Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом
Исследовано развитие гипертонического криогемолиза эритроцитов, модифицированных iodoacetamide (IAA) и p-chlormercuribenzoate (p-CMB) в средах, содержащих криопротекторы (глицерин, 1,2-пропандиол, полиэтиленгликоль-1500). Показано, что независимо от присутствия в среде инкубации криозащитных соедине...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2012 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68488 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом / Я.О. Черкашина // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 126-132. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860242943796838400 |
|---|---|
| author | Черкашина, Я.О. |
| author_facet | Черкашина, Я.О. |
| citation_txt | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом / Я.О. Черкашина // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 126-132. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Исследовано развитие гипертонического криогемолиза эритроцитов, модифицированных iodoacetamide (IAA) и p-chlormercuribenzoate (p-CMB) в средах, содержащих криопротекторы (глицерин, 1,2-пропандиол, полиэтиленгликоль-1500). Показано, что независимо от присутствия в среде инкубации криозащитных соединений модификация белкового компонента эритроцитов IAA и p-CMB приводит к повышению чувствительности эритроцитов к гипертоническому криогемолизу, что может быть обусловлено изменением конформации белков, прямо или опосредованно вовлеченных в механизмы адаптации клеток к стрессовым воздействиям.
Досліджували розвиток гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів, що модифіковані iodoacetamide (IAA) та p-chlormercuribenzoate (p-CMB) у середовищах, що містять кріопротектори (гліцерин, 1,2-пропандіол, поліетиленгліколь-1500). Показано, що незалежно від присутності у середовищі інкубування кріозахисних сполук, модифікація білкового компонента IAA та p-CMB призводить до підвищення чутливості клітин до гіпертонічного кріогемолізу, що може бути обумовлено зміною конформації білків, прямо чи опосередковано залучених у механізми адаптації клітин до стресових дій.
There was studied the development of hypertonic cryohemolysis of erythrocytes, modified with iodoacetamide (IAA) and pchlormercuribenzoate (p-CMB) in the media containing cryoprotectants (glycerol, 1,2-propane diol, polyethylene glycerol-1500). It has been shown that independently on the presence in the incubation medium of cryoprotective compounds when modifying the protein component of erythrocytes with IAA and p-CMB the sensitivity of erythrocytes to hypertonic cryohemolysis increases. This may be stipulated with the change in conformation of the proteins directly or indirectly involved into adaptation mechanisms of cells to stress effects.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:32:17Z |
| format | Article |
| fulltext |
126
* Адрес для корреспонденции : ул. Переяславская, 23,
г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-41-35, факс: (+38
057) 373-30-84, электронная почта: nardidyana@gmail.com
* Address for correspondence: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov,
Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 4135, fax: +380 57 373 3084, e-
mail: nardidyana@gmail.com
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
В настоящее время все более широкое приме-
нение приобретает длительное низкотемпера-
турное хранение клеточных суспензий, тканей и
других биологических объектов [11, 15]. Поэтому
важно изучение процессов, происходящих на раз-
личных этапах криоконсервирования биообъектов.
Известно [1, 11], что при замораживании клеток
изменяются осмотические и температурные усло-
вия среды. Частично такие условия можно смоде-
лировать в процессе гипертонического криогемо-
лиза, который представляет собой лизис клеток,
подвергнутых инкубации в гипертонических сре-
дах при положительных температурах и последую-
щему охлаждению до 0°С. Поскольку криопротек-
торы могут снижать чувствительность эритроци-
тов человека к гипертоническому криогемолизу [3],
представляло интерес исследовать их влияние на
Nowadays long-term low temperature storage of
cell suspensions, tissues and other biological objects
has gained wider application [11, 15], therefore inves-
tigation of the processes occurring at different stages
of the cryopreservation is important. During freezing
of cells the osmotic and temperature environmental
conditions is known to vary [1, 11]. These conditions
could be partly simulated with hypertonic cryohemolysis,
representing the lysis of cells subjected to incubation
in hypertonic media at positive temperatures and fol-
lowing cooling down to 0°C. It has been shown that
under certain conditions the cryoprotectants reduce the
sensitivity of human erythrocytes to hypertonic cryo-
hemolysis [3], therefore there was interesting to study
the effect of cryoprotectants on development of hemo-
lytic injury in erythrocytes with modified cytoskeleton-
membrane complex.
