Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования
Изучена роль формирования агрегатов нервными клетками (НК) новорожденных крыс в процессе восстановления после выделения и криоконсервирования этих клеток. Установлено, что краткосрочное культивирование НК в составе агрегатов устраняет повреждения, образовавшиеся в процессе их выделения, и возможно,...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2011 |
| Main Authors: | , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68462 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования / А.Н. Сукач, Т.Д. Ляшенко // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 395-405. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860118072567791616 |
|---|---|
| author | Сукач, А.Н. Ляшенко, Т.Д. |
| author_facet | Сукач, А.Н. Ляшенко, Т.Д. |
| citation_txt | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования / А.Н. Сукач, Т.Д. Ляшенко // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 395-405. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Изучена роль формирования агрегатов нервными клетками (НК) новорожденных крыс в процессе восстановления после выделения и криоконсервирования этих клеток. Установлено, что краткосрочное культивирование НК в составе агрегатов устраняет повреждения, образовавшиеся в процессе их выделения, и возможно, позволяет клеткам избежать апоптоза. Показано, что замораживание НК в составе агрегатов под защитой 10 % диметилсульфоксида эффективно сохраняет стволовые/прогениторные и дифференцированные НК. Сохранение целостности агрегатов НК после криоконсервирования является необходимым условием их выживания в культуре.
Вивчали роль формування агрегатів нервовими клітинами (НК) новонароджених щурів в процесі відновлення після виділення і кріоконсервування цих клітин. Встановлено, що короткострокове культивування НК у складі агрегатів відновлює ушкодження, що утворилися в процесі їх виділення та, можливо, дозволяє клітинам уникнути апоптозу. Показано, що заморожування НК у складі агрегатів під захистом 10% ДМСО ефективно зберігає стволові/прогеніторні і диференційовані НК. Збереження цілісності агрегатів НК після кріоконсервування є необхідною умовою їх виживання в культурі.
The role of formation of newborn rat neural cell aggregates on cell recovery after isolation and cryopreservation was studied. Shortterm cultivation of neural cells within aggregates eliminate the damages that appear during cell isolation and possibly protects from apoptosis. It was shown that freezing of neural cells within aggregates under protection of 10% DMSO is effective for storage of stem/progenitor and differentiated neural cells. Maintenance of integrity of neural cell aggregates after cryopreservation is a necessary condition for survival in culture.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:37:25Z |
| format | Article |
| fulltext |
395
Криоконсервирование изолированных клеток
включает несколько этапов: выделение клеток в
максимально жизнеспособном состоянии; инкуби-
рование в защитных растворах; замораживание по
определенной программе; оттаивание; удаление
криопротектора при необходимости. Если выделе-
ние сопряжено с дезагрегацией тканей, то у клеток
появляются микроповреждения, что может значи-
тельно снизить их выживаемость после криокон-
сервирования.
В процессе криоконсервирования, а также от-
мывки криопротектора в клетках могут происхо-
дить структурно-метаболические нарушения в
плазматической мембране и мембранах внутри-
клеточных компонентов, что сопровождается по-
терей поверхностных рецепторов, а также наруше-
Cryopreservation of isolated cells comprises several
stages: isolation of cells preserving highest viability;
equilibration in protective solutions; freezing according
to a certain program; thawing; removal of cryoprotec-
tive agent (CPA) if necessary. If the isolation is asso-
ciated with tissue disaggregating, the cells are subjected
to a microdamages, which may significantly reduce
their post-thaw survival.
Cryopreservation and CPA removal could be ac-
companied with occurence in cells of structure and
metabolism disorders in plasma membrane and
intracellular components, that may be accompanied
with the loss of surface receptors as well as impaired
homeostasis of cells. Therefore a very important stage
of cryopreservation is the creation of the conditions
activating reparation of frozen-thawed cells. More
problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
УДК 591.88.084:57.043
А.Н. СУКАЧ1,2*, Т.Д. ЛЯШЕНКО2
Роль формирования агрегатов в процессе выживания
изолированных нервных клеток новорожденных крыс
после криоконсервирования
UDC 591.88.084:57.043
A.N. SUKACH1,2*, T.D. LYASHENKO2
Role of Forming Aggregates in Post-Thaw Survival
of Isolated Neural Cells from Newborn Rats
Изучали роль формирования агрегатов нервными клетками (НК) новорожденных крыс в процессе восстановления после
выделения и криоконсервирования этих клеток. Установлено, что краткосрочное культивирование НК в составе агрегатов
устраняет повреждения, образовавшиеся в процессе их выделения, и возможно, позволяет клеткам избежать апоптоза. Показано,
что замораживание НК в составе агрегатов под защитой 10% ДМСО эффективно сохраняет стволовые/прогениторные и
дифференцированные НК. Сохранение целостности агрегатов НК после криоконсервирования является необходимым условием
их выживания в культуре.
Ключевые слова: нервные клетки новорожденных крыс, многоклеточные агрегаты, выживаемость, жизнеспособность,
криоконсервирование, культивирование.
Вивчали роль формування агрегатів нервовими клітинами (НК) новонароджених щурів в процесі відновлення після
виділення і кріоконсервування цих клітин. Встановлено, що короткострокове культивування НК у складі агрегатів відновлює
ушкодження, що утворилися в процесі їх виділення та, можливо, дозволяє клітинам уникнути апоптозу. Показано, що
заморожування НК у складі агрегатів під захистом 10% ДМСО ефективно зберігає стволові/прогеніторні і диференційовані
НК. Збереження цілісності агрегатів НК після кріоконсервування є необхідною умовою їх виживання в культурі.
Ключові слова: нервові клітини новонароджених щурів, багатоклітинні агрегати, виживання, життєздатність, кріокон-
сервування, культивування.
The role of formation of newborn rat neural cell aggregates on cell recovery after isolation and cryopreservation was studied. Short-
term cultivation of neural cells within aggregates eliminate the damages that appear during cell isolation and possibly protects from
apoptosis. It was shown that freezing of neural cells within aggregates under protection of 10% DMSO is effective for storage of stem/
progenitor and differentiated neural cells. Maintenance of integrity of neural cell aggregates after cryopreservation is a necessary
condition for survival in culture.
