Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования
Оценена сохранность и жизнеспособность популяций ядросодержащих клеток (ЯСК) кордовой и донорской крови в зависимости от метода криоконсервирования. Показано, что выделение клеток с помощью полиглюкина и последующее их замораживание под защитой 5 % диметилсульфоксида, а также выделение ЯСК методом д...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Дата: | 2011 |
| Автори: | , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68461 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования / Л.А. Бабийчук, О.А. Михайлова, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 385-394. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860146476505628672 |
|---|---|
| author | Бабийчук, Л.А. Михайлова, О.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. |
| author_facet | Бабийчук, Л.А. Михайлова, О.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. |
| citation_txt | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования / Л.А. Бабийчук, О.А. Михайлова, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 385-394. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Оценена сохранность и жизнеспособность популяций ядросодержащих клеток (ЯСК) кордовой и донорской крови в зависимости от метода криоконсервирования. Показано, что выделение клеток с помощью полиглюкина и последующее их замораживание под защитой 5 % диметилсульфоксида, а также выделение ЯСК методом двухэтапного центрифугирования с последующим замораживанием под защитой 10 % ПЭО-1500 позволяют сохранить количество и жизнеспособность клеток на достаточно высоком уровне. Основное снижение как сохранности, так и жизнеспособности ЯСК независимо от используемой технологии криоконсервирования происходит за счет популяции гранулоцитов, а лимфоциты и моноциты остаются более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервирования. Показано, что мононуклеарные клетки кордовой крови более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервирования, чем более зрелые клетки донорской крови, что проявляется в существенных отличиях показателей жизнеспособности клеток практически во всех случаях до и после их криоконсервирования.
Оцінювали збереженість і життєздатность популяцій ядровмісних клітин (ЯВК) кордової та донорської крові залежно від методу кріоконсервування. Показано, що виділення клітин за допомогою поліглюкіну і подальше їх заморожування під захистом 5% ДМСО, а також виділення ЯВК методом двохетапного центрифугування з наступним заморожуванням під захистом 10% ПЕО-1500 дозволяють зберегти кількість і життєздатність клітин на досить високому рівні. Основне зниження як збереженості, так і життєздатності ЯВК незалежно від використаної технології кріоконсервування відбувається за рахунок популяції гранулоцитів, а лімфоцити і моноцити є більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування. Було показано, що мононуклеарні клітини кордової крові більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування, ніж більш зрілі клітини донорської крові, що проявляється в суттєвих відмінностях показників життєздатності клітин практично у всіх випадках до і після їх кріоконсервування.
Quantity and viability of nucleated cell (NC) populations of cord and donor blood was assessed after implementation of various cryopreservation method. It has been shown that isolation of cells by polyglukin and their following freeze-thawing under 5% DMSO protection as well as isolation of NCs by two-step centrifugation with following freeze-thawing under 10% PEO-1500 protection allows the preservation of a quantity and viability of cells at quite a high level. Basic reduction of both quantity and viability of NCs independently on the cryopreservation methods used occurs on account of the population of granulocytes, lymphocytes and monocytes occured to be more resistant to damaging cryopreservation factors. Mononuclear cells of cord blood were shown to be more resistant to damaging cryopreservation factors unlike mature cells of adult donor blood that was manifested in significant differences of the indices of cell viability virtually in all cases prior to and after their cryopreservation.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:50:00Z |
| format | Article |
| fulltext |
385
В последние десятилетия для лечения различ-
ных заболеваний системы крови все чаще исполь-
зуют гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) из
кордовой крови (КК) и периферической крови
взрослых доноров (ДК) [6–8, 13, 14].
Использование фракции гемопоэтических ство-
ловых клеток, которые входят в состав ядросодер-
жащих клеток (ЯСК), стало предпосылкой к соз-
данию банков крови, в которых образцы хранятся
в жидком азоте (при –196°С) в течение длитель-
During recent decades to treat different diseases
of blood system the hemopoeitic stem cells (HSCs)
derived from cord blood (CB) and adult donor periphe-
ral blood (DPB) have been used more and amore often
[6–8, 13, 14].
Application of the fraction of hemopoietic stem cells
being the part of nucleated cells (NCs) has become
the pre-condition for establishing the blood banks,
where the samples are stored in liquid nitrogen (at
–196°C) for a long time with no loss of their biological
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
УДК 611-018.5.013.8:615.014.41
Л.А. БАБИЙЧУК, О.А. МИХАЙЛОВА*, П.М. ЗУБОВ, В.В. РЯЗАНЦЕВ
Оценка состояния различных популяций ядросодержащих
клеток кордовой и донорской крови в зависимости
от метода их криоконсервирования
UDC
L.A. BABIYCHUK, O.A. MIKHAYLOVA*, P.M. ZUBOV, V.V. RYAZANTSEV
Assessment of Status of Different Nucleated Cell Populations of Cord
and Donor Blood Depending on Their Cryopreservation Method
Оценивали сохранность и жизнеспособность популяций ядросодержащих клеток (ЯСК) кордовой и донорской крови в
зависимости от метода криоконсервирования. Показано, что выделение клеток с помощью полиглюкина и последующее их
замораживание под защитой 5% ДМСО, а также выделение ЯСК методом двухэтапного центрифугирования с последующим
замораживанием под защитой 10% ПЭО-1500 позволяют сохранить количество и жизнеспособность клеток на достаточно
высоком уровне. Основное снижение как сохранности, так и жизнеспособности ЯСК независимо от используемой технологии
криоконсервирования происходит за счет популяции гранулоцитов, а лимфоциты и моноциты остаются более устойчивы к
повреждающим факторам криоконсервирования. Было показано, что мононуклеарные клетки кордовой крови более устойчивы
к повреждающим факторам криоконсервирования, чем более зрелые клетки донорской крови, что проявляется в существенных
отличиях показателей жизнеспособности клеток практически во всех случаях до и после их криоконсервирования.
Ключевые слова: ядросодержащие клетки, кордовая и донорская кровь, криопротекторы, ДМСО, ПЭО-1500, криокон-
сервирование.
Оцінювали збереженість і життєздатность популяцій ядровмісних клітин (ЯВК) кордової та донорської крові залежно від
методу кріоконсервування. Показано, що виділення клітин за допомогою поліглюкіну і подальше їх заморожування під
захистом 5% ДМСО, а також виділення ЯВК методом двохетапного центрифугування з наступним заморожуванням під
захистом 10% ПЕО-1500 дозволяють зберегти кількість і життєздатність клітин на досить високому рівні. Основне зниження
як збереженості, так і життєздатності ЯВК незалежно від використаної технології кріоконсервування відбувається за рахунок
популяції гранулоцитів, а лімфоцити і моноцити є більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування. Було показано,
що мононуклеарні клітини кордової крові більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування, ніж більш зрілі клітини
донорської крові, що проявляється в суттєвих відмінностях показників життєздатності клітин практично у всіх випадках до і
після їх кріоконсервування.