УДК 57.043:577.352.4:611.018.51:547.422
Я.О. ЧЕРКАШИНА
Влияние криопротекторов на уровень гипертонического
криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным
цитоскелет-мембранным комплексом
UDC 57.043:577.352.4:611.018.51:547.422
YA.O. CHERKASHINA
Effect of Cryoprotectants on Hypertonic Cryohemolysis Rate of
Human Erythrocytes with Modified Cytoskeleton-Membrane Complex
Исследовали развитие гипертонического криогемолиза эритроцитов, модифицированных iodoacetamide (IAA) и p-
chlormercuribenzoate (p-CMB) в средах, содержащих криопротекторы (глицерин, 1,2-пропандиол, полиэтиленгликоль-1500).
Показано, что независимо от присутствия в среде инкубации криозащитных соединений модификация белкового компонента
эритроцитов IAA и p-CMB приводит к повышению чувствительности эритроцитов к гипертоническому криогемолизу, что
может быть обусловлено изменением конформации белков, прямо или опосредованно вовлеченных в механизмы адаптации
клеток к стрессовым воздействиям.
Ключевые слова: гипертонический криогемолиз, эритроциты, криопротекторы, модификаторы сульфгидрильных групп
белков.
Досліджували розвиток гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів, що модифіковані iodoacetamide (IAA) та p-chlormer-
curibenzoate (p-CMB) у середовищах, що містять кріопротектори (гліцерин, 1,2-пропандіол, поліетиленгліколь-1500). Показано,
що незалежно від присутності у середовищі інкубування кріозахисних сполук, модифікація білкового компонента IAA та
p-CMB призводить до підвищення чутливості клітин до гіпертонічного кріогемолізу, що може бути обумовлено зміною
конформації білків, прямо чи опосередковано залучених у механізми адаптації клітин до стресових дій.
Ключові слова: гіпертонічний кріогемоліз, еритроцити, кріопротектори, модифікатори сульфгідрильних груп білків.
There was studied the development of hypertonic cryohemolysis of erythrocytes, modified with iodoacetamide (IAA) and p-
chlormercuribenzoate (p-CMB) in the media containing cryoprotectants (glycerol, 1,2-propane diol, polyethylene glycerol-1500). It
has been shown that independently on the presence in the incubation medium of cryoprotective compounds when modifying the
protein component of erythrocytes with IAA and p-CMB the sensitivity of erythrocytes to hypertonic cryohemolysis increases.
This may be stipulated with the change in conformation of the proteins directly or indirectly involved into adaptation mechanisms of
cells to stress effects.
Key words: hypertonic cryohemolysis, erythrocytes, cryoprotectants, modifiers of protein sulfhydryl groups.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
127
The research aim was to study the effect of cryo-
protectants (glycerol, 1,2-propane diol, polyethylene
glycol-1500) on hypertonic cryohemolysis of erythro-
cytes with modified cytoskeleton-membrane complex
(iodoacetamide and parachlormercurium benzoate) in
the media containing 1.2 mol/l NaCl.
Materials and methods
Conventionally obtained erythrocytes of group II
donor blood were used in the experiments. All the used
media were prepared on base of 10 mmol/l tris-HCl-
buffer, pH 7.4. To saturate erythrocytes with penetrat-
ing cryoprotectants (glycerol, 1,2-propane diol) the cells
were incubated in the solution containing 0.15 mol/l
NaCl and 5% solution of corresponding cryoprotectant
for 30 min at 37°C. Erythrocytes were treated with mo-
difiers of sulfhydryl groups according to C.W.M. Haest
[9]. The cells were incubated with 15 mmol/l iodo-
acetamide (IAA) for 20 min, afterwards p-chlor-
mercuribenzoate (p-CMB) under 1 mmol/l concentra-
tion was added to the suspension and incubated an-
other 1 hr.