Key words: neural cells of newborn rats, multicellular aggregates, survival, viability, cryopreservation, cultivation.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
an_sukach@yahoo.com
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: an_sukach@yahoo.com
1Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2G.S. Skovoroda Kharkov National Pedagogical University, Kharkov,
Ukraine
1Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
2Харьковский национальный педагогический университет
им. Г.С. Сковороды
396 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
нием гомеостаза клеток. Поэтому очень важным
этапом криоконсервирования является создание
условий, активирующих репарацию деконсерви-
рованных клеток. Чаще всего для этого исполь-
зуют восстановительные среды, которые содер-
жат метаболически активные соединения, стиму-
лирующие биоэнергетический цикл клеток и про-
цессы биосинтеза белков и нуклеиновых кислот.
Эти среды могут содержать стабилизаторы мем-
бран и соединения, подавляющие процессы пере-
кисного окисления липидов [1]. Однако использо-
вание таких сред не всегда эффективно для всех
видов клеток.
Следует отметить, что чувствительность кле-
ток к действию криопротекторов и низких темпе-
ратур зависит от их вида и степени дифференциа-
ции. Поэтому при криоконсервировании различных
типов клеток в каждом отдельном случае необхо-
дим экспериментальный подбор условий их подго-
товки к замораживанию, замораживания и восста-
новления после оттаивания. Подбор таких условий
усложняется, если замораживаемые суспензии
клеток гетерогенны. Поиск оптимальных условий
подготовки к замораживанию, замораживания и
восстановления после оттаивания гетерогенных
суспензий важен для создания эффективных про-
токолов криоконсервирования клеток, полученных
из различных тканей.
Для эффективного восстановления клеток после
выделения их из ткани и криоконсервирования
необходимы восстановление межклеточных связей
и контакт с внеклеточным матриксом, которые
обеспечивают сигналы выживания и предотвра-
щают апоптоз [8, 9]. Как правило, клетки, нахо-
дящиеся в суспензии, не могут достаточно быстро
восстановить клеточное микроокружение, следст-
вием чего являются инициация апоптоза и гибель.
Условия, в которых клетки, как и в тканях, контак-
тируют друг с другом и в которых формируется
внеклеточный матрикс, можно воссоздать в не-
больших многоклеточных 3D-структурах. В этих
структурах для клеток создаются оптимальные
условия для выживания, пролиферации и диффе-
ренциации. Такими структурами также являются
агрегаты, которые формируют клетки, полученные
как из нормальных [6–10, 15], так и опухолевых
тканей [16]. Как показали наши исследования,
свойством формировать агрегаты обладают и
клетки, полученные из фетальных [3, 4] и пост-
натальных [2] нервных тканей.
Цель нашего исследования – изучение роли
образования многоклеточных агрегатов в условиях
культивирования in vitro в восстановлении по-
вреждений нервных клеток (НК) новорожденных
крыс, возникающих при их выделении и криокон-
сервировании.
often for this aim there are used the recovering media
containing metabolically active compounds, stimulating
bioenergetic cycle of cells, the processes of biosyn-
thesis of proteins and nucleic acids. These media can
contain the stabilizers of membranes and compounds
suppressing the lipid peroxidation [1]. However, the
application of these media is not always effective for
all the cell types.
It should be noted that the cell sensitivity to the
effect of CPAs and low temperatures depends on their
type and differentiation rate. Therefore during cryopre-
servation of different cell types in each individual case
the experimental selection of the conditions of their
preparing to freezing, freezing itself and recovery after
thawing is necessary. The selection of these conditions
is getting complicated if the cell suspensions to be
frozen are heterogenous. The search for optimal condi-
tions of preparing to freezing, freezing and recovery
after thawing of heterogenous suspension is important
to create the effective protocols for cryopreservation
of cells, derived from different tissues.
For effective recovery of cells after their isolation
from a tissue and cryopreservation the restoration of
cell-cell relationships and contact with extracellular
matrix, providing the surviving signals and preventing
apoptosis are needed [8, 9]. As a rule the cells being
in suspension can not quite rapidly restore a cell micro-
environment, that may result in apoptosis initiation and
death. The conditions in which the cells contact each
other like in tissues and when an extracellular matrix
forms can be reproduced in small multi-cellular 3D
structures. In these structures the optimal conditions
for the cells’ survival, proliferation and differentiation
are created. These structures are the aggregates form-
ing the cells obtained both from normal [6–10, 15] and
tumor tissues [16] as well. As our studies demonstrated
the feature to form the aggregates is inherent to the
cells derived from fetal [3, 4] and post-natal [2] neural
tissues.
The research aim was to study the role of forming
the multicellular aggregates under in vitro culturing
in restoration of the damages in newborn rat neural
cells (NCs), appearing during their isolation and cryo-
preservation.
Materials and methods
The research objects were NCs isolated from brain
of newborn rats using enzyme-mechanical method. To
do this the brain tissue was incubated for 10 min in 0.25%
trypsin solution at 37°C, and then disintegrated to single
cells. The resulted suspension was filtered through
nylon filter and later was washed free of trypsin using
centrifugation at 1500 rpm. Cell viability was estimated
by staining with 0.4% Trypan blue solution (Sigma,
USA) and was expressed in percents [18]. The number
of cells was counted in Goryaev’s chamber.
397 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Материалы и методы
Объектом исследования были изолированные
НК, которые выделяли из тканей мозга новорож-
денных крыс ферментативно-механическим мето-
дом. Для этого ткань мозга инкубировали 10 мин
в 0,25%-м растворе трипсина при 37°С, затем дез-
агрегировали на единичные клетки. Полученную
суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр,
затем отмывали от трипсина центрифугированием
при 1500 об/мин. Жизнеспособность клеток оцени-
вали по окрашиванию 0,4%-м раствором трипано-
вого синего (“Sigma”, США) и выражали в процен-
тах [18]. Количество клеток подсчитывали в каме-
ре Горяева.
