Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження
Проведено кріоконсервування мезенхімальних стромальних клітин (МСК) кісткового мозку та культури клітин хоріона (ККХ) під захистом 10 % ДМСО та 20 % ембріональної сироватки з застосуванням низької швидкості охолодження (1 град/хв) до -80 градусів за Цельсієм із наступним зануренням у рідкий азот. Од...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2012 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Ukrainian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68487 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження / Н.О. Волкова // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 118-125. — Бібліогр.: 18 назв. — укр., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860236623487172608 |
|---|---|
| author | Волкова, Н.О. |
| author_facet | Волкова, Н.О. |
| citation_txt | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження / Н.О. Волкова // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 118-125. — Бібліогр.: 18 назв. — укр., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Проведено кріоконсервування мезенхімальних стромальних клітин (МСК) кісткового мозку та культури клітин хоріона (ККХ) під захистом 10 % ДМСО та 20 % ембріональної сироватки з застосуванням низької швидкості охолодження (1 град/хв) до -80 градусів за Цельсієм із наступним зануренням у рідкий азот. Одержані результати показали, що після низькотемпературного зберігання обидві досліджені культури зберігали здатність до проліферації та спрямованого диференціювання. ККХ характеризувалася більш високою проліферативною активністю у порівнянні з МСК кісткового мозку. Здатність до спрямованого диференціювання в адипо- та хондрогенному напрямках була вищою у МСК кісткового мозку, ніж у ККХ.
Проведено криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга и культуры клеток хориона (ККХ) под защитой 10% ДМСО и 20% эмбриональной сыворотки с использованием низкой скорости охлаждения (1 град/мин) до –80°С с последующим погружением в жидкий азот. Полученные результаты показали, что после низькотемпературного хранения обе исследуемые культуры сохраняли способность к пролиферации и направленному дифференцированию. Культура клеток хориона характеризовалась более высокой пролиферативной активностью относительно МСК костного мозга. Способность к направленному дифференцированию в адипо- и хондрогенном направлениях была выше у МСК костного мозга, чем у ККХ.
Mesenchymal stromal cells (MSCs) of bone marrow and chorion cell culture (CCC) were cryopreserved under protection of 10% DMSO and 20% fetal bovine serum using low cooling rate (1 deg/min) down to –80°C with following plunging into liquid nitrogen. The findings have shown than after low temperature storage both studied cultures kept the ability to proliferation and directed differentiation. Chorion cell culture was characterized with higher proliferative activity if compared with bone marrow MSCs. The ability to the directed differentiation towards adipo- and chondrogeneic lineages was higher for bone marrow MSCs versus CCC.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:25:18Z |
| format | Article |
| fulltext |
118
На сьогодні широко використовують як модель-
ний об’єкт для потреб біомедичних технологій куль-
тивовані мезенхімальні стромальні клітини (МСК),
джерелами яких є кістковий мозок, жир, плацента,
амніон, кордова кров та ін. [5, 10, 14, 15]. Це обу-
мовлено високим проліферативним потенціалом,
здатністю до спрямованого диференціювання та
наявністю специфічного імунофенотипу. Мезенхі-
мальні стромальні клітини, які отримані з тканин
фетоплацентарного комплексу та тканин доросло-
го організму, мають схожі морфологічні та фено-
типічні характеристики [7, 8]. Культивовані клітини
хоріона (ККХ), які виділені з тканини раннього
хоріона є фібробластоподібними клітинами, що
мають здатність до адгезії, проліферації та харак-
теризуються вмістом 95% клітин з імунофеноти-
пом CD90+CD73+CD105+ [10, 15]. Для створення
запасу МСК з метою їх подальшого застосування
Nowadays the cultured mesenchymal stromal cells
(MSCs), the sources of those are bone marrow, fat,
placenta, amnion, cord blood etc., have been widely
used as the model object for the demands of biomedical
technologies [5, 10, 14, 15]. This is stipulated with a
high proliferative potential, capability to the directed
differentiation and presence of specific immune
phenotype. Mesenchymal stromal cells derived from
the tissues of fetoplacental complex and adult tissues
have similar morphological and phenotypic charac-
teristics [7, 8]. Chorion cultured cells (CCCs) isolated
from a tissue of early chorion are fibroblast-like cells
with the ability to adhesion, proliferation and charac-
terized with the content of 95% of cells with immune
phenotype CD90+CD73+CD105+ [10, 15]. Low tempe-
rature preservation is necessary for establishing the
stock of MSCs for their further use in regenerative
medicine. In cryopreservation protocols of bone mar-
УДК 611.018.46.085.23:615.014.41
Н.О. ВОЛКОВА
Дослідження морфофункціональних характеристик
кріоконсервованих культур клітин стромального походження
UDC 611.018.46.085.23:615.014.41
N.O. VOLKOVA
Study of Morphological Characteristics
of Cryopreserved Cell Cultures of Stromal Origin
Проведено кріоконсервування мезенхімальних стромальних клітин (МСК) кісткового мозку та культури клітин хоріона
(ККХ) під захистом 10% ДМСО та 20% ембріональної сироватки з застосуванням низької швидкості охолодження (1 град/хв)
до –80°С з наступним зануренням у рідкий азот. Отримані результати показали, що після низькотемпературного зберігання
обидві досліджені культури зберігали здатність до проліферації та спрямованого диференціювання. Культура клітин хоріона
характеризувалася більш високою проліферативною активністю порівняно із МСК кісткового мозку. Здатність до спрямованого
диференціювання в адипо- та хондрогенному напрямках була вищою у МСК кісткового мозку, ніж у ККХ.
