 0.440 85 28.3 91 30 0.400 77 32.9 106 П р и м е ч а н и я. Из грубой митохондриальной фракции головного мозга крыс удаляли холестерин путем воздействия МЦД (подробности см. в Методике). Активность кальпаина определяли путем инкубации проб в течение 3 ч при 30 °С. Удельную активность рассчитывали как кальцийзависимый прирост флуоресценции на 1 мг белка за 1 ч инкубации. За 100 % принимали соответственно содержание холестерина и удельную активность кальпаина в пробах, не обработанных МЦД. Т а б л и ц а 2. Влияние фосфолипидов на активность кальпаина в цитоплазматической фракции головного мозга крыс Т а б л и ц я 2. Вплив фосфоліпідів на активність кальпаїну в цитоплазматичній фракції головного мозку щурів Препарат Концентрация кальция, мМ Добавленные липид/смесь липидов Относительная активность кальпаина, % Кальпаин в цитоплазматической фракции 0.25 – 68 –”– 1.0 – 89 –”– 4.5 – 100 –”– 0.25 фосфатидилхолин 90 –”– 1.0 –“– 113 –”– 4.5 –“– 90 –”– 0.25 кардиолипин 37 –”– 1.0 фосфатидилхолин + кардиолипин 56 –”– 4.5 кардиолипин 87 –”– 0.25 фосфатидилсерин 81 Очищенный m-кальпаин 1.0 – 80 –”– 4.5 – 100 –”– 1.0 фосфатидилхолин 105 –”– 4.5 –“– 80 П р и м е ч а н и я. Пробы инкубировали 2 ч при 30 °С с добавлением соответствующих фосфолипидов (массовое соотношение белок/ липид в пробе составляло 1:3) в присутствии кальция в различных концентрациях (в таблице указана концентрация свободного кальция, которую рассчитывали по программе “CaBuf”). За 100 % принимали активность кальпаина в пробе, содержащей в себе 4.5 мМ Ca 2+ свобод., без добавления фосфолипидов. ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ НА АКТИВНОСТЬ КАЛЬПАИНА В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 18 ность кальпаина во фракции цитоплазмы нервных клеток из головного мозга крыс. Фосфолипиды применяли в виде суспензий многослойных или од- нослойных (диаметром до 100 нм) липосом. Результаты наших опытов, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что активность кальпаина незначительно увеличивалась только в присутствии фосфатидилхолина и в пробах, содержащих в себе кальций в субмаксимальных концентрациях. В при- сутствии кальция в максимальных количествах, не- обходимых для действия фермента, фосфатидил- холин обусловливал небольшой ингибирующий эффект. Кардиолипин и фосфатидилсерин не толь- ко не приводили к усилению активности кальпаи- на в цитоплазматической фракции головного мозга крыс, но даже подавляли эту активность. Все на- блюдаемые эффекты не зависели от способа получе- ния фосфолипидных везикул и (по предварительным данным) не различались в случаях применения одно- слойных (до 100 нм) и многослойных крупных липо- сом. Можно предположить, что в присутствии каль- ция в субмаксимальных концентрациях происходит взаимодействие фосфатидилхолиновых липосом с гидрофобной частью белковой молекулы кальпаи- на, приводящее к его активации. Такое взаимодей- ствие может быть очень существенным для актива- ции кальпаина в условиях нативных клеток [15, 20]. Используя ионообменную хроматографию, мож- но выделить фракции, содержащие в себе преимуще- ственно μ-кальпаин и кальпастатин в среде 0.15 М KCl либо m-кальпаин в среде 0.3 M KCl [5]. Ранее мы показали [18], что такое разделение увели- чивает активность кальпаина в цитоплазматиче- ской фракции нервных клеток в несколько раз. В настоящей работе выяснилось, что в очищенных препаратах m-кальпаина из всех исследованных фосфолипидов только фосфатидилхолин очень не- значительно увеличивал активность фермента при субмаксимальных концентрациях кальция (табл. 2). Другие фосфолипиды (данные не иллюстриру- ются) оказывали на активность m-кальпаина дей- ствие, аналогичное описанному для препаратов ци- топлазмы. Таким образом, результаты наших опытов не подтверждают высказанного ранее мнения, соглас- но которому отрицательно заряженные фосфолипи- ды являются наиболее эффективными активатора- ми кальпаина [22, 23]. Вместе с тем есть основания полагать, что активация кальпаина фосфолипида- ми in vitro может осуществляться по-разному – в зависимости от расщепляемого субстрата [37]. В настоящее время представляется все более вероят- ным, что широкая распространенность и многооб- разие функций этого фермента связаны с наличием разнообразных конкретных механизмов его актива- ции. Данные механизмы, скорее всего, не являются универсальными и зависят как от типа ткани, так и от локализации кальпаина в той или иной суб- клеточной структуре, реализующей определенную функцию в клетке. Л. І. Колчинська1, І. О. Трикаш2, В. П. Гуменюк2, М. К. Малишева1 ВПЛИВ ЛІПІДІВ НА АКТИВНІСТЬ КАЛЬПАЇНУ В СУБКЛІТИННИХ ФРАКЦІЯХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУРІВ 1 Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ (Україна). 