Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий
Эффективное криоконсервирование клеточных суспензий является важной задачей криобиологии. На основании предыдущих исследований была разработана методика системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий. В качестве клеточной модели использовали кератиноциты человека. Исследова...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2011 |
| Main Authors: | , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68458 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий / Н. Хофманн, И. Бернеманн, Д. Погожих, Б. Гласмахер // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 353-363. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860122491908784128 |
|---|---|
| author | Хофманн, Н. Бернеманн, И. Погожих, Д. Гласмахер, Б. |
| author_facet | Хофманн, Н. Бернеманн, И. Погожих, Д. Гласмахер, Б. |
| citation_txt | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий / Н. Хофманн, И. Бернеманн, Д. Погожих, Б. Гласмахер // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 353-363. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Эффективное криоконсервирование клеточных суспензий является важной задачей криобиологии. На основании предыдущих исследований была разработана методика системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий. В качестве клеточной модели использовали кератиноциты человека. Исследование включало 48 протоколов с различными скоростями охлаждения (B) в двухступенчатых режимах (B1 в диапазоне от 4 до –30°С и В2 от –30 до –80°С). Все протоколы изучали при четырех различных концентрациях наиболее часто применяемого криопротектора диметилсуфоксида (ДМСО). Растровый анализ около 600 образцов позволил изучить полный набор возможных переменных. В дальнейших исследованиях данная методика была использована для улучшения протоколов криоконсервирования HPMEC-ST1.6R (легочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека). Результаты исследования показали, что только определенное оптимальное сочетание скоростей охлаждения обеспечивает высокий уровень выживаемости клеток после оттаивания. Для кератиноцитов человека оптимальными протоколами замораживания были: охлаждение со скоростью 5 К/мин для B1 и 7,5 К/мин для В2, либо 5 К/мин для B1 и 10 K/мин для В2 при концентрации ДМСО 2,5%. Наиболее высокие показатели выживаемости культуры клеток HPMEC-ST1.6R были достигнуты при использовании следующих протоколов: 5 K/мин (B1) в сочетании с 5 K/мин (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/мин в сочетании с 3 К/мин (5 или 7,5% ДМСО); 10 K/мин (B1) в сочетании с 3 К/мин (B2) (10% ДМСО).
Ефективне кріоконсервування клітинних суспензій є важливим завданням кріобіології. На підставі попередніх досліджень була розроблена методика системної оптимізації протоколів кріоконсервування клітинних суспензій. У якості клітинної моделі використовували кератиноцити людини. Дослідження включало 48 протоколів з різними швидкостями охолодження (B) в двоступінчастих режимах (B1 в діапазоні від 4 до –30°С і В2 від –30 до –80°С). Усі протоколи вивчали при чотирьох різних концентраціях кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО), який вживається найбільш часто. Растровий аналіз близько 600 зразків дозволив вивчити повний набір можливих змінних. У подальших дослідженнях дана методика була використана для поліпшення протоколів кріоконсервування HPMEC-ST1.6R (легеневі мікросудинні ендотеліальні клітини людини). Результати дослідження показали, що тільки певне оптимальне поєднання швидкостей охолодження забезпечує високий рівень виживання клітин після відтавання. Для кератиноцитів людини оптимальними протоколами заморожування були: охолодження зі швидкістю 5 К/хв для B1 і 7,5 К/хв для В2 або 5 К/хв для B1 і 10 K/хв для В2 при концентрації ДМСО 2,5%. Найбільш високі показники виживаності культури клітин HPMEC-ST1.6R були досягнуті при застосуванні наступних протоколів: 5 K/хв (B1) у поєднанні з 5 K/хв (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/хв у поєднанні з 3 К/хв (5 або 7,5% ДМСО); 10 K/хв (B1) у поєднанні з 3 К/хв (B2) (10% ДМСО).
Effective cryopreservation of cellular suspensions is an important task of cryobiology. A systematic parameter optimization setup for cryopreservation of cellular suspensions was established on the basis of our previous studies. Keratinocytes were used as a cellular model. The investigation included 48 protocols with different cooling rates (B) in a two-step freezing protocols (B1 in the range of 4°C to –30°C and B2 from –30°C to –80°C). All protocols have been studied with four different concentrations of the most frequently applied cryoprotective agent dimethyl sulfoxide (DMSO). Raster analysis of approximately 600 samples allowed the detection of the most comprehensive array of possible variables. In further investigations this setup was used to improve the cryopreservation protocols for HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells). Results revealed that only an optimal combination of cooling rates ensured the highest survival rates of cells after thawing. In case of keratinocytes, the optimal freezing protocol was composed of the cooling rates of 5 K/min for B1 and 7.5 K/min for B2, or 5 K/min for B1 and 10 K/min for B2 (2.5% DMSO concentration). The highest survival rates of HPMEC-ST1.6R cell culture were achieved with application of the following protocols: 5 K/min (B1) combined with 5 K/min (B2) (7.5% DMSO); 3 K/min, combined with 3 K/min (5% or 7.5% DMSO); and 10 K/min combined with 3 K/min (10% DMSO).
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:40:14Z |
| format | Article |
| fulltext |
353
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
JRG Biothermodynamik, Institut fьr Mehrphasenprozesse, Leibniz
Universitдt Hannover, Callinstr. 36, D-30167 Hannover; тел.: +49-
511-762-19357; факс: +49-511-762-19389; электронная почта:
hofmann@imp.uni-hannover.de
* To whom correspondence should be addressed: JRG Biothermody-
namik, Institut fьr Mehrphasenprozesse, Leibniz Universitдt Hanno-
ver, Callinstr. 36, D-30167 Hannover; tel.: +49-511-762-19357; fax:
+49-511-762-19389; e-mail: hofmann@imp.uni-hannover.de
1 Leibniz Universitдt Hannover, Germany
2 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the
National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
1 Ганноверский университет им. Лейбница, Германия;
2 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН
Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
УДК 57.043:547.42:612.79.014
Н. ХОФМАНН1, И. БЕРНЕМАНН1, Д. ПОГОЖИХ1,2, Б. ГЛАСМАХЕР1
Разработка системной оптимизации протоколов
криоконсервирования клеточных суспензий
UDC 57.043:547.42:612.79.014
N. HOFMANN1, I. BERNEMANN1, D. POGOZHYKH1,2, B. GLASMACHER1
Development of Systematic Parameter Optimization for
Cryopreservation Protocols for Cellular Suspensions
Эффективное криоконсервирование клеточных суспензий является важной задачей криобиологии. На основании
предыдущих исследований была разработана методика системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных
суспензий. В качестве клеточной модели использовали кератиноциты человека. Исследование включало 48 протоколов с
различными скоростями охлаждения (B) в двухступенчатых режимах (B1 в диапазоне от 4 до –30°С и В2 от –30 до –80°С). Все
протоколы изучали при четырех различных концентрациях наиболее часто применяемого криопротектора диметилсуфоксида
(ДМСО). Растровый анализ около 600 образцов позволил изучить полный набор возможных переменных. В дальнейших
исследованиях данная методика была использована для улучшения протоколов криоконсервирования HPMEC-ST1.6R (ле-
гочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека). Результаты исследования показали, что только определенное
оптимальное сочетание скоростей охлаждения обеспечивает высокий уровень выживаемости клеток после оттаивания. Для
кератиноцитов человека оптимальными протоколами замораживания были: охлаждение со скоростью 5 К/мин для B1 и 7,5 К/мин
для В2, либо 5 К/мин для B1 и 10 K/мин для В2 при концентрации ДМСО 2,5%. Наиболее высокие показатели выживаемости
культуры клеток HPMEC-ST1.6R были достигнуты при использовании следующих протоколов: 5 K/мин (B1) в сочетании с
5 K/мин (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/мин в сочетании с 3 К/мин (5 или 7,5% ДМСО); 10 K/мин (B1) в сочетании с 3 К/мин (B2) (10%
ДМСО).
Ключевые слова: криоконсервирование, клеточные суспензии, кератиноциты человека, HPMEC-ST1.6R, криопротекторы,
ДМСО, скорость охлаждения.
Ефективне кріоконсервування клітинних суспензій є важливим завданням кріобіології. На підставі попередніх досліджень
була розроблена методика системної оптимізації протоколів кріоконсервування клітинних суспензій. У якості клітинної моделі
використовували кератиноцити людини. Дослідження включало 48 протоколів з різними швидкостями охолодження (B) в дво-
ступінчастих режимах (B1 в діапазоні від 4 до –30°С і В2 від –30 до –80°С). Усі протоколи вивчали при чотирьох різних концен-
траціях кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО), який вживається найбільш часто. Растровий аналіз близько 600 зразків
дозволив вивчити повний набір можливих змінних. У подальших дослідженнях дана методика була використана для поліпшення
протоколів кріоконсервування HPMEC-ST1.6R (легеневі мікросудинні ендотеліальні клітини людини). Результати дослідження
показали, що тільки певне оптимальне поєднання швидкостей охолодження забезпечує високий рівень виживання клітин після
відтавання. Для кератиноцитів людини оптимальними протоколами заморожування були: охолодження зі швидкістю 5 К/хв
для B1 і 7,5 К/хв для В2 або 5 К/хв для B1 і 10 K/хв для В2 при концентрації ДМСО 2,5%. Найбільш високі показники вижи-
ваності культури клітин HPMEC-ST1.6R були досягнуті при застосуванні наступних протоколів: 5 K/хв (B1) у поєднанні з
5 K/хв (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/хв у поєднанні з 3 К/хв (5 або 7,5% ДМСО); 10 K/хв (B1) у поєднанні з 3 К/хв (B2) (10% ДМСО).