Ключові слова: кріоконсервування, культури клітин, проліферація, диференціювання.
Проведено криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга и культуры клеток хориона
(ККХ) под защитой 10% ДМСО и 20% эмбриональной сыворотки с использованием низкой скорости охлаждения (1 град/мин)
до –80°С с последующим погружением в жидкий азот. Полученные результаты показали, что после низькотемпературного
хранения обе исследуемые культуры сохраняли способность к пролиферации и направленному дифференцированию. Культура
клеток хориона характеризовалась более высокой пролиферативной активностью относительно МСК костного мозга.
Способность к направленному дифференцированию в адипо- и хондрогенном направлениях была выше у МСК костного
мозга, чем у ККХ.
Ключевые слова: криоконсервирование, культуры клеток, пролиферация, дифференцирование.
Mesenchymal stromal cells (MSCs) of bone marrow and chorion cell culture (CCC) were cryopreserved under protection of 10%
DMSO and 20% fetal bovine serum using low cooling rate (1 deg/min) down to –80°C with following plunging into liquid nitrogen. The
findings have shown than after low temperature storage both studied cultures kept the ability to proliferation and directed differentiation.
Chorion cell culture was characterized with higher proliferative activity if compared with bone marrow MSCs. The ability to the
directed differentiation towards adipo- and chondrogeneic lineages was higher for bone marrow MSCs versus CCC.
Key words: cryopreservation, cell culture, proliferation, differentiation.
*Адреса для кореспонденції : вул. Переяславська, 23,
м. Харків, Україна 61015; тел.: (+38 057) 373-31-19, факс:
(+38 057) 373-30-84,
електронна пошта: volkovanatali2006@yandex.ru
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3119, fax: +380 57 373 3084, e-mail: volkovanatali2006@yandex.ru
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
м. Харків
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
119
у регенераторній медицині необхідно низькотемпе-
ратурне консервування. В протоколах кріоконсер-
вування стромальних клітин кісткового мозку вико-
ристовували повільне охолодження з наступним
зберіганням при температурі –80°C або у рідкому
азоті [4, 6, 9] з кріозахисним середовищем у вигляді
суміші кріопротекторів ендо- і екзоцелюлярного ти-
пу. Безпосередньо після заморожування-відігріву
культур МСК необхідним етапом є проведення їх
ретельної оцінки за морфологічними параметрами,
а саме життєздатності, здатності до адгезії, пролі-
ферації та спрямованого диференціювання. Дослі-
дження впливу заморожування-відігріву на проліфе-
рацію та потенціал диференціювання МСК важливо
як для розуміння механізмів процесів регуляції у
клітин-попередників, так і для оптимізації протоко-
лів кріоконсервування, які забезпечують збережен-
ня стовбурової фракції досліджених клітин. Цікаво,
чи може протокол кріоконсервування, що успішно
використовували для МСК кісткового мозку [4, 6,
9, 16], бути застосований для клітин з іншого
джерела – хоріона. Однакові умови кріоконсерву-
вання дозволяють оцінити вплив низьких темпе-
ратур на збереження проліферативних характерис-
тик і здатність до спрямованого диференціювання
МСК, отриманих з різних джерел.
Метою роботи було порівняльне дослідження
морфофункціональних властивостей кріоконсер-
вованих культур клітин хоріона і МСК кісткового
мозку.
Матеріали і методи
У роботі використовували культури клітин хоріо-
на людини [2, 15] та МСК кісткового мозку щурів
[5, 17]. При культивуванні обох культур щільність
посіву клітин становила 103 клітин/см2 культураль-
ного флакона площею 25 см2 («РАА», Австрія). Жи-
вильне середовище культивування містило: середо-
вище IMDM («PAA»), 10% ембріональної сироват-
ки (ЕС) великої рогатої худоби («HyClone», США),
гентаміцин (150 мкг/мл) («Фармак», Україна) та
амфотеріцин Б (10 мкг/мл) ("РАА"). Живильне се-
редовище змінювали кожні 3 доби. У роботі були
використані стандартні умови культивування при
37°С в атмосфері 5% СО2. Після утворення моно-
шару культури клітин пасирували. Кріоконсерву-
вання обох культур здійснювали під захистом 10%
ДМСО («РАА») з додаванням 20% ЕС на живиль-
ному середовищі. Отриману суспензію вміщували
по 1 мл у кріопробірки («Nunc», США). Охоло-
дження зразків проводили зі швидкістю 1 град/хв
до –80°С у парах зрідженого азоту в умовах кріо-
сховища протягом 30 хв з подальшим зануренням
у рідкий азот [9]. Зразки зберігали в умовах низько-
row stromal cells slow cooling rates with following
maintaining either at –80°C or liquid nitrogen have been
successfully used [4, 6, 9] with cryoprotective medium
as the mixture of cryoprotectants of exocellular type.
