Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер
Отмечено, что криоконсервирование клеток, инкапсулированных в альгинатные микросферы, является одним из актуальных вопросов тканевой инженерии. Изучено влияние времени экспозиции с мультикомпонентным раствором криопротекторов ДЭПС-1 (10 % ДМСО, 20 % ЭГ, 20 % 1,2-ПД и 0,5 М сахарозы) на жизнеспособно...
Gespeichert in:
| Veröffentlicht in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Datum: | 2012 |
| Hauptverfasser: | , , , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russisch |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68474 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859815860874510336 |
|---|---|
| author | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Петренко, А.Ю. |
| author_facet | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Петренко, А.Ю. |
| citation_txt | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Отмечено, что криоконсервирование клеток, инкапсулированных в альгинатные микросферы, является одним из актуальных вопросов тканевой инженерии. Изучено влияние времени экспозиции с мультикомпонентным раствором криопротекторов ДЭПС-1 (10 % ДМСО, 20 % ЭГ, 20 % 1,2-ПД и 0,5 М сахарозы) на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток (МСК) после витрификации в составе альгинатных микросфер. Показано, что использование мультикомпонентного раствора криопротеторов и ступенчатой экспозиции позволяет проводить успешное криоконсервирование МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы методом витрификации. Особенностью витрификации МСК в составе микросфер по сравнению с клетками в суспензии является более продолжительная экспозиция в растворе криопротекторов.
Кріоконсервування клітин, інкапсульованих в альгінатні мікросфери, є одним з актуальних питань тканинної інженерії. У представленій роботі вивчався вплив часу експозиції з мультикомпонентним розчином кріопротекторів ДЕПС-1 (10% ДМСО, 20% ЕГ, 20% 1,2-ПД і 0,5 M сахарози) на життєздатність і метаболічну активність мезенхімальних стромальних клітин (МСК) після вітрифікації в складі альгінатних мікросфер. Було показано, що використання мультикомпонентного розчину кріопротеторів та ступінчатої експозиції дозволяє проводити успішне кріоконсервування методом вітріфікації МСК, інкапсульованих в альгінатні мікросфери. Особливістю вітрифікації МСК у складі мікросфер у порівнянні з клітинами у суспензії є більш триваліша експозиція у розчині кріопротекторів.
Cryopreservation of cells encapsulated in alginate microbeads is one of the important issues of tissue engineering. The present study was directed on the estimation of the effect caused by of duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells (MSCs) exposure in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% DMSO, 20% EG, 20% 1,2-PD and 0.5 M sucrose) on survival and metabolic activity after vitrification and rewarming. It was shown using of multicomponent cryoprotective solution and stepwise exposure allowed to achieve successful cryopreservation by means of vitrofication of MSCs encapsulated in alginate microspheres. The main difference between vitrification of MSCs encapsulated in microspheres vs. single cells was the longer exposure with CPA.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:21:41Z |
| format | Article |
| fulltext |
14
Инкапсуляция в альгинатные микросферы
позволяет обеспечить надежную иммобилизацию
и иммуноизоляцию клеток при трансплантации, а
также обмен веществ между клетками и средой
[4, 16, 21]. Одним из перспективных объектов
инкапсуляции в альгинатные микросферические
носители являются мезенхимальные стромальные
клетки (МСК) человека, что обусловлено их высо-
кой пролиферативной активностью, мультилиней-
ным дифференцировочным потенциалом и низкой
иммуногенностью [3, 5, 12, 18]. Благодаря этим
уникальным свойствам, инкапсулированные МСК
(иМСК) все чаще используются в клеточной био-
технологии, тканевой инженерии и трансплантоло-
гии [4]. Но для разработки новых и усовершенство-
Encapsulation in alginate microbeads enables to
provide a reliable immobilization and immune isolation
of cells during transplantation as well as to maintain
optimal exchange of substances between cells and
medium [4, 16, 21]. One of the prospective objects of
encapsulation into alginate microbead carriers are hu-
man mesenchymal stromal cells (MSCs), which are
characterized by a high proliferative activity, multili-
neage differentiation potential and low immunogenicity
[3, 5, 12, 18]. Due to these unique properties, encap-
sulated MSCs (eMSCs) are often used in cell biotech-
nology, tissue engineering and transplantology [4]. To
establish a low temperature bank of eMSCs it is neces-
sary to develop new or improve the existing methods
of eMSC cryopreservation.
УДК 611.018.46.085.23
В.С. ЗАЙКОВ*, Ю.А. ПЕТРЕНКО, Н.А. ТРУФАНОВА, А.И. ПРАВДЮК, А.Ю. ПЕТРЕНКО
Особенности витрификации мезенхимальных
стромальных клеток в составе альгинатных микросфер
UDC 611.018.46.085.23
V.S. ZAYKOV*, YU.A. PETRENKO, N.A. TRUFANOVA, A.I. PRAVDYUK, A.YU. PETRENKO
Vitrification of Mesenchymal Stromal Cells in Alginate Microbeads
Криоконсервирование клеток, инкапсулированных в альгинатные микросферы, является одним из актуальных вопросов
тканевой инженерии. В представленной работе изучалось влияние времени экспозиции с мультикомпонентным раствором
криопротекторов ДЭПС-1 (10% ДМСО, 20% ЭГ, 20% 1,2-ПД и 0,5 M сахарозы) на жизнеспособность и метаболическую
активность мезенхимальных стромальных клеток (МСК) после витрификации в составе альгинатных микросфер. Было показано,
что использование мультикомпонентного раствора криопротеторов и ступенчатой экспозиции позволяет проводить успешное
криоконсервирование методом витрификации МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы. Особенностью
витрификации МСК в составе микросфер по сравнению с клетками в суспензии является более продолжительная экспозиция
в растворе криопротекторов.