Ключові слова: кріоконсервування, клітинні суспензії, кератиноцити людини, HPMEC-ST1.6R, кріопротектори, ДМСО,
швидкість охолодження.
Effective cryopreservation of cellular suspensions is an important task of cryobiology. A systematic parameter optimization
setup for cryopreservation of cellular suspensions was established on the basis of our previous studies. Keratinocytes were used as
a cellular model. The investigation included 48 protocols with different cooling rates (B) in a two-step freezing protocols (B1 in the
range of 4°C to –30°C and B2 from –30°C to –80°C). All protocols have been studied with four different concentrations of the most
frequently applied cryoprotective agent dimethyl sulfoxide (DMSO). Raster analysis of approximately 600 samples allowed the
detection of the most comprehensive array of possible variables. In further investigations this setup was used to improve the
cryopreservation protocols for HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells). Results revealed that only an
optimal combination of cooling rates ensured the highest survival rates of cells after thawing. In case of keratinocytes, the optimal
freezing protocol was composed of the cooling rates of 5 K/min for B1 and 7.5 K/min for B2, or 5 K/min for B1 and 10 K/min for B2
(2.5% DMSO concentration). The highest survival rates of HPMEC-ST1.6R cell culture were achieved with application of the
following protocols: 5 K/min (B1) combined with 5 K/min (B2) (7.5% DMSO); 3 K/min, combined with 3 K/min (5% or 7.5%
DMSO); and 10 K/min combined with 3 K/min (10% DMSO).
Key words: cryopreservation, cell suspensions, human keratinocytes, HPMEC-ST1.6R, cryoprotectants, Me2SO, cooling rate.
354 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Криоконсервирование суспензии живых клеток,
предназначенных для долгосрочного хранения, яв-
ляется важной областью криобиологии. Хранение
в жидком азоте при температуре –196°C позволяет
предотвратить развивающийся аутолиз, а также
ряд других неблагоприятных процессов [9, 19, 27].
Основные физико-химические процессы, которые
могут привести к повреждению клеток при крио-
консервировании, не протекают в течение долго-
срочного хранения, а развиваются в области тем-
ператур, где происходят зарождение и рекристал-
лизация кристаллов льда внутри клетки и непосред-
ственно вокруг нее, а также на этапе плавления
при отогреве [1, 8]. В литературе особое внимание
уделяется разработке термодинамических моде-
лей, позволяющих определять транспортные ха-
рактеристики плазматических мембран, в част-
ности проницаемость для молекул воды и криопро-
текторов, и, используя эти данные, прогнозировать
оптимальные скорости охлаждения для различных
типов клеток [2, 4, 5, 10, 28–30].
В практике криоконсервирования клеточных
суспензий широко применяют многоступенчатые
режимы замораживания с разными значениями
температуры переходов от этапа к этапу в зави-
симости от типа клеток [17, 20, 22]. При охлаж-
дении адекватное обезвоживание клеток теорети-
чески возможно до –30°С. Ниже этой температу-
ры неизбежно образуется внутриклеточный лед в
результате гомогенной нуклеации [23, 24, 34]. В
данном температурном диапазоне вследствие
рекристаллизации, интенсивность которой зависит
от скоростей охлаждения, изменяется морфология
кристаллов льда [6, 8, 21], а при температурах,
близких к –80°C, высококонцентрированная криоза-
щитная среда переходит в аморфное состояние [15,
16, 35].
Скорость охлаждения клеточных суспензий
определяет характер кристаллизационных процес-
сов. Концентрационные и температурные градиен-
ты, которые возникают при высоких скоростях
охлаждения системы, приводят к образованию в
структуре льда дефектов различного типа (вакан-
сии, дислокации и т. д.), а также так называемых
текстур, что свидетельствует о наличии в кристал-
лах льда значительных деформационных напряже-
ний [3]. Кинетические процессы, обусловленные
релаксацией деформационных напряжений, могут
быть причиной повреждения клеток в зоне низких
температур [3, 6, 7]. В связи с этим оптимизация
протоколов криоконсервирования требует, в первую
очередь, тщательного исследования и анализа ука-
занных температурных диапазонов и связанных с
ними процессов кристаллизации.
Таким образом, для минимизации количества
поврежденных клеток при криоконсервировании
An important field of cryobiology is the cryopreser-
vation of living cells in suspension, which are intended
for long-term storage. Storing in liquid nitrogen at
–196°C allows preventing developing autolysis and
other damaging processes [9, 19, 27]. The main critical
physical and chemical processes that may lead to the
cell damage at the process of cryopreservation do not
occur during the long-term storage at extremely low
temperatures, but rather during the passage through
those temperature ranges that induce nucleation or
recrystallisation within the cell and its nearest surround-
ing and at the melting stage during thawing [1, 8]. In
cryobiological literature, special attention is paid to the
development of thermodynamic models for determining
the transport characteristics of cellular membranes, in
particular the hydraulic permeability, and permeability
to cryoprotectants, and to selection of optimal cooling
rates for different types of cells on the basis of this
data [2, 4, 5, 10, 28–30].
Multi-step freezing protocols with different tempe-
ratures of transition from stage to stage depending on
a cell type are widely used in the practice of cryopre-
servation of cellular suspensions [17, 20, 22]. Tempe-
rature –30°С is considered as the temperature, higher
to which adequate cell dehydration is theoretically pos-
sible, and below which an intracellular ice inevitably
forms in result of homogeneous nucleation [23, 24, 34].
In this temperature range morphology of ice crystals
is being changed, as a consequence of recrystallization,
the intensity of which depends on the cooling rate [6,
8, 21]. Changes in the residual highly concentrated
cryoprotective medium (its transition to an amorphous
state) are possible in the temperature range approach-
ing –80°C [15, 16, 35].
The cooling rate of cellular suspensions determines
the character of crystallization processes. Concentra-
tion and temperature gradients, which occur at high
rates of cooling of a system, lead to formation of vari-
ous types of defects in the structure of ice (vacancies,
dislocations, etc.) as well as the so-called textures.
This indicates the presence of significant deformational
stress in the ice crystals [3]. The kinetic processes,
caused by the relaxation of deformational stress, can
lead to the cell damage at the range of low temperatures
[3, 6, 7]. For this reason, the optimization of cryopreser-
vation protocols requires precise observation and ana-
lysis of the mentioned temperatures ranges and asso-
ciated crystallization.
Therefore, freezing of biological object requires
accurate selection of appropriate cooling rate, conside-
ration of the nucleation temperature [32] and the choice
of a suitable cryoprotective agent (CPA) of adjusted
concentration in order to minimize the cryodamage of
cells. The impact of applied cooling rates on the cells
is widely described in literature [1, 8, 18, 19, 26, 27].
The CPA added to a freezing medium reduces the cell
355
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
необходимы тщательный подбор подходящей ско-
рости охлаждения, учет температуры зарождения
кристаллов льда [32] и выбор соответствующей
концентрации криопротекторов (КП). Влияние
скорости охлаждения на клетки достаточно полно
описано в литературе [1, 8, 18, 19, 26, 27]. Добав-
ление КП в криозащитную среду снижает повреж-
дение клеток при замораживании и отогреве. Пос-
ле оттаивания криоконсервированные клетки долж-
ны сохранять биологические функции и пролифе-
ративные свойства. Однако современные научные
исследования показывают, насколько трудно полу-
чить такие результаты. Для определения состояния
клеток после оттаивания принято оценивать их
жизнеспособность и функциональную активность.
Оптимальные условия замораживания и оттаива-
ния специфичны для каждого типа клеток и должны
определяться индивидуально [19, 26].
Исследования [11, 13, 25, 32, 33] подтверждают,
что оптимальные условия замораживания имеют
большое значение для каждого типа клеток, обес-
печивая более высокий уровень их сохранности
после отогрева. При подборе условий заморажива-
ния проводится полный анализ параметров (концен-
траций КП и скоростей охлаждения), которые поз-
воляют оптимизировать процессы замораживания
и тем самым увеличивать сохранность и жизнеспо-
собность клеток. Предыдущие исследования в
этом направлении [14] указанные параметры учиты-
вали выборочно, и высокой корреляции между
измеренными данными не было обнаружено. В
данной работе способ корректировки концентраций
криопротектора и скоростей охлаждения в прото-
колах замораживания конкретного типа клеток
может быть усовершенствован благодаря приме-
нению крупномасштабной сетки измерений, позво-
ляющей проводить объективный анализ этих пара-
метров без ограничения области наблюдения.