Ключові слова: ядровмісні клітини, кордова і донорська кров, кріопротектори, ДМСО, ПЕО-1500, кріоконсервування..
Quantity and viability of nucleated cell (NC) populations of cord and donor blood was assessed after implementation of various
cryopreservation method. It has been shown that isolation of cells by polyglukin and their following freeze-thawing under 5% DMSO
protection as well as isolation of NCs by two-step centrifugation with following freeze-thawing under 10% PEO-1500 protection
allows the preservation of a quantity and viability of cells at quite a high level. Basic reduction of both quantity and viability of NCs
independently on the cryopreservation methods used occurs on account of the population of granulocytes, lymphocytes and monocytes
occured to be more resistant to damaging cryopreservation factors. Mononuclear cells of cord blood were shown to be more resistant
to damaging cryopreservation factors unlike mature cells of adult donor blood that was manifested in significant differences of the
indices of cell viability virtually in all cases prior to and after their cryopreservation.
Key words: nucleated cells, cord and donor blood, cryoprotectants, DMSO, PEO-150, cryopreservation.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-30-34, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
mixolya@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3034, fax: +380 57 373 3084, e-mail: mixolya@mail.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
386 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
ного времени без потери их биологических свойств.
Однако, несмотря на множество существующих
методов криоконсервирования ЯСК крови, пробле-
ма сохранения их функциональной активности
после замораживания далека от окончательного
решения [1, 3, 8, 11].
Учитывая небольшие объемы кордовой крови
и трудности, связанные с получением ГСК из до-
норской, очень важно сохранить максимальное ко-
личество ЯСК без потери их пролиферативной
активности и жизнеспособности после криоконсер-
вирования. Для этого необходимо разрабатывать
новые и усовершенствовать существующие мето-
ды криоконсервирования данных клеток.
Технология криоконсервирования ЯСК состоит
из нескольких важных этапов. “Дестабилизация”
(нарушение нормального биологического ритма)
клеток на любом из них может привести к потере
функциональной активности, а также их количества
после криоконсервирования и, как следствие, несос-
тоятельности заготовленного препарата ЯСК.
Цель данного исследования – оценка сохранности
и жизнеспособности ЯСК кордовой и донорской
крови, а также анализ изменения их популяционного
состава после криоконсервирования различными
методами.
Материалы и методы
Объект исследования – ЯСК донорской и кор-
довой крови человека, заготовленной на глюкозо-
цитратном растворе. Кордовую кровь получали из
вены пульсирующей пуповины после информиро-
ванного согласия роженицы.
Концентраты (Conc) ЯСК выделяли нескольки-
ми методами: методом седиментации в 3%-м по-
лиглюкине (Conc1) [2], методом центрифугирова-
ния в градиенте плотности фиколл-верографина
(Conc2) [9] и по разработанному нами методу двух-
этапного центрифугирования цельной крови с пос-
ледующим получением концентрата ЯСК в ауто-
плазме (Conc3) [4].
В качестве криопротекторов в работе использо-
вали: диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной
концентрации 5% и полиэтиленоксид с м.м. 1500
(ПЭО-1500) в конечной концентрации 10%, приго-
товленный на растворе 0,01 М фосфатно-солевого
буфера, содержащего 0,15М NaCl, pH 7,4. Концент-
рат ЯСК Conc1 замораживали как под защитой 5%
ДМСО, так и без него. Концентрат ЯСК Conc2 за-
мораживали в присутствии ДМСО или ПЭО-1500.
Криоконсервирование ЯСК, полученных двухэтап-
ным центрифугированием (Conc3), проводили под
защитой 10% ПЭО-1500. Криопротекторы к сус-
пензии клеток добавляли дозированно при низкой
положительной температуре (2...4°C), 1:1 по
объему [1].
properties. However, in spite of numerous existing me-
thods for cryopreservation of blood NCs the problem
of preserving their functional activity after freeze-thaw-
ing is far from being completely solved [1, 3, 8, 11].
Taking into account small volumes of cord blood
and the difficulties related to the obtaining of HSCs
from blood of adult donor, it is very important to pre-
serve the maximum amount of NCs with no loss of
their post-thaw proliferative activity and viability. For
this aim it is necessary to develop novel and improve
existing methods to cryopreserve these cells.
Cryopreservation technique for NCs consists of
several important stages. Cell ‘destabilization’ (disorder
of normal biological rhythm) at any of them may lead
to the loss of functional activity of cells and also their
number after cryopreservation and as a consequence
to the failure of procured preparation of NCs. The
aim of this study was to assess the survival rate and
viability of cord and donor blood NCs as well as to
analyze the changes in their population composition
after cryopreservation with different methods.
Materials and methods
The research objects were NCs of human adult
donor and cord blood, procured with glucose-citrate
solution. Cord blood was obtained from vein of pulsing
umbilical cord after the informed consent of a parturient
woman.
Concentrates (Conc) of NCs were isolated with
following methods: sedimentation in 3% polyglukin
(Conc1) [2], centrifugation in ficoll-verografin density
gradient (Conc2) [9] and according to the own method
of two-step centrifugation of a whole blood with follow-
ing obtaining the concentrate of NCs in autoplasma
(Conc3) [4].
In the research the following cryoprotectants were
used: solutions of dimethyl sulfoxide (DMSO) in a final
concentration of 5% and polyethylene oxide with mole-
cular mass of 1500 (PEO-1500) in a final concentration
of 10% on a base of 0.01M phosphate buffer, containing
0.15M NaCl, pH 7.4. Concentrate of NCs Conc1 was
frozen-thawed both under protection of 5% DMSO
and without it. NCs concentrate Conc2 was frozen-
thawed in the presence of DMSO or PEO-1500. The
NCs obtained with two-step centrifugation (Conc3)
were frozen under the protection of PEO-1500. Cryo-
protectants were added to cell suspension drop-by-
drop at low positive temperature (2...4°C), 1:1 v/v [1].
Afterwards the cell suspension was transfered into
1.8 ml cryovials (Nunc) and was cooled down to –196°C
according to previously developed two-step program
[5] using programmable freezer Cryoson (Germany).
Thawing was performed at 37°C in water bath during
constant shaking.
The number of survived NC cells was examined
by standard method using Goryaev's chamber. Cell
387 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Затем суспензию клеток переносили в криопро-
бирки (“Nunc”, США) объемом 1,8 мл и охлаждали
до –196°С согласно ранее разработанной двухэтап-
ной программе [5] на программном заморажива-
теле “Cryoson” (Германия) [5]. Отогрев осущест-
вляли при 37°С на водяной бане при постоянном
покачивании.
Количество сохранных ЯСК определяли стан-
дартным методом с помощью камеры Горяева.
Сохранность клеток определяли как отношение ко-
личества клеток в образце, подвергнутом воздей-
ствию, к количеству интактных (до воздействия)
клеток, выраженное в процентах.
