Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс
Отмечено, что одним из необходимых условий для осуществления стероидогенной функции клетками коры надпочечников (ККН) является наличие потенциала на мембране митохондрий (Δψm). Для его оценки часто используется катионный краситель JC-1, который способен образовывать j-агрегаты в митохондрии при нали...
Збережено в:
| Опубліковано в: : | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Дата: | 2011 |
| Автори: | , , , , , , |
| Формат: | Стаття |
| Мова: | Російська |
| Опубліковано: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2011
|
| Теми: | |
| Онлайн доступ: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68463 |
| Теги: |
Додати тег
Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Цитувати: | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс / Т.А. Юрчук, Г.А. Божок, И.А. Боровой, Т.М. Гурина, П.М. Зубов, Т.П. Бондаренко, Ю.В. Малюкин // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 406-415. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
Репозитарії
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860119958577479680 |
|---|---|
| author | Юрчук, Т.А. Божок, Г.А. Боровой, И.А. Гурина, Т.М. Зубов, П.М. Бондаренко, Т.П. Малюкин, Ю.В. |
| author_facet | Юрчук, Т.А. Божок, Г.А. Боровой, И.А. Гурина, Т.М. Зубов, П.М. Бондаренко, Т.П. Малюкин, Ю.В. |
| citation_txt | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс / Т.А. Юрчук, Г.А. Божок, И.А. Боровой, Т.М. Гурина, П.М. Зубов, Т.П. Бондаренко, Ю.В. Малюкин // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 406-415. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Отмечено, что одним из необходимых условий для осуществления стероидогенной функции клетками коры надпочечников (ККН) является наличие потенциала на мембране митохондрий (Δψm). Для его оценки часто используется катионный краситель JC-1, который способен образовывать j-агрегаты в митохондрии при наличии потенциала на ее мембране. Проведена оценка этой способности в ККН крыс после замораживания-отогрева в бессывороточных и сывороткосодержащих криозащитных средах в концентрационном ряду диметилсульфоксида (ДМСО). Установлено, что количество ККН, содержащих j-агрегаты, увеличивалось во всех криозащитных средах после замораживания-отогрева. Данный эффект сохранялся после краткосрочного культивирования в течение 24 ч только в ККН, замороженных-отогретых в бессывороточных криозащитных средах, и был наиболее выраженным в средах с концентрациями ДМСО 5 и 7 %. ККН, криоконсервированные в сывороткосодержащих средах, по количеству клеток с j-агрегатами не отличались от нативных.
Однією з необхідних умов для здійснення стероїдогенної функції клітинами кори наднирників (ККН) є наявність потенціалу на мембрані мітохондрій (Δψm). Для його оцінки часто використовується катіонний барвник JC-1, який здатний створювати j-агрегати в мітохондрії при наявності потенціалу на її мембрані. У нашій роботі ми оцінювали цю здатність у ККН щурів після заморожуваннявідігрівання у кріозахисних середовищах з вмістом сироватки та без неї в концентраційному ряду ДМСО. Встановлено, що кількість ККН, які містять j-агрегати, збільшувалась після заморожування-відігрівання ККН у всіх кріозахисних середовищах. Даний ефект зберігався після короткострокового культивування протягом 24 годин тільки в ККН, заморожених-відігрітих у кріозахисних середовищах без сироватки і був найбільш вираженим у середовищах з концентраціями ДМСО 5 і 7%. Клітини кори наднирників, кріоконсервовані в середовищах з сироваткою, за кількістю клітин з j-агрегатами не відрізнялися від нативних.
One of necessary conditions to perform steroidogenesis by adrenal cortex cells (ACC) is the presence of the potential on mitochondrial membrane (Δψm). To assess it the cationic dye JC-1 capable of forming j-aggregates in mitochondrion with the presence of a potential on its membrane is frequently used. In this research we estimated this ability in rat ACC after freeze-thawing in serum-free and serum-enriched cryoprotective media in DMSO concentration row. It has been established that the number of ACC containing j-aggregates increased after freeze-thawing in all cryoprotective media. This effect was kept after short-term culturing during 24 hrs only in ACC, frozen-thawed in serum-free cryoprotective media and was the most manifested in the media with 5 and 7% DMSO. Adrenal cortex cells cryopreserved in serum-enriched media did not differ from native cells by the number of cells with j-aggregates.
|
| first_indexed | 2025-12-07T17:38:24Z |
| format | Article |
| fulltext |
406 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
УДК 577.366:57.043
Т.А. ЮРЧУК1,2*, Г.А.БОЖОК2, И.А. БОРОВОЙ3, Т.М. ГУРИНА2,
П.М. ЗУБОВ2, Т.П. БОНДАРЕНКО2, Ю.В. МАЛЮКИН3
Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных,
сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование
j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс
UDC 577.366:57.043
T.A. YURCHUK1*, G.A. BOZHOK2, I.A. BOROVOY3,
P.M. ZUBOV2, T.M. GURINA2, T.P. BONDARENKO2, YU.V. MALYUKIN3
Effect of Cryopreservation in Serum-Free and Serum-Enriched
Cryoprotective Media on Formation of J-Aggregates
in Rat Adrenal Cortex Cells
Одним из необходимых условий для осуществления стероидогенной функции клетками коры надпочечников (ККН) является
наличие потенциала на мембране митохондрий (∆ψм). Для его оценки часто используется катионный краситель JC-1, который
способен образовывать j-агрегаты в митохондрии при наличии потенциала на ее мембране. В нашей работе мы оценивали эту
способность в ККН крыс после замораживания-отогрева в бессывороточных и сывороткосодержащих криозащитных средах
в концентрационном ряду ДМСО. Установлено, что количество ККН, содержащих j-агрегаты, увеличивалось во всех крио-
защитных средах после замораживания-отогрева. Данный эффект сохранялся после краткосрочного культивирования в течение
24 ч только в ККН, замороженных-отогретых в бессывороточных криозащитных средах, и был наиболее выраженным в средах
с концентрациями ДМСО 5 и 7%. Клетки коры надпочечников, криоконсервированные в сывороткосодержащих средах, по
количеству клеток с j-агрегатами не отличались от нативных.
Ключевые слова: клетки коры надпочечников, стероидогенез, флуоресцентный краситель, j-агрегаты, митохондриальный
потенциал.
Однією з необхідних умов для здійснення стероїдогенної функції клітинами кори наднирників (ККН) є наявність потенціалу
на мембрані мітохондрій (∆ψм). Для його оцінки часто використовується катіонний барвник JC-1, який здатний створювати
j-агрегати в мітохондрії при наявності потенціалу на її мембрані. У нашій роботі ми оцінювали цю здатність у ККН щурів після
заморожуваннявідігрівання у кріозахисних середовищах з вмістом сироватки та без неї в концентраційному ряду ДМСО.