Цель работы – разработка системного подхода
к оптимизации протоколов криоконсервирования
клеточных суспензий.
Материалы и методы
Около 600 образцов клеточных суспензий кера-
тиноцитов человека были заморожены по разрабо-
танной схеме сочетаний скоростей охлаждения и
концентраций криопротектора (рис. 1) с использова-
нием программного замораживателя (CM 2000,
Carburos Metallicos/Air Products, Барселона, Испа-
ния). Был проведен анализ 48 различных двухсту-
пенчатых протоколов замораживания при четырех
концентрациях (2,5; 5,0; 7,5 и 10,0%) наиболее час-
то применяемого криопротектора диметилсуль-
фоксида (ДМСО). В каждом протоколе изменялся
только один параметр (либо скорость охлаждения,
либо концентрация КП), и таким образом путем
damage from cryopreservation during the freezing and
thawing processes. After the thawing process, the
cryopreserved cells should not exhibit any impairment
of its biological functions and proliferative behavior.
However, current scientific research shows how diffi-
cult it is to ensure such qualities. It is convenient to
evaluate the condition of cells after thawing by measur-
ing their viability and functional activity. Optimal
freezing and thawing conditions are specific to the cell
type and must be identified individually for each type
of cells [19, 26].
Previous studies [11, 13, 25, 32, 33] support the
understanding that optimized freezing conditions are
essential for each type of cells, and have positive
influence on higher cell survival rates. This standardized
experimental process involves an extensive analysis
of the freezing parameters (CPA concentration and
cooling rates) that may help to optimize freezing
processes and lead to increased cell survival rates.
Previous studies conducted on this topic have only con-
sidered these parameters selectively and no precise
correlation between the categories of measurement
was identified [14]. Improved parameter adjustment
of a cell specific freezing protocol could be achieved
with application of a large-scale measuring grid (see
Materials and methods section) that examines the para-
meters impartially and without prior limitation of the
field of observation.
The aim of the work was the development of syste-
matic approach to optimization of protocols for cryo-
preservation of cellular suspensions.
Materials and methods
About 600 individual samples of human keratinocyte
cell suspensions were frozen with the developed com-
bination scheme in a controlled manner using a control-
led rate freezer (CM 2000, Carburos Metallicos/Air
Products, Barcelona, Spain). The assay included the
analysis of 48 varying freezing protocols (Fig. 1) with
four different concentrations (2.5, 5, 7.5, and 10%) of
the commonly used cryoprotective agent dimethyl
sulfoxide (DMSO). As for variation of cooling rate
and CPA concentration, only one parameter has been
altered at a time in each trial approach, and the evenly
arranged measuring grid (Fig. 2) has been filled by
systematic combination of the tested parameters.
Controlled thawing process took place in a speci-
fically designed heating device [32]. This procedure
allows controlled and reproducible heating of the samp-
le, which ensures that changing viability values of the
cells can be ascribed to the variation of the appointed
parameters during freezing process. Primary human
keratinocytes (Fig. 3A) served as a first cell model
that was used to test the effectiveness of the developed
parameter study. Since the optimal proliferation capa-
city of primary cells in vitro only lasts a few passages
356 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
пассажей (P), а у кератиноцитов существенно сни-
жается к 4 пассажу (P4), для экспериментов по
замораживанию использовали образцы из пасса-
жей от P0 до Р2. Кератиноциты получали от
небольшого пула пациентов. Последующая оценка
(P), and in the case of keratinocytes it reduces signifi-
cantly when reaching the passage 4 (P4), the frozen
samples used were P0 to P2 trials. These samples
were derived from a very small patient pool. For the
further evaluation of the test system, a human pulmo-
nary microvascular endothelial cell line (HPMEC-
ST1.6R, Fig. 3B) was used.
Keratinocytes were cultivated in vitro in keratino-
cyte-SFM (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)
with EGF (1 ng/ml), BPE (30 µg/ml) and 1% Penicillin/
Streptomycin (Pen/Strep, Invitrogen GmbH, Karlsruhe,
Germany) at 5% CO2 and 37°C.
For HPMEC-ST1.6R Dulbecco’s modified Eagle’s
medium (DMEM, Biochrom AG, Germany) was used
as basic culture medium supplemented with 10% v/v
fetal bovine serum (FBS, Biochrom AG, Berlin, Germa-
ny), 1% Pen/Strep (Invitrogen GmbH, Karlsruhe,
Germany), 0,5% ECGS (5 mg/ml) and 0,17% Heparine
(5000 U/ml).
In order to obtain cellular suspension for freezing,
the cells were incubated for three minutes with 0.25%
trypsin/0.02% EDTA (Biochrom AG, Berlin, Germany)
at 37°C and then separated from the bottom of the
flask. 10% FBS enriched PBS (Biochrom AG, Berlin,
Germany) served as a stopping medium. The serum
containing stopping medium was separated through
centrifugation at 4°C. Subsequent cell counting was
carried out in a ViCell XR (Beckman Coulter GmbH,
Krefeld, Germany) using automatic TrypanBlue® stai-
ning. Cell number for each freezing sample was adjus-
Вариа
Variation of DMSO concentration in the freezing medium
нты концентрации ДМСО в среде замораживания
Приготовление клеточной суспензии
Preparation of cell suspension
Варианты скоростей охлаждения на обоих этапах протокола замораживания
Variation of cooling rates in both steps of a 2 step freezing protocol
Кератиноциты
Keratinocytes
2.5% 5% 7.5% 10%
Этап 1 (от 4 до –30°C)
Step 1 (4 to –30°C)
Этап (от –30 до –80°C)
Step 2 –30
2
( to –80°C)
1 2 3 5 7,5 10 25 50 К/мин
K/min
К/мин
K/min
Комбинирование
Systematic combination
107,5 50253 5
Рис. 1. Экспериментальная схема систематического сочетания скоростей охлаж-
дения в двухступенчатых протоколах замораживания суспензии кератиноцитов
человека с различной концентрацией ДМСО [11].
Fig. 1. Experiment scheme of the systematic combination of cooling rates in two-
step freezing protocols with varying concentrations of DMSO for cryopreservation
of keratinocytes (adapted from [11]).
последовательного сочетания
переменных были исследова-
ны все возможные экспери-
ментальные вариации (рис. 2).
Процесс оттаивания конт-
ролировали в специально раз-
работанном нагревательном
приборе [32]. Эта процедура
позволяет получать контроли-
руемый и воспроизводимый
отогрев образца, гарантирую-
щий, что изменения показате-
лей жизнеспособности клеток
связаны только с вариацией
параметров замораживания.
Первичная культура кератино-
цитов человека (рис. 3, A) явля-
лась первой клеточной мо-
делью, которую использовали
для проверки эффективности
разработанной методики под-
бора параметров. Поскольку
оптимальная пролиферацион-
ная способность клеток пер-
вичной культуры in vitro со-
храняется всего несколько
Рис. 2. Сетка измерений – основа для сбора данных
двухступенчатых протоколов замораживания (B1 – в
диапазоне от 4 до –30°С, В2 – в диапазоне от –30 до –80°C)
[11].
Fig. 2. Measuring grid as basis for data acquisition with
two-step freezing protocols (B1: in the range of 4 to –30°C;
B2: in the range of –30 to –80°C) adapted from [11].
Скорость охлаждения B1 (в диапазоне
от 4 до –30°С), К/мин
Cooling rate B1 (from 4 to –30°C), K/min
С
ко
ро
ст
ь
ох
ла
жд
ен
ия
B
2
(в
д
иа
па
зо
не
от
–
30
д
о
–8
0°
С
),
К/
ми
н
C
oo
lin
g
ra
te
B
2
(fr
om
–
30
to
–
80
°C
),
K/
m
in
0 10 20 30 40 50 60
60
50
40
30
20
10
0
357 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
эмбриональной телячьей сыворотки FBS (Biochrom
AG, Германия), 1% Pen/Strep (Invitrogen GmbH,
Германия), 0,5% ECGS (5 мг/мл) и 0,17% гепарина
(5000 МЕ/мл).
Для получения суспензии для замораживания
клетки инкубировали в течение 3 мин с 0,25% tryp-
sin/0,02% EDTA (Biochrom AG, Германия) при 37°С,
а затем отделяли от дна матраса. Средой, останав-
ливающей пролиферацию, являлся 10% FBS, обога-
щенный PBS (Biochrom AG, Германия). Сыворотку,
содержащую тормозящую среду, удаляли центри-
фугированием при 4°C. Последующий подсчет
клеток осуществляли на приборе ViCell XR (Beck-
man Coulter GmbH, Германия) с автоматическим
окрашиванием Trypan Blue®. Исходная концентра-
ция клеток во всех экспериментах была постоянной
и составляла 2×105 кл/мл. Среду замораживания
(культуральная среда + 20% FBS с различной кон-
центрацией ДМСО) добавляли капельным путем.
Образцы объемом 1,5 мл замораживали в крио-
пробирках (Nalgene, Thermo Fischer Scientific, Гер-
мания). В каждом эксперименте одновременно за-
мораживали три ампулы одного и того же образца.