Hypertonic cryohemolysis was initiated in the fol-
lowing way: the cells were incubated in 1.2 mol/l NaCl
at the temperature of 37°C for 1–60 min and then at
the temperature of 0°C for 10 min. The medium where
the cells were incubated during hypertonic cryohemo-
lysis contained one of the cryoprotectants (5% glyc-
erol, 5% 1,2-propane diol and 20% polyethylene gly-
col-1500 (PEG-1500)). The incubation of the cells in
hypertonic medium was the 1st stage and exposure of
the erythrocytes at 0°C was the 2nd stage of hyper-
tonic cryohemolysis. Afterwards the cells were sedi-
mented with centrifugation for 3 min at 1500 g. The
content of hemoglobin in supernatant was found spec-
trophotometrically using SF-4A device and flow cu-
vette at 543 nm. Hemoglobin release out of cell was
calculated in percentage vs. 100% hemolysis of eryth-
rocytes in presence of 0.1% triton X-100 solution.
The results were statistically processed on Student-
Fisher's method.
Results and discussion
Iodoacetamide (IAA) и p-chloromercuribenzoate
(p-CMB) are the protein reagents interacting with SH-
groups of band 3 protein [7]. Iodoacetamide is sulfhydryl
acetylating reagent blocking both membrane and cyto-
plasma SH-group pool [7], but not interacting with p-
CMB-specific SH-group on band 3 protein chymo-
tryptic fragment (17 kDa), located in lipid bilayer of
membrane [14]. p-chlormercuribenzoate being hydro-
phobic and charged molecule, affects the erythrocyte
membrane and destroys protein structural interactions,
causes dissociation and solubilization of cytoskeleton
развитие гемолитического повреждения эритроци-
тов с модифицированным цитоскелет-мембран-
ным комплексом.
Цель работы – исследовать влияние криопро-
текторов (глицерин, 1,2-пропандиол, полиэтиленгли-
коль-1500) на уровень гипертонического криогемо-
лиза эритроцитов человека с модифицированным
цитоскелет-мембранным комплексом (iodoaceta-
mide и p-chloromercuribenzoate) в среде, содержа-
щей 1,2 моль/л NaCl.
Материалы и методы
В экспериментах были использованы эритроци-
ты донорской крови II группы, полученные по обще-
принятой методике. Все экспериментальные среды
готовили на 10 ммоль/л трис-HCl-буфере, pH 7,4.
Для насыщения эритроцитов проникающими крио-
протекторами (глицерин, 1,2-пропандиол) клетки
предварительно инкубировали в физиологическом
растворе, содержащем криопротектор 5%, в течение
30 мин при 37°С. Обработку эритроцитов модифи-
каторами белков проводили по методу, описанному
ранее [9]. Клетки инкубировали с 15 ммоль/л iodo-
acetamide («Serva», США) в течение 20 мин, затем
добавляли p-chloromercuribenzoate («Sigma», США)
в концентрации 1 ммоль/л и инкубировали 1 ч.
Гипертонический криогемолиз осуществляли
следующим образом: клетки инкубировали в
растворе 1,2 моль/л NaCl при температуре 37°С в
течение 1–60 мин, затем экспонировали при 0°С в
среде той же тоничности 10 мин. Среда, в которой
инкубировали клетки в процессе гипертонического
криогемолиза, содержала один из криопротекторов
(5% глицерина, 5% 1,2-пропандиола и 20% полиэти-
ленгликоля-1500 (ПЭГ-1500)). Инкубирование эрит-
роцитов в гипертонической среде при температуре
37°С считали 1-м этапом, а экспонирование клеток
при 0°С – 2-м этапом гипертонического криогемо-
лиза. После проведения гипертонического криоге-
молиза клетки осаждали центрифугированием в
течение 3 мин при 1500g. Содержание вышедшего
в супернатант гемоглобина регистрировали спект-
рофотометрически на СФ 4А с проточной кюветой
при длине волны 543 нм. Выход гемоглобина из
клетки рассчитывали в процентах относительно
100%-го гемолиза эритроцитов в присутствии
0,1%-го раствора тритона Х-100.
Результаты статистически обрабатывали с
использованием метода Стьюдента-Фишера.
