Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася
Вивчали роль натрій-кальцієвого обмінника (NCX) та Ca²⁺-АТФази плазматичної мембрани (РМСА) як важливих внутрішньоклітинних систем регуляції кальцієвого обміну в нейронах мозочка толерантного до гіпоксії виду риб – карася Carassius gibelio. В експериментах використовували відповідні блокатори цих тр...
Saved in:
| Published in: | Нейрофизиология |
|---|---|
| Date: | 2009 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
2009
|
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68299 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася / І.О. Лук’янець, П.Г. Костюк, О.О. Лук’янець // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 4. — С. 281-287. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860129342120525824 |
|---|---|
| author | Лук’янець, І.О. Костюк, П.Г. Лук’янець, О.О. |
| author_facet | Лук’янець, І.О. Костюк, П.Г. Лук’янець, О.О. |
| citation_txt | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася / І.О. Лук’янець, П.Г. Костюк, О.О. Лук’янець // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 4. — С. 281-287. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Нейрофизиология |
| description | Вивчали роль натрій-кальцієвого обмінника (NCX) та Ca²⁺-АТФази плазматичної мембрани (РМСА) як важливих внутрішньоклітинних систем регуляції кальцієвого обміну в нейронах мозочка толерантного до гіпоксії виду риб – карася Carassius gibelio. В експериментах використовували відповідні блокатори цих транспортних систем – іони літію та лантану. Внутрішньоклітинну концентрацію Ca²⁺ ([Ca²⁺]і) вимірювали за допомогою кальційчутливого барвника Fura-2AM та мікрофлуоресцентного методу. Як було встановлено, нейрони мозочка карася мають ефективну систему очищення цитоплазми від надлишкового Ca²⁺, котре забезпечується як NCX, так і РМСА, присутніми в плазматичній мембрані. В умовах блокування роботи РМСА за допомогою лантану базальний рівень Ca²⁺ у клітині збільшувався в середньому на 31.4 % відносно контролю незалежно від тривалості тест-деполяризації. При виключенні роботи NCX за допомогою заміни іонів натрію в зовнішньому розчині іонами літію рівень Ca²⁺ у клітині збільшувався на 36.6 % відносно контролю (також незалежно від тривалості деполяризації). Отримані дані вказують на те, що функціонування РМСА та NCX у нейронах мозочка карася істотно впливає на внутрішньоклітинний кальцієвий обмін, забезпечуючи підтримання адекватного базального рівня Ca²⁺ у цих нейронах.
We studied the role of Na⁺/Ca²⁺ exchanger (NCX) and Ca²⁺-ATPase of the plasma membrane (РМСА), known to be the most important intracellular systems controlling calcium exchange in cerebellar neurons of a fish species tolerant to hypoxia, Carassius gibelio. In our experiments, we used the corresponding blockers of these transport systems, ions of lithium and lanthanum. The intracellular Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺] і ) was measured using a calcium-sensitive dye, Fura-2AM, and a microfluorescence technique. We found that neurons of the Carassius cerebellum possess an effective system of cleaning of the cytoplasm from excessive Ca²⁺, which is provided by both NCX and РМСА functioning in the plasma membrane. Under conditions of the blockade of functioning of РМСА using lanthanum, the basal Ca²⁺ level in the cells increased, on average, by 31.4% with respect to the control, independently of the duration of test depolarizations. After switching off of the NCX functioning by the replacement of sodium ions in the extracellular solution by lithium ions, the Ca²⁺ level in the cell increased by 36.6% with respect to the control (also independently of the duration of depolarization). The obtained data indicate that the functioning of РМСА and NCX in Carassius cerebellar neurons significantly influences the intracellular calcium exchange providing the maintenance of an adequate basal Ca²⁺ level in these neurons.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:43:43Z |
| format | Article |
| fulltext |
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4 281
УДК 576.32/36:577.352.465:577.151.63:597.4/.5:612.827
І. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ1, П. Г. КОСТЮК1, О. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ1
УЧАСТЬ КАЛЬЦІЙТРАНСПОРТНИХ СИСТЕМ
ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ В КАЛЬЦІЄВОМУ ОБМІНІ
В НЕЙРОНАХ МОЗОЧКА КАРАСЯ
Надійшла 15.07.09
Вивчали роль натрій-кальцієвого обмінника (NCX) та Ca2+-АТФази плазматичної мемб-
рани (РМСА) як важливих внутрішньоклітинних систем регуляції кальцієвого обміну в
нейронах мозочка толерантного до гіпоксії виду риб – карася Carassius gibelio. В експе-
риментах використовували відповідні блокатори цих транспортних систем – іони літію
та лантану. Внутрішньоклітинну концентрацію Ca2+ ([Ca2+]і) вимірювали за допомогою
кальційчутливого барвника Fura-2AM та мікрофлуоресцентного методу. Як було вста-
новлено, нейрони мозочка карася мають ефективну систему очищення цитоплазми від
надлишкового Ca2+, котре забезпечується як NCX, так і РМСА, присутніми в плазматич-
ній мембрані. В умовах блокування роботи РМСА за допомогою лантану базальний рі-
вень Ca2+ у клітині збільшувався в середньому на 31.4 % відносно контролю незалежно
від тривалості тест-деполяризації. При виключенні роботи NCX за допомогою заміни
іонів натрію в зовнішньому розчині іонами літію рівень Ca2+ у клітині збільшувався на
36.6 % відносно контролю (також незалежно від тривалості деполяризації). Отримані
дані вказують на те, що функціонування РМСА та NCX у нейронах мозочка карася іс-
тотно впливає на внутрішньоклітинний кальцієвий обмін, забезпечуючи підтримання
адекватного базального рівня Ca2+ у цих нейронах.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: натрій-кальцієвий обмінник, Ca2+-АТФаза, гіпоксія, толерант-
ність до гіпоксії, карась, кальцій, нейрони, мозочок.