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки, альгинатные микросферы, витрификация, мультикомпонентный
раствор криопротекторов, ступенчатое добавление криопротекторов.
Кріоконсервування клітин, інкапсульованих в альгінатні мікросфери, є одним з актуальних питань тканинної інженерії. У
представленій роботі вивчався вплив часу експозиції з мультикомпонентним розчином кріопротекторів ДЕПС-1 (10% ДМСО,
20% ЕГ, 20% 1,2-ПД і 0,5 M сахарози) на життєздатність і метаболічну активність мезенхімальних стромальних клітин (МСК)
після вітрифікації в складі альгінатних мікросфер. Було показано, що використання мультикомпонентного розчину
кріопротеторів та ступінчатої експозиції дозволяє проводити успішне кріоконсервування методом вітріфікації МСК,
інкапсульованих в альгінатні мікросфери. Особливістю вітрифікації МСК у складі мікросфер у порівнянні з клітинами у
суспензії є більш триваліша експозиція у розчині кріопротекторів.
Ключові слова: мезенхімальні стромальні клітини, альгінатнi мікросфери, вітрифікація, мультикомпонентний розчин
кріопротекторів, ступінчасте додавання кріопротекторів.
Cryopreservation of cells encapsulated in alginate microbeads is one of the important issues of tissue engineering. The present
study was directed on the estimation of the effect caused by of duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells (MSCs)
exposure in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% DMSO, 20% EG, 20% 1,2-PD and 0.5 M sucrose) on survival
and metabolic activity after vitrification and rewarming. It was shown using of multicomponent cryoprotective solution and stepwise
exposure allowed to achieve successful cryopreservation by means of vitrofication of MSCs encapsulated in alginate microspheres.
The main difference between vitrification of MSCs encapsulated in microspheres vs. single cells was the longer exposure with CPA.
Key words: mesenchymal stromal cells, alginate microbeads, vitrification, multicomponent cryoprotective solution, step-wise
exposure.
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
zaykov.vedeney@gmail.com
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 41
35, fax: +380 57 373 3084, e-mail: zaykov.vedeney@gmail.com
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
15
вания существующих методов криоконсервиро-
вания иМСК необходимо создать банк иМСК.
Методы криоконсервирования, основанные на
медленном замораживании, направлены на то,
чтобы исключить образование внутриклеточного
льда за счет выхода воды из клетки и ее кристал-
лизацию в окружающей среде [1]. Альтернативой
медленному замораживанию являются методы,
основанные на процессе витрификации, которые
позволяют исключить внутри- и внеклеточную
кристаллизацию. Согласно G.M. Fahy [8] использо-
вание медленного замораживания для криоконсер-
вирования биологических объектов уступает ме-
тоду витрификации по показателям выживаемости
после замораживания-отогрева. Так как при мед-
ленном замораживании внеклеточная кристалли-
зация способна влиять на структуру носителя, это
может привести к гибели клеток.
В литературе достаточно широко освещены
подходы к витрификации единичных клеток [2, 6,
19, 20], а также тканей и органов [7, 9, 17]. Вместе
с тем исследования по витрификации клеток в сос-
таве тканеиженерных конструкций начали прово-
дить лишь в последнее время. Так, описаны спосо-
бы витрификации инсулинпродуцирующих клеток
линии βTC3 [15], клеток костного мозга [10] и гепа-
тоцитов [11] в составе альгинатных микросфер, а
также остеобластов в пористых носителях на ос-
нове гидроксиаппатита [13]. Вопрос о витрифика-
ции МСК в составе различных биоинженерных
конструкций, в частности инкапсулированных в
альгинатные микросферы, остается открытым.
Ранее нами были разработаны условия витри-
фикации суспензии МСК [2], которые позволили
значительно сохранить метаболическую актив-
ность клеток, способность к адгезии, пролиферации
и дифференцировке в остеогенном и адипогенном
направлениях. Метод витрификации включал два
этапа экспозиции с раствором криопротекторов
ДЭПС-1, содержащим 10% ДМСО, 20% ЭГ, 20%
1,2-ПД и 0,5 M сахарозы [2]. Однако не ясно, будут
ли эти условия обеспечивать сохранность биологи-
ческих свойств МСК после витрификации в соста-
ве альгинатных микросфер.
Цель работы – изучить влияние витрификации
с использованием мультикомпонентного раствора
криопротекторов ДЭПС-1 на сохранность и мета-
болическую активность МСК, инкапсулированных
в альгинатные микросферы.
Материалы и методы
Мезенхимальные стромальные клетки выделя-
ли из дермы взрослого человека методом эксплан-
тации кусочков кожи [3], которые получали от
взрослых доноров только с их письменного согла-
Cryopreservation methods based on slow freezing
are directed to avoid the intracellular ice formation due
to outflow of intracellular water and its following crys-
tallization outside the cell [1]. Vitrification, which allow
to exclude both intra- and extracellular crystallization
is an alternative to slow freezing. According to Fahy
[8] the application of slow freezing for cryopreserva-
tion of biological objects is inferior to vitrification by
the post-thaw survival indices. The extracellular crys-
tallization during slow freezing can affect carrier struc-
ture and may result in a cell death.
There are numerous reports on the vitrification of
single cells [2, 6, 19, 20] as well as tissues and organs
[7, 9, 17]. However, only recently there were under-
taken the investigations of the vitrification of cells within
tissue engineered constructs. The approaches for vitri-
fication of insulin-producing βTC3 cells [15], bone mar-
row cells [10] and hepatocytes within alginate micro-
beads as well as osteoblasts in hydroxyapatite porous
scaffolds have been described [13]. However, the ques-
tion of MSCs vitrification within different bioengineered
constructs, particularly encapsulated in alginate micro-
beads, remained open.