Фенотипирование ядросодержащих (CD45+)
клеток, а также оценку их жизнеспособности с по-
мощью ДНК-маркера 7-аминоактиномицина D
(7AAD) проводили методом проточной цитофлуо-
риметрии на проточном цитометре “FACS Calibur”
(“Becton Dickinson”, США) с использованием реа-
ген-тов “BD” (США). Жизнеспособными считали
долю клеток, не окрашенных 7AAD (7AAD–) в оце-
ниваемых образцах. Данные проточной цитометрии
оценивали с помощью программного обеспечения
“CellQuestPro”.
Данные представлены в виде М ± SE, достовер-
ность различий между выборками оценивали с
помощью t-критерия Стьюдента с уровнем значи-
мости 5%. Объем выборки составлял не менее 5
экспериментов.
Результаты и обсуждение
На сегодняшний день криоконсервирование
ЯСК является одним из наиболее надежных мето-
дов их долгосрочного хранения и состоит из не-
скольких этапов: выделение фракции ЯСК из
цельной крови, обработка клеток криопротектором
и замораживание-отогрев. Каждый из этих этапов
может быть потенциально опасным для ЯСК, поэ-
тому при разработке наиболее эффективных мето-
дов их криоконсервирования с сохранением макси-
мального количества клеток в жизнеспособном
состоянии необходимо проводить комплексную
оценку их состояния на каждом этапе криоконсер-
вирования.
Проведенные нами ранее исследования струк-
турно-функциональной полноценности ЯСК показа-
ли [2], что после их выделения с помощью поли-
глюкина или двухэтапного центрифугирования
снижение жизнеспособности ЯСК и изменение в
асимметричном распределении фосфолипидов в
мембране не наблюдались, а при выделении клеток
с помощью фиколла, часто используемого в миро-
вой практике [9], отмечались уменьшение жизне-
способности и нарушение асимметрии.
Следующий этап подготовки полученных кон-
центратов ЯСК к замораживанию предполагает их
survival rate was defined as the ratio of cell number in
a sample subjected to the effect to the one of intact
cells (prior to the effect) expressed in percentage.
Phenotyping of nucleated cells (CD45+) as well as
assessment of their viability by means of DNA-marker
7-aminoactinomycin D (7AAD) was performed using
FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson,
USA) and BD reagents. The portion of cells non-
stained with 7AAD (7AAD–) in the assessed samples
were considered as viable (and expressed in percents
as viability). The data of flow cytometry were estimated
with CellQuest Pro software.
The data are presented as M±SE, the statistical
significance between the samplings was assessed by
means of Students t-criterion with significance level
5%. The sampling volume made not less than 5 experi-
ments.
Results and discussion
Today cryopreservation of NCs is one of the most
reliable methods for long-term storage and consists of
several stages: isolation of NC fraction from a whole
blood, treatment of cells with cryoprotectant and
freeze-thawing. Each of these stages may be potentially
dangerous for NCs, therefore during developing the
most effective methods of their cryopreservation with
preserving the maximum amount of the cells in a viable
state it is necessary to assess in a combined way their
state at every cryopreservation step.
The studies of structural and functional integrity of
NCs have shown [2] that after their isolation by means
of either polyglukin or two-step centrifugation there
were no reduced viability of NCs and no changes in
membrane asymmetric distribution of phospholipids,
and during isolation of cells with ficoll, frequently used
in the world practice [9], there was found the decrease
in viability and impaired asymmetry.
Next stage of preparing the obtained concentrates
of NCs to freezing requires their treatment with cryo-
protective agents, we used a penetrating into a cell
DMSO and non-penetrating PEO-1500. The treatment
of the cells with these cryoprotectants at low positive
temperature allowed the survival of 95% NCs (of their
initial number in corresponding concentrates after
isolation) both in cord and adult donor blood (Fig. 1).
After freeze-thawing the highest survival of NCs
in respect to their initial number in corresponding
concentrates after isolation is observed in the cell
suspensions obtained with two-step centrifugation
(Conc3) and frozen-thawed under the protection of
10% PEO-1500 as well as after isolation of the cells
using polyglukin (Conc1) and freeze-thawing with 5%
DMSO. These observations are similar both for NCs
of cord and adult donor blood. After freeze-thawing
of cord and adult donor blood NCs isolated with ficoll
(Conc2) we observed a decrease in their survival: when
*
*
0 25 50 75 100
388 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
обработку криопротекторными веществами, в ка-
честве которых были использованы проникающий
в клетку ДМСО и непроникающий ПЭО-1500. Об-
работка клеток данными криопротекторами при
низкой положительной температуре позволила сох-
ранить до 95% ЯСК (от их начального количества
в соответствующих концентратах после выделе-
ния) как в кордовой, так и донорской крови (рис.1).
После замораживания-отогрева лучшая сохран-
ность ЯСК по отношению к начальному их коли-
честву в соответствующих концентратах после вы-
деления наблюдается в клеточных суспензиях,
полученных двухэтапным центрифугированием
(Conc3) и замороженных под защитой 10% ПЭО-
1500, а также после выделения клеток с исполь-
зованием полиглюкина (Conc1) и замораживания
с 5% ДМСО. Такие изменения сохранности на-
блюдали в суспензиях ЯСК как кордовой крови,
так и донорской. После замораживания-отогрева
ЯСК кордовой и донорской крови, выделенных с
помощью фиколла (Conc2), наблюдается снижение
их сохранности: при использовании 5% ДМСО бо-
лее чем на 30%, а с 10% ПЭО-1500 более чем на
37% (рис. 1).
Наибольшие потери ЯСК как донорской, так и
кордовой крови наблюдаются в суспензиях клеток,
выделенных с помощью полиглюкина и заморо-
женных без добавления ДМСО (Conc1). Так, со-
хранность ЯСК ДК составляет 52,4 ± 3,6, а КК –
55,6 ± 1,4% от начального их количества в соответ-
ствующем концентрате ЯСК до замораживания
(рис. 1).
На следующем этапе оценки состояния клеток
в процессе криоконсервирования было проведено
исследование жизнеспособности CD45+-клеток с
использованием витального красителя 7AAD, ко-
торый проникает в клетки с нарушениями целост-
ности мембраны. Этот краситель образует в комп-
лексе с ДНК высокофлуоресцентные аддукты,
которые идентифицируют клетки как "нежизнеспо-
собные" 7AAD+-клетки [10, 12]. При этом экспе-
риментально было доказано, что использованные
в работе высокомолекулярные непроникающие в
клетку вещества (ПЭО-1500 и полиглюкин) не бло-
кируют CD-маркеры и не препятствуют проникно-
вению ДНК-красителя 7AAD в клетки.
using 5% DMSO it falled more than by 30% and with
10% PEO-1500 it decreased more than by 37% (Fig. 1).
The highest losses of NCs of both adult donor and
cord blood are observed in cell suspensions isolated
with polyglukin and frozen without DMSO (Conc1).
So, the survival rate of adult donor blood NCs makes
52.4 ± 3.6 and 55.6 ± 1.4 % for cord blood cells if
compare with their initial amount in corresponding
concentrate of NCs prior to freezing (Fig. 1).