Скорости охлаждения варьировали в обеих частях
двухступенчатого протокола замораживания: пер-
вую скорость охлаждения (B1) в диапазоне от 4
до –30°C; вторую (B2) – от –30 до –80°С. В случае,
когда скорости на первом и втором этапах были
равны (В1 = В2), протокол замораживания был
одноступенчатым. После охлаждения до –80°С
образцы помещали в морозильные камеры с
температурой –152°С (Sanyo MDF-1155, Германия)
и хранили минимум одну неделю. Поскольку
хранение образцов при –152°C было идентичным
для всех образцов, при анализе результатов его не
выделяли в качестве отдельного этапа протокола
замораживания. Контролируемый отогрев криокон-
ted to the desired value of 2×105 cells/ml. Freezing
medium (culture medium + 20% FBS with varying
DMSO concentration) was added drop by drop. All
trials were frozen in three parallels each at 1.5 ml in
cryotubes (Nalgene, Thermo Fischer Scientific, Lang-
selbold, Germany). The cooling rates were altered in
both cooling sections of the two-step freezing protocol:
first cooling rate (B1) from 4°C to –30°C; second
cooling rate (B2) from –30°C to –80°C. In cases when
B1 rate was equal to B2, the protocols were one-step.
The samples that were cooled down to –80°C were
then stored at –152°C (Sanyo MDF-1155, Landgraf,
Hannover, Germany) for a minimum of one week.
Since storage at –152°C was identical for all studied
samples, we did not distinguish it as a separate step in
freezing protocols during analysis. The controlled re-
heating of the cryopreserved samples to the tempe-
rature of 4°C was carried out in a 20°C water flow in
a specially designed thawing apparatus [32] that was
regulated by a LabView® control system. Firstly the
samples were heated to 4°C for 10 s, then to 20°C for
150 s and finally they were kept at 4°C for 60 s [12].
Due to subsequent drop by drop adding of the respec-
tive culture medium into cell suspension that was
performed immediately after the controlled warming,
the DMSO was able to slowly diffuse out of the cells
and thereby prevent them from damage.
After thawing the membrane integrity of the cells
was determined by TrypanBlue® staining using an
automatic cell counter (ViCell XR) and cell proliferation
was tested by recultivation for 24 hours, i. e. a period
shorter than the regular doubling time of the cells. The
recultivated cells were counted, first those in the super-
natant of the culture flask and then other cells, which
were adhered to the bottom of the flask. The nonad-
hered cells were assumed as dead ones respectively
not able to proliferate again, the adhered ones were
Рис. 3. Первичная культура кератиноцитов человека и HPMEC-ST1.6R. Адгезиро-
вавшие кератиноциты (А) и HPMEC-ST1.6R (В) формируют в культуре субкон-
флюэнтный монослой.
Fig. 3. Primary cultures of human keratinocytes and HPMEC-ST1.6R. Adherent kerati-
nocytes (A) and HPMEC-ST1.6R (B) in culture form a nearly confluent monolayer.
тест-системы была прове-
дена на клеточной линии че-
ловеческого легочного мик-
рососудистого эндотелия
HPMEC-ST1.6R (рис. 3, В).
Кератиноциты культиви-
ровали in vitro в среде kerati-
nocyte-SFM (Invitrogen GmbH,
Германия) с EGF (1 нг/мл),
BPE (30 мкг/мл) и 1% Peni-
cillin/Streptomycin (Pen/Strep,
Invitrogen GmbH, Карлсруэ,
Германия) при 5% CO2 и
37°C.
Основной питательной
средой при культивировании
HPMEC-ST1.6R была DMEM
(Biochrom AG, Германия) с
добавлением по объему 10%
A B
358 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
сервированных образцов до температуры 4°С
проводили в проточной воде при 20°С в специально
разработанном аппарате оттаивания [32], регули-
руемом системой управления LabView®. Вначале
образцы нагревали до 4°С в течение 10 с, затем –
до 20°С в течение 150 с и оставляли при темпера-
туре 4°С в течение 60 с [12]. Сразу же после отогре-
ва в клеточную суспензию по каплям добавляли
соответствующую питательную среду, что позво-
ляло ДМСО медленно диффундировать из клеток
и тем самым предохранять их от повреждения.
После оттаивания целостность мембран клеток
оценивали окрашиванием TrypanBlue® с помощью
автоматического счетчика клеток (ViCell XR), а
пролиферативную активность клеток проверяли
путем рекультивации в течение 24 ч, т. е. меньше-
му времени, чем время удвоения количества
клеток. После рекультивирования сначала подсчи-
тывали клетки в супернатанте из пластикового
матраса для культивирования, а затем адгезиро-
вавшие на дне матраса. Неадгезировавшие клетки
считали мертвыми и утратившими способность к
пролиферации, а адгезировавшие – живыми и
способными к пролиферации. Жизнеспособность
клеток рассчитывали по этим значениям для срав-
нения полученных результатов с данными о со-
хранности, т. е. количестве клеток с неповрежден-
ными мембранами.
Статистическую обработку результатов экспе-
риментов проводили по методу Стьюдента-Фи-
шера.
Результаты и обсуждение
Анализ результатов метода последовательного
варьирования параметров замораживания, который
вначале был апробирован на кератиноцитах чело-
века, ясно показал, что только определенное соче-
тание скоростей охлаждения гарантирует макси-
мально возможную жизнеспособность клеток.
Даже незначительное изменение параметров
оптимального протокола замораживания может
привести к значительному уменьшению количест-
ва клеток с поврежденными мембранами, в ре-
зультате чего достоверно снижается сохранность
клеток после оттаивания. Как следует из данных,
приведенных на рис. 4, при отклонении скорости
охлаждения на первом и/или втором этапе от
оптимальной всего на несколько градусов в минуту
снижение сохранности клеток может достигать
30%.
При подборе оптимальных скоростей охлажде-
ния для кератиноцитов человека с учетом необхо-
димой концентрации криопротектора было установ-
лено, что наилучшие результаты (сохранность кле-
ток более 92%) могут быть достигнуты при ис-
пользовании определенных протоколов даже при
assumed as alive and able to proliferate. The cell survi-
val rate was calculated from these values to compare
the results with those of the membrane integrity.
The results were statistically processed by the
Student-Fisher test.
Results and discussion
The results of the parameter analysis, which was
at first applied to human keratinocytes, clearly showed
that only an optimal combination of cooling rates gua-
ranteed the highest possible cell survival rates. Even
minor aberration from such an optimal combination of
cooling rates may lead to a severe reduction of mem-
brane integrity, resulting in a significant decrease of
cell viability after the thawing process. If the first and/
or second cooling rate varies only by a few percent,
the resulting membrane integrity might decrease by
up to 30% (Fig. 4).
Regarding the established optimal cooling rates for
keratinocytes (with membrane integrity rates of more
than 92%) with consideration of the necessary concen-
trations of CPA, leads to the conclusion that best results
for these cells can be achieved with these protocols
even at a low applied concentration of DMSO of 2.5%
(v/v). Higher DMSO concentrations in this case do
not result in increased membrane integrity in cellular
population. Therefore the concentration of DMSO can
be reduced to the ascertained minimum, ensuring a
cell friendly freezing process, if the optimal cooling
Рис. 4. Процент кератиноцитов человека с неповреж-
денными мембранами после оттаивания в зависимости
от двухступенчатых протоколов замораживания. При-
ведены результаты для среды замораживания, содержа-
щей 2,5% ДМСО (по объему), средние значения для n = 3,
среднее отклонение 3,8 [11].
Fig. 4. Percentage of keratinocytes with intact membrane
after thawing plotted against the according two-step freez-
ing protocol. Exemplified results for 2.5% (v/v) DMSO in
freezing medium, mean values from n = 3 with an average
deviation of 3.8 (results of [11]).
Скорость охлаждения B1 (от 4 до –30°C), К/минCooling rate B1 (4 to –30°C), K/min
С
ох
ра
нн
ос
ть
к
ле
то
к,
%
C
el
ls
w
ith
in
ta
ct
m
em
br
an
es
,
%
B2
(о
т –
30
д
о –
80
°C
),
К/
ми
н
B2
(–
30
to
–
80
°C
),
K/
min
359 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
низкой концентрации ДМСО (2,5% по объему).
В этом случае повышение концентрации ДМСО не
увеличивало сохранность в популяции клеток.
Поэтому применение оптимальных скоростей
охлаждения может значительно снизить необходи-
мую для создания благоприятных условий замора-
живания клеток концентрацию ДМСО. При
субоптимальных скоростях охлаждения показа-
тели сохранности клеток могут быть улучшены
путем некоторого повышения концентрации ДМСО
в соответствии с протоколом.
При криоконсервировании культуры клеток
HPMEC-ST1.6R повышение концентрации ДМСО
может улучшить показатели сохранности клеток
(рис. 5). Однако использования высоких концентра-
ций ДМСО, при которых проявляется его цитоток-
сичность, вероятно, можно избежать путем опре-
деления оптимального сочетания скоростей охлаж-
дения для каждого конкретного типа клеток, опи-
раясь на результаты данного исследования.