Previously we developed the protocol for the vitrifi-
cation of MSC suspension [2], which enabled to preser-
ve metabolic activity of cells, as well as its ability to
adhesion, proliferation and osteogenic and adipogenic
differentiation. The vitrification protocol included two
steps of exposure with cryoprotective solution DEPS-1,
containing 10% DMSO, 20% EG, 20% 1,2-PD and
0.5 M sucrose [2]. However, it was not clear if these
conditions would provide the preservation of biological
properties of MSCs within alginate microbeads after
vitrification and rewarming.
The aim of the research was to study the effect of
vitrification using multicomponent cryoprotective so-
lution DEPS-1 on the integrity and metabolic activity
of MSCs encapsulated in alginate microbeads.
Materials and methods
Mesenchymal stromal cells were derived from adult
human dermis by tissue explants method [3]. Tissue
fragments were obtained from adult donors only after
their written informed consent. Cells were cultured in
medium α-MEM (Sigma, USA) supplemented by 10%
fetal bovine serum (Biolot, Russia), 2 mM of L-gluta-
mine, 50 U/ml of penicillin and 50 mg/ml of streptomycin
at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity.
Cell encapsulation was performed by the method
described by A.I. Pravdyuk et al. [4]. Briefly, mesen-
chymal stromal cells of 2–3 passage after achievement
of 60–70% confluence were trypsinized by the stan-
dard method and centrifuged at 200g for 7 min. The
obtained sediment was resuspended in 1.2% purified
solution of sodium alginate (Sigma) afterwards suspen-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
16
сия. Культивирование клеток проводили в среде
α-MEM («Sigma», США), дополненной 10% эмб-
риональной сыворотки крови крупного рогатого
скота («Биолот», Россия), 2 мМ L-глютамина,
50 ед/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина
при 37°С, 5% СО2 и 95% влажности.
Инкапсуляцию клеток проводили по методике,
описанной А.И. Правдюком и соавт. [4]. Мезенхи-
мальные стромальные клетки 2–3 пассажа после
достижения 60–70% конфлуента в монослое трип-
синизировали по стандартной методике и осаждали
центрифугированием при 200g в течение 7 мин. По-
лученный осадок ресуспендировали в очищенном
1,2%-м растворе альгината натрия («Sigma»), после
чего суспензию покапельно вносили в раствор
100 мМ CaCl2 на 10 мин для полимеризации. По-
лученные иМСК отмывали физиологическим бу-
фером, содержащим 0,9% NaCl и 25 мМ HEPES, и
использовали для дальнейших экспериментов.
Для витрификации иМСК применяли метод,
описанный в [2]. В криопробирку («Nunk», США),
содержащую микросферы и 100 мкл буфера, вно-
сили 100 мкл раствора ДЭПС-1 и осуществляли
первый этап экспозиции, затем добавляли 800 мкл
ДЭПС-1 и выполняли второй этап. Экспозицию
проводили при комнатной температуре, ее продол-
жительность изменялась в зависимости от экспе-
риментальной группы. Затем образцы погружали
в жидкий азот на 30 с и выдерживали в парах азота
при температуре около –145°С в течение 5 мин,
после чего снова погружали в жидкий азот для
хранения.
Образцы отогревали на водяной бане при темпе-
ратуре 40°С. Инкапсулированные МСК отмывали
от раствора криопротекторов, помещая в раствор
0,5 М сахарозы, и затем пошагово разводили сре-
дой Игла (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН,
Россия).
Сохранность иМСК после витрификации-отог-
рева оценивали с помощью двойного окрашивания
флуоресцеиндиацетатом (ФДА) и этидиумбро-
мидом (ЭБ). Окрашенные клетки подсчитывали
с помощью флуоресцентного микроскопа («CETI»,
Великобритания), как было описано в работе [4].
Количество метаболически активных МСК в
составе микросфер после витрификации-отогрева
оценивали с помощью МТТ-теста. Для этого через
48 ч культивирования после отогрева иМСК в тече-
ние 2 ч инкубировали в среде, содержащей 5 мг/мл
МТТ. Клетки, накопившие формазан, подсчитывали
с помощью светового микроскопа («CETI»). Мета-
болическую активность определяли как отноше-
ние количества клеток, накопивших формазан,
к общему количеству клеток.
sion was introduced by drop wise manner into 100 mM
of CaCl2 solution and incubated during 10 min for poly-
merization. The derived eMSCs were washed with
physiological buffer, containing 0.9% NaCl and 25 mM
HEPES and used for further experiments.
The vitrification of eMSC was performed by the
method of Gorokhova et al. [2]. Briefly, 100 µl of
DEPS-1 solution were added into cryotubes (Nunc,
USA), containing microbeads in 100 µl of buffer. After
the first exposure stage 800 µl of DEPS-1 solution were
added and the second exposure stage was performed.
Exposure was carried-out at the room temperature; its
duration varied depending on the experimental group.
The samples were plunged into liquid nitrogen for 30 sec
and exposed in nitrogen vapors at –145°C for 5 min
and afterwards plunged into liquid nitrogen for storage.
The samples were thawed in water bath at 40°C.
Encapsulated eMSCs were washed free of cryoprotec-
tant solution by placing them into solution of 0.5 M
sucrose solution followed by stepwise dilution with
Eagle’s medium (Chumakov Institute of Poliomyelitis
and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medi-
cal Sciences, Russia).