At the next stage of assessment of cell state during
cryopreservation there was studied the viability of
CD45+ cells using vital dye 7AAD, penetrating into
the cells with impaired membranes. This stain binds
with DNA and forms highly fluorescent adducts,
identifying cells as ‘non-viable’ 7AAD+ cells [10, 12].
Herewith there was experimentally shown that the used
in the research highly molecular substances non-
penetrating into a cell (PEO-1500 and polyglukin) do
not block CD markers and do not prevent the penetra-
tion of DNA-dye 7AAD into the cells.
It has been shown (Fig. 2) that after treatment with
corresponding cryoprotectants of the cells isolated
either with polyglyukin or two-step centrifugation the
number of CD45+7AAD+ cells both in adult donor and
cord blood did not exceed 3%. In the case of the treat-
ment with cryoprotectants of the cells isolated by ficoll
the injuries were more evident: in cord blood cells the
number of 7AAD+ cells increased up to 7, and up to
12% in adult donor cells, that may be the result of
their significant destabilization at the stage of isolation
from a whole blood (Fig. 2).
The assessment of NC viability after freeze-thaw-
ing has shown (Fig. 2) that the lowest content of
Риc. 1. Сохранность ядросодержащих (CD45+) клеток пос-
ле обработки криопротекторами и замораживания-ото-
грева: – кордовая кровь; – кровь взрослого донора;
* – статистически достоверные отличия между донор-
ской и кордовой кровью (р ≤ 0,05).
Fig. 1. Survival rate of nucleated (CD45+) cells after treatment
with cryoprotectants and freeze-thawing: – cord blood;
– adult donor blood; * – statistically significant differen-
ces between donor and cord blood (p ≤ 0.05)
Сохранность клеток, %
Cell survival, %
Conc1 + 5% ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc2 + 5% ДМСО
Conc2 + 5% DMSO
Conc3 + 10% ПЭО
Conc3 + 10% PEO
Conc2 + 10% ПЭО
Conc2 + 10% PEO
Conc1
Conc1 + 5% ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc2 + 5% ДМСО
Conc2 + 5% DMSO
Conc3 + 10% ПЭО
Conc3 + 10% PEO
Conc2 + 10% ПЭО
Conc2 + 10% PEO
О
бр
аб
от
ка
к
ри
оп
ро
те
кт
ор
ом
Tr
ea
tm
en
t
w
ith
c
ry
op
ro
te
ct
an
t
За
м
ор
аж
ив
ан
ие
-о
то
гр
ев
Fr
ee
ze
-th
aw
in
g
389 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Было показано (рис. 2), что после обработки
соответствующими криопротекторами клеток, вы-
деленных с помощью полиглюкина или двухэтап-
ным центрифугированием, количество CD45+
7AAD+-клеток как в донорской, так и кордовой
крови не превышало 3%. Что касается обработки
криопротекторами клеток, выделенных с помощью
фиколла, то повреждения были уже более очевидны:
в кордовой крови количество 7AAD+-клеток повы-
шалось до 7, а в донорской – до 12%, что может
быть результатом их существенной дестабилиза-
ции на этапе выделения из цельной крови (рис. 2).
Оценка жизнеспособности ЯСК после замора-
живания-отогрева показала (рис. 2), что самое низ-
кое содержание 7AAD+-клеток как кордовой, так
и донорской крови наблюдалось в суспензии ЯСК,
выделенных с помощью полиглюкина и заморо-
женных под защитой 5% ДМСО. Замораживание
ЯСК под защитой 10% ПЭО-1500 после их выде-
ления двухэтапным центрифугированием также
характеризовалось низким содержанием 7AAD+-
клеток.
Замораживание-отогрев ЯСК, выделенных с
помощью полиглюкина (Conc1), без добавления
дополнительного проникающего криопротектора,
кроме наибольшей потери количества клеток, пока-
зывает самые низкие значения жизнеспособности
(рис. 3). В данном случае нежизнеспособные клет-
ки составляют 66,4 ± 4,0 в донорской крови и 60,0 ±
5,3% в кордовой (рис. 2).
Анализ жизнеспособности ЯСК, выделенных с
помощью фиколла, показал высокое содержание
7AAD+-клеток после криоконсервирования. Так,
замораживание-отогрев данных клеток с 5%
ДМСО снижало жизнеспособность ядросодер-
жащих клеток КК на 31,9 и ДК на 39,4%, а под
защитой 10% ПЭО-1500 – на 40,4 и 45,2% соот-
ветственно (рис. 2). Эти данные свидетельствуют
о том, что значительная дестабилизация клеток
при выделении с использованием фиколла приводит
к криоконсервированию заведомо поврежденных
клеток. Это проявляется в снижении их устой-
чивости и потере жизнеспособности на этапах
добавления криопротектора и замораживания-ото-
грева.
7AAD+ cells of both cord and adult donor blood was
observed in the suspension of the NCs isolated by
means of polyglukin and frozen under 5% DMSO
protection. Freezing of NCs under 10% PEO-1500
after their isolation with two-step centrifugation was
also characterized with low content of 7AAD+ cells.
Freeze-thawing of the NCs isolated with polyglukin
(Conc1) without adding the penetrating cryoprotectant,
resulted in the lowest values of viability and the biggest
loss of the cell number (Fig. 3). In this case non-viable
cells make 66.4 ± 4.0 in adult donor blood and 60.0 ±
5.3% in cord blood (Fig. 2).
Analysis of the viability of NCs, isolated with ficoll
has shown a high content of 7AAD+ cells after cryo-
preservation. So, freeze-thawing of these cells with 5%
DMSO reduced the viability of nucleated cells of cord
blood by 31.9 and adult donor cells by 39.4% and under
the protection of 10% PEO-1500 by 40.4 and 45.2%,
correspondingly (Fig. 2). These data show that signi-
ficant destabilization of cells when isolating with ficoll
results cryopreservation of already damaged cells. This
manifests in their reduced resistance and loss of viabi-
lity at the stages of adding cryoprotectant and freeze-
thawing.
Since the fraction of blood CD45+ cells is heteroge-
neous and comprises the populations of lymphocytes,
monocytes and granulocytes there was important to
estimate the state of each of these NC populations
after the effect on them of damaging factors of cryo-
preservation.
The performed by us analysis of population compo-
sition of CD45+ cells prior to and after cryopreservation
Риc. 2. Количество жизнеспособных (CD45+7AAD-) кле-
ток после обработки криопротекторами и заморажи-
вания-отогрева: – кордовая кровь; – кровь взрослого
донора; * – статистически достоверные отличия между
донорской и кордовой кровью (р ≤ 0,05).
Fig. 2. Number of viable (CD45+7AAD) cells after treatment
with cryoprotectants and freeze-thawing: – cord blood;
– adult donor blood;* – statistically significant differ-
ences between donor and cord blood (p ≤ 0.05).