Нервные клетки культивировали в 24-луночных
планшетах (“Corning”, США) в среде DMEM/F12
(“Sigma”), обогащенной 0,6 % глюкозы и 2 мM глу-
тамина, 3 мМ бикарбоната натрия. Свежевыде-
ленные клетки высевали в концентрациях 1, 2, 4 6
и 8 млн/мл. Культивировали НК в присутствии 10%
сыворотки крови крыс. В среду добавляли 100 ед/мл
пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культи-
вирование проводили в СО2 инкубаторе при 37°С
в атмосфере 5 % CO2 и 95% воздуха. Среду культи-
вирования меняли через 3–4 суток.
Иммуноцитохимические исследования клеток
проводили после их предварительной фиксации в
растворе 4%-го параформальдегида. В НК имму-
ноцитохимически определяли присутствие специ-
фических маркерных белков: нейронов – β-tubulin
III; нервных стволовых клеток – nestin; нервных
прогениторных клеток – vimentin. В качестве пер-
вичных антител использовали mouse monoclonal to
β-tubulin III (“Sigma”), mouse monoclonal to nestin
(“Abcam”, Великобритания) и rabbit polyclonal to vi-
mentin (“Abcam”). В качестве вторичных антител
использовали chromeo 546 goat anti-mouse (“Ab-
cam”), chromeo 488 goat anti-rabbit (“Abcam”). Ядра
клеток окрашивали hoechst 33342 (“Sigma”).
Микрофотосъемку культур клеток проводили
на микроскопе “Observer Z1” (“Carl Zeiss”, Германия).
Результаты статистически обрабатывали по
методу Стьюдента с использованием программы
“MS Excel”.
Эксперименты были проведены в соответствии
с “Общими принципами экспериментов на живот-
ных”, одобренными III конгрессом по биоэтике
(Киев, 2007) и согласованными с положением
“Европейской конвенции о защите позвоночных
животных, используемых для экспериментальных
и других научных целей” (Страсбург, 1986).
Результаты и обсуждение
Исходную суспензию клеток, полученную из
нервной ткани новорожденных крыс, жизнеспособ-
ность которых составляла 56,2 ± 4,2% (рис. 1),
Neural cells were cultured in 24-well plates (Cor-
ning, USA) in DMEM/F12 (Sigma, USA) supplemen-
ted with 0.6% glucose, 2 mM glutamine and 3 mM
sodium bicarbonate. Freshly isolated cells were seeded
under the concentrations of 1; 2; 4; 6 and 8 mln/ml.
NCs were cultured in presence of 10% rat blood serum.
The medium was supplemented with 100 units/ml
penicillin and 100 mg/ml streptomycin. Culturing was
performed in CO2 incubator at 37°C in 5% CO2 and
95% air atmosphere. Culturing medium was changed
each 3–4 days.
Immune cytochemical studies of cells were carried-
out after their preliminary fixation in 4% paraformal-
dehyde solution. In the NCs there was immunocytoche-
mically examined the presence of specific marker pro-
teins: beta-tubulin III for neurons; nestin for neural stem
cells; vimentin for neural progenitor cells. Mouse mono-
clonal to beta tubulin III (Sigma), mouse monoclonal
to nestin (Abcam, UK) and rabbit polyclonal to
vimentin (Abcam) primary anti-bodies were used. As
secondary antibodies there were used chromeo 546
goat anti-mouse (Abcam), chromeo 488 goat anti-rabbit
(Abcam). Cell nuclei were stained with Hoechst 33342
(Sigma).
Micro photo-imaging of cell cultures was performed
with microscope Observer Z1 (Carl Zeiss, Germany).
The results were statistically processed according
to the Student’s method using MS Excel software.
The experiments were performed in the accordance
with General Principles of the Experiments in Animals
approved by the 3nd Congress in Bioethics (Kiev, 2007)
and coordinated with the statement of European Con-
vention on the Protection of Vertebrate Animals Used
for Experimental and Other Scientific Purposes (Stras-
bourg, 1986).
Results and discussion
Initial cell suspension, derived from neural tissue
of newborn rats, with viability of 56.2 ± 4.2% (Fig. 1)
was cultured in the medium containing 10% rat blood
serum. In some hours of culturing the cells formed
floating multicellular aggregates (Fig. 2A). As well as
during culturing of human fetal NCs [3, 5] the number
of formed aggregates depended on the concentration,
the structure did from viability and the dimensions was
determined by concentrations and viability of the
seeded cells. Optimal concentrations of newborn rat
NCs, which provided the formation of homogenous
aggregates of 100 mm in average, were 2 and 4 mln
of cells/ml. When culturing the NCs under con-
centration of 1 mln/ml the aggregates of small diameter
and in small amount were formed. NCs’ culturing
under concentrations of 6 and 8 mln of cells/ml was
accompanied with the formation of aggregates of large
dimensions, and following fusion of the aggregates.
Herewith the suspension density of the formed aggre-
398 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
культивировали в среде, содержащей 10% сыворот-
ки крови крыс. Через несколько часов культивиро-
вания клетки формировали плавающие многокле-
точные агрегаты (рис. 2, А). Как и при культивиро-
вании фетальных НК человека [3, 5] количество
образованных агрегатов зависело от концентрации,
структура – от жизнеспособности, а размер – от
концентрации и жизнеспособности посеянных
клеток. Оптимальные концентрации НК новорож-
денных крыс, при которых образуются однородные
агрегаты размером в среднем 100 мкм, – 2 и 4 млн
клеток/мл. При культивировании НК в концентра-
ции 1 млн/мл формировались агрегаты небольшого
размера и в меньшем количестве. Культивирова-
ние НК в концентрациях 6 и 8 млн/мл сопровож-
далось образованием агрегатов большого размера,
которые сливались друг с другом. При этом плот-
ность суспензии образованных агрегатов была
очень высокой, что затрудняло наблюдение за
ними. В дальнейших экспериментах мы использо-
вали посевную концентрацию НК, равную 4 млн/мл.
В течение 1–2 суток культивирования в неприкреп-
ленном состоянии упаковка клеток в агрегатах ста-
новилась более плотной, и агрегаты превращались
в сфероиды (рис. 2, B).
Через сутки культивирования образовавшиеся
агрегаты собирали. Концентрация клеток в этих
суспензиях агрегатов составляла 2,0 ± 0,25 млн/мл,
а их жизнеспособность – 87 ± 5,4% (см. рис. 1).