Как показывают наши исследования, двухсту-
пенчатые режимы замораживания могут улучшить
показатели сохранности и жизнеспособности кера-
тиноцитов человека по сравнению с одноступенча-
тым замораживанием [31], что достигается при
определенном сочетании скорости охлаждения на
втором этапе (В2) и скорости охлаждения на пер-
вом (B1). Детальный анализ конкретных результа-
тов позволил сделать заключение относительно
оптимизации процессов замораживания кератино-
цитов человека. Оценка сохранности криоконсер-
вированных по разным режимам клеток непосред-
ственно после оттаивания показала, что 94%
клеток оставались неповрежденными. Наиболь-
ший процент сохранности клеток (> 90%) был полу-
чен при использовании различных двухступен-
чатых протоколов замораживания: 5 K/мин (B1) в
сочетании с 7,5 K/мин (B2); 5 K/мин в сочетании с
10 К/мин и 7,5 K/мин в сочетании с 10 К/мин.
Протоколы замораживания с применением скорос-
тей охлаждения на первом этапе 25 К/мин и более
напротив приводили к снижению сохранности
клеток.
Для HPMEC-ST1.6R высокие показатели со-
хранности клеток были достигнуты при использо-
вании следующих протоколов: 5 K/мин (B1) в
сочетании с 5 K/мин (B2) (93%-я жизнеспособ-
ность клеток, 7,5% ДМСО), 3 К/мин в сочетании с
3 К/мин (92%-я жизнеспособность клеток, 5,0 или
7,5% ДМСО, рис. 5, А) и 10 K/мин в сочетании с
3 К/мин (90%-я жизнеспособность клеток, 10%
ДМСО). Протокол замораживания 3/3 (рис. 5, А)
показал наиболее высокие показатели сохранности
и жизнеспособности клеток. В то же время при
использовании протокола 3/5 (рис. 5, B), с незначи-
тельным отличием скорости охлаждения на вто-
rate is applied. At suboptimal cooling rates, however,
the results of membrane integrity measurements may
be improved with generally higher DMSO concentra-
tions according to the protocol.
In the case of HPMEC-ST1.6R, an increased con-
centration of DMSO can lead to elevated membrane
integrity (Fig. 5). However, the high strain on cells that
is caused by CPA’s toxicity can possibly be avoided
by application of this report’s findings, which allow the
optimal and cell specific adaptation of cooling rates.
The investigated keratinocytes in the present study
elucidate that two-step cooling programs may give rise
to better membrane integrity and survival rates than
single-step freezing protocols [31]. With the cooling
programs that were applied in this study, an increase
in cell cultivability is realized as the second cooling
rate (B2) is adapted to the first cooling rate (B1).
Рис. 5. Сохранность клеток HPMEC-ST1.6R непосред-
ственно после оттаивания ( ) и жизнеспособность ( )
после рекультивирования в зависимости от концентра-
ции ДМСО в среде замораживания: A – В1 – 3 К/мин,
В2 – 3 К/мин; B – В1 – 3 К/мин, В2 – 5 К/мин.
Fig. 5. Mean values of membrane integrity directly after
thawing ( ) and survival rate ( ) of HPMEC-ST1.6R after
recultivation, arranged by DMSO concentration: А) В1 –
3К/min, В2 – 3К/min; B) В1 – 3К/min, В2 – 5К/min.
A
B
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
С
ох
ра
нн
ос
ть
/ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l m
em
br
an
e
in
te
gr
ity
/s
ur
vi
va
l,
%
Концентрация ДМСО, %
DMSO concentration, %
С
ох
ра
нн
ос
ть
/ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l m
em
br
an
e
in
te
gr
ity
/s
ur
vi
va
l,
%
360 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
ром этапе в интервале температур от –30 до –80°C
показатели сохранности клеток после оттаивания
заметно не отличались, в то время как жизнеспо-
собность клеток была значительно ниже при всех
концентрациях ДМСО.
Следует отметить, что сами по себе скорости
охлаждения как на первом, так на втором этапе не
влияют на увеличение сохранности клеток. Коли-
чество поврежденных клеток минимизируется
только при оптимальном сочетании этих скорос-
тей.
Исходя из этих данных, можно заключить, что
использование двухступенчатых протоколов
замораживания с окончанием первого этапа ох-
лаждения около –30°С улучшает результаты крио-
консервирования кератиноцитов человека по
сравнению с одноступенчатыми протоколами [31].
Как утверждает Mazur P. [26] и подтверждено
результатами других исследований [13, 25], для
различных типов клеток необходимы разные
оптимальные скорости охлаждения, которые позво-
ляют максимально улучшить показатели сохран-
ности и жизнеспособности клеток.
Таким образом, криоконсервирование клеточ-
ных суспензий с обеспечением максимальных
показателей жизнеспособности при минимальных
концентрациях криопротектора зависит от точного
подбора оптимальных параметров замораживания.
Разработанная методика системного тестирования
комбинаций скоростей охлаждения В1 и В2 и
концентраций криопротектора позволяет опреде-
лять оптимальные условия замораживания, спе-
цифические для конкретного типа клеток. Этот
подход исключает необходимость исследования
одиночных, а иногда случайно выбранных скорос-
тей охлаждения и концентраций криопротектора.
Он позволяет проводить надежный подбор опти-
мумов путем применения тест-сетки (растра) с
большим числом контрольных точек измерения.
Как показывают данные исследования, разница в
количестве клеток с неповрежденными мембра-
нами может достигать 30% даже у протоколов, рас-
положенных близко друг к другу на сетке изме-
рения (рис. 4, 5), т. е. небольшие вариации скоростей
охлаждения могут приводить к значительному
снижению сохранности клеток. Поэтому для дости-
жения надежных результатов подробный сбор
данных в представленном виде является не только
целесообразным, но и необходимым.
Полученные результаты свидетельствуют о
преимуществе точного определения оптимальных
протоколов замораживания, обеспечивающих пос-
ле отогрева максимальную сохранность и жизне-
способность клеток. Оптимальное сочетание ско-
ростей охлаждения В1 и В2 позволяет также сни-
Detailed examination of the particular results, allowed
drawing certain conclusions about optimized freezing
processes for human keratinocytes. If membrane
integrity of the differently cryopreserved samples was
measured directly after thawing, up to 94% of the cells
could be detected as undamaged. Cell survival of the
greatest extent (> 90%) was discovered when using
the various two-step protocols: 5 K/min (B1) combined
with 7.5 K/min (B2); 5 K/min, combined with 10 K/min,
and 7.5 K/min combined with 10 K/min. In contrast,
cooling protocols with first step rates of 25 K/min or
more, lead to reduced membrane integrity.
For HPMEC-ST1.6R the highest cell survival rates
were achieved with the protocols: 5 K/min (B1)
combined with 5 K/min (B2) (93% cell survival, 7.5 %
DMSO), 3 K/min, combined with 3 K/min (92% cell
survival, 5% or 7,5% DMSO, Fig. 5A), and unexpec-
tedly 10 K/min combined with 3 K/min (90% cell sur-
vival, 10% DMSO). Freezing protocol 3/3 (Fig. 5A)
has the highest values of membrane integrity and cell
survival. At the same time, with the application of
protocol 3/5 (Fig. 5B), with a minor deviations in the
rate of cooling at the second stage in the range from
–30°C to –80°C, membrane integrity levels after thaw-
ing are close in value, while the cell survival is signifi-
cantly lower at all concentrations of DMSO.
Notably, neither the first nor the second cooling rate
alone seems to be responsible for the increased memb-
rane integrity, but the combination of both values leads
to optimization of this parameter.
From these results, it can be assumed that the
application of a two-step protocol, with first step to
–30°C, improves cryopreservation of keratinocytes
compared to single-step protocols [31]. As stated by
Mazur P. [26], and affirmed in other previous studies
[13, 25], different cells require varying optimal cooling
rates that lead to maxima in membrane integrity and
cell viability.
Therefore, cryopreservation of cells in suspension
with maximum survival rates and minimum CPA
addition depends on the exact adjustment of the optimal
freezing parameters. By using the newly developed
system of testing of combinations of cooling rates B1
and B2 and CPA concentrations, the optimal freezing
conditions that are specific for a particular cell type
can be identified. This approach replaces the investi-
gation of single, selective and sometimes quite ran-
domly chosen cooling rates and CPA concentrations.
Instead, it leads to reliable optima findings, by applying
a test grid with a high number of measuring points. As
this study shows, the recession in percentages of mem-
brane integrity may be as high as 30% for cooling rates
lying close together on the measuring grid. Minor chan-
ges in cooling rates may result in unexpectedly high
differences of membrane integrity (Fig. 4, 5). Detailed
361 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
зить концентрацию цитотоксического криопро-
тектора и обеспечить более мягкий процесс замо-
раживания, что приведет к более быстрому и лег-
кому удалению токсического реагента после ото-
грева.