Встановлено, що кількість ККН, які містять j-агрегати, збільшувалась після заморожування-відігрівання ККН у всіх кріозахисних
середовищах. Даний ефект зберігався після короткострокового культивування протягом 24 годин тільки в ККН, заморожених-
відігрітих у кріозахисних середовищах без сироватки і був найбільш вираженим у середовищах з концентраціями ДМСО 5 і
7%. Клітини кори наднирників, кріоконсервовані в середовищах з сироваткою, за кількістю клітин з j-агрегатами не відрізнялися
від нативних.
Ключові слова: клітини кори наднирників, стероїдогенез, флуоресцентний барвник, j-агрегати, мітохондріальний потенціал.
One of necessary conditions to perform steroidogenesis by adrenal cortex cells (ACC) is the presence of the potential on mito-
chondrial membrane (∆ψm). To assess it the cationic dye JC-1 capable of forming j-aggregates in mitochondrion with the presence of
a potential on its membrane is frequently used. In this research we estimated this ability in rat ACC after freeze-thawing in serum-free
and serum-enriched cryoprotective media in DMSO concentration row. It has been established that the number of ACC containing
j-aggregates increased after freeze-thawing in all cryoprotective media. This effect was kept after short-term culturing during 24 hrs
only in ACC, frozen-thawed in serum-free cryoprotective media and was the most manifested in the media with 5 and 7% DMSO.
Adrenal cortex cells cryopreserved in serum-enriched media did not differ from native cells by the number of cells with j-aggregates.
Key words: adrenal cortex cells, steroidogenesis, fluorescent dye, j-aggregates, mitochondrial potential.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
tais_jazz@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: tais_jazz@mail.ru
1V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, Ukraine
2Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
3Institute for Scintillation Materials of the National Academy of Sci-
ences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
1Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина
2Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
3Институт сцинтилляционных материалов НАН Украины,
г. Харьков
Для лечения хронической надпочечниковой
недостаточности все чаще применяется клеточная
и тканевая трансплантация, а криоконсервирование
биологического материала, в том числе и эндо-
кринных клеток, является одним из способов его
долгосрочного хранения до момента транспланта-
Cell and tissue therapy is now used to treat chronic
adrenal insufficiency and cryopreservation of biological
material, including endocrine cells is one of the methods
of its long-term storage prior to transplantation [2, 3].
However, freeze-thawing can affect structural and
functional state of transplanted material and as a result
407 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
ции [2, 3]. Однако процесс замораживания-отогрева
может влиять на структурно-функциональное сос-
тояние трансплантируемого материала и в итоге
определяет его эффективность в организме реци-
пиента [2,7]. Таким образом, одной из главных
задач криоконсервирования клеток коры надпочеч-
ников (ККН) является сохранение их стероидоген-
ных свойств.
Важный этап биосинтеза стероидных гормо-
нов – превращение холестерина в прегненолон с
участием острого регуляторного стероидогенного
белка (StAR), при участии которого холестерин
доставляется к ферменту Р450scc, локализован-
ному на внутренней мембране митохондрии [12].
Для обеспечения этого процесса обязательно нали-
чие мембранного потенциала (∆ψм) на митохонд-
риях [13], который можно оценить с помощью ка-
тионного флуоресцентного красителя JC-1 [9, 16,
18]. Присутствие на митохондриях ∆ψм обеспечи-
вает прохождение JC-1 внутрь органеллы, где, акку-
мулируясь в достаточном количестве, он форми-
рует j-агрегаты, флуоресцирующие в красно-оран-
жевой области. В противном случае JC-1 не может
накапливаться, оставаясь в мономерной форме в
цитоплазме, и флуоресцирует в зеленой области
[14]. Таким образом, клетки с потенциалом на
мембране митохондрий легко отличить по наличию
двойной зеленой и красно-оранжевой флуоресцен-
ции.
Для криоконсервирования стероидогенных эндо-
кринных клеток наиболее часто в качестве крио-
протектора используют комбинированные криоза-
щитные среды на основе диметилсульфоксида
(ДМСО) и сыворотки крови. Однако целесообраз-
ность применения сывороточной добавки неодноз-
начна [6, 8, 19] и оценка мембранного потенциала
митохондрий клеток, подвергнутых заморажи-
ванию-отогреву в комбинированных средах, ве-
роятно, поможет оценить необходимость ее при-
сутствия в среде.
Цель данной работы – изучение влияния усло-
вий криоконсервирования в бессывороточных и сы-
вороткосодержащих криозащитных средах с раз-
ным содержанием ДМСО на формирование
j-агрегатов в ККН крыс.
Материалы и методы
Эксперименты проводили в соответствии с
“Общими этическими принципами экспериментов
на животных”, одобренными III Национальным
конгрессом по биоэтике (Киев, 2007), и положе-
ниями “Европейской конвенции о защите позвоноч-
ных животных, используемых для эксперимен-
тальных и других научных целей” (Страсбург, 1986).
В работе использовали суспензию клеток коры
надпочечников (ККН) 3-месячных половозрелых
крыс, полученную ферментативным способом. Для
determines its efficiency in a recipient's organism [2,
7]. Thus, one of the main tasks of adrenal cortex cells
(ACCs) cryopreservation is preservation of their steroi-
dogenic properties.
An important stage of steroid hormone biosynthesis
is a transformation of cholesterol into pregnenolone
with steroidogenic acute regulatory protein (StAR) due
to which cholesterol is delivered to enzyme P450scc
localized on interior membrane of mitochondrion [12].
To facilitate this process the presence of membrane
potential (∆ψm) on mitochondria is required [13] and
this may be evaluated using cation fluorescent dye JC-1
[9, 16, 18]. The presence of ∆ψm on mitochondria faci-
litate a penetration of JC-1 into organelles, where
following concentrating it forms j-aggregates with red-
orange fluorescence. Otherwise JC-1 can not be accu-
mulated and is monomeric in cytoplasm and in this case
its fluorescences is green [14]. Thus, the cells with
potential on mitochondria membrane are easy to be
distinguished by double green and red-orange fluores-
cence.
To cryopreserve steroidogenic endocrine cells the
mostly used cryoprotective media are combinations of
dimethylsulfoxide (DMSO) solutions and blood serum.
However, the expedience of serum enrichment is still
questionable [6, 8, 19] and assessment of membrane
potential of cell mitochondria after freeze-thawing in
combined media probably would help to estimate if it
presence in medium is nessessary.
The research aim is to study the effect of cryo-
preservation conditions in serum-free and serum-
enriched cryoprotective media with different content
of DMSO on formation of j-aggregates in rat ACCs.
Materials and methods
The experiments were carried-out according to the
General ethical principles of experiments in animals
approved by the 3rd National Congress in Bioethics
(Kiev, 2007) and agreed with the statements of Euro-
pean convention for the protection of vertebrate animals
used for experimental and other scientific purposes
(Strasbourg, 1986).