Directly after freeze-thawing of MSCs cultures the
necessary stage is a thorough assessment of morpho-
logical parameters, namely, viability, ability to adhe-
rence, proliferation and directed differentiation. Inves-
tigation of freeze-thawing effect on proliferation and
potential of MSCs differentiation is important both for
understanding the mechanisms of regulation processes
in progenitor cells and for optimization of cryopre-
servation protocols, providing the preservation of the
fraction of the studied cells. It would be of interest to
check if the cryopreservation protocol successfully
applied for bone marrow MSCs [4, 9, 16] could be
used in the case of the cells from another source, the
chorion. Similar cryopreservation conditions allow the
estimation of the effect of low temperatures on preser-
vation of proliferative characteristics and capability for
directed differentiation of MSCs, derived from different
sources.
The research aim was to comparatively study the
morphofunctional properties of cryopreserved cultures
of chorion cells and bone marrow MSCs.
Materials and methods
Investigations were performed in the cultures of
human chorion [2, 15] and bone marrow MSCs of rats
[5, 17]. When culturing both cultures the plating density
of cells was 103 cells/cm2 of cultural flask with 25 cm2
area (PAA, Austria), 10% fetal bovine serum (FBS)
(HyClone, USA), gentamicin (150 µg/ml) (Farmak,
Ukraine) and amphotericin B (10 µg/ml) (PAA). Nutri-
tive medium was changed every 3 days. In the research
there were used the standard conditions of culturing
at 37°C in 5% CO2 atmosphere. After monolayer for-
mation the cell cultures were passaged. Both cultures
were passaged under protection of 10% DMSO (PAA)
and 20% FBS on the base of nutritive medium. The
resulted suspension was placed by 1 ml into the cryo-
vials (Nunc, USA). The samples were cooled with
the rate of 1 deg/min down to –80°C in liquid nitrogen
vapors in cryostorage conditions for 30 min with follo-
wing plunging into liquid nitrogen [9]. The samples were
stored under conditions of low temperature bank for 4
months, thawed on water bath at 40°C up to the appea-
rance of liquid phase. Cryoprotectant was removed
with adding surplus (1:9) volume of Hank’s solution
(PAA) with following centrifugation at 1,500 rot/min
(834g) for 5 min. Cell membrane integrity was asses-
sed with the test on exclusion of supravital dye trypan
blue (Sigma, USA). The obtained suspension of cells
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
120
температурного банку протягом 4 місяців, відігрі-
вали на водяній бані при 40°С до появи рідкої фази.
Кріопротектор видаляли додаванням надлиш-
кового (1:9) об’єму розчину Хенкса («РАА») з на-
ступним центрифугуванням при 1500 об/хв (834g)
протягом 5 хв. Цілісність мембрани клітин оціню-
вали за тестом на виключення суправітального
барвника трипанового синього («Sigma», США).
Отриману суспензію клітин ресуспендували в живи-
льному середовищі і висівали на культуральні фла-
кони. При культивуванні обох досліджуваних куль-
тур після кріоконсервування застосовували такі ж
умови, як і для початкових культур.
Для визначення приросту кількості клітин у
досліджених культурах на 3, 5, 7, 10, 14-у добу їх
ферментативно (0,25% розчин трипсину:розчин
Версену, «РАА») знімали з пластика та підрахову-
вали кількість клітин [1, 3]. Для спрямованого дифе-
ренціювання досліджуваних культур в адіпо- та
хондрогенному напрямках змінювали живильне се-
редовище (на 15-у добу культивування) на середо-
вище диференціювання. Адіпогенне середовище
складалося з IMDM, 1% ЕС, 10–7 M дексаметазо-
ну, 10–9M інсуліну; хондрогенне – IMDM, 10–5 аскор-
бат-2-фосфату, 10 нг/мл TGF-β («Sigma»). Всі скла-
дові, використані для диференціювання, були
виробництва «РАА». Подальше культивування
проводили протягом 3-х тижнів зі зміною середови-
ща 2 рази на тиждень. Для підтвердження диферен-
ціювання in vitro в адіпогенному напрямку клітини
фарбували Sudan IV («Fluka», Німеччина) (підрахо-
вували кількість клітин з ліпідними краплями, які
мали оранжеве забарвлення, n = 5), хондрогенно-
го – Toludine blue (Fluka) (підраховували кількість
клітин з наявністю протеогліканів в екстрацелюляр-
ному матриксі, які мали синє забарвлення, n = 5).
Кількість диференційованих клітин підраховували
у світловому мікроскопі та визначали їх відсоток
до загальної кількості клітин. Контролем спонтан-
ного диференціювання були клітини, культивовані
у відсутності спеціальних індукторів.
При статистичній обробці результатів використо-
вували однофакторний дисперсійний аналіз і t-кри-
терій Стьюдента за допомогою програми Exсel.
Результати та обговорення
Першим етапом роботи було дослідження ціліс-
ності мембрани клітин після кріоконсервування з
використанням тесту на виключення трипанового
синього. Після кріоконсервування життєздатність
МСК кісткового мозку складала 78,5 ± 6,2%, що у
1,2 рази нижче відповідного показника у початкових
культурах (95,2 ± 4,5%). Показник життєздатності
кріоконсервованих ККХ був знижений у 1,2 рази
was resuspended in nutritive medium and plated into
cultural flasks. When culturing both studied cultures
after cryopreservation there were used the same con-
ditions as for initial cultures.