Часть собранных агрегатов (200–250 тыс. клеток)
пересевали, оставшиеся агрегаты криоконсервиро-
вали под защитой 10%-го раствора ДМСО. Для
этого перед замораживанием к агрегатам в среде
DMEM/F12 (“Sigma”) с 10% сыворотки крыс по
каплям добавляли равный объем 20%-го раствора
ДМСО, затем их инкубировали при 4°С 15 мин и
зохлаждали со скоростью 1 град/мин до –80°С в
криоконтейнерах (“Corning”). Через сутки заморо-
женные агрегаты НК помещали в жидкий азот.
Через несколько часов после пересева агрегаты
свежевыделенных НК начинали прикрепляться, их
клетки мигрировали и распластывались, формируя
участки монослоя. При этом наблюдалось образо-
вание длинных отростков, по которым клетки ми-
грировали (рис. 3, А). Возможно, эти отростки об-
разуются клетками радиальной глии [11]. После
прикрепления агрегатов происходила дифферен-
циация как в направлении клеток с морфологией
глии, так и β-тубулин III – положительных клеток
с морфологией нейронов (рис. 3, B).
На 4–6-е сутки культивирования на 80% по-
верхности лунки формировался монослой клеток
с морфологией глии, на 8–9-е сутки на поверхности
глиального монослоя появлялись β-тубулин III –
положительные клетки, морфологически похожие
на нейробласты (рис. 4). При этом β-тубулин III –
gates was very high, which made the observation
difficult. In further experiments we used plating con-
centration of NCs of 4 mln/ml. During 1–2 days of
culturing in a non-attached state the cell packing in
aggregates became denser and the aggregates trans-
formed into spheroids (Fig. 2B).
In 24 hrs of culturing the formed aggregates were
collected. Cell concentration in these suspensions of
aggregates made 2.0 ± 0.25 mln/ml and their viability
was 87 ± 5.4% (see Fig. 1). The part of collected ag-
gregates (200–250 thousand of cells) were re-plated,
the rest was cryopreserved under 10% DMSO pro-
tection. For this aim prior to freezing the equal volume
of 20% DMSO was added dropwise to aggregates in
DMEM/F12 (Sigma) supplemented with 10% rat
serum, then they were incubated at 4°C for 15 min
and cooled with the rate of 1 grad/min down to –80°C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
*
#
Рис. 1. Влияние криоконсервирования и способа отмы-
вания ДМСО на жизнеспособность НК в составе агре-
гатов: 1 – свежевыделенных НК; 2 – НК агрегатов через
1 сутки культивирования; 3 – НК деконсервированных
агрегатов после отмывания ДМСО центрифугирова-
нием; 4 – НК деконсервированных агрегатов после
удаления ДМСО путем разведения и последующего пере-
сева; * – отличия статистически достоверны по сравне-
нию со свежевыделенными НК, р < 0,05; # – отличия ста-
тистически достоверны по сравнению с НК деконсерви-
рованных агрегатов, отмытыми от ДМСО центрифуги-
рованием, р < 0,05.
Fig. 1. Effect of cryopreservation and removing of DMSO
on viability of NCs as the components of aggregates: 1 –
freshly isolated NCs; 2 – NCs of aggregates in 24 hrs of
culturing; 3 – NCs of frozen-thawed aggregates after DMSO
removal with centrifugation; 4 – NCs of frozen-thawed
aggregates after DMSO removal by dilution and following
re-plating; * – differences are statistically significant if
compared with freshly isolated NCs, p < 0.05; # – differences
are statistically significant if compared with NCs of frozen-
thawed aggregates, washed free of DMSO with centrifuga-
tion, p < 0.05.
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
Н
К,
%
N
C
v
ia
bl
ity
, %
399 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
положительных клеток с морфологией нейронов,
образовавшихся после прикрепления агрегатов, мы
не наблюдали. Возможно, эти клетки погибали
вследствие отсутствия соответствующего микро-
окружения в процессе культивирования. При даль-
нейшем культивировании количество нейробласто-
подобных β-тубулин III – положительных клеток
увеличивалось. На 15-е сутки культивирования
образовывались колонии недифференцированных
β-тубулин III – положительных клеток (см. рис. 3).
Иммуноцитохимическое окрашивание также пока-
зало, что большинство этих клеток были нестин-
и виментин-положительными (рис. 5), т. е. являлись
стволовыми и прогениторными клетками, которые
в процессе дальнейшего культивирования пролифе-
рировали, что проявлялось в увеличении размера
in the containers (Corning, USA). In 24 hrs the frozen
aggregates of NCs were plunged into liquid nitrogen.
In some hours after re-plating the aggregates of
freshly isolated NCs started to attach, their cells migra-
ted and spreaded forming the monolayer sites. Herewith
there was observed the formation of long processes
along with the cells migrated (Fig. 3 A). These
processes are likely formed by the cells of radial glia
[11]. After the aggregates attached the cells started
to differentiate both in the direction of cells with glial
morphology and β-tubulin III positive cells with neu-
ron morphology (Fig. 3B).
To the 4–6th culturing days 80% of a well surface
were coated by the cell monolayer with glial morphology,
to the 8–9th days on the surface of glial monolayer
appeared b-tubulin III positive cells, morphologically
Рис. 2. Формирование свежеизолированными НК новорожденных крыс плавающих многоклеточных агрегатов (А),
в которых упаковка клеток (B), в процессе культивирования становилась более плотной (стрелка). Масштаб 100 мкм.
Fig. 2. Formation of floating multicellular aggregates (A), wherein the cell packing (B) during culturing was getting denser
(arrow). Scale 100 µm.
Рис. 3. Миграция, дифференциация и пролиферация клеток прикрепленных агрегатов: А – фазовый контраст. В –
флуоресценция β-тубулин III. Масштаб 100 мкм.
Fig. 3. Migration, differentiation and proliferation of cells of the attached aggregates: A – phase contrast; B – fluorescence
of β-tubulin III. Scale 100 µm.
400 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
колоний и количества единичных недифференциро-
ванных клеток.