2 Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ (Україна). Р е з ю м е Досліджено вплив ліпідів на активність нейтральної цис- теїнової протеїнази кальпаїну в субклітинних фракціях го- ловного мозку щурів. Видалення з грубої мітохондріальної фракції мозку до 23 % мембранного холестерину не приз- водило до зміни питомої активності кальпаїну в цій фрак- ції. Детергенти дигітонін та Тритон Х-100 у концентрації 0.3 % підвищували активність кальпаїну в грубій мітохондрі- альній фракції. Результати дослідження впливу препаратів різних фосфоліпідів на активність кальпаїну в цитоплазмі мозку показали, що тільки фосфатидилхолін, але не фос- фатидилсерін і кардіоліпін незначно підвищував активність кальпаїну (незалежно від розміру та структури фосфоліпід- них везикул). Висловлено припущення, що механізми вза- ємодії кальпаїну з ліпідами не є універсальними; у нативній клітині та модельних дослідах вони можуть помітно розріз- нятись і змінюються залежно від умов. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. G. Lynch and M. Baudry, “The biochemistry of memory: a new and specific hypothesis,” Science, 224, No. 4653, 1057-1063 (1984). 2. Т. Кастрикина, М. Малышева, “Кальпаин – один из медиаторов кальциевого сигнала в клетке”, Нейрофизиология/ Neurophysiology, 32, № 2, 142-156 (2000). 3. L. Casaletti, S. Tauhata, J. Moreira, and R. Larson, “Myosin- Va proteolysis by Ca2+/calpain in depolarized nerve endings from rat brain,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 308, No. 1, 159-164 (2003). 4. D. Goll, V. Thompson, H. Li, et al., “The calpain system,” Physiol. Rev., 83, No. 3, 731-801 (2003). Л. И. КОЛЧИНСКАЯ, И. О. ТРИКАШ, В. П. ГУМЕНЮК, М. К. МАЛЫШЕВА НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 1 9 5. K. Takeuchi, K. Saito, and R. Nixon, “Immunoassay and activity of calcium-activated neutral proteinase (mCANP): distribution in soluble and membrane-associated fractions in human and mouse brain,” J. Neurochem., 58, No. 4, 1526-1532 (1992). 6. N. Banik, A. Chakrabarti, and E. Hogan, “Effects of detergents on Ca-activated neural proteinase (calpain) in neural and non- neural tissue: a comparative study,” Neurochem. Res., 17, No. 8, 797-802 (1992). 7. F. Zalewska, B. Zablocka, T. Saido, et al., “Dual response of calpain to rat brain postdecapitative ischemia,” Mol. Chem. Neuropathol., 33, No. 3, 185-197 (1998). 8. G. Broutman and M. Baudry, “Involvement of the secretory pathway for AMPA receptors in NMDA-induced potentiation in hippocampus,” J. Neurosci., 21, No. 1, 27-34 (2001). 9. U. Zimmerman, S. Malek, L. Liu, and H. Li, “Proteolysis of synaptobrevin, syntaxin, and SNAP-25 in alveolar epithelial type II cells,” IUBMB Life, 48, No. 4, 453-458 (1999). 10. K. Blomgren, A. McRae, A. Elmerd, et al., “The calpain proteolytic system in neonatal hypoxic ischemia,” Ann. New York Acad. Sci., 825, 104-119 (1997). 11. G. DiRosa, T. Odrijin, R. Nixon, and O. Arancio, “Calpain inhibitors: a treatment for Alzheimer’s disease,” J. Mol. Neurosci., 19, Nos. 1/2, 135-141 (2002). 12. H. Wu, K. Tomizawa, Y. Oda, et al., “Critical role of calpain-mediated cleavage of calcineurin in excitotoxic neurodegeneration,” J. Biol. Chem., 279, No. 6, 4929-4940 (2004). 13. K. Wang, S. Lamer, G. Robinson, and R. Hayes, “Neuroprotection targets after traumatic brain injury,” Current Opin. Neurol., 19, No. 6, 514-519 (2006). 14. R. Sinjoanu, S. Kleinschmidt, R. Bitner, et al., “The novel calpain inhibitor A-705253 potenthy inhibits oligomeric betaamyloid-induced dynamin 1 and tau cleavage in hippocampal neurons,” Neurochem. Int., 53, Nos. 3/4, 79-88 (2008). 15. M. Molinari and E. Carafoli, “Calpain: a cytosolic proteinase active at the membranes,” J. Membrane Biol., 156, No. 1, 1-8 (1997). 