To examine the increment of cell number in the
studied cultures to the 3, 5, 7, 10, 14 days they were
enzymatically (0.25% trypsin solution: Versene solution,
PAA) detached from plastic and the number of cells
was counted [1, 3]. For the directed differentiation of
the studied cultures towards adipo- and chondrogenic
lineages the nutrient medium was changed to diffe-
rentiation medium (to the 15th day of differentiation).
Adipogenic medium comprised IMDM, 1 FBS, 10–7 M
dexamethasone, 10–9 insulin; chondrogenic one did
IMDM, 10–5 ascorbate-2-phosphate, 10 ng/ml TGF-β
(Sigma). All the components used for differentiation
were of PAA production. Following culturing was per-
formed during 3 weeks with changing the medium twice
a week. To confirm the differentiation in vitro towards
adipogenic lineage the cells were stained with Sudan
IV (Fluka, Germany) (the number of cells with lipid
drops having an orange color, n = 5, was counted),
chondrogeneic one was done with Toluidine blue
(Fluka) (there was counted the number of cells with
the presence of proteoglycans in extracellular matrix,
having blue colour, n = 5). The number of differentiated
cells was counted with light microscope and their
percentage to total number of cells was found. The
controls of spontaneous differentiation were the cells
cultured in the absence of special inducers.
Statistical processing of the results involved one-
way ANOVA test and Student’s t-criterion with the
help of Excel software.
Results and discussion
The first step of the work was the studying of cell
membrane integrity after cryopreservation using the
test for the exclusion of trypan blue. After cryopre-
servation the viability of bone marrow MSCs made
78.5 ±6.2% which is 1.2 times lower than corresponding
index in initial cultures (95.2 ± 4.5%). The viability in-
dex of cryopreserved CCC was reduced in 1.2 times
versus initial cultures (97.4 ± 5.8%) and made 80.2 ±
4.4%.
The next stage of the work was the examining of
proliferative characteristics of cryopreserved cultures
of bone marrow MSCs and CCC (Fig. 1). In the
studied cultures the cells which adhered to plastic were
of fibroblast-like morphology and formed the monolayer
sites with 10–15 cells to the 5–7th observation day. To
the 14th day of culturing of bone marrow MSCs there
was observed 75% confluent, in the case of CCC the
density of monolayer reached 90% (Fig. 2). Dynamics
of the growth of the studied cultures was similar but
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
121
відносно початкових культур (97,4 ± 5,8%) та скла-
дав 80,2 ± 4,4%.
Наступним етапом роботи було визначення про-
ліферативних характеристик кріоконсервованих
культур МСК кісткового мозку та ККХ (рис. 1). У
досліджених культурах клітини, які адгезували до
пластика, мали фібробластоподібну морфологію та
утворювали ділянки моношару з 10–15 клітин на
5–7-му добу спостереження. На 14-ту добу культи-
вування МСК кісткового мозку спостерігався 75%-й
конфлюєнт, у випадку ККХ щільність моношару до-
сягала 90% (рис. 2). Динаміка зростання дослідже-
них культур була схожою, але кількість клітин на
см2 була більшою у ККХ під час всього строку
спостереження. Слід зазначити, що на 3–4-му паса-
жі досліджувані кріоконсервовані культури мали
більш високу здатність до проліферації, ніж на 0-му
пасажі. Це явище, ймовірно, пов’язано, з одного
боку, з пригніченням проліферативної активності
після кріоконсервування, а з другого – адаптацією
клітин до культуральних умов [6, 9].
Отримані експериментальні дані щодо спрямо-
ваного диференціювання досліджених культур по-
казали, що перші ознаки адипоцитарного диферен-
ціювання, які виражалися в зміні морфології клітин
(округлість, зернистість цитоплазми), спостерігали
на 5–7-му добу у випадку МСК кісткового мозку
та на 8–10-ту добу – у випадку ККХ. Цитохімічне
фарбування досліджених культур барвником Sudan
IV на 21-шу добу після початку адипоцитарного
диференціювання виявило наявність ліпідних кра-
пель, які були пофарбовані в оранжевий колір у цито-
плазмі більш ніж 54,7 ± 6,2% в культурах МСК
кісткового мозку та 24,6 ± 7,3% – в ККХ (рис. 3).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 3 5 7 10 14
Час спостереження, доба
Observation term, days
Кі
ль
кіс
ть
к
лі
ти
н,
м
лн
н
а
см
2
C
el
l n
um
be
r,
m
ln
p
er
c
m
2
Рис. 1. Динаміка росту ККХ та МСК кісткового мозку
після заморожування-відігріву, 0-й пасаж (n = 5): –
ККХ; – МСК кісткового мозку.
Fig. 1. Growth dynamics of CCCs and bone marrow MSCs
after freeze-thawing, 0 passage (n = 5): – CCCs; – bone
marrow MSCs .
Рис. 2. Культури ККХ (A) і МСК кісткового мозку (B) після заморожування-відігріву, 0-й пасаж, ×250, світлова
мікроскопія, фарбування гематоксиліном і еозином.