In the research we used the adrenal cortex cell
(ACC) suspension of 3 month-old adult rats derived
by enzyme method. Adrenal cortex was separated
from medulla under visual control of microscope
MBS-10. Cortical adrenal tissue was placed in medium
199 (Biolot, Russia) with enzyme mixture containing
collagenase V type (1 mg/ml, Sigma, USA), DNAase
I type (0,1 mg/ml, Sigma) [10] for 15 min at 37°C,
incubation was performed with constant agitating. Then
the suspension was dispersed with Pasteur pipette and
thrice washed free of enzyme solution in the medium
199 with 0.2% bovine serum albumin (Sigma) using
centrifugation for 3 min at 1,500 rpm.
Cell viability was evaluated by their supravital
staining with trypan blue. Viable cells exclude pene-
408 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
этого под микроскопом МБС-10 отделяли кортекс
надпочечников от медулы. Кортикальную ткань над-
почечников помещали в среду 199 (“Биолот”, Рос-
сия) с ферментативным коктейлем, содержащим
коллагеназу V типа (1мг/мл “Sigma”, США), ДНКазу
I типа (0,1 мг/мл, “Sigma”) [10], на 15 мин при 37°С и
постоянном встряхивании. Диспергировали с помо-
щью пастеровской пипетки и трижды отмывали от
ферментативного раствора в среде 199 с 0,2%-м
бычьим сывороточным альбумином (“Sigma”)
путем центрифугирования 3 мин при 1500 об/мин.
Жизнеспособность клеток оценивали по окраши-
ванию их суправитальным красителем трипано-
вым синим. Жизнеспособные клетки исключают
проникающий внутрь краситель, в отличие от мерт-
вых, которые окрашиваются синим цветом. В
полученной суспензии ККН жизнеспособность в
среднем составляла 85%. Сохранность ККН опре-
деляли как количество клеток в суспензии после
инкубации с криозащитными средами или замора-
живания-отогрева по отношению к количеству кле-
ток до инкубации или замораживания, выраженное
в процентах.
В экспериментах использовали бессывороточ-
ные криозащитные среды, приготовленные на среде
199, с концентрациями ДМСО 5, 7, 10, 15% и сы-
вороткосодержащие среды с такими же концент-
рациями ДМСО и с добавлением 25% эмбриональ-
ной телячьей сыворотки (ЭТС) (“Биолот”, Россия).
Для минимизации осмотического повреждаю-
щего действия криозащитные среды добавляли
ступенчатым способом. К 500 мкл суспензии кле-
ток надпочечников в 5 этапов добавляли по 100 мкл
раствора ДМСО двукратной концентрации с
интервалом 1 мин, затем инкубировали 5 мин при
22°С для последующего замораживания или 20 мин
для оценки влияния растворов криопротектора на
сохранность и жизнеспособность клеток.
Суспензию ККН охлаждали со скоростью
1 град/мин до –40°С на программном заморажи-
вателе “Cryoson” (Германия) с последующим по-
гружением в жидкий азот [5].
Для удаления криозащитных сред поэтапно
уменьшали концентрацию ДМСО с дальнейшим
центрифугированием при 1500 об/мин в течение
3 мин. Ступенчатое удаление криопротектора
предполагало последовательное разведение сре-
дой 199 с 10% ЭТС путем добавления аликвот по
500, 500, 1000, 2000 мкл с интервалом 1 мин.
Для краткосрочного культивирования разморо-
женную суспензию клеток помещали в среду 199
с 10% ЭТС на коллагеновую подложку в 96-луноч-
ный планшет на 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2.
Клетки коры надпочечников окрашивали JC-1
(10 мкг/мл) в течение 30 мин при 37°С в среде
ДМЕМ (“Sigma”) без фенолового красного, после
чего дважды отмывали этой же средой.
trating dye unlike blue stained dead ones. In derived
ACC suspension viability in average made 85%.
Survival of ACCs was determined as cell number in
suspension after incubation with cryoprotective media
or freeze-thawing in relation to a cell number prior to
effect, and expressed in percent.
In the experiments there we used serum-free cryo-
protective media prepared on the base of medium 199
with 5; 7; 10; 15% DMSO concentrations or serum-
enriched ones with the same DMSO concentrations
and supplemented with 25% fetal bovine serum (FBS)
(Biolot, Russia).
To minimize a damaging effect of osmotic factors
the cryoprotective media were added to cell suspesion
step-wise. Double concentration of 100 µl DMSO was
added through 5 steps into 500 µl of adrenal cell
suspension by 1 min interval and then incubated for
5 min at 22°C for following freezing, or 20 min to
evaluate the effect of cryoprotectant solutions on a
cell survival and viability.
ACC suspension was cooled with the rate of
1 degree/min down to –40°C using Cryoson program-
mable freezer (Germany) and then plunged into liquid
nitrogen [5].
To remove cryoprotective media the concentration
of DMSO was stepwise reduced and then sample was
centrifugated for 3 min at 1,500 rpm. Stepwise removal
of cryoprotectant supposed a serial dilution with
medium 199 with 10% FBS by addition of aliquots of
500, 500, 1,000, 2,000 µl with 1 min interval.
For a short-term culturing the frozen-thawed cell
suspension was placed into the medium 199 with 10%
FBS on collagen-coated surface in 96-well plate for
24 hrs at 37°C in 5% CO2 atmosphere.
Adrenal cortex cells were stained with JC-1
(10 µg/ml) for 30 min at 37°C in medium DMEM
(Sigma) without phenol red, thereafter twice washed
with the same medium.
Microscopic researches were performed with fluo-
rescent microscope Olympus X71 (Japan) using light
filters, exitation wave-length was 485 nm and emission
was observed in green zone of spectrum at 520 nm, in
red one at 590 nm. In each zone (with magnification
400) a cell number with and without j-aggregates was
calculated.
ACCs stained with JC-1 were studied with flow
cytofluorimeter FACS Calibur (BD Bioscience). The
analysis of the data obtained in FACS Calibur was
performed with WinMDI software.
To evaluate a mitochondrial potential there was
used the coefficient of double fluorescence, which was
calculated by the formula:
Cdf =
Cgreen+red
,
Cgreen
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
К 5 7 10 15 5+ЭТС 7+ЭТС 10+ЭТС 15+ЭТС
**
#
#
#
#
#
409 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Микроскопические исследования проводили на
флуоресцентном микроскопе “Olympus Х71” (Япо-
ния) с использованием светофильтров: длина волны
возбуждения 485 нм и эмиссии в зеленой области
спектра 520 нм, в красной – 590 нм. В каждом поле
(увеличение 400) подсчитывали количество клеток,
содержащих и не содержащих j-агрегаты.
На проточном цитофлуориметре “FACS Calibur”
(“BD Bioscience”, США) исследовали ККН, окра-
шенные JC-1. Анализ данных, полученных на
“FACS Calibur”, осуществляли при помощи про-
граммы WinMDI.
Для оценки митохондриального потенциала
использовали коэффициент двойной флуоресцен-
ции, который рассчитывали по формуле:
Кдф =
Кзелен+красн
,
Кзелен
где Кзелен+красн – количество клеток с красной и зе-
леной флуоресценцией; Кзелен – количество клеток
только с зеленой флуоресценцией.