*
*
*
*
*
*
*
0 25 50 75 100
Сохранность клеток, %
Cell survival, %
Conc1 + 5% ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc2 + 5% ДМСО
Conc2 + 5% DMSO
Conc3 + 10% ПЭО
Conc3 + 10% PEO
Conc2 + 10% ПЭО
Conc2 + 10% PEO
Conc1
Conc1 + 5% ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc2 + 5% ДМСО
Conc2 + 5% DMSO
Conc3 + 10% ПЭО
Conc3 + 10% PEO
Conc2 + 10% ПЭО
Conc2 + 10% PEO
О
бр
аб
от
ка
к
ри
оп
ро
те
кт
ор
ом
Tr
ea
tm
en
t
w
ith
c
ry
op
ro
te
ct
an
t
За
м
ор
аж
ив
ан
ие
-о
то
гр
ев
Fr
ee
ze
-th
aw
in
g
390 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
До замораживания-отогрева
Before freeze-thawing
Conc1 + 5%ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc3 + 10%ПЭО-1500
Conc3 + 10% PEO-1500
Conc1
Conc1
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 97.27
UR 2.73
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 98.87
UR 1.13
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 97.58
UR 2.42
LL 0.00
LR 0.00
После замораживания-отогрева
After freeze-thawing
Conc1 + 5%ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc3 + 10%ПЭО-1500
Conc3 + 10% PEO-1500
Conc1
Conc1
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 97.27
UR 2.73
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 98.87
UR 1.13
LL 0.00
LR 0.00
Quadrant Statistics
X Parameter: 7AAD
Y Parameter: CD45 FITC
Quad %Gated
UL 97.58
UR 2.42
LL 0.00
LR 0.00
Рис. 3. Жизнеспособность ядросодержащих клеток кордовой крови до и после замораживания-отогрева, %: UL –
жизнеспособные (CD45+7AAD–) клетки; UR – нежизнеспособные (CD45+7AAD+) клетки. Данные типичного
эксперимента.
Fig. 3. Viability of cord blood nucleated cells prior to and after freeze-thawing, %: UL – viable (CD45+7AAD–) cells, UR –
non-viable (CD45+7AAD+) cells. The data of typical experiment.
Поскольку фракция CD45+-клеток крови яв-
ляется гетерогенной и включает популяции лимфо-
цитов, моноцитов и гранулоцитов, важно оценить
состояние каждой из данных популяций ЯСК после
воздействия на них факторов криоконсервирования.
with different methods testify to a re-distribution of
percentage ratio of NCs populations (Fig. 4, Table 1):
the relative content of lymphocytes and monocytes
increases, and granulocytes reduces, i. e. the cell los-
ses during freezing occur mainly due to granulocytes.
391 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
снижению жизнеспособности лимфоцитов и моно-
цитов независимо от типа используемого криопро-
тектора – проникающего (ДМСО) или непроникаю-
щего в клетки (ПЭО-1500). Гранулоциты харак-
теризовались еще более высоким процентом не-
жизнеспособных клеток до 65 в ДК и 38% в КК.
Последующее замораживание-отогрев данных
клеток (Conc2) приводило к увеличению количест-
ва нежизнеспособных лимфоцитов и моноцитов
Estimation of survival and viability of different
populations of NCs, isolated with polyglukin or two-
step centrifugation has shown (Table 1, 2) that treat-
ment of the cells with cryoprotectants did not result in
a signficant lessening of the number and reduction of
viability of lymphocytes, monocytes and granulocytes.
Viability of lymphocytes, isolated with polyglukin
and two-step centrifugation and frozen-thawed under
protection of corresponding cryoprotectants, remained
Рис.4. Популяционный состав ядросодержащих (CD45+) клеток кордовой
крови до и после криоконсервирования: R1 – лимфоциты; R2 – моноциты;
R3 – гранулоциты. Данные типичного эксперимента.
Fig. 4. Populational composition of nucleated (CD45+) cells of cord blood
prior to and after cryopreservation: R1 – lymphocytes; R2 – monocytes; R3 –
granulocytes. The data of typical experiment.
До замораживания-отогрева
Before freeze-thawing
Conc1 + 5%ДМСО
Conc1 + 5% DMSO
Conc3 + 10%ПЭО-1500
Conc3 + 10% PEO-1500
Region Statistics
X Parameter: CD45 FITC
Y Parameter: SSC-Height
Quad %Gated
R1 39.8
R2 13.3
R3 47.0
Region Statistics
X Parameter: CD45 FITC
Y Parameter: SSC-Height
Quad %Gated
R1 36.8
R2 13.1
R3 50.1
Region Statistics
X Parameter: CD45 FITC
Y Parameter: SSC-Height
Quad %Gated
R1 42.9
R2 14.0
R3 43.1
Region Statistics
X Parameter: CD45 FITC
Y Parameter: SSC-Height
Quad %Gated
R1 41.2
R2 14.2
R3 44.5
Проведенный нами анализ
популяционного состава CD45+-
клеток до и после криоконсерви-
рования различными методами
свидетельствует о перераспреде-
лении процентного соотношения
популяций ЯСК (рис. 4, табл.1):
увеличивается относительное со-
держание лимфоцитов и моноци-
тов, а гранулоцитов снижается,
т. е. потери клеток при заморажи-
вании происходят в основном за
счет гранулоцитов.
Оценка сохранности и жизне-
способности различных популя-
ций ЯСК, выделенных с помощью
полиглюкина или двухэтапным
центрифугированием, показала
(табл.1, 2), что обработка клеток
криопротекторами не приводила к
значительному уменьшению коли-
чества и снижению жизнеспособ-
ности лимфоцитов, моноцитов и
гранулоцитов.
Жизнеспособность лимфоци-
тов, выделенных с помощью
полиглюкина и двухэтапным цен-
трифугированием и заморожен-
ных под защитой соответствую-
щих криопротекторов, оставалась
на достаточно высоком уровне
(табл. 2). Моноциты кордовой и
донорской крови, подобно лимфо-
цитам, характеризовались высо-
кой жизнеспособностью при ис-
пользовании данных методов
криоконсервирования. При этом
основное снижение жизнеспособ-
ности ЯСК в этих препаратах, как
и снижение сохранности, происхо-
дило за счет популяции грануло-
цитов (табл. 2), которая менее
устойчива к действию низких
температур.