Integrity of eMSCs after vitrification and rewarming
was evaluated by fluorescein diacetate (FDA) and
ethidium bromide (EB) double staining. The stained
samples were analyzed using fluorescent microscope
(CETI, UK) [4].
The number of metabolically active eMSCs after
vitrification-rewarming was evaluated by MTT-test.
Briefly, the rewarmed eMSCs were cultured during
after 48 hrs and thereafter incubated for 2 hrs in the
medium containing 5 mg/ml MTT. The cells accumu-
lated formazan were calculated using transmitted light
microscope (CETI). Metabolic activity was determined
as a ratio of formazan positive cells number and the
total cell number. The indices of integrity and metabolic
activity of eMSCs before vitrification served as the
control.
The statistical processing of obtained results and
the significance estimation was performed by paramet-
ric method of statistical analysis (Student’s t-criterion)
using Origin 6.7 software.
Results and discussion
Some approaches of vitrification of the cells encap-
sulated in alginate microbeads have been described pre-
viously [10, 11, 13, 15]. These approaches were usually
based on the several stages of sample exposure in
multicomponent solutions of cryoprotectants. A com-
mon trend was the stepwise increase of the cryoprotec-
tants concentration in the mixture at each stage of ex-
posure with corresponding reduction of the duration
of contact with the cryoprotectant. The main task of
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
17
Контролем служили показатели сохранности и
метаболической активности иМСК после инкапсу-
ляции.
Для статистической обработки полученных ре-
зультатов использовали пакет программ «Origin 6.7»,
для оценки достоверности полученных данных -
параметрический метод статистического анализа
(t-критерий Стьюдента).
Результаты и обсуждение
В литературе описаны некоторые подходы к вит-
рификации клеток, инкапсулированных в альгинат-
ные микросферы [10, 11, 13, 15]. Основой этих под-
ходов являются использование многокомпонент-
ных растворов криопротекторов и проведение не-
скольких этапов экспозиции образцов в криозащит-
ной среде. При этом общим является ступенчатое
увеличение концентрации криозащитной смеси на
каждом этапе экспозиции, а также соответствую-
щее уменьшение времени контакта с криопротек-
тором. Основной задачей исследователей было
определение оптимального состава раствора крио-
протекторов, а также количества этапов экспозиции
и их продолжительности.
Ранее нами были разработаны условия витри-
фикации суспензии МСК под защитой раствора
криопротекторов ДЭПС-1 [2]. Установлено, что
для успешной витрификации необходимо проводить
два этапа экспозиции клеток в растворе криопро-
текторов: на первом – в 50%-м растворе криопро-
текторов в течение 1 мин, на втором – в 100%-м
растворе 15–20 с. В результате удалось добиться
высокого уровня сохранности суспензии МСК пос-
ле витрификации-отогрева (70,6 ± 2,8% по окраши-
ванию трипановым синим).
Поскольку объектом настоящего исследования
являлись иМСК, то для их витрификации был оп-
робован метод, хорошо зарекомендовавший себя
при витрификации этих клеток в виде суспензии
[2]. Простое повторение условий данного метода
приводило к гибели МСК, заключенных в альгинат-
ные микросферы, что, возможно, связано с тем,
что времени экспозиции в криозащитном растворе,
достаточного для успешной витрификации единич-
ных клеток, не достаточно для клеток, инкапсули-
рованных в альгинатный носитель. Из этого сле-
дует, что для достижения успешной витрификации
иМСК необходимо было модифицировать данный
метод. С этой целью на основе предварительных
экспериментов были сформированы четыре экспе-
риментальные группы, отличающиеся по времени
экспозиции образцов в растворе криопротекторов
ДЭПС-1 на первом и втором этапах (таблица).
Для оценки сохранности иМСК после криокон-
сервирования проводили двойное окрашивание
ФДА/ЭБ образцов каждой группы.
researchers was to determine the optimal composition
of cryoprotectant solution as well as a number of
exposure stages and their duration.
Previously we have studied the conditions for MSC
suspensions vitrification under the protection of
DEPS-1 cryoprotective solution [2]. It was established
that successful vitrification required the performance
of two stages of cell exposure in cryoprotective solution:
at the first stage the cells were exposed to 50% cryo-
protective solution for 1 min, and at the second stage
lasted 15–20 sec in 100% solution. The use of this ap-
proach enabled to achieve high integrity level of MSCs
suspension after vitrification-rewarming (70.6 ± 2.8%
by trypan blue staining).
Since this research was performed with eMSCs,
we have chosen the method which was shown to be
effective for vitrification of these cells as the suspen-
sion [2]. Simple reproduction of the conditions required
by the mentioned method resulted in death of the MSCs
encapsulated in alginate microbeads, that could pro-
ceed from the duration of exposure in the cryoprotec-
tant solution, sufficient to achieve the successful vitri-
fication of single cells, however, insufficient for cells
encapsulated in alginate carriers. Thus, to achieve a
successful vitrification of eMSCs, the modification of
this method was needed. Based on the previous experi-
ments we formed four experimental groups, which
differed by time of samples exposure in cryoprotective
solution DEPS-1 at the 1st and 2nd stages (Table).
To evaluate the integrity of eMSCs after cryopre-
servation we performed FDA/EB double staining of
samples from each group.