Повышение Кдф свидетельствует о поляризации
мембран митохондрий, тогда как понижение Кдф –
о деполяризации [17].
При статистической обработке результатов ис-
пользовали однофакторный дисперсионный анализ
и t-критерий Стьюдента. Достоверными считали
различия при р < 0,05. Данные представляли как
среднее значений, полученных в серии аналогич-
where Cgreen+red is cell number with green and red
fluorescence; Cgreen is cell number only with green
fluorescence
The increase of Cdf testifies to polarization of mito-
chondria membranes, whereas the decrease of Cdf
means depolarization [17].
Statistical processing of the results was performed
using one-factor dispersion analysis and Student's t-
criterion. The differences were significant at p < 0.05.
The data were presented as mean obtained during the
same experiments (n = 10), ± standard deviation.
Results and discussion
To examine cytotoxicity of cryoprotective media
the viability and survival of ACCs were evaluated after
incubation for 20 min at room temperature 22°C
(Fig. 1). During the experiment an incubation duration
was selected to conform the time within which the
cells contact liquid cryoprotective media. The cell
survival did not significantly differ from the control in
serum-enriched cryoprotective media with 7 and 10%
DMSO concentrations and in serum-free one with 10%
DMSO. The lowest cell integrity was observed in
serum-free medium with 15% DMSO. In the rest
observed cryoprotective media it varied within the
range of 70–85%.
Viability and survival of ACC were also evaluated
after freeze-thawing of suspension. It was established
that in serum-free cryoprotective media with different
DMSO concentrations in average nearly 50% of cells
were preserved (Fig. 2). Herewith ACC viability made
Рис. 1. Влияние инкубации ККН в криозащитных средах разного состава в тече-
ние 20 мин при 22°С на жизнеспособность ( ) и сохранность ( ) клеток; К –
контроль; * – отличия жизнеспособности достоверны относительно контроля;
# – отличия сохранности достоверны относительно контроля, р < 0,05.
Fig. 1. Effect of ACC incubation in cryoprotective media of different composition
during 20 min at 22°C on cell viability ( ) and survival ( ); K – control; * – the
differences in viability are significant if compared to the control; # – the differences
in survival are significant if compared to the control; p < 0.05.
Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, %
Ко
ли
че
ст
во
к
ле
то
к,
%
C
el
l n
um
be
r,
%
ных экспериментов (n = 10),
± стандартное отклонение.
Результаты и обсуждение
Для определения цитоток-
сичности криозащитных сред
оценивали жизнеспособность
и сохранность ККН после ин-
кубации в течение 20 мин в
условиях комнатной темпера-
туры 22°С (рис. 1). При про-
ведении эксперимента про-
должительность инкубации
была выбрана исходя из того
периода времени, в течение
которого клетки контактиро-
вали с жидкофазными крио-
защитными средами. Cохран-
ность клеток достоверно не
отличалась от контроля в сы-
вороткосодержащих криоза-
щитных средах с концентра-
циями ДМСО 7 и 10% и
бессывороточной среде – с
10% ДМСО. Самая низкая
5+FBS 7+FBS 10+FBS 15+FBS
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
К 5 7 10 15 5+ЭТС 7+ЭТС 10+ЭТС 15+ЭТС
* *
*
*
*
*# #
#
#
#
#
#
410 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
ДМСО, а наименьшее (35%) – в образцах с 5 и
15% ДМСО. Жизнеспособность ККН составляла
70% в средах с 7 и 10% ДМСО, 57% – с 5% ДМСО.
Наименьшее количество жизнеспособных клеток
(46%) наблюдалось в среде с 15% ДМСО. Такая
низкая жизнеспособность клеток в среде с 5%
ДМСО, возможно, обусловлена недостаточным
защитным эффектом данной концентрации крио-
протектора, а в среде с 15% ДМСО – его токсичес-
ким влиянием.
Для оценки митохондриального потенциала
после оттаивания ККН окрашивали JC-1 и с по-
мощью проточного цитофлуориметра оценивали
количество клеток с двойной (красной и зеленой)
и только зеленой флуоресценцией.
При анализе полученных данных на цитограмме
по параметрам прямого и углового светорассеяния
выделяли “регион событий”, отвечающий разме-
рам исследованных клеток (рис. 3, A). Далее его
анализировали по параметрам флуоресценции в
зеленой и красной областях спектра (рис. 3, B). При
этом выделяли три популяции клеток: 1) неокра-
шенные, среди которых основную часть составля-
ли эритроциты; 2) флуоресцирующие в зеленой
области спектра; 3) флуоресцирующие в зеленой
и красной областях спектра (двойная флуоресцен-
ция). Мы подсчитывали количество ККН, имею-
щих двойную флуоресценцию. Эта популяция кле-
ток содержала j-агрегаты, что свидетельствовало
о наличии потенциала на мембране митохондрий и
39–55%: minimum for medium with 15% and ma-
ximum with 10% DMSO.
After freeze-thawing of ACC in serum-enriched
media the biggest amount of cells (82%) was preserved
in the medium with 7% DMSO, and lowest survival
(35%) was in the samples with 5 and 15% DMSO.
Viability of ACC made 70% in the media with 7 and
10% DMSO, 57% viability was with 5% DMSO. The
least number of viable cells (46%) was observed in
the medium with 15% DMSO. Such a low cell viability
in the medium with 5% DMSO is probably stipulated
by insufficient protective effect of this cryoprotectant
concentration, and in the medium with 15% DMSO it
was due to a toxic effect.
To assess a mitochondrial potential after thawing
ACCs were stained with JC-1 and a number of cells
with dual (red and green) and just green fluores-cence
was evaluated with flow cytometer.
Analyzing the obtained cytograms by direct and side
scattering parameters we determined ‘region of events’
corresponding to the dimensions of the investigated
cells (Fig. 3A). Later it was analyzed by the parameters
of fluorescence in green and red spectrum regions (Fig.
3B). Furthermore three populations of cells were deter-
mined: 1) unstained cells (predominantly erythrocytes);
2) cells fluoresced in green spectrum region; 3) cells
fluoresced in green and red spectrum regions (dual
fluorescence). We estimated ACCs having a dual fluo-
rescence. This population of cells contained j-aggre-
gates. This fact testified to the presence of a potential
Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, %
Ко
ли
че
ст
во
к
ле
то
к,
%
C
el
l n
um
be
r,
%
Рис. 2. Влияние условий криоконсервирования ККН в криозащитных средах
разного состава на жизнеспособность ( ) и сохранность ( ) клеток; К — конт-
роль; * – отличия жизнеспособности достоверны относительно контроля; # –
отличия сохранности достоверны относительно контроля, р < 0,05.
Fig. 2. Effect of ACC cryopreservation conditions in cryoprotective media of diffe-
rent composition on cell viability ( )and survival ( ); K – control; * – the differences
in viability are significant if compared to the control; # – the differences in survival
are significant if compared to the control, p < 0.05.