1 Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ (Україна).
Ел. пошта: elena@biph.kiev.ua (О. О. Лук’янець).
ВСТУП
Перспективним напрямком наукових пошуків ефек-
тивних засобів лікування патологічних станів, ви-
кликаних ішемією/гіпоксією, є вивчення механізмів
виживання нейронів тварин, толерантних до гіпок-
сії [1, 2]. До подібних видів, зокрема, відноситься
срібний карась Carassius gibelio. Як було показано
раніше, в умовах ряду патологічних станів, у тому
числі під час гіпоксії/ішемії, відбувається істотне
підвищення концентрації кальцію в цитоплазмі не-
рвових клітин, що може призводити до їх апопто-
зу та загибелі [3, 4]. Вилучення надлишкового Ca2+,
що накопичується в цитозолі під час збудження
ней ронів, забезпечується декількома мембранни-
ми системами. Серед них істотну роль відіграють
натрій-кальцієвий обмінник (NCX) та Ca2+-ATФаза
цитоплазматичної мембрани (PMCA). Вважається,
що NCX є одним з найпотужніших клітинних меха-
нізмів виведення Ca2+ із цитозолю [5]. PMCA роз-
повсюджена ширше, має набагато вищу спорідне-
ність до Ca2+, але набагато нижчу місткість. Висока
спорідненість РМСА до Ca2+ забезпечує їй здатність
зв’язувати ці іони навіть в умовах, коли їх концен-
трації дуже низькі. Тому вважається, що PMCA ре-
алізує модуляцію кальцієвих внутрішньоклітинних
сигналів при низьких концентраціях даних іонів у
межах нормального функціонування клітини [6], а
активності NCX і PMCA є взаємодоповнюючими
факторами.
NCX є антипортерним мембранним білком, який
має здатність ефективно видаляти кальцій із клі-
тини. Для цього процесу використовується енергія
електрохімічного градієнта натрію, забезпечуючо-
го вхід іонів Na+ згідно з градієнтом концентрації
через плазматичну мембрану в обмін на зустрічний
транспорт іонів Ca2+, котрі виводяться назовні клі-
тини. У перебігу одиночного циклу NCX видаляє з
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4282
цитоплазми один іон кальцію та натомість імпортує
три іони натрію [7]. NCX зв’язує Ca2+ не дуже міц-
но (має низьку спорідненість), але має високу міст-
кість і може швидко переносити згадані іони – аж
до п’яти тисяч іонів Ca2+ за секунду [8]. Такі влас-
тивості NCX забезпечують його ефективну роботу
в разі значних підвищень концентрації Ca2+, і він
є здатним позбавляти клітини великих кількостей
Ca2+ за короткий час. Необхідність у цьому може
виникати в умовах гіперзбудження клітини та де-
яких патологічних станів, наприклад при глутамат-
ній ексайтоксичності [9], гіпоксії та ін.
До теперішнього часу було знайдено декіль-
ка блокаторів NCX, але всі вони виявилися не до-
сить селективними, справляючи дію на інші клі-
тинні процеси, а не тільки на обмін Ca2+. Відносно
специфічними блокаторами кальцієвого транспор-
ту, котрий забезпечується NCX, є такі сполуки, як
CGP-37157 (7-хлоро-5-(2-хлорфеніл)-1,5-дигідро-
4,1-бензотіазепін-2(3H)один), TPP (тетрафеніл-
фосфоній) та KB-R7943 ([(нітробензилокси)феніл-
етил]мезилат ізотіосечовини). Останній є сильним
селективним інгібітором реверсного способу робо-
ти NCX (IC50 = 0.7 мкМ). Він не впливає на натрій-
залежні транспортні системи, натрієві канали або
іонотропні глутаматні рецептори, але блокує кана-
ли сімейства TRPC [10]. Серед відповідних аген-
тів також відомі SEA-0400 (2-[4-[(2,5-дифлуорофе-
ніл)метокси]фенокси]-5-етоксіанілін), беприділ та
DCB (3',4'-дихлорбензамілгідрохлорид). Виявило-
ся, що деякі з них є більш специфічними щодо або
плазматичного (NCX-пм), або мітохондріально-
го (NCX-мх) NCX. Так, CGP-37157 є ефективним
селективним інгібітором мітохондріального NCX
(IC50 = 0.4 мкM), але він також блокує мітохондрі-
альну перехідну проникність. TPP, який виявився
специфічним блокатором мітохондріального NCX,
також блокує мітохондріальні калієві канали mito-
KIR та mitoKATP [11]. Крім того, він та його анало-
ги конкурентним чином істотно пригнічують амі-
нооксидази, зокрема амінооксидазу сироватки бика
(BSAO) [12]. Багато сполук, що мають властивос-
ті блокаторів кальцієвих каналів, є також блокато-
рами NCX-мх. Серед них – дилтіазем, феніламін,
фенілідин, ніфедипін та верапаміл. Їх IC50 відпо-
відно складають 7, 12, 13, 66 та 150 мкМ [13]. У
той же час така споріднена сполука, як клоназепам,
виявилася сильним блокатором NCX (IC50 =7 мкМ),
але вона не впливає на активність кальцієвих ка-
налів. Таким чином, можна констатувати, що, хоча
відносно селективні блокатори NCX існують, їх
дія може ускладнюватися можливими впливами на
інші компоненти клітинних процесів.