Результаты и обсуждение
Iodoacetamide (IAA) и p-chloromercuribenzoate
(p-CMB) являются белковыми реагентами, кото-
рые взаимодействуют с SH-группами белков эрит-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
128
роцитов [7]. Так, IAA – сульфгидрильный ацетили-
рующий реагент, блокирующий как мембранный,
так и цитоплазматический пул SH-групп [7], но не
взаимодействующий с p-CMB-специфической SH-
группой на 17 кДа химотриптическом фрагменте
белка полосы 3, который локализуется в липидном
бислое мембраны [14]. p-CMB, являясь гидрофоб-
ной и заряженной молекулой, при действии на
мембрану эритроцитов нарушает в ней структур-
ные взаимодействия белков, вызывает диссоциа-
цию и солюбилизацию белков цитоскелета [12, 13].
Без предобработки клеток IAA p-CMB не оказы-
вает влияния на p-CMB-специфические SH-группы
и связывается с другими SH-группами, в том числе
с SH-группами белка полосы 3 [7, 10, 16]. Соче-
танное действие IAA и p-CMB приводит к моди-
фикации белков полос 4.1, 4.3, 4.9, 2.1 (анкирина,
связывающего спектрин с белком полосы 3) [2].
Комбинированная обработка эритроцитов чело-
века с помощью IAA и p-CMB приводит также к
изменению конформации цитоплазматического
домена белка полосы 3, вследствие которого нару-
шается взаимодействие этого белка с анкирином
и спектрином [2]. Известно также, что p-CMB ин-
гибирует транспорт воды через мембрану эритро-
цита [6, 16].
На рис. 1 представлены данные об уровне ги-
пертонического криогемолиза эритроцитов в среде,
содержащей 1,2 моль/л NaCl. Установлено, что
уровень гемолиза снижается с увеличением про-
должительности инкубации клеток на 1-м этапе ги-
пертонического криогемолиза (рис. 1, незакрашен-
ные столбцы), что согласуется с данными, полу-
ченными ранее [3, 4, 8]. Предварительная модифи-
кация эритроцитов человека IAA и p-CMB приво-
дит к сдвигу уровня гемолиза в сторону более вы-
соких значений и не изменяет характер зависи-
мости гипертонического криогемолиза от продол-
жительности инкубации на 1-м этапе (рис. 1).
В следующей серии экспериментов вводили
проникающие криопротекторы (1,2-пропандиол и
глицерин) в среду, в которой клетки подвергали
гипертоническому криогемолизу (рис. 2). Видно,
что криопротекторы не изменяют характер времен-
ной зависимости гипертонического криогемолиза,
представленной на рис. 1 и 2 (незакрашенные
столбцы). Следует отметить, что непродолжи-
тельная инкубация (1 мин) клеток в присутствии
криопротектора на 1-м этапе гипертонического
криогемолиза приводит к более высокому уровню
повреждения. Как видно из рис. 2, A, модификация
эритроцитов IAA и p-CMB не приводит к измене-
нию уровня гипертонического криогемолиза в при-
сутствии 1,2-пропандиола при непродолжительной
инкубации клеток (1–10 мин) на 1-м этапе. Однако
proteins [12, 13]. Without IAA treatment p-CMB does
not affect p-CMB-specific SH-groups, and binds with
other SH-groups, including SH-groups of band 3 protein
[7, 10, 16]. A combined treatment of human
erythrocytes with IAA and p-CMB leads also to the
change in conformation of cytoplasm domain of band
3 protein resulting in an impaired interaction of this
protein with ankyrin and spectrin [2]. p-CMB is also
known as inhibiting the water transport through the
erythrocyte membrane [6, 16].
Fig. 1 demonstrates the data on the level of hyper-
tonic cryohemolsyis of erythrocytes in the medium,
containing 1.2 mol/l NaCl. It has been established that
when prolonging the incubation in hypertonic medium
at the 1st stage of hypertonic cryohemolysis the rate of
hemolysis reduces (Fig. 1, white columns) that corres-
ponded to the data obtained previously [3, 4, 8]. Pre-
modification of human erythrocytes with IAA and p-
CMB led to the shift of cryohemolysis rate towards
higher values and did not change the character of the
depen-dence of hypertonic cryohemolysis on the dura-
tion of the incubation at the 1st stage (Fig. 1).