сохранность клеток наблюда-
лась в бессывороточной сре-
де с 15% ДМСО. В остальных
исследуемых криозащитных
средах она колебалась в пре-
делах 70– 85%.
Показатели жизнеспособ-
ности и сохранности ККН оце-
нивали также после замора-
живания-отогрева суспензии.
Установлено, что в бессыво-
роточных криозащитных сре-
дах с различной концент-
рацией ДМСО сохраняется в
среднем около 50% клеток
(рис. 2). Жизнеспособность
ККН при этом составляла 39–
55%: минимальная – для сре-
ды с 15% и максимальная –
с 10% ДМСО.
После замораживания-
отогрева ККН в сыворотко-
содержащих средах наиболь-
шее количество клеток (82%)
сохранялось в среде с 7%
5+FBS 7+FBS 10+FBS 15+FBS
411 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
клеток с двойной флуоресценцией; в среде с 10%
ДМСО – 43%, а в среде с 15% ДМСО – 50%.
Коэффициент двойной флуоресценции для
свежевыделенной суспензии ККН составил 1, а в
клетках, криоконсервированных в бессывороточ-
ной среде с 5% ДМСО, – 5 (рис.5). В остальных
криозащитных средах Кдф составлял около 3, кроме
сывороткосодержащей среды с 15% ДМСО (1,5).
on mitochondria membrane and indirectly pointed to
the possibility of active steroidogenesis in cells.
It was that in fresh suspension about 30% of ACCs
had dual red-green fluorescence (Fig. 4). After thawing
of ACCs frozen in serum-free cryoprotective media
the biggest amount of cells with dual fluorescence in
the sample with 5% DMSO was 70%, and in the rest
samples it made 45%.
Рис. 3. Цитофлуориметрический анализ ККН, окрашенных JC-1: A – цитограмма
по параметрам прямого и углового светорассеяния ККН; B – цитограмма по
параметрам зеленой и красной флуоресценции.
Fig.3. Cytofluorimetric analysis of ACCs stained with JC-1: A – cytogram by direct
and side scatter ing parameters of ACCs; B – cytogram on green and red fluorescence
parameters.
косвенно указывало на воз-
можность активного стерои-
догенеза в клетках.
Установлено, что в свеже-
выделенной суспензии около
30% ККН обладали двойной
красно-зеленой флуоресцен-
цией (рис. 4). После оттаи-
вания ККН, замороженных в
бессывороточных криоза-
щитных средах, наибольшее
количество клеток с двойной
флуоресценцией в пробе с
5% ДМСО составило 70%, а
в остальных пробах – 45%.
Клетки коры надпочеч-
ников, криоконсервированные
в сывороткосодержащих сре-
дах с концентрациями ДМСО
5 и 7%, содержали около 60%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
К 5 7 10 15 5+ЭТС 7+ЭТС 10+ЭТС 15+ЭТС
*
# #
Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, %
Ко
ли
че
ст
во
к
ле
то
к,
%
C
el
l n
um
be
r,
%
5+FBS 7+FBS 10+FBS 15+FBS
Рис. 4. Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных и
сывороткосодержащих средах с разной концентрацией ДМСО на флуорес-
ценцию ККН, окрашенных JC-1 непосредственно после оттаивания; К –
контроль; * – различия достоверны по сравнению с остальными данными; # –
отличие достоверно относительно такой же концентрации ДМСО в бессыворо-
точной криозащитной среде, р < 0,05.
Fig. 4. Effect of cryopreservation conditions in serum-free and serum containing
media with different DMSO concentrations on fluorescence of ACCs stained with
JC-1 immediately after thawing; K – control. * – the difference is significant as
compared to other data; # – the difference is significant as compared to the same
DMSO concentration in serum-free cryoprotective medium, p < 0.05.
На основе полученных дан-
ных можно заключить, что
после криоконсервирования
ККН наблюдалось увеличе-
ние количества клеток с поля-
ризованными митохондрия-
ми, содержащих j-агрегаты.
Известно, что поврежде-
ния клеток, возникшие вслед-
ствие замораживания-отогре-
ва, могут иметь обратимый
характер. Репарация клеточ-
ных дефектов может происхо-
дить при возвращении клеток
в физиологические условия
[1]. В связи с этим ККН после
замораживания-отогрева
культивировали 24 ч и окра-
шивали JC-1. Наибольшее
количество j-агрегат-содержа-
щих клеток (40%) наблюдали
в бессывороточной среде с
7% ДМСО (рис. 6). В осталь-
ных случаях количество
таких клеток колебалось в
пределах 12–20% (минималь-
ное для среды с 10%, макси-
мальное – с 5% ДМСО).
412 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
После культивирования
замороженных-отогретых в
сывороткосодержащих крио-
защитных средах с иссле-
дуемыми концентрациями
ДМСО количество ККН с
j-агрегатами достоверно не
отличалось от контроля и дос-
тигало 5% от их общего коли-
чества.
На основании результатов,
полученных при изучении
токсичности криопротекторов
до замораживания, можно за-
ключить, что при использо-
вании концентрации ДМСО
свыше 10% уменьшается
сохранность ККН.
После замораживания-
отогрева снижается сохран-
ность и жизнеспособность
ККН по сравнению с нативны-
0
1
2
3
4
5
6
7
К 5 7 10 15 5+ЭТС 7+ЭТС 10+ЭТС 15+ЭТС
*
*
*
* * * *
Рис. 5. Коэффициент двойной флуоресценции. К – контроль; * – отличие
достоверно относительно контроля, р < 0,05.
Fig. 5. Coefficient of double fluorescence; K – control; * – the difference is
significant as compared to the control, p < 0.05.
Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, %
Ко
эф
ф
иц
ие
нт
д
во
йн
ой
ф
лу
ре
сц
ен
ци
и
D
ua
l f
lu
or
es
ce
nc
e
co
ef
fic
ie
nt
5+FBS 7+FBS 10+FBS 15+FBS
ми образцами до 50–70%. Необходимо отметить
положительное влияние присутствия сыворотки в
составе криозащитных сред на жизнеспособность
ККН. Этот факт, возможно, объясняется способ-
ностью сыворотки компенсировать осмотическое
давление, изменяющееся в процессе заморажи-
вания-отогрева клеточной суспензии. В литературе
Adrenal cortex cell suspension cryopreserved in
serum-enriched media with 5 and 7% DMSO con-
centration contained about 60% of cells with dual
fluorescence; in the case of 10% DMSO it was 43%,
and 50% were observed in the suspesion cryopreserved
in the medium with 15% DMSO.