16. T. Yoschizawa, H. Sorimachi, S. Tomioka, et al., “Calpain dissociates into subunits in the presence of calcium ions,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 208, No. 1, 376-383 (1995). 17. H. Kawasaki and S. Kawashima, “Regulation of the calpain- calpastatin system by membranes,” Mol. Membrane Biol., 13, No. 4, 217-224 (1996). 18. Л. Колчинская, М. Малышева, “Активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс”, Нейрофизиология/Neurophysiology, 36, № 4, 265-271 (2004). 19. C. Garret, P. Cottin, J. Dufourcq, and A. Ducastaing, “Evidence for a Ca2+-independent association between calpain II and phospholipids vesicles,” FEBS Lett., 227, No. 2, 209-214 (1988). 20. A. Fernandez-Montalvan, I. Assflag-Machleidt, D. Pfeiler, et al., “mu-Calpain binds to lipid bilayers via the exposed hydrophobic surface of its Ca2+-activated conformation,” J. Biol. Chem., 387, No. 5, 617-627 (2006). 21. S. Pontremoli, E. Melloni, B. Sparatore, et al., “Role of phospholipids in the activation of the Ca2+-dependent neutral proteinase of human erythrocytes,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 129, No. 2, 389-395 (1985). 22. S. Coolican and D. Hathaway, “Effect of L-alpha- phosphatidylinositol on a vascular smooth muscle Ca2+ - dependent protease. Reduction of the Ca2+ requirement for autolysis,” J. Biol. Chem., 259, No. 19, 11627-11630 (1984). 23. T. Saido, M. Shibata, T. Takenawa, et al., “Positive regulation of mu-calpain action by polyphosphoinositides,” J. Biol. Chem., 267, No. 34, 24585-24590 (1992). 24. A. Chakrabarti, S. Dasgupta, R. Gadshen, et al., “Regulation of brain m-calpain Ca2+ sensitivity by mixtures of membrane lipids: activation by intracellular Ca2+ level,” J. Neurosci. Res., 44, No. 4, 374-380 (1996). 25. C. Sprague, T. Traley, H. Jang, et al., “Phosphoinositide binding to the substrate regulates susceptibility to proteolysis by calpain,” J. Biol. Chem., 283, No. 14, 9217-9223 (2008). 26. D. Brown and E. London, “Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts,” J. Biol. Chem., 275, No. 23, 17221-17224 (2000). 27. L. Morford, K. Forrest, B. Logan, et al., “Calpain II colocalizes with detergent-insoluble rafts on human and Jurkat T-cells,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, No. 2, 540-546 (2002). 28. S. Goudeneqe, E. Darqelos, S. Claverol, et al., “Comparative proteomic analysis of myotube caveolae after milli-calpain deregulation,” Proteomics, 7, No. 18, 3289-3298 (2007). 29. P. Nuzzi, M. Senetar, and A. Huttenlocher, “Asymmetric localization of calpain 2 during neutrophil chemotaxis,” Mol. Biol. Cell, 18, No. 3, 795-805 (2007). 30. E. Babiychuk, K. Monastyrskaya, F. Burkhard, et al., “Modulating signaling events in smooth muscle: cleavage of annexin 2 abolishes its binding to lipid rafts,” FASEB J., 16, No. 10, 1177-1184 (2002). 31. O. Lowry, N. Rosenberg, A. Farr, et al., “Protein measurement with the Folin phenol reagent,” J. Biol. Chem., 193, No. 1, 265-275 (1951). 32. H. Maeda, “Assay of proteolytic enzymes by the fluorescence polarization technique,” Anal. Biochem., 92, No. 1, 222-227 (1979). 33. A. Zlatkis, B. Zak, and A. Boyle, “A new method for the direct determination of serum cholesterol,” J. Lab. Clin. Med., 41, No. 3, 486-492 (1953). 34. P. Yancey, W. Rodrigueza, E. Kilsdonk, et al., “Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins. Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux,” J. Biol. Chem., 271, No. 27, 16026-16034 (1996). 35. J. Hood, B. Logan, P. Sinai, et al., “Association of the calpain/ calpastatin network with subcellular organelles,” Biochem. Biophys. Res. Commun., 310, No. 4, 1200-1212 (2003). 36. K. Haim, I. Ben-Aharon, and R. Shalgi, “Expression and immunolocalization of the calpain-calpastatin system during parthenogenetic activation and fertilization in the rat egg,” Reproduction, 131, No. 1, 35-43 (2006). 37. A. Kishimoto, N. Kajikawa, M. Shiota, and Y. Nishizuka, “Proteolytic activation of calcium-activated, phospholipids- dependent protein kinase by calcium-dependent neutral protease,” J. Biol. Chem., 258, No. 2, 1156-1164 (1983). ВЛИЯНИЕ ЛИПИДОВ НА АКТИВНОСТЬ КАЛЬПАИНА В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Влияние липидов на активность кальпаина в субклеточных фракциях головного мозга крыс

Репозитарії

Схожі ресурси