It was found, that vitrification resulted in a signi-
ficant reduction of integrity of eMSCs by 29–53% de-
pending on exposure time (Fig.1). The most expressed
decrease in integrity was observed in the groups 3 and
4, where the duration of the second exposure stage
was 45 sec. In this case the integrity was 47.21 ± 1.8
and 51.25 ± 3.34%, correspondingly, which differed
Продолжительность этапов экспозиции иМСК
с раствором криопротекторов ДЭПС-1
Duration of exposure stages of eMSCs in
cryoprotective solution DEPS-1
ыпатЭ
segatS
апатэьтсоньлетижлодорП
noitarudegatS
1аппурГ
1puorG
2аппурГ
2puorG
3аппурГ
3puorG
4аппурГ
4puorG
1- патэй
СПЭД%05( - )1
egatsts1
SPED%05( - )1
с51ним2
s51nim2
с03ним2
s03nim2
с51ним2
s51nim2
с03ним2
s03nim2
2- патэй
СПЭД%001( - )1
egatsdn2
SPED%05( - )1
с03
s03
с03
s03
с54
s54
с54
s54
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
* *
* *#
#
18
Витрификация приводила к достоверному сни-
жению уровня сохранности иМСК на 29–53% в за-
висимости от времени экспозиции (рис. 1), наибо-
лее выражено снижение в группах 3 и 4, где продол-
жительность второго этапа экспозиции была 45 с.
В данном случае сохранность составляла 47,21 ±
1,8 и 51,25 ± 3,34% соответственно и достоверно
отличалась от групп 1 и 2 (71,87 ± 2,0 и 73,12 ±
1,8%). Из рис. 1 следует, что продолжительность
первого этапа несущественно влияет на уровень
сохранности, а решающее значение имеет время
экспозиции на втором этапе. Хотя значения сохран-
ности в группах 1 и 2 были выше, чем в группах 3
и 4, они были достоверно ниже уровня контроля.
При оценке метаболической активности клеток
с использованием МТТ-теста через 48 ч после вит-
рификации-отогрева наблюдалась схожая динами-
ка с результатами окрашивания ФДА/ЭБ, однако
показатели были ниже (рис. 2). Видно, что метабо-
лическая активность в группах 3 и 4 была до-
стоверно ниже, чем в группах 1 и 2, что подтверж-
дает негативное влияние продолжительного (более
30 с) контакта иМСК с раствором криопротекторов
на втором этапе экспозиции, которое наблюдалось
при окрашивании ФДА/ЭБ. Кроме того, использова-
ние МТТ-теста позволило оценить влияние времени
экспозиции клеток в растворе криопротекторов на
первом этапе, что не удавалось при оценке сохран-
ности клеток с помощью ФДА/ЭБ. Так, было от-
мечено, что экспозиция клеток в растворе ДЭПС-1
в течение 2 мин 30 с на первом этапе (группы 2 и
4) приводила к более полному сохранению мета-
болической активности иМСК после витрифика-
significantly from data of groups 1 and 2 (71.87 ± 2.0
and 73.12 ± 1.8%). Fig. 1 shows that the duration of
the first stage insignificantly affects the integrity of
cells, while the exposure time at the second stage has
a crucial effect. Although values of integrity in the
groups 1 and 2 were higher than in 3 and 4 ones, they
were significantly lower compared to the control (prior
to vitrification).
The evaluation of cell metabolic activity using MTT-
test in 48 hrs after vitrification-rewarming showed the
dynamics similar to FDA/EB staining results, however
the indices were lower (Fig. 2). The metabolic activity
in groups 3 and 4 was significantly lower than in groups
1 and 2, confirming the negative effect of continuous
(more than 30 sec) contact of eMSCs with cryoprotec-
tive solution at the second stage of exposure, found
also by FDA/EB staining. Moreover, the application
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4
*
*
*
*
Экспериментальная группа
Experimental group
С
ох
ра
нн
ос
ть
, %
In
te
gr
ity
, %
Рис. 1. Влияние времени экспозиции в растворе крио-
протекторов ДЭПС-1 на сохранность иМСК после витри-
фикации-отогрева (n = 8); * – различия достоверны (р <
0,05) по отношению к контролю до криоконсервиро-
вания; # – различия достоверны (р < 0,05) по отношению
к группам 1 и 2.
Fig. 1. Effect of exposure time in cryoprotective solution
DEPS-1 on the integrity of eMSCs after vitrification-rewar-
ming (n = 8); * – differences are significant (p < 0.05) relative
to the control prior to cryopreservation; # – differences are
significant (p < 0.05) relative to the groups 1 and 2.
Экспериментальная группа
Experimental group
М
ет
аб
ол
ич
ес
ка
я
ак
ти
вн
ос
ть
, %
M
et
ab
ol
ic
a
ct
iv
ity
, %
Рис. 2. Влияние времени экспозиции в растворе крио-
протекторов ДЭПС-1 на метаболическую активность
иМСК после витрификации-отогрева (n = 8); все приве-
денные данные достоверно отличаются друг от друга и
от уровня контроля (р < 0,05).
Fig. 1. Effect of exposure time in cryoprotectant solution
DEPS-1 on metabolic activity of eMSCs after vitrification-
rewarming (n = 8); all the presented data are significantly
different from each other and the control level (p < 0.05).
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
19
ции-отогрева, по сравнению с группами 1 и 3, где
длительность экспозиции составляла 2 мин 15 с.
Наиболее высокая метаболическая активность
клеток была достигнута в группе 2 (54,7 ± 1,9%),
наименьшая – в группе 3 (22,8 ± 1,7%), где время
экспозиции составляло 2 мин 15 с на первом этапе
и 45 с – на втором. Аналогичная динамика отме-
чалась R. Malpique и соавт. [14]: сохранность МСК,
оцененная непосредственно после замораживания-
отогрева, была значительно выше, чем через 24 ч
культивирования. Вполне естественно, что резуль-
таты, полученные с помощью МТТ-теста, являют-
ся более информативными, поскольку окрашивание
ФДА/ЭБ выявляет только клетки с нарушением
целостности плазматической мембраны, а МТТ-
тест – метаболически активные клетки.