Next series of experiments involved the supplement-
ing of the medium for hypertonic cryohemolysis with
penetrating cryoprotectants (1,2-propane diol and glyc-
erol) (Fig. 2). It is seen that the presence of cryoprotec-
tants did not change the temporal character of the
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 20 40 60
Рис. 1. Уровень гипертонического криогемолиза эритро-
цитов человека в зависимости от продолжительности
инкубации в растворе 1,2 моль/л NaCl при 37°С: –
немодифицированные эритроциты; – эритроциты,
модифицированные IAA и p-CMB.
Fig. 1. Rate of hypertonic cryohemolysis for human eryth-
rocytes in dependence of term of incubation in 1.2 mol/l
NaCl solution at 37°С: 1 – non-modified erythrocytes; 2 –
IAA and p-CMB modified erythrocytes.
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Продолжительность инкубации, мин
Incubation term, min
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
129
увеличение продолжительности инкубации модифи-
цированных эритроцитов приводит к статистически
значимому повышению уровня повреждения клеток
по сравнению с контрольными. В том случае, когда
среда инкубации содержала глицерин (рис. 2, B),
уровень гемолиза модифицированных клеток был
выше по сравнению с контрольными клетками во
всем временном диапазоне.
Сравнительный анализ данных, представленных
на рис. 1 и 3 (незакрашенные столбцы), показывает,
что присутствие в среде непроникающего криопро-
тектора ПЭГ-1500 приводит к снижению уровня
гемолитического повреждения эритроцитов на про-
тяжении всего времени инкубации клеток на 1-м
этапе. Предварительная обработка эритроцитов мо-
дификаторами цитоскелет-мембранного комплек-
са приводит к увеличению уровня гипертоничес-
кого криогемолиза в присутствии непроникающего
криопротектора (рис. 3, закрашенные столбцы). Та-
ким образом, независимо от вида используемого
криопротектора, обработка эритроцитов модифика-
торами цитоскелет-мембранного комплекса (IAA
и p-CMB) приводит к увеличению повреждения
клеток в условиях гипертонического криогемолиза.
Многие биологические объекты повреждаются
при охлаждении в изоосмотических условиях. Для
лизиса эритроцитов млекопитающих при сдвиге
температуры от 37 до 0°С необходимы гипертони-
ческие условия, которые являются сенсибилизи-
рующим фактором к охлаждению. Криопротек-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 20 40 60
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 20 40 60
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
%
Рис. 2. Уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека в зависимости от продолжительности инку-
бации в растворе, содержащем 1,2 моль/л NaCl при 37°С: A –1,2-пропандиол ( – 5% 1,2-пропандиола; – 5% 1,2-
пропандиола + IAA и p-CMB); B – глицерин ( – 5 % глицерина; – 5% глицерина + IAA и p-CMB).
Fig. 2. Rate of hypertonic cryohemolysis for human eryth-rocytes in dependence of term of incubation in 1.2 mol/l NaCl
solution at 37°С: A – 1,2-propane diol ( – 5% 1,2-propane diol; – 5% 1,2-propanediol + IAA and p-CMB); B – glycerol ( –
5% glycerol; – 5% glycerol + IAA and p-CMB).
Продолжительность инкубации, мин
Incubation term, min
Продолжительность инкубации, мин
Incubation term, min
A B
cryohemolysis rate in the Figs. 1 and 2 (white columns).
Short-time incubation (during 1 min) of the cells in the
presence of cryoprotectants at the 1st stage of hyper-
tonic cryohemolysis did not lead to the higher rate of
injury. Modification of erythrocytes with IAA and p-
CMB did not increase the rate of hypertonic cryo-
hemolysis after short-term incubation of the cells (1–
10 min) at the 1st stage in the medium, containing 1,2-
propane diol (Fig. 2A). However, the prolongation of
incubation for modified cells results in statistically sig-
nificant rise in the rate of erythrocyte injury if com-
pared with the non-modified cells. In the case if the
incubation medium contained glycerol (Fig. 2B) the
hemolysis rate in modified cells was higher if compared
with non-modified cells through the whole observation
period.