Ефективним інструментом для вивчення актив-
ності NCX може бути заміна іонів Na+ іонами Li+
або застосування іонів La3+. Ще в 1974 р. Карафо-
лі та співавт. показали, що такі іони, як K+, Rb+,
Cs+ або Mg2+, не можуть замінювати іони Na+ або
Ca2+ у роботі NCX, проте іони Li+ можуть заміню-
вати іони Na+ у перебігу NCX-мх-опосередковано-
го транспорту Ca2+ [14]. Пізніше встановили, що
мембранний NCX-пм не має такої властивості, але
іони Li+ у цьому випадку можуть бути активато-
рами NCX; в їх присутності активність NCX мог-
ла збільшуватися до 270 % порівняно з контролем
[15]. Іншою особливістю NCX-мх виявилася здат-
ність цього обмінника опосередковувати неелек-
трогенний обмін Сa2+/Ca2+ та Na+/Li+ у відсутнос-
ті Ca2+ (див. [13]). Результати досліджень показали,
що іони La3+ ефективно блокують NCX як у плаз-
матичній мембрані, так і в мітохондріях, але менш
ефективно, ніж кальцієвий уніпортер мітохондрій.
Крім того, як було встановлено, La3+ не блокує про-
тон-кальцієвого обмінника, забезпечуючого обмін
Ca2+ у незбудливих клітинах, де NCX є відсутнім.
На даний час специфічні блокатори РМСА плаз-
матичної мембрани невідомі, але існують антаго-
ністи кальмодуліну (такі, як кальмідазоліум або
трихлорпромазин), ортованадат, (карбоксі-)еозин
та іони La3+, котрі паралельно блокують активність
цього ферменту. Підвищення pH на зовнішньоклі-
тинному боці мембрани також блокує дану молеку-
лярну помпу, оскільки згаданий фермент обмінює
протони на викачуваний Ca2+. Існують дані про те,
що іони La3+ у низьких концентраціях (<250 мкМ)
блокують PMCA та не впливають на активність
NCX, але при більших концентраціях вони також
можуть ефективно пригнічувати активність NCX
[16].
У нашій роботі ми вивчали особливості функці-
онування NCX та РМСА мембрани в нейронах мо-
зочка толерантного до гіпоксії виду риб (Carassius
gibelio) та пов’язані з цим особливості внутріш-
ньоклітинного кальцієвого обміну в зазначеному
об’єкті. В експериментах використовували ізольо-
вані нейрони мозочка.
МЕТОДИКА
Експерименти були виконані на ізольованих нейро-
нах мозочка срібного карася Carassius gibelio, ви-
І. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ, П. Г. КОСТЮК, О. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4 283
ділених з мозку трирічних риб (середня маса 70 г).
Для знеболювання було використано метод природ-
ного газового наркозу, запропонований Карамяном
для операцій на головному мозку риб [17]. Ми мо-
дифікували даний метод: рибу, підготовлену вище-
вказаним способом, додатково охолоджували, вмі-
щуючи в спеціальній ємкості в морозильну камеру
(температура –19 °С) на 5–10 хв. Видалений мозо-
чок одразу вміщували в охолоджений до +5 °С роз-
чин DMEM (“Sigma Aldrich”, США) на 7 хв і піс-
ля цього розрізали на частини, які витримували
10 хв у розчині DMEM на льоду. Блоки тканини мо-
зочка піддавали ферментативній обробці розчином,
котрий вміщував 0.1 % протеази (“Sigma Aldrich”,
США) та 0.1 % трипсину (“Sigma Aldrich”, США),
при температурі +30 °С протягом 30 хв. Після фер-
ментної обробки частини мозочка відмивали розчи-
ном DMEM, подрібнювали на менші фрагменти та
пропускали через піпетки. Отримані окремі нейро-
ни розміщували на покривних скельцях. Для заван-
таження клітин кальційчутливим барвником клі-
тини витримували в розчині Тіроде з додаванням
флуоресцентного барвника Fura-2AM (“Molecular
Probes”, США) у концентрації 5 мкМ та детергенту
Плуронік F-127 (0.02 %). Завантаження клітин барв-
ником здійснювалося протягом 30 хв при кімнатній
температурі (+22 °С). Після цієї процедури клітини
інкубували в розчині Тіроде протягом 30–40 хв для
забезпечення повної деестерифікації барвника.
Рівень внутрішньоклітинного кальцію вимірю-
вали за допомогою мікрофлуоресцентного аналі-
зу. Для вимірювання [Ca2+]i барвник поперемін-
но збуджували ультрафіолетовим світлом з двома
довжинами хвиль (360 та 390 нм), використовую-
чи монохроматор. Для реєстрації кальцієвих тран-
зієнтів під час експерименту застосовували CCD-
камеру Imago-QE (“Till Photonics”, ФРН). Сигнали
з CCD-камери подавали на комп’ютер, за допомо-
гою якого вимірювали відношення величин флу-
оресцентних сигналів при двох довжинах хвиль
(R = F1/F2); це відношення, як відомо, адекватно ві-
дображує зміни внутрішньоклітинної концентра-
ції кальцію. Запис та обробка даних експерименту
здійснювалися із застосуванням програми “TillVis-
ion” (ФРН).