The coefficient of dual fluorescence for fresh ACC
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
К 5 7 10 15 5+ЭТС 7+ЭТС 10+ЭТС 15+ЭТС
5+FBS 7+FBS 10+FBS 15+FBS
Концентрация ДМСО, % DMSO concentration, %
Ко
эф
ф
иц
ие
нт
д
во
йн
ой
ф
лу
ре
сц
ен
ци
и
D
ua
l f
lu
or
es
ce
nc
e
co
ef
fic
ie
nt
Рис. 6. Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сыворотко-
содержащих и криозащитных средах с разной концентрацией криопротектора на
формирование j-агрегатов в ККН после краткосрочного культивирования; К –
контроль; * – отличие достоверно относительно контроля, р < 0,05.
Fig. 6. Effect of cryopreservation conditions in serum-free, serum containing and
cryoprotective media with different concentration of cryoprotectant on j-aggregates
formation on ACCs after short-term culturing; C – control; * – the difference is
significant if compared to the control, p < 0.05.
suspension was 1, and in the
cells cryopreserved in serum-
free medium with 5% DMSO
it made 5 (Fig. 5), in other
cryoprotective media Cdf it
was about 3, exept serum-
enriched medium with 15%
DMSO, where it was 1.5.
Thus we may conclude that
freeze-thawing of ACCs re-
sulted in rised number of cells
with polarized mitochondria
comprising j-aggregates.
It is known the cell dama-
ges appearing after freeze-
thawing may have a reversible
character. Reparation of cell
defects may occur during cell
transfer to physiological con-
ditions [1]. For this aim we
cultured ACCs after freeze-
thawing for 24 hrs and then
stained with JC-1. The high-
est number (40%) of cells
containing j-aggregates was
413 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
observed in serum-free medium with 7% DMSO
(Fig. 6). In other cases their number varied within 12–
20% (minimal for the medium with 10%, maximal for
the one with 5% DMSO).
After culturing of frozen-thawed cells in serum-
enriched cryoprotective media with the investigated
DMSO concentrations the number of ACCs with j-ag-
gregates did not significantly differ from the control
and reached 5% of their total number.
The results obtained during the studying of cryopro-
tectant toxicity prior to freezing attest to the fact that
ACC survival decreases at DMSO concentration over
10%.
After freeze-thawing the ACC survival and viability
decrease down to 50–70% as compared to the non-
frozen-thawed samples. A positive effect of serum
presence in cryoprotective media on ACC viability in
should be noted. This fact could be explained by pro-
bable ability of serum to compensate osmotic pressure
variations during freeze-thawing of cell suspension.
The effect of serum adding to cryoprotective medium
is reported as controversial [8, 19]. Earlier we have
shown [6] a high viability and survival of a primary
culture of newborn piglet adrenal cells after freeze-
thawing in cryoprotective media enriched with FBS.
Because steroidogenesis in ACCs depends on the
mitochondria membrane potential ∆ψm [11, 15], we
assessed it by staining with fluorescent dye JC-1. We
established that after cryopreservation in all the studied
cryoprotective media a higher content of ACC with
j-aggregates is observed if compared with fresh sus-
pension. The highest content (72%) was observed after
cryopreservation in serum-free medium with 5%
DMSO. Probably it is associated with stimulation effect
of DMSO in this concentration on activity of adenylate
cyclase and secretion of steroid hormones [3, 4]. The
increase of ACC with j-aggregates content indirectly
confirms the data for activation of steroid hormones
basal secretion after cryopreservation [7].
After the day of culturing the number of cells
containing j-aggregates did not change in the case if
ACCs were frozen-thawed in serum-enriched medium
and does not differ from the control values, whereas
in the case of serum-free medium their number remains
increased. We believe that this phenomenon is of
negative nature therefore serum-enriched cryopro-
tective media enabling to neutralize this effect are more
preferable for ACC cryopreservation.
Conclusions
1. The most expressed cytotoxic effect on survival
index during incubation in cryoprotective media was
manifested when using serum-free medium with
DMSO concentration of 15%, and the lowest effect
эффект добавления сыворотки в криозащитную
среду описан противоречиво [8, 19], однако в ра-
боте [6] также показана высокая жизнеспособность
и сохранность культуры клеток надпочечников
новорожденных поросят при криоконсервировании
первичной в криозащитных средах с добавлением
ЭТС.
Поскольку стероидогенез в ККН зависит от
мембранного потенциала митохондрий ∆ψм [11, 15],
мы оценивали его с помощью окрашивания флуо-
ресцентным красителем JC-1. Установлено, что
после криоконсервирования во всех изученных
криозащитных средах в ККН образуется большее
количество клеток с j-агрегатами по сравнению со
свежевыделенными клетками. Наибольшее их
количество (72%) наблюдалось после криоконсер-
вирования в бессывороточной среде с 5% ДМСО.
Возможно, это связано со стимулирующим дейст-
вием ДМСО в данной концентрации на активность
аденилатциклазы и секрецию стероидных гормо-
нов [3, 4]. Увеличение количества клеток с j-агре-
гатами в ККН косвенно подтверждает данные об
активации базальной секреции стероидных гормо-
нов после криоконсервирования [7].
После культивирования в течение 24 ч количест-
во j-агрегат-содержащих ККН, замороженных в
сывороткосодержащих криозащитных средах, не
отличается от контрольных значений, тогда как
после криоконсервирования ККН в бессыворо-
точных средах сохраняется повышенное количест-
во клеток с j-агрегатами. По нашему мнению, такое
явление носит негативный характер, поэтому для
криоконсервирования ККН более предпочтительны
сывороткосодержащие криозащитные среды, поз-
воляющие нивелировать это влияние.
Выводы
1. Наиболее выраженный цитотоксический эф-
фект по показателю сохранности при инкубации в
криозащитных средах оказала бессывороточная
среда с концентрацией ДМСО 15%, а наименее –
сывороткосодержащие среды с концентрациями
ДМСО 7 и 10 %.
2. Наилучшими показателями жизнеспособ-
ности и сохранности ККН в изученных условиях
криоконсервирования обладала сывороткосодер-
жащая среда с концентрацией ДМСО 7%.
3. Количество ККН, содержащих j-агрегаты,
увеличивалось после замораживания-отогрева во
всех криозащитных средах и сохранялось после
краткосрочного культивирования ККН, заморожен-
ных-отогретых в бессывороточных средах. При
этом наиболее выраженный эффект наблюдался в
средах с концентрациями ДМСО 5 и 7%.
414 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
was observed in serum-enriched media with 7 or 10%
DMSO concentrations.
2. Serum-enriched medium with 7% DMSO con-
centration provided the highest indices of ACC viability
and survival in the studied conditions.
3. Number of ACCs containing j-aggregates increa-
sed after freeze-thawing in all the cryoprotective media
and was kept after short-term culturing of ACCs fro-
zen-thawed in serum-free media. Herewith, the most
pronounced effect was observed in the media with 5
and 7% DMSO concentrations.
Литература
Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология.– Киев: Наук.
думка, 1994.– 432 с.
Бондаренко Т.П., Самченко И.И., Божок Г.А., Алабедаль-
карим Н.М. Гормонсекретирующая способность криокон-
сервированной органной культуры надпочечников
новорожденных поросят in vivo и in vitro // Проблеми
медичної науки та освіти.– 2002.– № 3 – С. 35–37.