The comparison of the data in Figs. 1 and 3 (white
columns) showed that the presence of non-penetrating
cryoprotectant PEO-1500 in the medium led to the low-
ering of the rate of hemolytic injury in the erythocytes
through the whole period of incubation at the 1st stage.
Pre-treatment of erythrocytes with modifiers of cy-
toskeleton-membrane complex led to the increase of
the rate of hypertonic cryohemolysis in the presence
of non-penetrating cryoprotectant (Fig. 3, grey col-
umns). Thus, independently of the used cryoprotectant
the treatment of erythrocytes with cytoskeleton-mem-
brane complex modifiers (IAA and p-CMB) led to the
rise in cell damage rate under the hypertonic cryo-
hemolysis conditions.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
130
Many biological objects are being damaged under
cooling in isoosmotic conditions. Lysis of erythrocytes
after shift of temperature from 37 down to 0°C is pos-
sible only in hypertonic conditions, being the sensibiliza-
ting additives to cooling. A cryoprotectant independ-
ently of mechanism of its action allows to decrease
the rate of erythocytes injury under hypertonic cryohe-
molysis conditions. It was shown earlier in our experi-
ments, that presence of non-penetrating cryoprotectant
PEO-1500 in the media decreased significantly the sen-
sitivity of the erythrocytes to hypertonic cryohemolysis.
At the same time the addition of penetrating cryopro-
tectants (propane diol and glycerol) resulted in the de-
creased sensitivity of human erythrocytes at the very
start of incubation (up to the 10th min) and followed by
the increased sensitivity to the mentioned process [3].
In the present research the protective action of pen-
etrating (propane diol, glycerol) and non-penetrating
(PEO-1500) cryoprotectants revealed as the lowered
sensitivity of erythrocytes to hypertonic cryohemolysis
was neutralized if the cytoskeleton-membrane com-
plex of cells was modified by IAA and p-CMB (Figs.
2 and 3). One of the effects of PCMB onto the mem-
brane is the inhibition of water transport [6]. It is known
also that mammalian erythrocytes characterized by
lower hydraulic conductivity are being damaged in
greater extent under the alterations of osmotic and tem-
perature conditions of medium [5]. Treatment of eryth-
rocytes with modifiers of cytoskeleton-membrane com-
plex leads to the covalent cross-linkage in the mem-
brane, making it more rigid. The above mentioned facts
allow to hypothese the found in the present investiga-
tion decreased efficiency of cryoprotectants in the
conditions of hypertonic cryohemolysis of erythrocytes
with modified cytoskeleton-membrane complex to be
associated either with changed membrane rigidity or
with changed rate of water transport.
торы, независимо от механизма их действия,
позволяют снизить уровень повреждения эритро-
цитов при гипертоническом криогемолизе. Ранее
в наших работах было показано, что присутствие
в среде непроникающего криопротектора ПЭГ-
1500 заметно снижает чувствительность эритроци-
тов человека к гипертоническому криогемолизу.
В то же время использование проникающих крио-
протекторов (пропандиол и глицерин) приводит к
снижению чувствительности клеток к гипертони-
ческому криогемолизу на начальном этапе ин-
кубации (до 10-й минуты) и последующему возрас-
танию чувствительности к указанному процессу
[3]. В настоящей работе показано, что защитное
действие проникающих (пропандиол, глицерин) и
непроникающих криопротекторов (ПЭГ-1500),
проявляющееся в снижении чувствительности
эритроцитов к гипертоническому криогемолизу,
нивелируется, если модифицировать цитоскелет-
мембранный комплекс клеток IAA и p-CMB (рис. 2
и 3). Одним из действий p-CMB на мембрану
является ингибирование транспорта воды [6]. Кро-
ме того, известно, что эритроциты млекопитающих,
характеризующиеся более низкими скоростями
водного транспорта, повреждаются в большей
степени при изменении осмотических и темпера-
турных условий среды [5]. Обработка эритроцитов
модификаторами цитоскелет-мембранного комп-
лекса приводит к образованию ковалентных сши-
вок в мембране, что делает ее более жесткой. Из
вышесказанного можно предположить, что отме-
ченное в работе снижение эффективности криопро-
текторов в условиях гипертонического криогемо-
лиза эритроцитов с модифицированным цитоске-
лет-мембранным комплексом может быть связано
как с изменением жесткости мембраны, так и с
изменением скорости транспорта воды.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 10 20 40 60
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
,
% Рис. 3. Уровень гипертонического криогемолиза эритро-
цитов человека в зависимости от продолжительности
инкубации в растворе, содержащем 1,2 моль/л NaCl при
37°С: – 20% ПЭГ-1500; – 20% ПЭГ-1500 + IAA и p-
CMB.