Обработка ЯСК, выделенных
с помощью фиколла (Conc2), при-
водила к более существенному
После замораживания-отогрева
After freeze-thawing
атнемирепскэяиволсУ
snoitidnoclatnemirepxE
ытицофмиЛ
setycohpmyL
ытицоноМ
setyconoM
ытицолунарГ
setycolunarG
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
актобарбО
мороткеторпоирк
htiwtnemtaerT
tnatcetorpoyrc
ОСМД%5+1cnoC
OSMD%5+1cnoC 5,0±84,79 2,0±34,99 7,0±81,49 3,0±4,89 5,0±30,89 0,1±14,69
ОСМД%5+2cnoC
OSMD%5+2cnoC 4,1±46,29 4,0±40,59 8,0±6,78 7,0±70,39 4,31±29,65 9,01±29,47
ОЭП%01+3cnoC
OEP%01+3cnoC 3,0±2,89 1,0±43,99 3,0±88,59 2,0±88,89 2,1±69,69 2,0±26,89
ОЭП%01+2cnoC
OEP%01+2cnoC 8,0±64,49 4,0±96,59 7,0±83,78 7,0±10,49 8,41±91,05 1,9±93,17
еинавижаромаЗ -
вергото
ezeerF - gniwaht
ОСМД%5+1cnoC
OSMD%5+1cnoC 8,0±81,88 5,0±77,69 5,1±66,38 9,0±41,69 3,5±66,55 1,6±62,36
ОСМД%5+2cnoC
OSMD%5+2cnoC 4,3±27,56 9,2±57,37 1,3±28,65 1,4±99,55 4,4±71,51 1,3±32,31
ОЭП%01+3cnoC
OEP%01+3cnoC 6,0±65,48 4,0±28,59 4,0±4,18 7,0±13,09 4,8±07,44 2,4±00,65
ОЭП%01+2cnoC
OEP%01+2cnoC 8,1±22,06 1,2±51,56 1,2±86,84 8,2±95,74 5,11±56,12 6,9±41,02
1cnoC 1,2±81,24 2,4±65,35 1,4±7,33 3,9±15,85 0,11±17,51 8,11±31,22
атнемирепскэяиволсУ
snoitidnoclatnemirepxE
ытицофмиЛ
setycohpmyL
ытицоноМ
setyconoM
ытицолунарГ
setycolunarG
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
КД
doolbronod
KK
doolbdroc
актобарбО
мороткеторпоирк
htiwtnemtaerT
tnatcetorpoyrc
ОСМД%5+1cnoC
OSMD%5+1cnoC 9,0±17,79 4,0±08,79 5,2±99,49 2,3±39,49 2,1±91,19 1,1±10,19
ОСМД%5+2cnoC
OSMD%5+2cnoC 0,1±85,59 8,0±40,49 7,1±92,59 0,2±41,19 4,8±99,56 7,2±34,28
ОЭП%01+3cnoC
OEP%01+3cnoC 4,0±73,89 4,0±89,89 6,3±93,39 4,0±13,89 5,0±21,49 0,1±77,29
ОЭП%01+2cnoC
OEP%01+2cnoC 1,1±93,49 1,1±89,69 3,2±26,39 7,1±53,49 2,01±28,56 6,5±24,76
еинавижаромаЗ -
вергото
ezeerF - gniwaht
ОСМД%5+1cnoC
OSMD%5+1cnoC 4,2±41,49 3,1±56,69 4,7±57,38 9,4±91,49 9,3±56,15 4,1±93,76
ОСМД%5+2cnoC
OSMD%5+2cnoC 8,3±85,66 9,5±00,47 6,2±87,77 8,4±27,27 7,11±50,14 1,5±81,42
ОЭП%01+3cnoC
OEP%01+3cnoC 9,0±91,79 6,1±67,79 4,2±71,39 6,1±47,59 8,2±03,36 9,1±96,37
ОЭП%01+2cnoC
OEP%01+2cnoC 8,4±54,75 2,5±65,66 5,4±96,22 5,11±23,63 2,8±85,42 3,21±57,53
1cnoC 9,5±85,67 8,1±62,47 2,9±10,86 5,6±00,36 2,4±25,13 9,2±96,24
392 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Таблица 1. Сохранность ядросодержащих клеток донорской и кордовой крови после обработки криопротектором
и замораживания (по отношению к соответствующим концентратам), %
Table 1. Survival rate of nucleated cells of donor and cord blood after treatment with cryoprotectant and freezing (in
respect to corresponding concentrates), %
Таблица 2. Количество жизнеспособных (CD45+7AAD-) клеток донорской и кордовой крови
после обработки криопротектором и замораживания, %
Table 2. Number of viable (CD45+7AAD-) cells of donor’s and cord blood after treatment
with cryoprotectants and freezing, %
393 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
(табл. 2). Что касается популяции гранулоцитов,
которая составляет не более 10% от всех ЯСК пос-
ле выделения с использованием фиколла, то их
жизнеспособность как в ДК, так и КК после
замораживания-отогрева снижалась до 90% неза-
висимо от типа используемого криопротектора
(табл. 2).
Как видно из табл. 1 и 2, замораживание-ото-
грев ЯСК, выделенных с помощью полиглюкина,
без добавления ДМСО приводит к гибели боль-
шего количества лимфоцитов, моноцитов и грану-
лоцитов как КК, так и ДК. Такое снижение
жизнеспособности клеток (см. рис. 2) на фоне
потери их количества (см. рис. 1) может привести
к неэффективности данного препарата при исполь-
зовании в клинической практике.
Также необходимо отметить, что практически
во всех случаях после обработки ЯСК крио-
протектором и замораживания-отогрева жизнеспо-
собность лимфоцитов и моноцитов КК была
существенно выше таковой в ДК, что свидетельст-
вует о большей устойчивости мононуклеаров КК
к повреждающим факторам криоконсервирования.
Выводы
Проведенные исследования показали, что
выделение ядросодержащих клеток с использова-
нием полиглюкина и последующее их заморажи-
вание под защитой 5% ДМСО, а также выделение
ЯСК методом двухэтапного центрифугирования с
последующим замораживанием под защитой 10%
ПЭО-1500 позволяют максимально сохранить ко-
личество ЯСК в препаратах, полученных как из
кордовой крови, так и донорской. При этом их жиз-
неспособность остается на достаточно высоком
уровне. Основное уменьшение сохранности и сни-
жение жизнеспособности ЯСК независимо от
используемого метода криоконсервирования проис-
ходят за счет популяции гранулоцитов, а лимфоциты
и моноциты являются более устойчивыми к по-
вреждающим факторам криоконсервирования.
Также было показано, что мононуклеарные клетки
кордовой крови более устойчивы к повреждающим
факторам криоконсервирования, чем более зрелые
клетки донорской крови, что проявляется в су-
щественных отличиях показателей жизнеспособ-
ности клеток практически во всех случаях до и
после их криоконсервирования.
at quite a high level. Monocytes of cord and adult donor
blood, like lypmphocytes, were characterized with a
high viability when using these methods of cryopreser-
vation. Herewith the main reduction of NC viability in
these preparations as well as a decrease in survival rate,
occurred due to the population of granulocytes, which
was less resistant to the effect of low temperatures.
Treatment of the NCs isolated with ficoll (Conc2)
led to more significant reduction of viability of lympho-
cytes and monocytes independently on the type of the
used cryoprotectants – penetrating (DMSO) or non-
penetrating into cells (PEO-1500). Granulocytes were
characterized with even higher percent of non-viable
cells: in adult donor blood up to 65 and 38% in cord blood.
Further freeze-thawing of these cells (Conc2) re-
sulted in the rise of the number of non-viable lympho-
cytes and monocytes (Table 2). As for the population
of granulocytes, comprising no more than 10% of all
NCs after isolation using ficoll then their post-thaw
viability both in adult donor and cord blood reduced
down to 90% undependently on the type of the used
cryoprotectants (Table 2).