Під час роботи з клітинами використовували
розчин DMEM та розчин, аналогічний розчину Ті-
роде, такого складу (у мілімолях на 1 л): NaCl –
125, CaCl – 2, KCl – 2.5, MgCl – 1, HEPES – 20,
глюкоза – 10 (pH 7.4). Усі досліди проводили при
кімнатній температурі. Статистична обробка вико-
нувалася за допомогою програмного забезпечення
“OriginPro 8.0”. Усі чисельні значення результатів
дослідження наведені у вигляді середніх значень ±
± похибка середнього (m ± s.e.m.). Рівень вірогід-
ності різниць визначався за допомогою однофак-
торного дисперсійного аналізу (one-way ANOVA), і
відмінності вважалися вірогідними при P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТИ
Кальцієві транзієнти в досліджуваних клітинах мо-
зочка карася викликалися деполяризацією плазма-
тичної мембрани. Використовували лише клітини
із чітко окресленою мембраною без пошкоджень
і без чітко видимих внутрішньоклітинних ком-
партментів. Деполяризацію плазматичної мембра-
ни викликали аплікацією розчину з підвищеною
концентрацією К+ (50 мМ). У відповідь на таку де-
поляризацію мембрани гіперкалієвим розчином у
нейронах мозочка карася відбувалося швидке зрос-
тання внутрішньоклітинного рівня Са2+ ([Ca2+]i),
після чого спостерігалося швидке експоненціаль-
не падіння [Ca2+]i до нормальних значень протягом
відносно короткого проміжку часу. Для тестування
життєздатності клітин та задовільного відтворення
відповідей ми використовували аплікації гіперка-
лієвого розчину тривалістю 5 с. Амплітуда кальці-
євих транзієнтів, що виникали у відповідь на депо-
ляризацію мембрани, була стабільною та стійкою
протягом усього періоду експерименту (25–30 хв).
Амплітуди та кінетичні параметри кальцієвих
транзієнтів на початку експерименту та через 25 хв
мали подібні значення, що вказувало на збережен-
ня нормальної життєдіяльності клітини під час до-
слідження.
У наступних експериментах ми досліджували
участь мембранної РМСА в кальцієвому обміні
ней ронів. Для цього ми використовували додаван-
ня 100 мкМ іонів La3+ у зовнішній розчин (при та-
кій концентрації La3+ блокує активність РМСА і не
впливає на активність NCX [16]). Кальцієві тран-
зієнти в контрольних умовах викликали деполяри-
зацією мембрани, використовуючи аплікації гіпер-
калієвого розчину тривалістю 5 або 10 с (рис. 1).
Амплітуда контрольних кальцієвих транзієнтів при
таких тривалостях стимуляції була ідентичною
або трохи більшою в разі триваліших деполяриза-
цій. Час повернення концентрації Ca2+ до базаль-
ного рівня та відносна кількість Ca2+, що входив у
клітину під час деполяризації, зі збільшенням три-
УЧАСТЬ КАЛЬЦІЙТРАНСПОРТНИХ СИСТЕМ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4284
валості аплікації гіперкалієвого розчину зростали
(рис. 1).
Дія La3+ тестувалася також із використанням
двох тривалостей дії гіперкалієвого розчину (5 та
10 с). Відомо, що La3+, як і багато інших неорга-
нічних катіонів, може також блокувати активність
потенціалзалежних кальцієвих каналів мембрани.
Тому для виключення такої можливості ми апліку-
вали розчин, який вміщував La3+, відразу ж після
деполяризації мембрани. Як показали вимірюван-
ня, амплітуда кальцієвих транзієнтів після бло-
кування роботи РМСА не зростала при збільшен-
ні тривалості дії La3+, проте у всіх досліджуваних
клітинах рівень Ca2+ повертався не до базального, а
до деякого значно вищого значення. Іншими слова-
ми, спостерігалася певна «поличка», котра існува-
ла стільки, скільки тривала аплікація La3+ (рис. 1).
Це вказувало на блокування роботи РМСА, в ре-
зультаті чого в цитозолі накопичувався Ca2+ і ба-
зальний рівень [Ca2+]i зростав. Після видалення
La3+ із зовнішнього розчину за допомогою відми-
вання базальний рівень [Ca2+]i повертався до почат-
кової величини протягом приблизно 1 хв. Кількісні
вимірювання кальцієвих транзієнтів, викликаних
3- або 5-секундними деполяризаціями під дією гі-
перкалієвого розчину, показали, що в присутності
100 мкМ La3+ базальний рівень [Ca2+]i підвищував-
ся відносно контрольних значень у середньому на
31.4 ± 3.2 % (P < 0.01; рис. 3, А), і цей ефект не за-
лежав від тривалості деполяризації. При збільшен-
ні концентрації La3+ характер змін кальцієвих тран-
зієнтів істотно змінювався.