Fig. 2. Microphoto of CCCs (A) and bone marrow MSCs (B) after freeze-thawing, 0 passage, ×250, light microscopy,
hematoxylin and eosin staining.
A B
the number of cells per cm2 was higher in CCC during
the whole observation term. It should be noted that at
3–4th passage the investigated cryopreserved cultures
had higher ability to proliferation versus passage 0.
This phenomenon is likely related from one side to the
suppression of proliferative activity after cryopreser-
vation and from another one it is associated with adap-
tation of cells to cultural conditions [6, 9].
The obtained experimental data as for the directed
differentiation of the studied cultures have shown that
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
122
У морфології контрольних зразків зазначених змін
не було виявлено.
При дослідженні спрямованого хондрогенного
диференціювання перші ознаки зміни морфології у
випадку МСК кісткового мозку спостерігали на 3–
4-ту добу культивування та на 5–6-ту добу – у ви-
падку ККХ. З 8-ї доби хондрогенного диференцію-
вання в культурах спостерігали ділянки з концент-
рацією клітин, більшою в порівнянні з ділянками
навколо. При подальшому спостереженні щільність
клітин збільшувалася та на 21-шу добу відмічалося
утворення оформлених структур із значною масою
екстрацелюлярного матриксу, що підтверджува-
лося фарбуванням культур Toluidine blue на наяв-
ність протеогліканів (рис. 4). Загальний відсоток
диференційованих у хондрогенному напрямку клі-
тин МСК кісткового мозку становив 70,3 ± 5,6%, а
у випадку ККХ – 58,2 ± 4,8%. При цьому ознак
спонтанного диференціювання у морфології конт-
рольних зразків не спостерігалося. Порівняння заз-
начених кріоконсервованих культур показало, що
МСК і ККХ мають здатність до спрямованого муль-
тилінійного мезенхімального диференціювання.
Підсумовуючи отримані дані, можна заключити,
що кріоконсервованим культурам МСК кісткового
мозку на початкових етапах властиві повільна
проліферація та високий потенціал до диференцію-
вання. Культури клітин хоріона за однакових умов
кріоконсервування мали більшу здатність до пролі-
ферації та нижчу – до диференціювання, ніж МСК
кісткового мозку. Поряд із кістковим мозком, який
є найбільш поширеним джерелом стовбурових
клітин, тканина хоріона може бути альтернативним
Рис. 3. Спрямоване хондрогенне диференціювання ККХ (A) і МСК кісткового мозку (B) після заморожування-
відігріву, ×250, світлова мікроскопія, фарбування Toluidine blue.
Fig. 3. Directed chondrogenic differentiation of CCCs (A) and bone marrow MSCs (B) after freeze-thawing, ×250, light
microscopy, Toluidine blue staining.
A B
the first signs of adipocytic differentiation manifested
in the alteration of cell morphology (roundure, cyto-
plasm granulation) were found to the 5–7th day in case
of bone marrow MSCs and to the 8–10th day in the
case of CCC. Cytochemical staining of the studied
cultures with Sudan IV stain to the 21st day after the
start of adipocytic differentiation revealed the presence
of lipid drops which were colored orange in cytoplasm
more than 54.7 ± 6.2% in cultures of bone marrow
MSCs and 24.6 ± 7.3% in CCCs (Fig. 3). In morphology
of the control samples no mentioned changes were
revealed.
When studying the directed chondrogeneic differen-
tiation the first signs of the changes in morphology in
case of bone marrow MSCs were observed to the 3–
4th culturing day and to the 5–6th in the case of CCC.
From the 8th day of chondrogeneic differentiation in
the cultures there were observed the sites of increased
concentration of cells if compared with the surrounding
ones. During following observation the density of cells
increased and to the 21st day there was noted the
formation of the shaped structures with a significant
mass of extracellular matrix, which was confirmed with
the staining of the cultures with Toluidine blue for the
presence of proteoglycans (Fig. 4). Total percentage
of differentiated towards chondrogeneic lineage cells
of bone marrow MSCs made 70.3 ± 5.6% and in the
case of CCC it was 58.2 ± 4.8%. Herewith no signs
of spontaneous differentiation in morphology of the
control samples were noted. The comparison of the
mentioned cryopreserved cultures has shown that
MSCs and CCC have the ability to the directed mul-
tilinear mesenchymal differentiation.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
123
джерелом для отримання культур стромальних
клітин.
Результати проведених раніше досліджень [2]
по кріоконсервуванню ККХ показали, що оптималь-
ною є програма з охолодженням від 25 до –6°С зі
швидкістю 1 град/хв, з наступним сидінгом та охо-
лодженням до –80°С зі швидкістю 10 град/хв і за-
нуренням у рідкий азот. Використання зазначеної
програми забезпечує після відігріву як високу збе-
реженість популяції ККХ в цілому (життєздатність
82,4 ± 5,7% та формування щільного моношару на
14-ту добу культивування), так і виживання фракції
мультипотентних клітин. Аналогічні результати
збереження морфофункціональних характеристик
ККХ отримані в цій роботі з використанням програ-
ми кріоконсервування з повільним охолодженням.