В данной работе показано достоверное сниже-
ние как сохранности, так и метаболической актив-
ности в группах 3 и 4. Такая же зависимость была
отмечена в работе L. Kuleshova и соавт. [11]: жиз-
неспособность гепатоцитов достоверно снижалась
при продолжительном контакте с раствором крио-
протекторов на последнем этапе экспозиции. Это
указывает на то, что при длительном контакте
иМСК с раствором криопротекторов на втором
этапе проявляется токсический эффект криопро-
текторов, входящих в состав криозащитной смеси,
приводящий к гибели клеток.
Таким образом, полученные результаты свиде-
тельствуют о перспективности применения витри-
фикации для сохранения свойств МСК, инкапсу-
лированных в альгинатные микросферы.
Выводы
Показано, что иМСК, криоконсервированные
методом витрификации под защитой раствора
криопротекторов ДЭПС-1, имеют высокий уровень
сохранности и метаболической активности. Для
насыщения МСК в составе микросфер криозащит-
ным раствором ДЭПС-1 требуется более продол-
жительная экспозиция в растворе криопротекторов,
чем для клеток в суспензии. Следует полагать, что
для успешной витрификации клеток в составе бо-
лее крупных биоинженерных конструкций и фраг-
ментов тканей потребуется еще более длительная
экспозиция в растворах криопротекторов.
of MTT-test enabled to evaluate the effect of the first
stage exposure duration on the metabolic activity of
cells, which was impossible using the FDA/EB test
for assessing cell integrity. Thus, it was noted that cell
exposure in DEPS-1 for 2 min and 30 sec at the first
stage (groups 2 and 4) resulted in more effective pre-
servation of metabolic activity of eMSCs after vitri-
fication-rewarming in comparison to the groups 1 and
3, where the exposure duration made 2 min and 15 sec.
The highest metabolic activity of cells was achieved
in group 2 (54.7 ± 1.9%), the lowest one was found in
group 3 (22.8 ± 1.7%), where exposure time at the
first stage was 2 min and 15 sec and at the second one
was 45 sec. A similar dynamics was observed by Mal-
pique et al. [14], i. e. MSCs integrity evaluated imme-
diately after freeze-thawing was significantly higher
than after 24 hrs of culturing. It is obviously that the
results obtained with MTT-test are more informative
because the latter allows assessing the number of meta-
bolically active cells, while FDA/EB staining reveals
only the cells with damaged plasma membrane.
Our study showed the significant reduction both of
the integrity and metabolic activity of cells in the groups
3 and 4. Similar dependence was described by Kule-
shova et al. [11], it has been noted that hepatocytes
viability was significantly reduced after long-term con-
tact with cryoprotective solution at the last stage of
exposure. This indicates that continuous contact of
eMSCs with cryoprotectant solution at the second stage
causes a toxic effect of the cryoprotectants comprising
the solution, which could lead to death of the cells.
Thus, the obtained results confirm the vitrification
as a promising method allowing to preserve the pro-
perties of MSCs encapsulated in alginate microbeads.
Conclusions
It was shown that eMSCs cryopreserved by vitrifi-
cation under protection of cryoprotective solution
DEPS-1 had high levels of integrity and metabolic
activity. To saturate MSCs within microbeads with
cryoprotective solution DEPS-1 a longer exposure in
cryoprotective solution is required, if compared to cells
in suspension. It could be suggested that the suc-
cessful vitrification of cells within larger bioengineered
constructs and tissue fragments requires longer expo-
sure in cryoprotective solutions.
Литература
1. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низко–
температурного консервирования клеточных суспензий. –
Киев: Наукова думка, 1994. – 142 с.
2. Горохова Н.А., Петренко Ю.А., Петренко А.Ю. Выбор крио-
защитной среды для витрификации суспензии эмбрио-
нальных фибробластоподобных клеток // Проблемы крио-
биологии.– 2007. – Т. 17, №1. – С. 71–79.
References
1. Gordienko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low-tempe-
rature preservation of cell suspensions. – Kiev: Naukova Dum-
ka, 1994. – 142 p.
2. Gorokhova N.A., Petrenko Yu.A., Petrenko A.Yu. Search of
cryoprotective medium for vitrification of fetal fibroblast-like
cell suspension // Problems of Cryobiology. – 2007. – Vol. 17,
N1. – P. 71–79.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
20
3. Петренко А.Ю., Петренко Ю.А., Мазур С.П. и др. Выделе-
ние и мультилинейная дифференцировка стромальных
клеток из тканей плодов и взрослого человека // Транс-
плантологія. – 2007. – Т. 9, №1.– С.218–220.
4. Правдюк А.И., Петренко Ю.А., Волкова Н.А., Петренко А.Ю.
Свойства мезенхимальных стромальных клеток человека
при инкапсуляции в альгинатные микросферы // Биотехно-
логия. – 2010. – Т. 3, №2. – С. 62–70.
5. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells
modulate allogeneic immune cell responses // Blood. – 2005. –
Vol. 105, №4. – P. 1815–1822.
6. Cai X.Y., Chen G.A., Lian Y. et al. Cryoloop vitrification of
rabbit oocytes // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20, №7. – P. 1969–
1974.
7. de Graaf I., Draaisma A., Schoeman O. et al. Cryopreservation
of rat precision-cut liver and kidney slices by rapid freezing and
vitrification // Cryobiology. – 2007. – Vol. 54, №1. – P. 1–12.