Для визначення участі мембранного NCX ми за-
мінювали іони Na+ у зовнішньоклітинному розчині
іонами Li+. Як уже вказувалося вище, NCX-пм не
може функціонувати в умовах, коли іони Na+ замі-
щені іонами Li+, тоді як робота NCX-мх при цьо-
му не порушується [13]. Така ситуація дає змогу
за допомогою іонів Li+ дослідити роль NCX-пм, не
втручаючись у роботу NCX-мх. Для вивчення дії
іонів Li+ був застосований такий самий, як і в по-
передньому випадку (у разі використання Lа3+),
протокол експериментів; використовували два зна-
чення тривалості деполяризації мембрани (5 і 10 с)
під дією гіперкалієвого розчину. Як видно з рис. 2,
вплив Li+ в аналогічних умовах був подібним до
такого іонів Lа3+, описаного вище. У присутності
іонів Li+ амплітуда кальцієвих транзієнтів не змі-
нювалась, а рівень цитоплазматичного Ca2+ після
розвитку таких транзієнтів не повертався до почат-
20
–
00 2500
0.2
0.0
0.2
10 5 10 5 10 5 10
Р и с. 1. Кальцієві транзієнти в нейронах мозочка карася,
викликані деполяризацією плазматичної мембрани – аплікаціями
50 мМ КCl (позначено стрілками) різної тривалості – 5 та 10 с
(позначено вгорі).
Вимірювання були проведені в контролі і в умовах блокування
Ca2+-АТФази плазматичної мембрани в присутності 100 мкМ
La3+ в зовнішньому розчині (позначено лініями під записами
транзієнтів). По осі абсцис – час, с; по осі ординат – відношення
величини флуоресцентних сигналів при двох довжинах хвиль
(F/F0), що відображає зміни внутрішньоклітинної концентрації
кальцію.
1400 1600 1800
– 0.2
– 0.1
0.0
0.1
0.2
Р и с. 2. Кальцієві транзієнти, викликані в нейронах мозочка
карася деполяризацією мембрани (аплікаціями 50 мМ KCl
тривалістю 5 с).
Вимірювання були проведені в контролі і в умовах блокування
мембранного натрій-кальцієвого обмінника в результаті заміни
Na+ у зовнішньому розчині іонами Li+. Решта позначень ті ж
самі, що й на рис. 1.
с
100 мкМ La3+ La3+ La3+ La3+
Li+ Li+
KCl
с
І. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ, П. Г. КОСТЮК, О. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4 285
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
кового значення. Цей рівень збільшувався відносно
контрольних значень у середньому на 36.6 ± 2.1 %
(P < 0.01; рис. 3, Б); величина таких зрушень не за-
лежала від тривалості деполяризації клітини. Піс-
ля відмивання базальний рівень [Ca2+]i повертався
до початкового значення протягом 1–2 хв. На від-
міну від дії La3+ у випадку використання Li+ і замі-
ни його контрольним розчином, що вміщував Na+,
спостерігалося значне зменшення амплітуди каль-
цієвих транзієнтів, викликаних контрольними аплі-
каціями KCl (рис. 2). Однак згодом (через 6–7 хв)
амплітуда цих транзієнтів поступово відновлюва-
лася до контрольного рівня. Даний феномен можна
пояснити нездатністю іонів Li+ замінювати іони Na+
у перебігу деполяризації мембрани нейронів, зумов-
леної роботою натрієвих каналів. Необхідно зазна-
чити, що описані ефекти проявлялись у всіх дослід-
жуваних нейронах і дуже добре відтворювалися.
Таким чином, отримані дані можуть вказувати на
те, що активність РМСА та NCХ мембрани в ней-
ронах мозочка карася є досить істотною. Вона за-
безпечує значний внесок у функціонування кальці-
євої сигнальної системи нейронів цих тварин.
ОБГОВОРЕННЯ
Відомо, що у хребетних тварин нервова система є
найбільш вразливою до дії ішемії/гіпоксії. З іншо-
го боку, виявилося, що існує цілий ряд видів тва-
рин, пристосованих виживати в екстремальних
умовах нестачі кисню – інтенсивної гіпоксії. Серед
толерантних до гіпоксії тварин відомі досить бага-
то видів риб; зокрема, у водоймах України мешкає
представник родини коропових – карась срібний
(Carassius gibelio). Цей вид карася відомий своєю
загальною високою життєстійкістю [18]. У неспри-
ятливих умовах замору (нестачі кисню) він здатен
успішно виживати, тоді як переважна кількість ін-
ших видів риб у таких умовах гинуть. Беручи до
уваги той факт, що в процесах ушкоджень нерво-
вої тканини під час гіпоксії істотну роль відіграє
значне підвищення рівня цитоплазматичного каль-
цію, вивчення особливостей клітинних механізмів
кальцієвого обміну в нейронах толерантних до гі-
поксії тварин є перспективним напрямом; такі ме-
ханізми зумовлюють високу стійкість нейронів до
виживання в умовах нестачі кисню.
Метою наших досліджень було визначення особ-
ливостей функціонування двох основних механіз-
мів видалення іонів Ca2+ із цитозолю – РМСА та
NCX ендоплазматичної мембрани – та їх ролі в за-
безпеченні кальцієвого гомеостазу в нейронах мо-
зочка толерантного до гіпоксії виду риб – карася
Carassius gibelio. РМСА мембрани має дуже ба-
гато спільних властивостей з Ca2+-АТФазою ендо-
плазматичного ретикулуму (SERCA). Обидва ці
транс портних ензими мають велику спорідненість
до Ca2+ (IC50 = 0.2–0.5 мкМ). Проте виявилося, що
РМСА значно ефективніша, ніж SERCA, у віднов-
ленні базального рівня Ca2+ після стимуляції клі-
тини. Вважається, що ця властивість може бути
пов’язана з особливостями локалізації даних транс-
портних систем, насамперед в аспекті близькості до
кальцієвих каналів [19]. Можливо, саме останнім і
Контроль La3+
Контроль Li+
* *
n=21
Р и с. 3. Вплив блокування Ca2+-АТФази плазматичної мембрани
під дією 100 мкМ Lа3+ (А) та мембранного натрій-кальцієвого
обмінника в результаті заміни Na+ у зовнішньому розчині іонами
Li+ (Б) на базальний рівень Ca2+ у нейронах мозочка карася.