Таким образом, можно заключить, что стандар-
тизированная система тестирования, использую-
щая последовательную экспериментальную схему
изучения и оценки широкого спектра скоростей
охлаждения, а также концентраций криозащитных
агентов, может обеспечить успешное криоконсер-
вирование любого типа клеток.
Выводы
1. Представленный в работе метод системной
оптимизации протоколов криоконсервирования
различных клеточных суспензий позволяет опреде-
лить наиболее эффективное сочетание скоростей
двухступенчатого охлаждения и концентрации
криопротектора, обеспечивающих максимальное
сохранение клеток после отогрева.
2. Установлено, что в случае исследованных
кератиноцитов человека наивысшая сохранность
(> 90%) была получена при использовании различ-
ных двухступенчатых протоколов охлаждения: 5
K/мин (B1) в сочетании с 7,5 K/мин (B2), 5 K/мин
в сочетании с 10 К/мин и 7,5 K/мин в сочетании с
10 К/мин. При этом достаточная концентрация
криопротектора ДМСО составляла всего 2,5%.
3. В рамках изученных параметров наиболее
высокие показатели жизнеспособности культуры
клеток HPMEC-ST1.6R были достигнуты при ис-
пользовании следующих протоколов охлаждения:
5 K/мин (B1) в сочетании с 5 K/мин (B2) (93% жиз-
неспособных клеток, 7,5% ДМСО); 3 К/мин в соче-
тании с 3 К/мин (92% жизнеспособных клеток, 5,0
или 7,5% ДМСО); 10 K/мин в сочетании с 3 К/мин
(B2) (90% жизнеспособных клеток, 10% ДМСО).
4. Охлаждение исследуемых образцов с опти-
мальными скоростями позволяет снизить концент-
рацию ДМСО в среде замораживания до опреде-
ленного минимума, обеспечивающего благоприят-
ный для клеток процесс замораживания. В то же
время при субоптимальных скоростях охлаждения
показатели сохранности клеток могут быть улуч-
шены путем небольшого повышения концентрации
ДМСО в соответствии с протоколом.
Авторы благодарят Дж. Киркпатрика (J. Kirkpat-
rick) за предоставление клеточной линии HPMEC-
ST1.6R, а также Р. Шпиндлера (R. Spindler), К. Штол-
ля (C. Stoll) и Х. Сун (H. Sun) за техническую поддержку.
Работа проводилась при финансовой поддержке
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкого
исследовательского фонда) для Кластера передового
опыта “REBIRTH” (“From Regenerative Biology to
Reconstructive Therapy” – “Oт регенеративной биоло-
data acquisition, as presented, is not only advisable,
but essential, in order to achieve reliable statements.
It also shows how advantageous the precise deter-
mination of an optimal cooling protocol is, with respect
to the post-thaw membrane integrity and survival of
the cells. The optimal combination of B1 and B2 cooling
rates allows achieving the reduction of cytotoxic CPA
concentration and proves the freezing process to be
milder, which results in an easier and faster removal
of the toxic reagent after thawing.
In summary, it can be concluded that a standardized
testing system that uses a consistent experiment pattern
to examine and evaluate a large variety of cooling rates
and cryoprotective agent concentrations may lead to
successful cryopreservation of any tested cell type.
Conclusions
1. Presented method of systematic optimization of
protocols for cryopreservation of various cellular sus-
pensions allows determining the most effective combi-
nation of the rates of two-step cooling with concen-
tration of cryoprotectant for maximal preservation of
the cells after thawing.
2. It was established that in the case of studied cel-
lular suspension of human keratinocytes, the highest
survival (> 90%) was achieved with application of vari-
ous two-step cooling protocols: 5 K/min (B1) combined
with 7.5 K/min (B2); 5 K/min, combined with 10 K/min;
and 7.5 K/min combined with 10 K/min. Sufficient con-
centration of DMSO was only 2.5%.
3. Within the studied parameters the highest cell
survival rates for HPMEC-ST1.6R were achieved with
the following cooling protocols: 5 K/min (B1) combined
with 5 K/min (B2) (93% cell survival, 7.5% DMSO);
3 K/min, combined with 3 K/min (92% cell survival,
5% or 7.5% DMSO); and 10 K/min combined with
3 K/min (B2) (90% cell survival, 10% DMSO).
4. Application of optimal cooling rates for the stu-
died samples allowed reduction of applied concentration
of DMSO to the ascertained minimum, while still
ensuring a cell friendly freezing process. At the same
time, at suboptimal cooling rates, membrane integrity
values after thawing could be improved with slight
increase of DMSO concentrations according to the
protocol.
We thank J. Kirkpatrick for providing the HPMEC-
ST1.6R cell line as well as R. Spindler, C. Stoll, and H. Sun
for their outstanding technical support. This work was
supported by funding from the Deutsche Forschungs-
gemeinschaft (DFG, German Research Foundation) for the
Cluster of Excellence REBIRTH (from Regenerative
Biology to Reconstructive Therapy) (EXC 62/1) and BMBF
(80/049).
Authors express gratitude to Dr. L.G. Kuleshova for
useful discussion.
362 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
гии к реконструктивной терапии”) (EXC62/1) и BMBF
(80/049).
Авторы выражают благодарность рецензенту
Кулешовой Л.Г. за плодотворную дискуссию.
Литература
Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко-
температурного консервирования клеточных суспен-
зий.– Киев: Наук. думка, 1994.– 142 с.
Давыдова Е.В., Гордиенко О.И. Влияние температуры на
проницаемость мембран эритроцитов для криопро-
текторов с различной степенью гидрофобности //
Проблемы криобиологии.– 2009.– Т. 19, №3.– С. 261–272.
Кулешова Л.Г. Исследование структурных особен–
ностей замороженных водных растворов ПЭО–400 //
Современные вопросы криобиологии: Сб. научных тру-
дов.– Киев: Наук. думка, 1976.– С. 11–13.
Кулешова Л.Г., Коваленко И.Ф. Определение транспорт-
ных характеристик плазматических мембран клеток в
условиях внеклеточной кристаллизации // Проблемы
криобиологии.– 2006.– Т. 16, №1.– С. 3–12.
Кулешова Л. Г., Коваленко И.Ф. Теоретическое прогнози-
рование оптимальных скоростей охлаждения клеточных
суспензий // Вестник Харьковского национального уни-
верситета. Биофиз. вестник. – 2008.– Вип. 20 (1).– С. 56–
64.
Кулешова Л. Г., Розанов Л.Ф. Роль структуры внеклеточ-
ного льда в процессе криоповреждения клеток // Модели-
рование криобиологических процессов: Cб. научных
трудов.– Харьков, 1988.– С. 25–34.
Осецкий А. И., Кирилюк А. Л., Гурина Т. М. О возможном
механизме повреждения криоконсервируемых биологи-
ческих объектов за счет пластической релаксации дав-
лений в замкнутых жидкофазных включениях // Пробле-
мы криобиологии.– 2007.– Т. 17, № 3.– С. 272–281.
Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Иткин Ю.А. и др. Низкотем-
пературная кристаллизация в биологических системах.–
Киев: Наук. думка, 1972.– 242 с.
Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование
для создания банка клеток: современные концепции на
рубеже XXI столетия // Проблемы криобиологии.– 2003.–
№2.– С. 62–83.
Чернобай Н.А., Пахомов А.В., Коваленко И.Ф. и др.
Зависимость проницаемости мембран клеток интерсти-
ция тестисов для молекул ряда криопротекторов от
температуры // Проблемы криобиологии.– 2010.– Т. 20,
№2.– С. 153–158.
Bernemann I., Hofmann N., Szentivanyi A., Glasmacher B.
Development of a standard procedure to systematically optimi-
ze the cryopreservation protocol of suspended cells // Cryo-
biology.– 2006.– Vol. 53, N3.– P. 408.
Bernemann I., Hofmann N., Szentivanyi A. et al. Optimisierung
von Kryokonservierungsprotokollen: Systematische Para-
meteranalyse. // KI Kälte-Lüft-Klimatechnik, 2008.– Vol. 1–
2.– P. 24–27.
Bernemann I., Kuberka M., Petersen A. et al. Cryopreser-
vation of human fibroblasts and epithelial cells: Comparison
of different freezing methods // Cryobiology.– 2005.– Vol. 51,
N3.– P. 397.
Bischof J.C., Fahssi W.M., Smith D. et al. A parametric
study of freezing injury in ELT-3 uterine leiomyoma tumour
cells // Hum. Reprod.– 2001.– Vol. 16, N2.– P. 340–348.
Boutron P. Comparison with the theory of the kinetics and
extent of ice crystallization and of the glassforming tendency
in aqueous cryoprotective solutions // Cryobiology.– 1986.–
Vol. 23, N1.– P. 88–102.
References
Gordiyenko Ye.A., Pushkar N.S. Physical principles of low
temperature preservation of cell suspensions.– Kiev: Naukova
Dumka, 1994.– 142 p.
Davydova E.V., Gordienko O.I. Temperature effect on
erythrocyte membrane permeability for cryoprotectants with
different hydrophobicities // Problems of Cryobiology.– 2009.–
Vol. 19, N3.– P. 261–272.