Ймовірно, в процесі культивування стромальні
клітини набувають стійкості до переохолодження,
що дає можливість консервувати ці клітини без за-
стосування сидінга з низькою швидкістю охоло-
дження [4, 6, 9]. Таким чином, для стандартизації
та спрощення процесу кріоконсервування стовбуро-
вих клітин з різних джерел можливим є викорис-
тання двохетапної програми з низькою швидкістю
охолодження та суміші 10% ДМСО та 20% ЕС як
кріопротектора, що дозволяє зберегти ростові ха-
рактеристики та здатність до спрямованого дифе-
ренціювання. Результати проведеного дослідження
узгоджуються з даними робіт щодо впливу низько-
температурного консервування на морфофункціо-
нальні властивості МСК [4, 11–13, 18] та можуть
використовуватися при створенні кріобанку перс-
пективних ліній клітин стромального походження з
Рис. 4. Спрямоване адипогенне диференціювання ККХ (A) і МСК кісткового мозку (B) після заморожування-відігріву,
×250, світлова мікроскопія, фарбування Sudan I.
Fig. 4. Directed adipogenic differentiation of CCCs (A) and bone marrow MSCs (B) after freeze-thawing, ×250, light
microscopy, Sudan IV staining.
A B
To summarize the data obtained one may conclude
that to cryopreserved cultures of bone marrow MSCs
at initial stages slow proliferation and high potential to
differentiation are inherent. Chorion cell cultures under
similar cryopreservation conditions has a high ability
to proliferation and lower one to differentiation if
compared with bone marrow MSCs. Along with bone
marrow which is the most wide spread source of stem
cells, chorion tissue can be an alternative source for
obtaining the cultures of stromal cells.
The results of the performed previously researches
[2] on cryopreservation of CCC have shown that opti-
mal one is the program with cooling from 25 down to
–6°C with the rate of 1 deg/min with following seeding
and cooling down to –80°C with the rate of 10 deg/min
and plunging into liquid nitrogen. Use of the mentioned
program provides after thawing both a high preserva-
tion of CCC population in a whole (viability of 82.4 ±
5.7% and formation of dense monolayer to the 14th
culturing day) and survival of the fraction of multipotent
cells. The same results of preservation of CCC
morphofunctional characteristics were obtained in the
presented work using the cryopreservation program
with low cooling rate. During culturing process of stro-
mal cells are likely getting resistance to overcooling,
giving the possibility to cryopreserve these cells using
no seeding with low rate [4, 6, 9]. Thus to standardize
and simplify the cryopreservation process of stem cells
of different origins the use of two-stage program with
low cooling rate and mixture of 10% DMSO and 20%
FBS as cryoprotectants enabling to preserve the growth
characteristics and ability to directed differentiation is
possible. The results of the performed studies are in
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
124
можливістю їх наступного застосування для потреб
біотехнології та клітинної терапії.
Висновки
Проведено порівняльне дослідження впливу
однакових умов низькотемпературного консерву-
вання культур клітин стромального походження,
отриманих з різних джерел, а саме кісткового мозку
та тканини хоріона. Встановлено, що кріоконсерву-
вання досліджених культур з застосуванням низької
швидкості охолодження (1 град/хв) до –80°С та се-
редовища кріоконсервування (10% ДМСО та 20%
ЕС) дозволяє зберегти цілісність мембрани клітин,
їх проліферативні характеристики та здатність до
спрямованого диференціювання.
Література
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. – М.:
Мир, 1983. – 264 с.
2.Гончарук О.І., Волкова Н.О., Грищенко В.І. Вплив
кріоконсервування на проліферативні характеристики і
потенціал диференціювання культивованих клітин хоріо-
на // Проблемы криобиологии. – 2010. – Т.20, №3. – C.309–
317.
3. Методы культивирования клеток. Сб. научных трудов /
Под. ред. Г.П. Пинаева. – Л.: Наука, 1988. – 287 с.
4. Петренко Ю.А., Скоробогатова Н.Г., Волкова Н.А., Пет-
ренко А.Ю. Характеристика иммунофенотипа и диффе-
ренцировочного потенциала мезенхимальных стромаль-
ных клеток костного мозга человека после криоконсерви-
рования // Проблемы криобиологии. – 2010. – Т. 20, №4. –
C. 436–442.
5. Суздальцев Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В. и др.
Сравнение способности к дифференцировке в ткани мезо-
дермального происхождения мезенхимальных клеток че-
ловека, выделенных из разных источников // Клеточные
технологии в биологии и медицине. – 2007. – №1. – С. 3–
10.
6. Труфанова Н.А., Петренко Ю.А., Петренко А.Ю. Влияние
криоконсервирования на жизнеспособность, иммуно-
фенотип и дифференцировочные свойства мезенхималь-
ных стромальных клеток ранних стадий органогенеза //
Проблемы криобиологии. – 2010. – Т. 20, №2. – C. 135–144.
7. Angelo P.C., Ferreira A.C., Fonseca V.D. et al. Cryopreserva-
tion does not alter karyotype, multipotency, or NANOG/SOX2
gene expression of amniotic fluid mesenchymal stem cells //
Genet. Mol. Res. – 2012. – Vol. 11, №2. – P.1002–1012.
8. Baksh D., Yao R., Tuan R. Comparison of proliferative and
multilineage differentiation potential of human mesenchymal
stem cells derived from umbilical cord and bone marrow //
Stem Сells. – 2007. – Vol. 25, №4. – P.1384–1392.
9. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M. et al. Rapid expansion
of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells
from human bone marrow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –
2000. – Vol. 97, N7. – P. 3213–3218.
10. Diaz-Prado S., Muinos-Lopez E., Hermida-Gomez T. et al.
Multilineage differentiation potential of cells isolated from the
human amniotic membrane // J. Cell Biochem. – 2010. – Vol. 111,
N4. – P. 846–857.
11. Gonda K., Shigeura T., Sato T. Preserved proliferative capacity
and multipotency of human adipose-derived stem cells after
accordance with the data of the reports as for the ef-
fect of low temperature preservation on morphofunc-
tional properties of MSCs [4, 11–13, 18] and may be
used when establishing the cryobank of perspective
lines of the cells of stromal origin with their possible
following application for the demands of biotechnology
and cell therapy.
Conclusions
There was performed a comparative study of the
similar conditions of low temperature preservation of
cell cultures of stromal origin derived from different
sources namely of chorion tissues. It has been
established that cryopreservation of the studied cultures
using low cooling rate (1 deg/min) down to -80°C and
cryopreservation medium (10% DMSO and 20% FBS)
allows the keeping an integrity of cell membrane, their
proliferative characteristics and ability to the directed
differentiation.
References
1. Adams R. Methods of cell culture for biochemists. – Moscow:
Mir, 1983. – 264 p.
2. Goncharuk E.I., Volkova N.A., Grischenko V.I. Cryopreserva-
tion effect on proliferation characteristics and differentiation
potential of cultured chorion cells // Problems of Cryobiology. –
2010. – Vol. 20, N3. – P. 309–317.
3. Methods of cell culturing: Collection of Scientific Papers/ Ed. by
G.P. Pinaeva. – Leningrad: Nauka, 1988. – 287 p.
4. Petrenko Yu.A., Skorobogatova N.G., Volkova N.A., Petren-
ko A.Yu. Characterization of immunophenotype and differen-
tiation potential of human bone marrow mesenchymal stromal
cells after cryopreservation // Problems of Cryobiology. –
2010. – Vol. 20, N4. – P. 436–442.
5. Suzdaltsev Yu.G., Burunova V.V., Vakhrushev I.V. et. al. Compa-
rison of ability to differentiation in tissue of mesodermal origin
of human mesenchymal cells, derived from different sources //
Kletochnye technologii v biologii i meditsine. – 2007. – N1. –
P. 3–10.
6. Trufanova N.A., Petrenko Yu.A., Petrenko A.Yu. Effect of cryo-
preservation on viability, immunophenotype and differentiation
properties of mesenchymal stromal cells of early organogenetic
stage // Problems of Cryobiology. – 2010. – Vol. 20, N2. –
P. 135–144.
7. Angelo P.C., Ferreira A.C., Fonseca V.D. et al. Cryopreserva-
tion does not alter karyotype, multipotency, or NANOG/SOX2
gene expression of amniotic fluid mesenchymal stem cells //
Genet. Mol. Res. – 2012. – Vol. 11, N2. – P.1002–1012.
8. Baksh D., Yao R., Tuan R. Comparison of proliferative and
multilineage differentiation potential of human mesenchymal
stem cells derived from umbilical cord and bone marrow //
Stem Сells. – 2007. – Vol. 25, N4. – P.1384–1392.
9. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M. et al. Rapid expansion
of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells
from human bone marrow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –
2000. – Vol. 97, N7. – P. 3213–3218.
10. Diaz-Prado S., Muinos-Lopez E., Hermida-Gomez T. et al.
Multilineage differentiation potential of cells isolated from the
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
125
long-term cryopreservation // Plast. Reconstr. Surg. – 2008. –
Vol. 121, №2. – P. 401–410.
12. Haack-Sorensen M., Bindslev L., Mortensen S. et al. The
influence of freezing and storage on the characteristics and
functions of human mesenchymal stromal cells isolated for
clinical use // Cytotherapy. – 2007. – Vol. 9, №4. – P. 328–337.
13. Haack-Sorensen M., Kastrup J. Cryopreservation and revival
of mesenchymal stromal cells // Methods Mol. Biol. – 2011. –
Vol.698, №1. – P.161–174.
14. Hegyi B., Sagi1 B., Kovacs J. Identical, similar or different?
Learning about immunomodulatory function of mesenchymal
stem cells isolated from various mouse tissues: bone marrow,
spleen, thymus and aorta wall // Int. Immunology. – 2010. –
Vol. 22, №7. – Р. 551–559.
15. Maddalena S., Elsa V., Lucia G. et al. Isolation and characteri-
zation of mesenchymal cells from human fetal membranes // J.
Tissue Eng. Regen. Med. – 2007. – Vol.1, №4. – Р. 296–305.
16. Mamidi M.K., Nathan K.G., Singh G. et al. Comparative cel-
lular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent
mesenchymal stromal cells during continuous passaging and
after successive cryopreservation // J. Cell Biochem. – 2012. –
Vol. 113, №10. – P. 3153–3164.
17. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. –
1999. – Vol. 284, №2. – Р. 143–147.