8. Fahy G.M. Vitrification. Emerging applications and engineering
contributions. // Low temperature biotechnology. – 1988. –
Vol. 10, №6 – P. 113–146.
9. Fahy G.M., Wowk B., Wu J.et al. Cryopreservation of organs
by vitrification: perspectives and recent advances // Cryobiolo-
gy. – 2004. – Vol. 48, №2. – P. 78–157.
10. Gajadhar B., Kong L., Raquel M. et al. Cryopreservation of
alginate-fibrin beads involving bone marrow derived mesen-
chymal stromal cells by vitrification // Biomaterials. – 2009. –
Vol. 30, №2. – P. 336–343.
11. Kuleshova L., Wang W., Wu Y. et al. Vitrification of encap-
sulated hepatocytes with reduced cooling and warming rates //
CryoLetters. – 2004. – Vol. 25, №4. – P. 154–167.
12. Lee H., Huang G., Chiang H. et al. Multipotential mesenchymal
stem cells from femoral bone marrow near the site of
osteonecrosis // Stem Cells. – 2003. – Vol. 21, №2. – P. 190–199.
13. Liu B.L., McGrath J., McCabe L. et al. Response of murine
osteoblasts and porous hydroxyapatite scaffolds to two-step,
slow freezing and vitrification processes // Cell Preservation
Technology. – 2002. – Vol. 1, №1. – P. 33–44.
14. Malpique R., Ehrhart F., Katsen-Globa F. et al. Cryopreser-
vation of adherent cells: strategies to improve cell viability and
function after thawing // Tissue Engineering. – 2009. – Vol. 3,
№14. – P. 150–165.
15. Mukherjee N., Chen Z., Sambanis A. et al. Effects of cryopre-
servation on cell viability and insulin secretion in a model tissue-
engineered pancreatic substitute (TEPS) // Cell Transplant. –
2005. – Vol. 14, № 7. – P. 449–456.
16. Murua A., Portero A., Orive G., et al. Cell microencapsulation
technology: towards clinical application // J. Control. Rel. –
2008. – Vol. 132, №4. – P. 76–83.
17. PichuginY., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hip-
pocampal slices by vitrification // Cryobiology. – 2006. – Vol. 52,
№3. – P. 228–239.
18. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage po-
tential of adult human mesenchymal stem cells // Science. –
1999. – Vol. 284, №5411. – P. 143–147.
19. Reubinoff B.E., Pera M.E., Vajta G. et al. Effective cryopre-
servation of human embryonic stem cells by the open pulled
straw vitrification method // Hum. Reprod. – 2001. – Vol.16,
№10. – P. 2187–2194.
20. Tao L., Canquan Z., Caixia L., et al. Bulk vitrification of human
embryonic stem cells // Human Reproduction. – 2008 – Vol. 23,
№2. – P. 358–364.
21. Zimmermann H., Shirley S. G., Zimmerman U. Alginate-
based encapsulation of cells: past, present and future // Cur.
Diabetes Rep. – 2007. – Vol. 7, №4. – P. 314–320.
Поступила 21.02.1012
3. Petrenko A.Yu., Petrenko Yu.A., Mazur S.P. et al. Isolation and
multilinear differentiation of stromal cells from fetal and adult
human tissues // Transplantologiya. – 2007. – Vol. 9, N1. –
P. 218–220.
4. Pravdyuk A.I., Petrenko Yu.A., Volkova N.A., Petrenko A.Yu.
Properties of human mesenchymal stromal cells at encapsu-
lation in alginate microspheres // Biotechnology. – 2010. – Vol. 3,
N2. – P. 62–70.
5. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells
modulate allogeneic immune cell responses // Blood. – 2005. –
Vol. 105, N4. – P. 1815–1822.
6. Cai X.Y., Chen G.A., Lian Y. et al. Cryoloop vitrification of
rabbit oocytes // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20, N7. – P. 1969–
1974.
7. de Graaf I., Draaisma A., Schoeman O. et al. Cryopreservation
of rat precision-cut liver and kidney slices by rapid freezing and
vitrification // Cryobiology. – 2007. – Vol. 54, N1. – P. 1–12.
8. Fahy G.M. Vitrification. Emerging applications and engineering
contributions. // Low temperature biotechnology. – 1988. –
Vol. 10, N6 – P. 113–146.
9. Fahy G.M., Wowk B., Wu J.et al. Cryopreservation of organs
by vitrification: perspectives and recent advances // Cryobiolo-
gy. – 2004. – Vol. 48, N2. – P. 78–157.
10. Gajadhar B., Kong L., Raquel M. et al. Cryopreservation of
alginate-fibrin beads involving bone marrow derived mesen-
chymal stromal cells by vitrification // Biomaterials. – 2009. –
Vol. 30, N2 – P. 336–343.
11. Kuleshova L., Wang W., Wu Y. et al. Vitrification of encap-
sulated hepatocytes with reduced cooling and warming rates //
CryoLetters. – 2004. – Vol. 25, N4. – P. 154–167.
12. Lee H., Huang G., Chiang H. et al. Multipotential mesenchymal
stem cells from femoral bone marrow near the site of
osteonecrosis // Stem Cells. – 2003. – Vol. 21, N2. – P. 190–199.
13. Liu B.L., McGrath J., McCabe L. et al. Response of murine
osteoblasts and porous hydroxyapatite scaffolds to two-step,
slow freezing and vitrification processes // Cell Preservation
Technology. – 2002. – Vol. 1, N1. – P. 33–44.
14. Malpique R., Ehrhart F., Katsen-Globa F. et al. Cryopreser-
vation of adherent cells: strategies to improve cell viability and
function after thawing // Tissue Engineering. – 2009. – Vol. 3,
N14. – P. 150–165.