As Tables 1 and 2 show the freeze-thawing of NCs,
isolated with polyglukin with no DMSO results in the
death of bigger amount of lymphocytes, monocytes and
granulocytes both in cord and adult donor blood. Such
a reduction of viable cells (see Fig. 2) on the back-
ground of the loss of their amount (see Fig. 1) may
lead to inefficiency of this preparation when used in
clinical practice.
It also should be noted that virtually in all the cases
after treatment of NCs with cryoprotectants and
freeze-thawing the viability of lymphocytes and mono-
cytes of cord blood was considerably higher than that
in adult donor blood, testifying to a higher resistance
of cord blood mononuclear cells to cryopreservation
damaging factors.
Conclusions
The performed studies have shown that isolation
of nucleated cells using polyglukin and their following
freezing under 5% DMSO protection as well as isola-
tion of NCs by two-step centrifugation with following
freezing under 10% PEO-1500 protection enables the
maximum preservation of NCs number in the prepara-
tions obtained both from cord blood and adult donor
blood. Herewith their viability has remained at quite a
high level. Basic reduction in the survival rate and
decrease in viability of NCs independently in the used
method of cryopreservation occur due to the population
of granulocytes, unlike lymphocytes and monocytes
which are more resistant to cryopreservation damaging
factors. Also it has been demonstrated that mononuclear
cells of cord blood are more resistant to cryopreserva-
tion damaging factors if compared with mature cells
of adult donor blood, which is manifested in significant
Литература
Бабийчук Л. А., Грищенко В. И., Рязанцев В. В. и др. Новые
подходы к проблеме криоконсервирования гемопоэти–
ческих клеток кордовой крови человека // Укр. журнал
гематол. і трансфузіол.– 2005.– № 4(д).– С.122–123.
1.
394 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Михайлова О.А., Бабийчук Л. А., Рязанцев В. В., Зубов П.М.
Оценка жизнеспособности и степени нарушения асим–
метрии мембран ядросодержащих клеток при различных
методах их выделения из цельной кордовой и донорской
крови // Вісник проблем біології і медицини.– 2011.–
Вип.4(90).– С.118–122.
Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Зайцева О.О. и др.
Разработка нового метода сохранения жизнеспособных
лейкоцитов в условиях околонулевых температур //
Казанский мед. журнал.– 2008.– №4.– С.558–560.
Пат. 23499 Україна, МПК С 12 N 5/00. Спосіб виділення
ядровмісних клітин кордової крові / Л.О. Бабійчук, В.І. Гри-
щенко, В.В. Рязанцев, П. М. Зубов, О. Л. Зубова; Заявлено
22.01.07; опубл. 25.05.07, Бюл. №7.
Пат. 92227 Україна, МПК А 01 N 1/02. Спосіб кріоконсер-
вування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі
стовбурових гемопоетичних клітин / Л.О. Бабійчук,
В.І. Грищенко, Т.М. Гуріна та ін.; Заявлено 05.12.2008;
опубл. 11.10.2010, Бюл.№19.
Abrahamsen J.F., Bakken A.M., Bruserud O. et al. Flow
cytometric measurement of apoptosis and necrosis in
cryopreserved PBPC concentrates from patients with
malignant diseases // Bone Marrow Transplant.– 2002.–
Vol.29, N2.– P.165–171.
Boyum A. Isolation of leucocytes from human blood. Further
observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythro-
cyte aggregating agents // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.–
1968.– Vol. 97.– P. 31–50.
Broxmeyer H. E., Douglas G. W., Hangoc G. et al. Human
umbilical cord blood as a potential source of transplantable
hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.– 1989.– Vol. 86, N10.– P. 3828 –3832.
Gluckman E., Broxmeyer H.E., Auerbach A.D. et al. Hema-
topoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by
means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling //
N. Engl. J. Med.– 1989.– Vol. 321, N17.– P. 1174–1178.
Halle P., Tournilhac O., Knopinska–Posluszny W. et al. Un-
controlled-rate freezing and storage at –80 degrees C, with
only 3.5–percent DMSO in cryoprotective solution for 109
autologous peripheral blood progenitor cell transplantations //
Transfusion.– 2001.– Vol. 41, N5.– P. 667–673.
Hubl W., Iturraspe J., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage
on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood.–
1997.– Vol. 90, N10.– P. 326b.
Philpott N.J., Turner A.J., Scopes J. et al. The use of 7-ami-
noactinomycin D identifying apoptosis: simplicity of use and
broad spectrum of application compared with other tech-
niques // Blood.– 1996.– Vol. 87, N6.– P. 2244–2251.
Siena S., Bregni M., Brando B. et al. Circulation of CD34+
hematopoietic stem cells in the peripheral blood of high-dose
cyclophosphamide-treated patients: enhancement by intra-
venous recombinant human granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor // Blood.– 1989.– Vol. 74, N6.– P. 1905–
1914.
Watt S.M., Contreras M. Stem cell medicine: umbilical cord
blood and its stem cell potential // Semin. Fetal Neonatal
Med.– 2005.– Vol. 10, N3.– P.209–220.
Поступила 08.11.2011
Рецензент А.М. Компаниец
References
Babiychuk L.A., Grischenko V.I., Ryazantsev V.V. et al. New
approaches to problems of cryopreservation of hemopoietic
cells of human cord blood// Ukr. Zhurnal Gematol. i Tranzfu-
siol.– 2005.– N4(d).– P. 122–123.
Mikhaylova O.A., Babiychuk L.A., Ryazantsev V.V., Zubov P.M.
Assessment of viability and rate of asymmetry disorder in
membranes of nucleated cells during different methods of
their isolation from whole cord and donor blood // Visnyk
Problem Biologii i Meditsyny.– 2011.– Issue 4(90).– P. 118–
122.
Svedentsov Ye.P., Tumanova T.V., Zaytseva O.O. et al. Deve-
lopment of new method of preservation of viable leukocytes
under conditions of about zero temperatures// Kazansky Med.
Zhurnal.– 2008.– N4.– P. 558–560.
Patent 23499 Ukraine, IPC12N5/00. Method of isolation of
cord blood nucleated cells / L.O. Babiychuk, V.I. Grischenko,
V.V. Ryazantsev, P.M. Zubov, O.L. Zubova; Applied 22.01.07;
Publ. 25.05.07, Bul. N7.
Patent 92227 Ukraine, IPC A01N1/02. Method of cryopreser-
vation of nucleated cells of cord blood, including hemopoietic
stem cells/ L.O. Babiychuk, V.I. Grischenko, T.M. Gurina et al.
Applied 05.12.2008; Publ. 11.10.2010, Bul. N19.
Abrahamsen J.F., Bakken A.M., Bruserud O. et al. Flow
cytometric measurement of apoptosis and necrosis in
cryopreserved PBPC concentrates from patients with
malignant diseases // Bone Marrow Transplant.– 2002.–
Vol.29, N2.– P.165–171.