Наведені нормовані значення даного параметра; за одиницю
прийнятий рівень Ca2+ в умовах контролю. **P < 0.01 порівняно
з контролем.
А
Б
* *
n=24
УЧАСТЬ КАЛЬЦІЙТРАНСПОРТНИХ СИСТЕМ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4286
зумовлена більша ефективність РМСА. Іншою від-
мінністю РМСА від SERCA є стехіометрія Ca2+/АТФ-
реакції, яка є рівною одиниці в РМСА та двом у ви-
падку SERCA. РМСА є об’єктом контролю, котрий
здійснюється численними клітинними ферментами
та регуляторами, серед яких слід згадати протеїн-
кінази, протеази (особливо кальцинейрин), каспази
та ін. Однією з особливостей РМСА є присутність
в її цитозольному домені кальмодулінзв’язуючого
сайта, котрий за відсутності кальмодуліну діє як
автоінгібуюча ділянка молекули ферменту. Саме
це є причиною того, що антагоністи кальмодулі-
ну можуть блокувати активність РМСА. Існує чо-
тири ізоформи РМСА (1–4), котрі кодуються різни-
ми генами, а також багато її сплайсових варіантів.
Три ізоформи РМСА (1–3) експресуються в мозку,
тоді як РМСА-4 є ізоформою, розповсюдженою в
усіх тканинах [6]. Експресія РМСА регулюється
іонами Ca2+ – збільшення їх концентрації стимулює
експресію даного ферменту. Позитивна регуляція
(up-regulation) експресії РМСА, очевидно, є фунда-
ментальною властивістю, котра гарантує виживан-
ня нейронів у несприятливих умовах (значного та/
або довготривалого підвищення рівня цитозольно-
го Ca2+).
NCХ є присутнім у різних типах клітин різних
видів тварин [5]. Були ідентифіковані три ізоформи
плазматичного NCX (NCX1, NCX2 та NCX3). Ці ізо-
форми експресуються родиною окремих генів, що
знаходяться в різних хромосомах; всі ізоформи ма-
ють багато сплайсових варіантів [20]. Їх активність
залежить від багатьох клітинних факторів і моду-
люється останніми, у першу чергу іонами Ca2+ та
Na+, а також протеїнкіназами, РІР2, АТФ та ін. [15].
Встановлено, що NCX існує в плазматичній мемб-
рані, мембранах мітохондрій та ендоплазматичного
ретикулуму збудливих і незбудливих клітин [9, 13,
21]. Усі форми NCX експресується в нейронах різ-
них ділянок мозку, у тому числі й мозочка. Цікавою
особливістю NCX-пм є його здатність оперувати в
двох режимах – прямому та зворотному. Коли кон-
центрація Na+ в цитоплазмі істотно збільшується,
NCX переходить до оперування в зворотному ре-
жимі – іони Na+ виводяться з клітини в обмін на
іони Ca2+, що вносяться в середину клітини. Даний
феномен роботи NCХ у натрійзалежному режи-
мі може спричинювати кальційзалежне ушкоджен-
ня нейронів в умовах гіпоксії/аноксії, коли рівень
АТФ падає (це значно знижує активність РМСА,
яка виводить надлишковий Na+ з цитоплазми), а рі-
вень Ca2+ значно підвищується. Іншою особливістю
NCX-пм є те, що місце зв’язування Ca2+ для акти-
вації вказаного обмінника відрізняється від місця
транспортування Ca2+. Значення [Ca2+]i, необхідні
для активації NCX, лежать у діапазоні 100–300 нМ.
Відомо, що NCХ залучений у реалізацію різнома-
нітних функцій клітини, таких, як контроль нейро-
секреції, активність фоторецепторних клітин, спря-
ження збудження/скорочення у м’язових клітинах,
регуляція концентрації Ca2+ у збудливих клітинах,
обмін Ca2+ у мітохондріях та ендоплазматичному
ретикулумі.
Результати наших досліджень свідчать про те, що
всі протестовані нейрони мозочка карася на дію на
них La3+ у досить низьких концентраціях відповіда-
ли істотним підвищенням базального рівня [Ca2+]i,
тоді як часові параметри кальцієвого транзієнта як
такого змінювалися мало. Цей факт підтверджує,
що РМСА присутня в цитоплазматичній мембра-
ні і демонструє значну активність. Ми встанови-
ли, що вказана транспортна система ефективно за-
безпечує очищення цитоплазми від надлишкового
Ca2+, оскільки при виключенні роботи РМСА-пом-
пи за допомогою її блокатора La3+ базальний рівень
кальцієвих транзієнтів збільшувався приблизно на
третину відносно їх контрольної величини. Робота
цієї помпи практично не залежала від тривалості
тест-деполяризації. Виявилося, що інша система
очищення цитоплазми від надлишкового Ca2+ –
NCХ – також представлена в плазматичній мембра-
ні нейронів мозочка карася. При виключенні робо-
ти NCХ за допомогою специфічного щодо такого
обмінника фактора – іонів Li+ – базальний рівень
Ca2+, від якого починалося формування кальцієвих
транзієнтів, збільшувався більш ніж на 36 % від-
носно його контрольної величини. Робота даної
транспортної системи також не залежала від трива-
лості деполяризації.