Через 5–7 суток низкотемпературного хранения
криоконсервированные агрегаты НК отогревали на
водяной бане при 40°С. ДМСО, обладающий ток-
сическим действием на клетки [17, 19], удаляли
двумя способами: центрифугированием на протя-
жении 90 с при 100g с последующим суспендирова-
нием осадка в среде культивирования, разведением
той же средой до концентрации ДМСО, равной
0,15%, и пересевом агрегатов в среду культиви-
рования с сывороткой. При этом центрифуги-
рование и суспендирование разрушали значитель-
ную часть деконсервированных агрегатов до еди-
ничных клеток, жизнеспособность которых состав-
ляла 45,8 ± 7,4% (см. рис. 1). В процессе культи-
вирования in vitro эти клетки агрегатов не форми-
ровали, хотя при этом некоторые из них прикреп-
лялись к подложке, однако не распластывались и
в последующем погибали.
Для “удаления” ДМСО путем разведения в
лунку 24-луночного планшета высевали 200 мкл
суспензии деконсервированных агрегатов (200–
250 тыс. клеток), добавляли к ним 300 мкл среды
культивирования с сывороткой и культивировали
20 мин в инкубаторе. За это время агрегаты НК
концентрировались в центре лунки, после чего их
в объеме 20 мкл пересевали и культивировали в
500 мкл среды с сывороткой. Такой способ уда-
ления ДМСО приводил к потере части агрегатов
НК, однако при этом сохранялись их целостность
и структура (рис. 6, А). Жизнеспособность клеток
агрегатов составляла 53,5 ± 2,3% (см. рис. 1). На
2-е сутки культивирования агрегаты начинали
similar to neuroblasts (Fig. 4). Herewith no β-tubulin
III positive cells with neuron morphology formed after
attaching of aggregates were observed. These cells
likely died due to the absence of corresponding micro-
environment during culturing. During following culturing
the number of neuroblast-similar β-tubulin III positive
cells increased. To the 15th culturing day there were
formed the colonies of non-differentiated β-tubulin III
positive cells (see Fig. 3). Immune cytochemical stain-
ing also demonstrated that the majority of these cells
was nestin- and vimentin-positive (Fig. 5.), i. e. they
were stem and progenitor ones, proliferating during
following culturing, that was manifested in the enhan-
cing of the colonies’ size and number of single non-
differentiated cells.
In 5–7 days of low temperature storage the cryo-
preserved aggregates of NCs were thawed in water
bath at 40°C. DMSO having a toxic effect on cells
[17, 19] was removed by two ways: a) centrifugation
for 90 sec at 100 g with following suspending of the
pellet in culturing medium, and b) dilution with the same
medium up to the concentration of DMSO, equal to
15% and re-plating of aggregates into culturing medium
with serum. Herewith centrifugation and suspending
destroyed a significant part of frozen-thawed aggrega-
tes into single cells, viability of those made 45.8 ± 7.4%
(see Fig. 1). During culturing in vitro these cells did
not form aggregates, though some of them attached to
embedding, but did not spread and died.
To ‘remove’ DMSO by dilution into a well of 24-
well plate we placed 200 µl of the suspension of frozen-
thawed aggregates (200–250 thousands of cells),
added 300 µl of culturing medium supplemented with
serum and later cultured for 20 min in an incubator.
Рис. 4. Образование на монослое глии β-тубулин III-положительных нейробластоподобных клеток и их колоний
(стрелки): А – фазовый контраст; В – флуоресценция β-тубулин III. Масштаб 100 мкм.
Fig. 4. Formation of β-tubulin III positive neuroblast cells and their colonies on glia monolayer (arrows): A – phase cont-
rast; B – fluorescence of β-tubulin III. Scale 100 µm.
401 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
прикрепляться к подложке. Через 4 суток их при-
креплялось около 60%. В процессе культивирова-
ния клетки агрегатов активно мигрировали, рас-
пластывались и дифференцировались (рис. 6, B). На
6-е сутки культивирования монослой клеток зани-
мал 40%, на 9–10-е сутки – 80% поверхности лунок.
При этом первичный монослой клеток состоял
преимущественно из клеток глии (рис. 6, C). На
15–16-е сутки культивирования на монослое глии
появлялись клетки, морфологически похожие на
нейробласты (рис. 6, D). На 19–21-е сутки культи-
вирования, как и в случае свежевыделенных кле-
ток, появлялись колонии стволовых/прогениторных
клеток, дальнейшее культивирование которых так-
же приводило к их росту.
Таким образом, проведенные исследования по-
казали, что свежевыделенные гетерогенные НК
новорожденных крыс через несколько часов куль-
тивирования в присутствии 10% сыворотки крови
During this time the NC aggregates concentrated in a
center of the well, afterwards they were re-plated in a
volume of 20 µl and cultured in 500 µl of the medium
supplemented with serum. This method of DMSO
removal resulted in the loss of the part of NCs aggre-
gates, however their integrity and structure were
preserved (Fig. 6A). Viability of cell in aggregates
made 53.5 ± 2.3% (see Fig.1). To the 2nd day of cultu-
ring the aggregates started to attach to the surface. In
4 days 60% of aggregates attached. During culturing
the cells of aggregates migrated, flattened and diffe-
rentiated (Fig. 6B). To the 6th day of culturing the cell
monolayer covered 40%, and to the 9–10th days it did
80% of well surface. Herewith the promary monolayer
consisted predominantly of glial cells (Fig. 6C). To the
15–16th days of culturing the cells morphologically
similar to neuroblasts appeared on glial monolayer
(Fig. 6D). To the 19–21st culturing days we revealed
the colonies of stem/progenitor cells like in the case
Рис. 5. Иммуноцитохимическое окрашивание культуры свежевыделенных НК новорожденных крыс после 15 суток
культивирования (A) на присутствие маркерных белков нервных стволовых клеток – нестин (B) и прогениторных –
виментин (C). Ядра клеток были окрашены красителем Hoechst (D). Масштаб 100 мкм.
Fig. 5. Immune cytochemical staining of the culture of freshly isolated NCs derived from newborn rats after 15 culturing
days (A) for the presence of marker proteins of nervous stem cells, nestin (B), and progenitor ones, vimentin (C). Cell
nuclei were Hoechst-stained (D). Scale 100 µm.