Boyum A. Isolation of leucocytes from human blood. Further
observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythro-
cyte aggregating agents // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.–
1968.– Vol. 97.– P. 31–50.
Broxmeyer H. E., Douglas G. W., Hangoc G. et al. Human
umbilical cord blood as a potential source of transplantable
hematopoietic stem/progenitor cells // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.– 1989.– Vol. 86, N10.– P. 3828 –3832.
Gluckman E., Broxmeyer H.E., Auerbach A.D. et al. Hema-
topoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by
means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling //
N. Engl. J. Med.– 1989.– Vol. 321, N17.– P. 1174–1178.
Halle P., Tournilhac O., Knopinska–Posluszny W. et al. Un-
controlled-rate freezing and storage at –80 degrees C, with
only 3.5–percent DMSO in cryoprotective solution for 109
autologous peripheral blood progenitor cell transplantations //
Transfusion.– 2001.– Vol. 41, N5.– P. 667–673.
Hubl W., Iturraspe J., Hutcheson C.E. et al. Effect of storage
on stem cell concentration and viability in cord blood // Blood.–
1997.– Vol. 90, N10.– P. 326b.
Philpott N.J., Turner A.J., Scopes J. et al. The use of 7-ami-
noactinomycin D identifying apoptosis: simplicity of use and
broad spectrum of application compared with other tech-
niques // Blood.– 1996.– Vol. 87, N6.– P. 2244–2251.
Siena S., Bregni M., Brando B. et al. Circulation of CD34+
hematopoietic stem cells in the peripheral blood of high-dose
cyclophosphamide-treated patients: enhancement by intra-
venous recombinant human granulocyte-macrophage colony-
stimulating factor // Blood.– 1989.– Vol. 74, N6.– P. 1905–
1914.
Watt S.M., Contreras M. Stem cell medicine: umbilical cord
blood and its stem cell potential // Semin. Fetal Neonatal
Med.– 2005.– Vol. 10, N3.– P.209–220.
Accepted 08.11.2011
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
differences of the indices of cell viability virtually in all
the cases prior to and after cryopreservation.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68461 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:50:00Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Бабийчук, Л.А. Михайлова, О.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. 2014-09-24T11:37:06Z 2014-09-24T11:37:06Z 2011 Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования / Л.А. Бабийчук, О.А. Михайлова, П.М. Зубов, В.В. Рязанцев // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 385-394. — Бібліогр.: 14 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68461 611-018.5.013.8:615.014.41 Оценена сохранность и жизнеспособность популяций ядросодержащих клеток (ЯСК) кордовой и донорской крови в зависимости от метода криоконсервирования. Показано, что выделение клеток с помощью полиглюкина и последующее их замораживание под защитой 5 % диметилсульфоксида, а также выделение ЯСК методом двухэтапного центрифугирования с последующим замораживанием под защитой 10 % ПЭО-1500 позволяют сохранить количество и жизнеспособность клеток на достаточно высоком уровне. Основное снижение как сохранности, так и жизнеспособности ЯСК независимо от используемой технологии криоконсервирования происходит за счет популяции гранулоцитов, а лимфоциты и моноциты остаются более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервирования. Показано, что мононуклеарные клетки кордовой крови более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервирования, чем более зрелые клетки донорской крови, что проявляется в существенных отличиях показателей жизнеспособности клеток практически во всех случаях до и после их криоконсервирования. Оцінювали збереженість і життєздатность популяцій ядровмісних клітин (ЯВК) кордової та донорської крові залежно від методу кріоконсервування. Показано, що виділення клітин за допомогою поліглюкіну і подальше їх заморожування під захистом 5% ДМСО, а також виділення ЯВК методом двохетапного центрифугування з наступним заморожуванням під захистом 10% ПЕО-1500 дозволяють зберегти кількість і життєздатність клітин на досить високому рівні. Основне зниження як збереженості, так і життєздатності ЯВК незалежно від використаної технології кріоконсервування відбувається за рахунок популяції гранулоцитів, а лімфоцити і моноцити є більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування. Було показано, що мононуклеарні клітини кордової крові більш стійкі до пошкоджень факторами кріоконсервування, ніж більш зрілі клітини донорської крові, що проявляється в суттєвих відмінностях показників життєздатності клітин практично у всіх випадках до і після їх кріоконсервування. Quantity and viability of nucleated cell (NC) populations of cord and donor blood was assessed after implementation of various cryopreservation method. It has been shown that isolation of cells by polyglukin and their following freeze-thawing under 5% DMSO protection as well as isolation of NCs by two-step centrifugation with following freeze-thawing under 10% PEO-1500 protection allows the preservation of a quantity and viability of cells at quite a high level. Basic reduction of both quantity and viability of NCs independently on the cryopreservation methods used occurs on account of the population of granulocytes, lymphocytes and monocytes occured to be more resistant to damaging cryopreservation factors. Mononuclear cells of cord blood were shown to be more resistant to damaging cryopreservation factors unlike mature cells of adult donor blood that was manifested in significant differences of the indices of cell viability virtually in all cases prior to and after their cryopreservation. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования Assessment of Status of Different Nucleated Cell Populations of Cord and Donor Blood Depending on Their Cryopreservation Method Article published earlier |
| spellingShingle | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования Бабийчук, Л.А. Михайлова, О.А. Зубов, П.М. Рязанцев, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| title_alt | Assessment of Status of Different Nucleated Cell Populations of Cord and Donor Blood Depending on Their Cryopreservation Method |
| title_full | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| title_fullStr | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| title_short | Оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| title_sort | оценка состояния различных популяций ядросодержащих клеток кордовой и донорской крови в зависимости от метода их криоконсервирования |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68461 |
| work_keys_str_mv | AT babiičukla ocenkasostoâniârazličnyhpopulâciiâdrosoderžaŝihkletokkordovoiidonorskoikrovivzavisimostiotmetodaihkriokonservirovaniâ AT mihailovaoa ocenkasostoâniârazličnyhpopulâciiâdrosoderžaŝihkletokkordovoiidonorskoikrovivzavisimostiotmetodaihkriokonservirovaniâ AT zubovpm ocenkasostoâniârazličnyhpopulâciiâdrosoderžaŝihkletokkordovoiidonorskoikrovivzavisimostiotmetodaihkriokonservirovaniâ AT râzancevvv ocenkasostoâniârazličnyhpopulâciiâdrosoderžaŝihkletokkordovoiidonorskoikrovivzavisimostiotmetodaihkriokonservirovaniâ AT babiičukla assessmentofstatusofdifferentnucleatedcellpopulationsofcordanddonorblooddependingontheircryopreservationmethod AT mihailovaoa assessmentofstatusofdifferentnucleatedcellpopulationsofcordanddonorblooddependingontheircryopreservationmethod AT zubovpm assessmentofstatusofdifferentnucleatedcellpopulationsofcordanddonorblooddependingontheircryopreservationmethod AT râzancevvv assessmentofstatusofdifferentnucleatedcellpopulationsofcordanddonorblooddependingontheircryopreservationmethod |