Отримані нами результати дають підстави вва-
жати, що функціонування РМСА та NCX у нейро-
нах мозочка карася істотно впливає на внутріш-
ньоклітинний кальцієвий обмін, забезпечуючи
підтримання адекватного базального рівня Ca2+ у
цих нейро нах.
І. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ, П. Г. КОСТЮК, О. О. ЛУК’ЯНЕЦЬ
НЕЙРОФИЗИОЛОГИЯ / NEUROPHYSIOLOGY.—2009.—T. 41, № 4 287
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. P. E. Bickler, “Clinical perspectives: neuroprotection lessons
from hypoxia-tolerant organisms,” J. Exp. Biol., 207, 3243-
3249 (2004).
2. P. E. Bickler and L. T. Buck, “Hypoxia tolerance in reptiles,
amphibians, and fishes: life with variable oxygen availability,”
Annu. Rev. Physiol., 69, 145-170 (2007).
3. R. I. Stanika, P. G. Kostyuk, and E. A. Lukyanetz, “Studies of
action of hypoxia on calcium homeostasis in sensory neurons
of rats,” Фізіол. журн., 48, 15-16 (2002).
4. E. A. Lukyanetz, V. M. Shkryl, and P. G. Kostyuk, “Action of
hypoxia on different types of calcium channels in hippocampal
neurons,” Biochim. Biophys. Acta, 1618, 33-38 (2003).
5. R. DiPolo and L. Beauge, “Sodium/calcium exchanger:
influence of metabolic regulation on ion carrier interactions,”
Physiol. Rev., 86, 155-203 (2006).
6. G. J. Siegel, R. W. Albers, S. Brady, and D. L. Price, Basic
Neurochemistry: Molecular, Cellular and Medical Aspects,
Acad. Press, New York (2005).
7. S. P. Yu and D. W. Choi, “Na(+)-Ca2+ exchange currents in
cortical neurons: concomitant forward and reverse operation
and effect of glutamate,” Eur. J. Neurosci., 9, 1273-1281
(1997).
8. E. Carafoli, L. Santella, D. Branca, et al., “Generation,
control, and processing of cellular calcium signals,” Crit. Rev.
Biochem. Mol. Biol., 36, 107-260 (2001).
9. L. Kiedrowski, G. Brooker, E. Costa, et al., “Glutamate impairs
neuronal calcium extrusion while reducing sodium gradient,”
Neuron, 12, 295-300 (1994).
10. R. Kraft, “The Na+/Ca2+ exchange inhibitor KB-R7943 potently
blocks TRPC channels,” Biochem. Biophys. Res. Commun.,
361, 230-236 (2007).
11. G. D. Mironova, A. E. Negoda, B. S. Marinov, et al.,
“Functional distinctions between the mitochondrial ATP-
dependent K+ channel (mitoKATP) and its inward rectifier
subunit (mitoKIR),” J. Biol. Chem., 279, 32562-32568
(2004).
12. M. L. Di Paolo, M. Lunelli, M. Scarpa, et al., “Phosphonium
compounds as new and specific inhibitors of bovine serum
amine oxidase,” Biochem. J., 384, 551-558 (2004).
13. P. Castaldo, M. Cataldi, S. Magi, et al., “Role of the
mitochondrial sodium/calcium exchanger in neuronal
physiology and in the pathogenesis of neurological diseases,”
Prog. Neurobiol., 87, 58-79 (2009).
14. M. Crompton, M. Kunzi, and E. Carafoli, “The calcium-
induced and sodium-induced effluxes of calcium from heart
mitochondria. Evidence for a sodium-calcium carrier,” Eur. J.
Biochem., 79, 549-558 (1977).
15. L. Annunziato, G. Pignataro, and G. F. Di Renzo,
“Pharmacology of brain Na+/Ca2+ exchanger: from molecular
biology to therapeutic perspectives,” Pharmacol. Rev., 56,
633-654 (2004).
16. H. Shimizu, M. L. Borin, and M. P. Blaustein, “Use of La3+ to
distinguish activity of the plasmalemmal Ca2+ pump from Na+/
Ca2+ exchange in arterial myocytes,” Cell Calcium, 21, 31-41
(1997).
17. А. И. Карамян, Методологические основы эволюционной
нейрофизиологии, Наука, Ленинград (1949).
18. G. E. Nilsson and P. L. Lutz, “Anoxia tolerant brains,” J.
Cerebr. Blood Flow Metab., 24, 475-486 (2004).
19. M. Brini, “Plasma membrane Ca(2+)-ATPase: from a
housekeeping function to a versatile signaling role,” Pflügers
Arch., 457, 657-664 (2009).
20. J. Lytton, “Na+/Ca2+ exchangers: three mammalian gene
families control Ca2+ transport,” Biochem. J., 406, 365-382
(2007).