Kuleshova L.G. Investigation of structure peculiarities of
frozen aqueous solutions of PEO-400 // Current problems of
cryobiology: Collection of scientific articles.– Kiev: Naukova
Dumka, 1976.– P. 11–13.
Kuleshova L.G., Kovalenko I.F. Determining transport
characteristics for cell plasma membranes under extracellular
crystallisation // Problems of Cryobiology.– 2006.– Vol. 16,
N1.– P. 3–12.
Kuleshova L.G., Kovalenko I.F. Theoretical prediction of
optimal cooling rates of cell suspensions // Vestnik of Kharkov
National University. Biophysical Bulletin.– 2008.– Issue 20
(1).– P. 56–64.
Kuleshova L.G., Rozanov L.F. Role of extracellular ice
structure in the process of cell cryoinjury // Modeling of
cryobiological processes: Collection of scientific articles.–
Kharkov, 1988.– P. 25–34.
Osetsky A.I., Kiri lyuk A.L., Gurina T.M. On possible
mechanism of damage in frozen-thawed biological objects
due to pressure plastic relaxation in closed liquid phase
inclusions // Problems of Cryobiology.– 2007.– Vol. 17, N3.–
P. 272–281.
Pushkar N.S., Belous A.M., Itkin Yu.A. et al. Low temperature
crystallization in biological systems.– Kiev: Naukova Dumka,
1972.– 242 p.
Fuller B., Green C., Grischenko V.I. Cryopreservation for
cell banking: current concepts at the turn of the 21st century //
Problems of Cryobiology.– 2003.– N2.– P. 62–83
Chernobai N.A., Pakhomov A.V., Kovalenko I.F. et al.
Temperature dependence of testes intersticium cell membrane
permeability for cryoprotectant molecules // Problems of
Cryobiology.– 2010.– Vol. 20, N2.– P. 153–158.
Bernemann I., Hofmann N., Szentivanyi A., Glasmacher B.
Development of a standard procedure to systematically
optimize the cryopreservation protocol of suspended cells //
Cryobiology.– 2006.– Vol. 53, N3.– P. 408.
Bernemann I., Hofmann N., Szentivanyi A. et al. Optimisierung
von Kryokonservierungsprotokollen: Systematische Para-
meteranalyse. // KI Kälte-Lüft-Klimatechnik, 2008.– Vol. 1–
2.– P. 24–27.
Bernemann I., Kuberka M., Petersen A. et al. Cryopreser-
vation of human fibroblasts and epithelial cells: Comparison
of different freezing methods // Cryobiology.– 2005.– Vol. 51,
N3.– P. 397.
Bischof J.C., Fahssi W.M., Smith D. et al. A parametric
study of freezing injury in ELT-3 uterine leiomyoma tumour
cells // Hum. Reprod.– 2001.– Vol. 16, N2.– P. 340–348.
Boutron P. Comparison with the theory of the kinetics and
extent of ice crystallization and of the glassforming tendency
in aqueous cryoprotective solutions // Cryobiology.– 1986.–
Vol. 23, N1.– P. 88–102.
Boutron P., Mehl P., Kaufmann A., Angibaud P. Glass-forming
tendency and stability of the amorphous state in the aqueous
solutions of linear polyalcohols with four carbons : I. Binary
systems water-polyalcohol // Cryobiology.– 1986.– Vol. 23,
N5.– P. 453–469.
Farrant J.,Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.–Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Franks F. Biophysics and biochemistry at low temperature.–
Cambridge: University Press, 1985.– 210 p.
Fuller B.J., Lane N., Benson E.E. Life in a frozen state.–
Boca Raton: CRC Press, 2004.– 696 p.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Higgins A.Z., Cullen D.K., La Placa M.C., Karlsson J.O.
Effects of freezing profile parameters on the survival of cryo-
preserved rat embryonic neural cells // J. Neurosci. Meth.–
2011.– Vol. 201, N1.– P. 9–16.
Ishiguro H., Rubinsky B. Mechanical interactions between
ice crystals and red blood cells during directional solidifica-
tion // Cryobiology.– 1994.– Vol. 31, N5.– P. 483–500.
Karlsson J. O. M., Eroglu A., Toth T. L. et al. Fertilization and
development of mouse oocytes cryopreserved using a
theoretically optimized protocol // Hum. Reprod.– 1996.–
Vol. 11, N6.– P. 1296–1305.
Karlsson J.O.M., Cravalho E.G., Borel Rinkes I.H.M. et al.
Nucleation and growth of ice crystals inside cultured
hepatocytes during freezing in the presence of dimethyl
sulfoxide // Biophys. J.– 1993.– Vol. 65, N6.– P. 2524–2536.
Karlsson J.O.M., Cravalho E.G., Toner M. A model of
diffusion-limited ice growth inside biological cells during
freezing // J. Appl. Phys.– 1994.– Vol. 75, N9.– P. 4442–4455.
Kuberka M., Rau G., Glasmacher B. Cryopreservation of
epithelial kidney cells // Biomedizinische Technik.– 2003.–
Vol. 48, Suppl. 1.– P. 322–323.
Mazur P. Freezing of living cells: Mechanism and implication //
Am. J. Physiol.– 1963.– Vol. 247.– P. 125–142.
Mazur P., Leibo S.P., Chu E. H.Y. A two–factor hypothesis
of freezing injury // Exp. Cell Res.– 1972.– Vol. 71.– P. 345–
355.
Mazur P. Kinetics water loss from cells at subzero temperature
and the likehood of intracellular freezing // J. Gen. Physiol.–
1984.– Vol. 47, N2.– P. 347–369.
Mazur P., Rall W.F, Leibo S.P. Kinetics of water loss and the
likelihood of intracellular freezing in mouse ova: Influence of
the method of calculating the temperature dependence of
water permeability // Cell Biophys.– 1984.– Vol. 6, N3.– P. 197–
213.
McGrath J.J. Quantitative measurement of cell membrane
transport: Technology and applications // Cryobiology.– 1997.–
Vol. 34, N4.– P. 315–334.
Pasch J., Schiefer A., Heschel I., Rau G. Cryopreservation
of keratinocytes in a monolayer // Cryobiology.– 1999.–
Vol. 39, N2.– P. 158–168.
Petersen A., Schneider H., Rau G., Glasmacher B. A new
approach for freezing of aqueous solutions under active
control of the nucleation temperature // Cryobiology.– 2006.–
Vol. 53, N2.– P. 248–257.
Schneider H., Petersen A., Rau G., Glasmacher B. First
experimental application of new freezing devices for
cryopreservation of human cells under controlled ice nucleus
formation // Cryobiology.– 2005.– Vol. 51, N3.– P. 411.
Trad F.S., Toner M., Biggers J.D. Effects of cryoprotectants
and ice–seeding temperature on intracellular freezing and
survival of human oocytes // Hum. Reprod.– 1999.–Vol. 14,
N6.– P. 1569–1577.
Wowk B. Thermodynamic aspects of vitrification // Cryobio-
logy.– 2010.– Vol. 60, N1.– P. 11–22.
Accepted 18.07.2011
363 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Boutron P., Mehl P., Kaufmann A., Angibaud P. Glass-forming
tendency and stability of the amorphous state in the aqueous
solutions of linear polyalcohols with four carbons : I. Binary
systems water-polyalcohol // Cryobiology.– 1986.– Vol. 23,
N5.– P. 453–469.
Farrant J.,Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-
step cooling procedures to examine factors influencing cell
survival following freezing and thawing // Cryobiology.–
1977.–Vol. 14, N3.– P. 273–286.
Franks F. Biophysics and biochemistry at low temperature.–
Cambridge: University Press, 1985.– 210 p.
Fuller B.J., Lane N., Benson E.E. Life in a frozen state.–
Boca Raton: CRC Press, 2004.– 696 p.
Higgins A.Z., Cullen D.K., La Placa M.C., Karlsson J.O.
Effects of freezing profile parameters on the survival of cryo-
preserved rat embryonic neural cells // J. Neurosci. Meth.–
2011.– Vol. 201, N1.– P. 9–16.
Ishiguro H., Rubinsky B. Mechanical interactions between
ice crystals and red blood cells during directional solidifica-
tion // Cryobiology.– 1994.– Vol. 31, N5.– P. 483–500.
Karlsson J. O. M., Eroglu A., Toth T. L. et al. Fertilization and
development of mouse oocytes cryopreserved using a
theoretically optimized protocol // Hum. Reprod.– 1996.–
Vol. 11, N6.– P. 1296–1305.
Karlsson J.O.M., Cravalho E.G., Borel Rinkes I.H.M. et al.
Nucleation and growth of ice crystals inside cultured
hepatocytes during freezing in the presence of dimethyl
sulfoxide // Biophys. J.– 1993.– Vol. 65, N6.– P. 2524–2536.
Karlsson J.O.M., Cravalho E.G., Toner M. A model of
diffusion-limited ice growth inside biological cells during
freezing // J. Appl. Phys.– 1994.– Vol. 75, N9.– P. 4442–4455.