402 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Рис. 6. Деконсервированные агрегаты НК новорожденных крыс после удаления ДМСО разведением (А) в процессе
культивирования прикрепляются (B), их клетки мигрируют, пролиферируют и формируют монослой (C), на котором
образуются нейробласты и колонии стволовых/прогениторных клеток (D). Масштаб: А, B, C – 100 мкм, D – 50 мкм.
Fig. 6. Frozen-thawed aggregates of newborn rats after DMSO dilution and transfer (A) adhere during culturing (B); their
cells migrate, proliferate and form the monolayer (C), on which there are formed neuroblasts and the colonies of stem/
progenitor cells (D). Scale: A, B, C – 100 µm; D – 50 µm.
крыс формируют многоклеточные агрегаты. В
процессе культивирования жизнеспособность кле-
ток в составе агрегатов повышается, упаковка
клеток в них становится более плотной, часть агре-
гатов превращается в компактные сфероиды.
Способность НК, культивируемых в составе
агрегатов, восстанавливать возможные поврежде-
ния, формировать нейроны, клетки глии, нейро-
бласты и колонии стволовых/прогениторных клеток
позволяет предположить, что в агрегате воссоз-
дается клеточное микроокружение, приближенное
к интактной нервной ткани [2]. Очевидно, такое
микроокружение способствует репарации повреж-
дений, полученных при выделении клеток, и обес-
печивает сигналы выживания для них. В процессе
культивирования агрегатов в клетках может проис-
ходить накопление белка адгезии Е-кадгерина [16],
что является причиной морфологического перехода
of freshly isolated cells, and further culturing of the
aggregates led to their growth as well.
Thus the studies performed have shown that freshly
isolated heterogenous NCs of newborn rats in several
hours after culturing in the presence of 10% rat blood
serum form the multicellular aggregates. During cultu-
ring the viability of cells of aggregates increases, the
packing of cells in them becomes denser, the part of
aggregates transforms into compact spheroids.
Ability of NCs cultured as the components of aggre-
gates to recover potential damages, to form neurons,
glial cells, neuroblasts and colonies of stem/progenitor
cells allows the supposition that a cell microenvironment
similar to an intact nervous tissue one is reproduced
inside an aggregate [2]. This microenvironment likely
facilitates the reparation of injuries caused by cell
isolation and provides the survival signals for them.
Culturing of aggregates could be accompanied by ac-
яинаворивитьлукиидатС
КНвотагерга
spetserutlucsetagerggaCN
иктус,КНяинаворивитьлукямерВ
syaderutlucCN
еыннеледывежевС
detalosiyramirP
еыннаворивреснокоирK
nezorF - dewaht
вотагергаеинелперкирП
setagerggafognihcattA 1-5,0 2-1
яолсоном%08еинаворимроФ
gnimrofreyalonom%08 6-4 01-9
вотсалборйенеинелвяоП
stsalboruenfogniraeppA 9-8 61-51
КНйинолокеинаворимроФ
gnimrofseinolocCN 61-41 12-91
403 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
вирования деконсервированных НК in vitro имеет
не их жизнеспособность, а сохранение морфологи-
ческой целостности агрегатов. Так, при культивиро-
вании единичных НК, полученных в результате
разрушения деконсервированных агрегатов в
процессе отмывания от ДМСО с центрифугиро-
ванием, реагрегации клеток не происходит, они не
прикрепляются к подложке и погибают. Очевидно,
дезагрегация агрегатов сопровождается разруше-
нием межклеточного матрикса и нарушением
адгезивных свойств клеток, что препятствует их
прикреплению, стимулирует развитие апоптоза [8,
9, 13, 14] и в итоге приводит к их гибели.
При культивировании деконсервированных
морфологически целых агрегатов сохраняется их
способность к прикреплению с последующей миг-
рацией НК и формированием ими клеток глии,
нейронов, нейробластов и колоний стволовых/про-
гениторных клеток. Отличием от культивирования
исходных пересеянных агрегатов является лишь
задержка во времени стадий прикрепления агрега-
тов, формирования монослоя клетками глии, обра-
зования нейробластов и колоний стволовых/проге-
ниторных клеток (таблица).
Причиной такой задержки, очевидно, является
процесс восстановления повреждений НК, возник-
ших при криоконсервировании, который занимает
определенное время. Этот время, вероятно, неоди-
наково для стволовых/прогениторных, комитиро-
ванных и дифференцированных клеток нервной
ткани, о чем свидетельствует замедление сроков
наступления различных стадий культивирования
агрегатов НК (таблица).
Таким образом, краткосрочное культивирование
НК новорожденных крыс в составе агрегатов поз-
воляет клеткам эффективно восстанавливаться
после выделения и криоконсервирования.
cumulation of adhesion protein e-cadherinin the cells
[16], that is the cause of morphological transition of a
loosen aggregate to a compact spheroid. It should be
noted that e-cadherin (being one of the most important
adhesion proteins) plays a significant role in protecting
cells from apoptosis [12].
Freeze-thawing results in a reduced viability of NC
aggregates, assessed by trypan blue staining in average
up to 49.6 ± 3.9% (in 1.75 times if compared with the
cells of initial aggregates).
However, as the carried-out experiments showed,
the crucial factor for successful in vitro culturing of
frozen-thawed NCs was not their viability, but preser-
vation of morphological integrity of aggregates. So, the
culturing of single NCs obtained as a result of destruc-
tion of frozen-thawed aggregates during the process
of DMSO removal using centrifugation resulted in no
re-aggregation of cells, they did not attach to surface
and die. Disaggregation of aggregates is probably ac-
companied with the destruction of intercellular matrix
and disorder in adhesive properties of cells, that lead
to absence of adhesion, stimulation the apoptosis
development [8, 9, 13, 14], and finally to their death.
Culturing of frozen-thawed aggregates with preser-
ved morphologically integrity showed their ability to
attach, following migration of NCs and formation of
glial cells, neurons, neuroblasts and colonies of stem/
progenitor cells. The only difference from culturing of
primary re-plated aggregates was the time delay in
attaching the aggregates, formation of glial cell
monolayer, formation of neuroblasts and colonies of
stem/progenitor cells (Table).