15. Mukherjee N., Chen Z., Sambanis A. et al. Effects of cryopre-
servation on cell viability and insulin secretion in a model tissue-
engineered pancreatic substitute (TEPS) // Cell Transplant. –
2005. – Vol. 14, N7. – P. 449–456.
16. Murua A., Portero A., Orive G., et al. Cell microencapsulation
technology: towards clinical application // J. Control. Rel. –
2008. – Vol. 132, N4. – P. 76 – 83.
17. PichuginY., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hip-
pocampal slices by vitrification // Cryobiology. – 2006. – Vol. 52,
N3. – P. 228–239.
18. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage po-
tential of adult human mesenchymal stem cells // Science. –
1999. – Vol. 284, N5411. – P. 143–147.
19. Reubinoff B.E., Pera M.E., Vajta G. et al. Effective cryopre-
servation of human embryonic stem cells by the open pulled
straw vitrification method // Hum. Reprod. – 2001. – Vol.16,
N10. – P. 2187–2194.
20. Tao L., Canquan Z., Caixia L., et al. Bulk vitrification of human
embryonic stem cells // Human Reproduction. – 2008 – Vol. 23,
N2. – P. 358–364.
21. Zimmermann H., Shirley S. G., Zimmerman U. Alginate-
based encapsulation of cells: past, present and future // Cur.
Diabetes Rep. – 2007. – Vol. 7, N4. – P. 314–320.
Accepted 21.02.1012
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №1
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №1
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68474 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:21:41Z |
| publishDate | 2012 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Петренко, А.Ю. 2014-09-25T04:44:45Z 2014-09-25T04:44:45Z 2012 Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер / В.С. Зайков, Ю.А. Петренко, Н.А. Труфанова, А.И. Правдюк, А.Ю. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 1. — С. 14-20. — Бібліогр.: 21 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68474 611.018.46.085.23 Отмечено, что криоконсервирование клеток, инкапсулированных в альгинатные микросферы, является одним из актуальных вопросов тканевой инженерии. Изучено влияние времени экспозиции с мультикомпонентным раствором криопротекторов ДЭПС-1 (10 % ДМСО, 20 % ЭГ, 20 % 1,2-ПД и 0,5 М сахарозы) на жизнеспособность и метаболическую активность мезенхимальных стромальных клеток (МСК) после витрификации в составе альгинатных микросфер. Показано, что использование мультикомпонентного раствора криопротеторов и ступенчатой экспозиции позволяет проводить успешное криоконсервирование МСК, инкапсулированных в альгинатные микросферы методом витрификации. Особенностью витрификации МСК в составе микросфер по сравнению с клетками в суспензии является более продолжительная экспозиция в растворе криопротекторов. Кріоконсервування клітин, інкапсульованих в альгінатні мікросфери, є одним з актуальних питань тканинної інженерії. У представленій роботі вивчався вплив часу експозиції з мультикомпонентним розчином кріопротекторів ДЕПС-1 (10% ДМСО, 20% ЕГ, 20% 1,2-ПД і 0,5 M сахарози) на життєздатність і метаболічну активність мезенхімальних стромальних клітин (МСК) після вітрифікації в складі альгінатних мікросфер. Було показано, що використання мультикомпонентного розчину кріопротеторів та ступінчатої експозиції дозволяє проводити успішне кріоконсервування методом вітріфікації МСК, інкапсульованих в альгінатні мікросфери. Особливістю вітрифікації МСК у складі мікросфер у порівнянні з клітинами у суспензії є більш триваліша експозиція у розчині кріопротекторів. Cryopreservation of cells encapsulated in alginate microbeads is one of the important issues of tissue engineering. The present study was directed on the estimation of the effect caused by of duration of alginate encapsulated mesenchymal stromal cells (MSCs) exposure in multicomponent cryoprotective solution DEPS-1 (10% DMSO, 20% EG, 20% 1,2-PD and 0.5 M sucrose) on survival and metabolic activity after vitrification and rewarming. It was shown using of multicomponent cryoprotective solution and stepwise exposure allowed to achieve successful cryopreservation by means of vitrofication of MSCs encapsulated in alginate microspheres. The main difference between vitrification of MSCs encapsulated in microspheres vs. single cells was the longer exposure with CPA. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер Vitrification of Mesenchymal Stromal Cells in Alginate Microbeads Article published earlier |
| spellingShingle | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер Зайков, В.С. Петренко, Ю.А. Труфанова, Н.А. Правдюк, А.И. Петренко, А.Ю. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_alt | Vitrification of Mesenchymal Stromal Cells in Alginate Microbeads |
| title_full | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_fullStr | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_full_unstemmed | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_short | Особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| title_sort | особенности витрификации мезенхимальных стромальных клеток в составе альгинатных микросфер |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68474 |
| work_keys_str_mv | AT zaikovvs osobennostivitrifikaciimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT petrenkoûa osobennostivitrifikaciimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT trufanovana osobennostivitrifikaciimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT pravdûkai osobennostivitrifikaciimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT petrenkoaû osobennostivitrifikaciimezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokvsostavealʹginatnyhmikrosfer AT zaikovvs vitrificationofmesenchymalstromalcellsinalginatemicrobeads AT petrenkoûa vitrificationofmesenchymalstromalcellsinalginatemicrobeads AT trufanovana vitrificationofmesenchymalstromalcellsinalginatemicrobeads AT pravdûkai vitrificationofmesenchymalstromalcellsinalginatemicrobeads AT petrenkoaû vitrificationofmesenchymalstromalcellsinalginatemicrobeads |