Kuberka M., Rau G., Glasmacher B. Cryopreservation of
epithelial kidney cells // Biomedizinische Technik.– 2003.–
Vol. 48, Suppl. 1.– P. 322–323.
Mazur P. Freezing of living cells: Mechanism and implication //
Am. J. Physiol.– 1963.– Vol. 247.– P. 125–142.
Mazur P., Leibo S.P., Chu E. H.Y. A two–factor hypothesis
of freezing injury // Exp. Cell Res.– 1972.– Vol. 71.– P. 345–
355.
Mazur P. Kinetics water loss from cells at subzero temperature
and the likehood of intracellular freezing // J. Gen. Physiol.–
1984.– Vol. 47, N2.– P. 347–369.
Mazur P., Rall W.F, Leibo S.P. Kinetics of water loss and the
likelihood of intracellular freezing in mouse ova: Influence of
the method of calculating the temperature dependence of
water permeability // Cell Biophys.– 1984.– Vol. 6, N3.– P. 197–
213.
McGrath J.J. Quantitative measurement of cell membrane
transport: Technology and applications // Cryobiology.– 1997.–
Vol. 34, N4.– P. 315–334.
Pasch J., Schiefer A., Heschel I., Rau G. Cryopreservation
of keratinocytes in a monolayer // Cryobiology.– 1999.–
Vol. 39, N2.– P. 158–168.
Petersen A., Schneider H., Rau G., Glasmacher B. A new
approach for freezing of aqueous solutions under active
control of the nucleation temperature // Cryobiology.– 2006.–
Vol. 53, N2.– P. 248–257.
Schneider H., Petersen A., Rau G., Glasmacher B. First
experimental application of new freezing devices for
cryopreservation of human cells under controlled ice nucleus
formation // Cryobiology.– 2005.– Vol. 51, N3.– P. 411.
Trad F.S., Toner M., Biggers J.D. Effects of cryoprotectants
and ice–seeding temperature on intracellular freezing and
survival of human oocytes // Hum. Reprod.– 1999.–Vol. 14,
N6.– P. 1569–1577.
Wowk B. Thermodynamic aspects of vitrification // Cryobio-
logy.– 2010.– Vol. 60, N1.– P. 11–22.
Поступила 18.07.2011
Рецензент Л.Г. Кулешова
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68458 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:40:14Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Хофманн, Н. Бернеманн, И. Погожих, Д. Гласмахер, Б. 2014-09-24T11:31:22Z 2014-09-24T11:31:22Z 2011 Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий / Н. Хофманн, И. Бернеманн, Д. Погожих, Б. Гласмахер // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 353-363. — Бібліогр.: 35 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68458 57.043:547.42:612.79.014 Эффективное криоконсервирование клеточных суспензий является важной задачей криобиологии. На основании предыдущих исследований была разработана методика системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий. В качестве клеточной модели использовали кератиноциты человека. Исследование включало 48 протоколов с различными скоростями охлаждения (B) в двухступенчатых режимах (B1 в диапазоне от 4 до –30°С и В2 от –30 до –80°С). Все протоколы изучали при четырех различных концентрациях наиболее часто применяемого криопротектора диметилсуфоксида (ДМСО). Растровый анализ около 600 образцов позволил изучить полный набор возможных переменных. В дальнейших исследованиях данная методика была использована для улучшения протоколов криоконсервирования HPMEC-ST1.6R (легочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека). Результаты исследования показали, что только определенное оптимальное сочетание скоростей охлаждения обеспечивает высокий уровень выживаемости клеток после оттаивания. Для кератиноцитов человека оптимальными протоколами замораживания были: охлаждение со скоростью 5 К/мин для B1 и 7,5 К/мин для В2, либо 5 К/мин для B1 и 10 K/мин для В2 при концентрации ДМСО 2,5%. Наиболее высокие показатели выживаемости культуры клеток HPMEC-ST1.6R были достигнуты при использовании следующих протоколов: 5 K/мин (B1) в сочетании с 5 K/мин (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/мин в сочетании с 3 К/мин (5 или 7,5% ДМСО); 10 K/мин (B1) в сочетании с 3 К/мин (B2) (10% ДМСО). Ефективне кріоконсервування клітинних суспензій є важливим завданням кріобіології. На підставі попередніх досліджень була розроблена методика системної оптимізації протоколів кріоконсервування клітинних суспензій. У якості клітинної моделі використовували кератиноцити людини. Дослідження включало 48 протоколів з різними швидкостями охолодження (B) в двоступінчастих режимах (B1 в діапазоні від 4 до –30°С і В2 від –30 до –80°С). Усі протоколи вивчали при чотирьох різних концентраціях кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО), який вживається найбільш часто. Растровий аналіз близько 600 зразків дозволив вивчити повний набір можливих змінних. У подальших дослідженнях дана методика була використана для поліпшення протоколів кріоконсервування HPMEC-ST1.6R (легеневі мікросудинні ендотеліальні клітини людини). Результати дослідження показали, що тільки певне оптимальне поєднання швидкостей охолодження забезпечує високий рівень виживання клітин після відтавання. Для кератиноцитів людини оптимальними протоколами заморожування були: охолодження зі швидкістю 5 К/хв для B1 і 7,5 К/хв для В2 або 5 К/хв для B1 і 10 K/хв для В2 при концентрації ДМСО 2,5%. Найбільш високі показники виживаності культури клітин HPMEC-ST1.6R були досягнуті при застосуванні наступних протоколів: 5 K/хв (B1) у поєднанні з 5 K/хв (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/хв у поєднанні з 3 К/хв (5 або 7,5% ДМСО); 10 K/хв (B1) у поєднанні з 3 К/хв (B2) (10% ДМСО). Effective cryopreservation of cellular suspensions is an important task of cryobiology. A systematic parameter optimization setup for cryopreservation of cellular suspensions was established on the basis of our previous studies. Keratinocytes were used as a cellular model. The investigation included 48 protocols with different cooling rates (B) in a two-step freezing protocols (B1 in the range of 4°C to –30°C and B2 from –30°C to –80°C). All protocols have been studied with four different concentrations of the most frequently applied cryoprotective agent dimethyl sulfoxide (DMSO). Raster analysis of approximately 600 samples allowed the detection of the most comprehensive array of possible variables. In further investigations this setup was used to improve the cryopreservation protocols for HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells). Results revealed that only an optimal combination of cooling rates ensured the highest survival rates of cells after thawing. In case of keratinocytes, the optimal freezing protocol was composed of the cooling rates of 5 K/min for B1 and 7.5 K/min for B2, or 5 K/min for B1 and 10 K/min for B2 (2.5% DMSO concentration). The highest survival rates of HPMEC-ST1.6R cell culture were achieved with application of the following protocols: 5 K/min (B1) combined with 5 K/min (B2) (7.5% DMSO); 3 K/min, combined with 3 K/min (5% or 7.5% DMSO); and 10 K/min combined with 3 K/min (10% DMSO). Авторы благодарят Дж. Киркпатрика (J. Kirkpatrick) за предоставление клеточной линии HPMECST1.6R, а также Р. Шпиндлера (R. Spindler), К. Штолля (C. Stoll) и Х. Сун (H. Sun) за техническую поддержку. Работа проводилась при финансовой поддержке Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкого исследовательского фонда) для Кластера передового опыта “REBIRTH” (“From Regenerative Biology to Reconstructive Therapy” – “Oт регенеративной биологии к реконструктивной терапии”) (EXC62/1) и BMBF (80/049).
 Авторы выражают благодарность рецензенту Кулешовой Л.Г. за плодотворную дискуссию. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий Development of Systematic Parameter Optimization for Cryopreservation Protocols for Cellular Suspensions Article published earlier |
| spellingShingle | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий Хофманн, Н. Бернеманн, И. Погожих, Д. Гласмахер, Б. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| title_alt | Development of Systematic Parameter Optimization for Cryopreservation Protocols for Cellular Suspensions |
| title_full | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| title_fullStr | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| title_full_unstemmed | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| title_short | Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| title_sort | разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68458 |
| work_keys_str_mv | AT hofmannn razrabotkasistemnoioptimizaciiprotokolovkriokonservirovaniâkletočnyhsuspenzii AT bernemanni razrabotkasistemnoioptimizaciiprotokolovkriokonservirovaniâkletočnyhsuspenzii AT pogožihd razrabotkasistemnoioptimizaciiprotokolovkriokonservirovaniâkletočnyhsuspenzii AT glasmaherb razrabotkasistemnoioptimizaciiprotokolovkriokonservirovaniâkletočnyhsuspenzii AT hofmannn developmentofsystematicparameteroptimizationforcryopreservationprotocolsforcellularsuspensions AT bernemanni developmentofsystematicparameteroptimizationforcryopreservationprotocolsforcellularsuspensions AT pogožihd developmentofsystematicparameteroptimizationforcryopreservationprotocolsforcellularsuspensions AT glasmaherb developmentofsystematicparameteroptimizationforcryopreservationprotocolsforcellularsuspensions |