The cause of such a delay is likely the recovery of
injuries of NCs, appeared during cryopreservation, and
this is time-consuming. For stem/progenitor, committed
and differentiated cells of nervous tissue this time is
probably different, which is confirmed with slowing-
Сравнение стадий культивирования агрегатов НК до и после
криоконсервирования
Comparison of the stage for culturing NCs aggregates prior to and after
cryopreservation
от рыхлого агрегата к компакт-
ному сфероиду. Следует отме-
тить, что Е-кадгерин (один из
самых важных белков адгезии)
предположительно играет опре-
деляющую роль в защите кле-
ток от апоптоза [12].
Замораживание-отогрев
приводит к снижению жизне-
способности НК агрегатов, оп-
ределяемой по окрашиванию
трипановым синим, в среднем
до 49,6 ± 3,9% (в 1,75 раза по
сравнению с клетками исход-
ных агрегатов).
Однако, как показали прове-
денные эксперименты, опреде-
ляющее значение для культи-
404 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Выводы
Краткосрочное культивирование НК в составе
агрегатов позволяет восстановить повреждения,
образовавшиеся в процессе их выделения и, воз-
можно, избежать апоптоза, который может возник-
нуть вследствие потери клеточного микроокру-
жения.
Замораживание НК в составе агрегатов под за-
щитой раствора 10% ДМСО позволяет эффективно
сохранять стволовые/прогениторные и дифферен-
цированные нервные клетки.
Сохранение целостности агрегатов НК после
криоконсервирования – необходимое условие для
их выживания в культуре.
Использовать центрифугирование при отмывке
агрегатов НК от ДМСО после криоконсервирова-
ния нецелесообразно, так как оно приводит к разру-
шению агрегатов.
down of onset time for different culturing stages of
NCs aggregates (Table).
Thus short-term culturing of newborn rat NCs as
the part of aggregates enables an effective recovery
of cells after isolation and cryopreservation.
Conclusions
Short-term culturing of NCs as the part of aggre-
gates enables the recovery of the damages, appeared
during their isolation and likely the prevention of apop-
tosis, which may appear due the loss of cell microenvi-
ronment.
Freezing of NCs as the part of aggregates under
10% DMSO protection allows the effective preserva-
tion of stem/progenitor and differentiated nervous cells.
The preservation of post-thaw integrity of NCs
aggregates is the essential condition for their survival
in culture.
The use of centrifugation for removing DMSO from
NC aggregates after cryopreservation is inexpedient,
since it leads to aggregates destroying.
Литература
Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев.: Наук.
думка, 1994.– 431 с.
Ляшенко Т.Д., Сукач А.Н. Характеристика изолированных
нервных клеток новорожденных крыс // Патология.–
2009.– Т. 6, №1.– С. 55–58.
Сукач А.Н. Характеристика эмбриональных нервных
клеток человека, полученных неферментативным
способом // Цитология.– 2005.– Т. 47, №3.– С. 207–213.
Сукач А.Н., Иванов Э.Н. Образование сферических коло-
ний как свойство стволовых клеток // Цитология.– 2007.–
Т. 49, №11.– С. 916–922.
Сукач А.Н., Петренко А.Ю. Особенности поведения
эмбриональных нервных клеток в условиях культи-
вирования in vitro // Проблемы криобиологии.– 2005.– Т. 15,
№3.– С. 385–388.
Abu-Absi S.F., Friend J.R., Hansen L.K., Hu W.S. Structural
polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte
spheroids // Exp. Cell Res.– 2002.– Vol. 274, N1.– P. 56–67.
Arusha O., Timothy M., Shoukat D. Regulation of E-cadherin
expression and β-catenin/Tcf transcriptional activity by the
integrin-linked kinase // Biochem. Biophys. Acta.– 2004.–
Vol. 1691, N1.– P. 1–15.
Frisch S.M., Ruoslahti E. Integrins and anoikis // Curr. Opin.
Cell Biol.– 1997.– Vol. 9, N5. – P. 701–706.
Frisch S.M., Screaton R.A. Anoikis mechanisms // Curr. Opin.
Cell Biol.– 2001.– Vol. 13, N5.– P. 555–562.
Furukawa K.S., Ushida T., Sakai Y. et al. Formation of human
fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture // Cell.
Transplant.– 2001.– Vol. 10, N4–5.– P. 441–445.
Gregg C., Weiss S. Generation of functional radial glial cells
by embryonic and adult forebrain neural stem cells // J. Neuro-
sci.– 2003.– Vol. 23, N37.– P. 11587–11601.
Grossmann J. Molecular mechanisms of "detachment-
induced apoptosis-anoikis"// Apoptosis.– 2002.– Vol. 7, N3.–
P. 247–260.
Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell.–
2000.– Vol. 100, N1.– P. 57–70.
Korff T., Augustin H.G. Integration of endothelial cells in multi-
cellular spheroids prevents apoptosis and induces diffe-
rentiation // J. Cell Biol.– 1998.–Vol. 143, N5.– P. 1341–1352
Lin R.Z., Chang H.Y. Recent advances in three-dimensional
multicellular spheroid culture for biomedical research // Bio-
technol. J.– 2008.– Vol. 3, N9–10.– P. 1172–1184.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
References
Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Naukova
Dumka, 1994.– 431p.
Lyashenko T.D., Sukach A.N. Characteristics of isolated
neural cells from newborn rats // Patologiya.– 2009.– Vol. 6,
N1.– P. 55–58.
Sukach A.N. Characteristics of human embryonic neuronal
cells, obtained by non-enzyme method // Tsitologiya.– 2005.–
Vol. 47, N3.– P. 207–213.
Sukach A.N., Ivanov E.N. Formation of sphere colonies as
the feature of stem cells // Tsytologiya.– 2007.– Vol. 49, N11.–
P. 916–922.
Sukach A.N., Petrenko A.Yu. Behavioral peculiarities of
embryonic nervous cells under culturing in vitro // Problems
of Cryobiology.– 2005.– Vol. 15, N3.– P. 385–388.
Abu-Absi S.F., Friend J.R., Hansen L.K., Hu W.S. Structural
polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte
spheroids // Exp. Cell Res.– 2002.– Vol. 274, N1.– P. 56–67.