Грищенко В.І., Бондаренко Т.П., Легач Є.І., та ін.
Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування
органної культури наднирників новонароджених поросят
в лікуванні недостатності наднирників: Метод. реко-
мендації – Харків, 2000.– 12 с.
Грищенко В.И., Чуйко В.А., Пушкарь М.С. Криоконсер-
вация тканей и клеток эндокринных органов.– Киев:
Наук. думка, 1993.– 244 с.
Дудецкая Г.В., Гурина Т.М., Бондаренко Т.П. Изучение
возможности криоконсервирования клеток надпочеч-
ников крыс // Проблемы криобиологии.– 2010.– Т. 20, №4.–
С. 379–387.
Сидоренко О.С., Божок Г.А., Легач Е.И. и др. Изучение
возможности получения и криоконсервирования пер-
вичной культуры клеток надпочечников новорожденных
поросят // Проблемы криобиологии.– 2011.– Т. 21, №1.–
С. 58–67.
Устиченко В.Д. Функціональні властивості надниркових
залоз новонароджених поросят при дії різних режимів
заморожування: Автореф. дис. … канд. біол. наук.–
Харків, 2006.– 20 с.
Brockbank K.G., Heacox A.E., Schenke–Layland K. Guidan-
ce for removal of fetal bovine serum from cryopreserved
heart valve processing // Cell Tissues Organs.– 2011.–
Vol. 193, N4.– Р. 264–273.
Cossarizza A., Baccarani-Contri M., Kalashnikova G. et al.
A new method for the cytofluorimetric analysis of mitochond-
rial membrane potential using the J-aggregate forming lipophilic
cation 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3' tetraethylbenzimidazolyl-
carbocyanine iodide (JC-1) // Biochem. Biophys. Res. Com-
mun.– 1993.– Vol. 197, N1.– Р. 40–45.
Hales D.B., Allen J.A., Shankara T. Mitochondrial function in
Leydig cell steroidogenesis. // Ann. N.Y. Acad. Sci.– 2005.–
Vol. 1061.– P. 120–134.
Dunn J.C., Chu Y., Qin H.H., Zupekan T. Transplantation of
adrenal cortical progenitor cells enriched by Nile red // J. Surg.
Res.– 2009.– Vol. 156, N2.– Р. 317–324.
Jefcoate C. High-flux mitochondrial cholesterol trafficking, a
specialized function of the adrenal cortex // J. Clin. Invest.–
2002.– Vol. 110, N7.– P. 881–890.
King S.R., Liu Z., Soh J. et al. Effects of disruption of the
mitochondrial electrochemical gradient on steroidogenesis and
the Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) protein // J. Steroid
Biochem. Mol. Biol.– 1999.– Vol. 69, N1–6.– Р.143–54.
Nuydens R., Novalbos J., Dispersyn G. et al. A rapid method
for the evaluation of compounds with mitochondria-protective
properties // J. Neurosci Methods.– 1999.– Vol. 92, N1–2.–
Р. 153–159.
Perry S.W., Norman J.P., Barbieri J. et al. Mitochondrial
membrane potential probes and the proton gradient: a practical
usage guide // BioTechniques.– Vol. 50, N2.– Р. 98–115.
Smiley S. T. Reers M., Mottola-Hartshorn C. et al. Intracellular
heterogeneity in mitochondrial membrane potential revealed
by a J-aggregate forming lipophilic cation JC–1 // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA.– 1991.– Vol. 88 – Р. 3671–3675.
Wilding М., Dale B., Marino M. et al. Mitochondrial aggregation
patterns and activity in human oocytes and preimplantation
embryos // Hum. Reprod.– 2001.– Vol.16, N5.– Р. 909–917.
Woollacott A.J., Simpson P.B. High throughput fluorescence
assays for the measurement of mitochondrial activity in intact
human neuroblastoma cells // J. Biomol. Screen.– 2001.– Vol. 6,
N6.– Р. 413–420.
References
Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology.– Kiev: Naukova
Dumka, 1994.– 432 p.
Bondarenko T.P., Samchenko I.I., Bozhok G.A., Alabedal-
karim N.M. Hormone-secreting ability of cryopreserved organ
culture of newly born piglet adrenal glands in vivo and in
vitro // Problems of Medical Science and Education.– 2002.–
N3.– P. 35–37.
Grischenko V.I., Bondarenko T.P., Legach E.I. et al. Procure-
ment, cryopreservation and clinical use of organ culture of
newly born piglet adrenal glands in treatment of adrenal
insufficiency: Methodical recommendations.– Kharkiv, 2000.–
12 p.
Grischenko V.I., Chuyko V.A., Pushkar M.S. Cryopreser-
vation of endocrine organ cells and tissues.– Kiev: Naukova
Dumka, 1993.– 244 p.
Dudetskaya G.V., Gurina T.M., Bondarenko T.P. Study of
possibility of rat adrenal gland cells cryopreservation // Vestnik
of V.N. Karazin Kharkiv National University. Series: Biology.–
2010.– Vol. 20, N4.– P. 379–387.
Sidorenko O.S., Bozhok G.A., Legach E.I. et al. Study of
possibility to obtain and cryopreserve adrenal cell primary
culture of newly born piglets // Problems of Cryobiology.–
2011.– Vol. 21, N1.– P. 58–67.
Ustichenko V.D. Functional properties of newly born piglet
adrenal glands at different freezing regimens: Author's Abst-
ract of the Thesis of Candidate of Biological Sciences.– Khar-
kiv, 2006.– 20 p.
Brockbank K.G., Heacox A.E., Schenke–Layland K. Guidan-
ce for removal of fetal bovine serum from cryopreserved
heart valve processing // Cell Tissues Organs.– 2011.–
Vol. 193, N4.– Р. 264–273.
Cossarizza A., Baccarani-Contri M., Kalashnikova G. et al.
A new method for the cytofluorimetric analysis of mitochond-
rial membrane potential using the J-aggregate forming lipophilic
cation 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3' tetraethylbenzimidazolyl-
carbocyanine iodide (JC-1) // Biochem. Biophys. Res. Com-
mun.– 1993.– Vol. 197, N1.– Р. 40–45.
Hales D.B., Allen J.A., Shankara T. Mitochondrial function in
Leydig cell steroidogenesis. // Ann. N.Y. Acad. Sci.– 2005.–
Vol. 1061.– P. 120–134.
Dunn J.C., Chu Y., Qin H.H., Zupekan T. Transplantation of
adrenal cortical progenitor cells enriched by Nile red // J. Surg.
Res.– 2009.– Vol. 156, N2.– Р. 317–324.
Jefcoate C. High-flux mitochondrial cholesterol trafficking, a
specialized function of the adrenal cortex // J. Clin. Invest.–
2002.– Vol. 110, N7.– P. 881–890.