21. M. Patterson, J. Sneyd, and D. D. Friel, “Depolarization-
induced calcium responses in sympathetic neurons: relative
contributions from Ca2+ entry, extrusion, ER/mitochondrial
Ca2+ uptake and release, and Ca2+ buffering,” J. Gen. Physiol.,
129, 29-56 (2007).
УЧАСТЬ КАЛЬЦІЙТРАНСПОРТНИХ СИСТЕМ ПЛАЗМАТИЧНОЇ МЕМБРАНИ
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68299 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0028-2561 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:43:43Z |
| publishDate | 2009 |
| publisher | Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Лук’янець, І.О. Костюк, П.Г. Лук’янець, О.О. 2014-09-20T16:14:11Z 2014-09-20T16:14:11Z 2009 Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася / І.О. Лук’янець, П.Г. Костюк, О.О. Лук’янець // Нейрофизиология. — 2009. — Т. 41, № 4. — С. 281-287. — Бібліогр.: 21 назв. — укр. 0028-2561 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68299 576.32/36:577.352.465:577.151.63:597.4/.5:612.827 Вивчали роль натрій-кальцієвого обмінника (NCX) та Ca²⁺-АТФази плазматичної мембрани (РМСА) як важливих внутрішньоклітинних систем регуляції кальцієвого обміну в нейронах мозочка толерантного до гіпоксії виду риб – карася Carassius gibelio. В експериментах використовували відповідні блокатори цих транспортних систем – іони літію та лантану. Внутрішньоклітинну концентрацію Ca²⁺ ([Ca²⁺]і) вимірювали за допомогою кальційчутливого барвника Fura-2AM та мікрофлуоресцентного методу. Як було встановлено, нейрони мозочка карася мають ефективну систему очищення цитоплазми від надлишкового Ca²⁺, котре забезпечується як NCX, так і РМСА, присутніми в плазматичній мембрані. В умовах блокування роботи РМСА за допомогою лантану базальний рівень Ca²⁺ у клітині збільшувався в середньому на 31.4 % відносно контролю незалежно від тривалості тест-деполяризації. При виключенні роботи NCX за допомогою заміни іонів натрію в зовнішньому розчині іонами літію рівень Ca²⁺ у клітині збільшувався на 36.6 % відносно контролю (також незалежно від тривалості деполяризації). Отримані дані вказують на те, що функціонування РМСА та NCX у нейронах мозочка карася істотно впливає на внутрішньоклітинний кальцієвий обмін, забезпечуючи підтримання адекватного базального рівня Ca²⁺ у цих нейронах. We studied the role of Na⁺/Ca²⁺ exchanger (NCX) and Ca²⁺-ATPase of the plasma membrane (РМСА), known to be the most important intracellular systems controlling calcium exchange in cerebellar neurons of a fish species tolerant to hypoxia, Carassius gibelio. In our experiments, we used the corresponding blockers of these transport systems, ions of lithium and lanthanum. The intracellular Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺] і ) was measured using a calcium-sensitive dye, Fura-2AM, and a microfluorescence technique. We found that neurons of the Carassius cerebellum possess an effective system of cleaning of the cytoplasm from excessive Ca²⁺, which is provided by both NCX and РМСА functioning in the plasma membrane. Under conditions of the blockade of functioning of РМСА using lanthanum, the basal Ca²⁺ level in the cells increased, on average, by 31.4% with respect to the control, independently of the duration of test depolarizations. After switching off of the NCX functioning by the replacement of sodium ions in the extracellular solution by lithium ions, the Ca²⁺ level in the cell increased by 36.6% with respect to the control (also independently of the duration of depolarization). The obtained data indicate that the functioning of РМСА and NCX in Carassius cerebellar neurons significantly influences the intracellular calcium exchange providing the maintenance of an adequate basal Ca²⁺ level in these neurons. uk Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Нейрофизиология Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася The Involvement of Calcium Transport Systems of the Plasma Membrane in Calcium Exchange in Neurons of the Carassius gibelio Cerebellum Article published earlier |
| spellingShingle | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася Лук’янець, І.О. Костюк, П.Г. Лук’янець, О.О. |
| title | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| title_alt | The Involvement of Calcium Transport Systems of the Plasma Membrane in Calcium Exchange in Neurons of the Carassius gibelio Cerebellum |
| title_full | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| title_fullStr | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| title_full_unstemmed | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| title_short | Участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| title_sort | участь кальційтранспортних систем плазматичної мембрани в кальцієвому обміні в нейронах мозочка карася |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68299 |
| work_keys_str_mv | AT lukânecʹío učastʹkalʹcíitransportnihsistemplazmatičnoímembranivkalʹcíêvomuobmínívneironahmozočkakarasâ AT kostûkpg učastʹkalʹcíitransportnihsistemplazmatičnoímembranivkalʹcíêvomuobmínívneironahmozočkakarasâ AT lukânecʹoo učastʹkalʹcíitransportnihsistemplazmatičnoímembranivkalʹcíêvomuobmínívneironahmozočkakarasâ AT lukânecʹío theinvolvementofcalciumtransportsystemsoftheplasmamembraneincalciumexchangeinneuronsofthecarassiusgibeliocerebellum AT kostûkpg theinvolvementofcalciumtransportsystemsoftheplasmamembraneincalciumexchangeinneuronsofthecarassiusgibeliocerebellum AT lukânecʹoo theinvolvementofcalciumtransportsystemsoftheplasmamembraneincalciumexchangeinneuronsofthecarassiusgibeliocerebellum |