Arusha O., Timothy M., Shoukat D. Regulation of E-cadherin
expression and β-catenin/Tcf transcriptional activity by the
integrin-linked kinase // Biochem. Biophys. Acta.– 2004.–
Vol. 1691, N1.– P. 1–15.
Frisch S.M., Ruoslahti E. Integrins and anoikis // Curr. Opin.
Cell Biol.– 1997.– Vol. 9, N5. – P. 701–706.
Frisch S.M., Screaton R.A. Anoikis mechanisms // Curr. Opin.
Cell Biol.– 2001.– Vol. 13, N5.– P. 555–562.
Furukawa K.S., Ushida T., Sakai Y. et al. Formation of human
fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture // Cell.
Transplant.– 2001.– Vol. 10, N4–5.– P. 441–445.
Gregg C., Weiss S. Generation of functional radial glial cells
by embryonic and adult forebrain neural stem cells // J. Neu-
rosci.– 2003.– Vol. 23, N37.– P. 11587–11601.
Grossmann J. Molecular mechanisms of "detachment-
induced apoptosis-anoikis"// Apoptosis.– 2002.– Vol. 7, N3.–
P. 247–260.
Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer // Cell.–
2000.– Vol. 100, N1.– P. 57–70.
Korff T., Augustin H.G. Integration of endothelial cells in multi-
cellular spheroids prevents apoptosis and induces diffe-
rentiation // J. Cell Biol.– 1998.–Vol. 143, N5.– P. 1341–1352
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
405 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Lin R.Z, Chou L.F., Chien C.C., Chang H.Y. Dynamic analysis
of hepatoma spheroid formation: roles of E-cadherin and β1-
integrin // Cell. Tissue Res.– 2006.– Vol. 324, N3.– P. 411–
422.
Malinin T.I., Perry V.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on HeLa
cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell
Biol.– 1976.– N13.– P. 29–83.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.–P. 253–259.
Поступила 18.10.2011
Рецензент Г.А. Божок
16.
17.
18.
19.
Lin R.Z., Chang H.Y. Recent advances in three-dimensional
multicellular spheroid culture for biomedical research // Bio-
technol. J.– 2008.– Vol. 3, N9–10.– P. 1172–1184.
Lin R.Z, Chou L.F., Chien C.C., Chang H.Y. Dynamic analysis
of hepatoma spheroid formation: roles of E-cadherin and β1-
integrin // Cell. Tissue Res.– 2006.– Vol. 324, N3.– P. 411–
422.
Malinin T.I., Perry V.P. Toxicity of dimethyl sulfoxide on HeLa
cells // Cryobiology.– 1967.– Vol. 4, N2.– P. 90–96.
Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells // Meth. Cell
Biol.– 1976.– N13.– P. 29–83.
Tomford W.W., Fredericks G.R., Mankin H.J. Studies on
cryopreservation of articular cartilage chondrocytes // J.
Bone Joint Surg. Am.– 1984.– Vol. 66, N2.–P. 253–259.
Accepted 18.10.2011
15.
16.
17.
18.
19.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68462 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:37:25Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Сукач, А.Н. Ляшенко, Т.Д. 2014-09-24T11:38:52Z 2014-09-24T11:38:52Z 2011 Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования / А.Н. Сукач, Т.Д. Ляшенко // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 395-405. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68462 591.88.084:57.043 Изучена роль формирования агрегатов нервными клетками (НК) новорожденных крыс в процессе восстановления после выделения и криоконсервирования этих клеток. Установлено, что краткосрочное культивирование НК в составе агрегатов устраняет повреждения, образовавшиеся в процессе их выделения, и возможно, позволяет клеткам избежать апоптоза. Показано, что замораживание НК в составе агрегатов под защитой 10 % диметилсульфоксида эффективно сохраняет стволовые/прогениторные и дифференцированные НК. Сохранение целостности агрегатов НК после криоконсервирования является необходимым условием их выживания в культуре. Вивчали роль формування агрегатів нервовими клітинами (НК) новонароджених щурів в процесі відновлення після виділення і кріоконсервування цих клітин. Встановлено, що короткострокове культивування НК у складі агрегатів відновлює ушкодження, що утворилися в процесі їх виділення та, можливо, дозволяє клітинам уникнути апоптозу. Показано, що заморожування НК у складі агрегатів під захистом 10% ДМСО ефективно зберігає стволові/прогеніторні і диференційовані НК. Збереження цілісності агрегатів НК після кріоконсервування є необхідною умовою їх виживання в культурі. The role of formation of newborn rat neural cell aggregates on cell recovery after isolation and cryopreservation was studied. Shortterm cultivation of neural cells within aggregates eliminate the damages that appear during cell isolation and possibly protects from apoptosis. It was shown that freezing of neural cells within aggregates under protection of 10% DMSO is effective for storage of stem/progenitor and differentiated neural cells. Maintenance of integrity of neural cell aggregates after cryopreservation is a necessary condition for survival in culture. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования Role of Forming Aggregates in Post-Thaw Survival of Isolated Neural Cells from Newborn Rats Article published earlier |
| spellingShingle | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования Сукач, А.Н. Ляшенко, Т.Д. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| title_alt | Role of Forming Aggregates in Post-Thaw Survival of Isolated Neural Cells from Newborn Rats |
| title_full | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| title_fullStr | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| title_full_unstemmed | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| title_short | Роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| title_sort | роль формирования агрегатов в процессе выживания изолированных нервных клеток новорожденных крыс после криоконсервирования |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68462 |
| work_keys_str_mv | AT sukačan rolʹformirovaniâagregatovvprocessevyživaniâizolirovannyhnervnyhkletoknovoroždennyhkrysposlekriokonservirovaniâ AT lâšenkotd rolʹformirovaniâagregatovvprocessevyživaniâizolirovannyhnervnyhkletoknovoroždennyhkrysposlekriokonservirovaniâ AT sukačan roleofformingaggregatesinpostthawsurvivalofisolatedneuralcellsfromnewbornrats AT lâšenkotd roleofformingaggregatesinpostthawsurvivalofisolatedneuralcellsfromnewbornrats |