18. Tokumoto S., Sotome S., Torigoe I. et al. Effects of cryopre-
servation on bone marrow derived mesenchymal cells of a
nonhuman primate // J. Med. Dent. Sci. – 2008. – Vol. 55, №1. –
P. 137–143.
Надійшла 1.06.2012
human amniotic membrane // J. Cell Biochem. – 2010. – Vol. 111,
N4. – P. 846–857.
11. Gonda K., Shigeura T., Sato T. Preserved proliferative capacity
and multipotency of human adipose-derived stem cells after
long-term cryopreservation // Plast. Reconstr. Surg. – 2008. –
Vol. 121, N2. – P. 401–410.
12. Haack-Sorensen M., Bindslev L., Mortensen S. et al. The
influence of freezing and storage on the characteristics and
functions of human mesenchymal stromal cells isolated for
clinical use // Cytotherapy. – 2007. – Vol. 9, N4. – P. 328–337.
13. Haack-Sorensen M., Kastrup J. Cryopreservation and revival
of mesenchymal stromal cells // Methods Mol. Biol. – 2011. –
Vol.698, N1. – P.161–174.
14. Hegyi B., Sagi1 B., Kovacs J. Identical, similar or different?
Learning about immunomodulatory function of mesenchymal
stem cells isolated from various mouse tissues: bone marrow,
spleen, thymus and aorta wall // Int. Immunology. – 2010. –
Vol. 22, N7. – Р. 551–559.
15. Maddalena S., Elsa V., Lucia G. et al. Isolation and characteri-
zation of mesenchymal cells from human fetal membranes // J.
Tissue Eng. Regen. Med. – 2007. – Vol.1, N4. – Р. 296–305.
16. Mamidi M.K., Nathan K.G., Singh G. et al. Comparative cel-
lular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent
mesenchymal stromal cells during continuous passaging and
after successive cryopreservation // J. Cell Biochem. – 2012. –
Vol. 113, N10. – P. 3153–3164.
17. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. –
1999. – Vol. 284, N2. – Р. 143–147.
18. Tokumoto S., Sotome S., Torigoe I. et al. Effects of cryopre-
servation on bone marrow derived mesenchymal cells of a
nonhuman primate // J. Med. Dent. Sci. – 2008. – Vol. 55, N1. –
P. 137–143.
Accepted 1.06.2012
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68487 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Ukrainian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:25:18Z |
| publishDate | 2012 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Волкова, Н.О. 2014-09-25T07:08:49Z 2014-09-25T07:08:49Z 2012 Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження / Н.О. Волкова // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 118-125. — Бібліогр.: 18 назв. — укр., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68487 611.018.46.085.23:615.014.41 Проведено кріоконсервування мезенхімальних стромальних клітин (МСК) кісткового мозку та культури клітин хоріона (ККХ) під захистом 10 % ДМСО та 20 % ембріональної сироватки з застосуванням низької швидкості охолодження (1 град/хв) до -80 градусів за Цельсієм із наступним зануренням у рідкий азот. Одержані результати показали, що після низькотемпературного зберігання обидві досліджені культури зберігали здатність до проліферації та спрямованого диференціювання. ККХ характеризувалася більш високою проліферативною активністю у порівнянні з МСК кісткового мозку. Здатність до спрямованого диференціювання в адипо- та хондрогенному напрямках була вищою у МСК кісткового мозку, ніж у ККХ. Проведено криоконсервирование мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга и культуры клеток хориона (ККХ) под защитой 10% ДМСО и 20% эмбриональной сыворотки с использованием низкой скорости охлаждения (1 град/мин) до –80°С с последующим погружением в жидкий азот. Полученные результаты показали, что после низькотемпературного хранения обе исследуемые культуры сохраняли способность к пролиферации и направленному дифференцированию. Культура клеток хориона характеризовалась более высокой пролиферативной активностью относительно МСК костного мозга. Способность к направленному дифференцированию в адипо- и хондрогенном направлениях была выше у МСК костного мозга, чем у ККХ. Mesenchymal stromal cells (MSCs) of bone marrow and chorion cell culture (CCC) were cryopreserved under protection of 10% DMSO and 20% fetal bovine serum using low cooling rate (1 deg/min) down to –80°C with following plunging into liquid nitrogen. The findings have shown than after low temperature storage both studied cultures kept the ability to proliferation and directed differentiation. Chorion cell culture was characterized with higher proliferative activity if compared with bone marrow MSCs. The ability to the directed differentiation towards adipo- and chondrogeneic lineages was higher for bone marrow MSCs versus CCC. uk Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження Study of Morphological Characteristics of Cryopreserved Cell Cultures of Stromal Origin Article published earlier |
| spellingShingle | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження Волкова, Н.О. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| title_alt | Study of Morphological Characteristics of Cryopreserved Cell Cultures of Stromal Origin |
| title_full | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| title_fullStr | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| title_full_unstemmed | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| title_short | Дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| title_sort | дослідження морфофункціональних характеристик кріоконсервованих культур клітин стромального походження |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68487 |
| work_keys_str_mv | AT volkovano doslídžennâmorfofunkcíonalʹnihharakteristikkríokonservovanihkulʹturklítinstromalʹnogopohodžennâ AT volkovano studyofmorphologicalcharacteristicsofcryopreservedcellculturesofstromalorigin |