King S.R., Liu Z., Soh J. et al. Effects of disruption of the
mitochondrial electrochemical gradient on steroidogenesis and
the Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) protein // J. Steroid
Biochem. Mol. Biol.– 1999.– Vol. 69, N1–6.– Р. 143–54.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
415 problems
of cryobiology
Vol. 21, 2011, №4
проблемы
криобиологии
Т. 21, 2011, №4
Zhao J., Hao H.N., Thomas R.L. et al. An efficient method
for the cryopreservation of fetal human liver hematopoeitic
progenitor cells // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– Р. 212–
118.
Поступила 04.10.2011
Рецензент А.Ю. Сомов
Nuydens R., Novalbos J., Dispersyn G. et al. A rapid method
for the evaluation of compounds with mitochondria-protective
properties // J. Neurosci Methods.– 1999.– Vol. 92, N1–2.–
Р. 153–159.
Perry S.W., Norman J.P., Barbieri J. et al. Mitochondrial mem-
brane potential probes and the proton gradient: a practical
usage guide // BioTechniques.– Vol. 50, N2.– Р. 98–115.
Smiley S. T. Reers M., Mottola-Hartshorn C. et al. Intracellular
heterogeneity in mitochondrial membrane potential revealed
by a J-aggregate forming lipophilic cation JC–1 // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA.– 1991.– Vol. 88 – Р. 3671–3675.
Wilding М., Dale B., Marino M. et al. Mitochondrial aggregation
patterns and activity in human oocytes and preimplantation
embryos // Hum. Reprod.– 2001.– Vol.16, N5.– Р. 909–917.
Woollacott A.J., Simpson P.B. High throughput fluorescence
assays for the measurement of mitochondrial activity in intact
human neuroblastoma cells // J. Biomol. Screen.– 2001.– Vol. 6,
N6.– Р. 413–420.
Zhao J., Hao H.N., Thomas R.L. et al. An efficient method
for the cryopreservation of fetal human liver hematopoeitic
progenitor cells // Stem Cells.– 2001.– Vol. 19, N3.– Р. 212–
118.
Accepted 04.10.2011
19. 14.
15.
16.
17.
18.
19.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68463 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T17:38:24Z |
| publishDate | 2011 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Юрчук, Т.А. Божок, Г.А. Боровой, И.А. Гурина, Т.М. Зубов, П.М. Бондаренко, Т.П. Малюкин, Ю.В. 2014-09-24T11:41:25Z 2014-09-24T11:41:25Z 2011 Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс / Т.А. Юрчук, Г.А. Божок, И.А. Боровой, Т.М. Гурина, П.М. Зубов, Т.П. Бондаренко, Ю.В. Малюкин // Проблемы криобиологии. — 2011. — Т. 21, № 4. — С. 406-415. — Бібліогр.: 19 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68463 577.366:57.043 Отмечено, что одним из необходимых условий для осуществления стероидогенной функции клетками коры надпочечников (ККН) является наличие потенциала на мембране митохондрий (Δψm). Для его оценки часто используется катионный краситель JC-1, который способен образовывать j-агрегаты в митохондрии при наличии потенциала на ее мембране. Проведена оценка этой способности в ККН крыс после замораживания-отогрева в бессывороточных и сывороткосодержащих криозащитных средах в концентрационном ряду диметилсульфоксида (ДМСО). Установлено, что количество ККН, содержащих j-агрегаты, увеличивалось во всех криозащитных средах после замораживания-отогрева. Данный эффект сохранялся после краткосрочного культивирования в течение 24 ч только в ККН, замороженных-отогретых в бессывороточных криозащитных средах, и был наиболее выраженным в средах с концентрациями ДМСО 5 и 7 %. ККН, криоконсервированные в сывороткосодержащих средах, по количеству клеток с j-агрегатами не отличались от нативных. Однією з необхідних умов для здійснення стероїдогенної функції клітинами кори наднирників (ККН) є наявність потенціалу на мембрані мітохондрій (Δψm). Для його оцінки часто використовується катіонний барвник JC-1, який здатний створювати j-агрегати в мітохондрії при наявності потенціалу на її мембрані. У нашій роботі ми оцінювали цю здатність у ККН щурів після заморожуваннявідігрівання у кріозахисних середовищах з вмістом сироватки та без неї в концентраційному ряду ДМСО. Встановлено, що кількість ККН, які містять j-агрегати, збільшувалась після заморожування-відігрівання ККН у всіх кріозахисних середовищах. Даний ефект зберігався після короткострокового культивування протягом 24 годин тільки в ККН, заморожених-відігрітих у кріозахисних середовищах без сироватки і був найбільш вираженим у середовищах з концентраціями ДМСО 5 і 7%. Клітини кори наднирників, кріоконсервовані в середовищах з сироваткою, за кількістю клітин з j-агрегатами не відрізнялися від нативних. One of necessary conditions to perform steroidogenesis by adrenal cortex cells (ACC) is the presence of the potential on mitochondrial membrane (Δψm). To assess it the cationic dye JC-1 capable of forming j-aggregates in mitochondrion with the presence of a potential on its membrane is frequently used. In this research we estimated this ability in rat ACC after freeze-thawing in serum-free and serum-enriched cryoprotective media in DMSO concentration row. It has been established that the number of ACC containing j-aggregates increased after freeze-thawing in all cryoprotective media. This effect was kept after short-term culturing during 24 hrs only in ACC, frozen-thawed in serum-free cryoprotective media and was the most manifested in the media with 5 and 7% DMSO. Adrenal cortex cells cryopreserved in serum-enriched media did not differ from native cells by the number of cells with j-aggregates. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс fect of Cryopreservation in Serum-Free and Serum-Enriched Cryoprotective Media on Formation of J-Aggregates in Rat Adrenal Cortex Cells Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс Юрчук, Т.А. Божок, Г.А. Боровой, И.А. Гурина, Т.М. Зубов, П.М. Бондаренко, Т.П. Малюкин, Ю.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| title_alt | fect of Cryopreservation in Serum-Free and Serum-Enriched Cryoprotective Media on Formation of J-Aggregates in Rat Adrenal Cortex Cells |
| title_full | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| title_fullStr | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| title_full_unstemmed | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| title_short | Влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| title_sort | влияние условий криоконсервирования в бессывороточных, сывороткосодержащих криозащитных средах на формирование j-агрегатов в клетках коры надпочечников крыс |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68463 |
| work_keys_str_mv | AT ûrčukta vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT božokga vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT borovoiia vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT gurinatm vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT zubovpm vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT bondarenkotp vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT malûkinûv vliânieusloviikriokonservirovaniâvbessyvorotočnyhsyvorotkosoderžaŝihkriozaŝitnyhsredahnaformirovaniejagregatovvkletkahkorynadpočečnikovkrys AT ûrčukta fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT božokga fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT borovoiia fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT gurinatm fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT zubovpm fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT bondarenkotp fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells AT malûkinûv fectofcryopreservationinserumfreeandserumenrichedcryoprotectivemediaonformationofjaggregatesinratadrenalcortexcells |