Fig. 3. Level of hypertonic cryohemolysis of human erythro-
cytes depending on incubation perioud in solution of 1.2
mol/l NaCl at 37°С: – 20% PEG-1500; – 20% PEG-1500 +
IAA and p-CMB.
Продолжительность инкубации, мин
Incubation term, min
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
131
Литература
1. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. – Киев: Наук.
думка, 1994. – 432 с.
2. Єршов С.С. Осмотична та температурна чутливість
еритроцитів ссавців: Автореф. дис… канд. біол. наук. –
Харків, 2009. – 20 с.
3. Кудокоцева Е.В., Рамазанов В.В., Тимченко Л.Н. и др.
Влияние модификаторов цитоскелета на структурный
спектр белков цитоскелета эритроцитов человека // Про-
блемы криобиологии. – 1998. – №4. – С. 22–25.
4. Нардид Я.О., Даниленко Н.А. Рамазанов В.В. Бондарен-
ко В.А. Влияние хлорида алюминия и различных криопро-
текторов на развитие гипертонического криогемолиза
эритроцитов человека // Проблемы криобиологии. –
2005. – Т. 15, №4. – С. 607–613.
5. Шпакова Н.М., Семенченко А.Ю., Бондаренко В.А. Моди-
фицирующий эффект конканавалина-А и диамида на чув-
ствительность эритроцитов к холодовому шоку // Биохи-
мия. –1991. – Т. 56, №5. – С. 923–929.
6. Brahm J. Diffusional water permeability of human erythrocytes
and their ghosts // J. Gen. Physiol. – 1982. – Vol. 79, №5. –
P. 791–819.
7. Deuticke B. The role of membrane sulfhydryls in passive, me-
diated transport processes and for the barrier function of the
erythrocyte membrane // Membrane biochemistry. – 1986. –
Vol. 6, №4. – P. 309–326.
8. Green F.A., Jung C.Y., Cuppoletti J., Owens N. Hypertonic
cryohemolysis and cytoskeletal system // Biochem. Biophys.
Acta. – 1981. – Vol. 648. – P. 225–230.
9. Haest C.W.M., Kamp D., Deuticke B. Topology of membrane
sulfhydryl groups in the human erythrocyte. Demonstration
of a non–reactive population in intrinsic proteins // Biochem.
Biophys. Acta. – 1981. – Vol. 643, №2. – Р. 219–326.
10.Jarolim P., Lahav M., Liu S.C., Pale K.J. Effect hemoglobin
oxidation products on the stability of red cell membrane
skeletons and the associations of skeletal proteins: correlation
with a release of hemin // Blood. – 1990. – Vol. 76, №10. –
P. 2125–2131.
11.Kanias T., Acker J.P. Biopreservation of red blood cells – the
struggle with hemoglobin oxidation // FEBS J. – 2010. – Vol. 277,
№2. – P. 343–356.
12.Kuniboto M., Shibata K., Miura T. p-chlormercuribenzoate-
induced dissociation of cytoskeletal protein in red blood cell of
rats // Biochem. Biophys. Acta. – 1987. – Vol. 905, №2. –
P. 257–267.
13. Ralston G.B., Crisp E.A. The action of organic mercurials on
the erythrocyte membrane // Biochem. Biophys. Acta. – 1981. –
Vol. 649, №1. – P. 98–104.
14.Ramjeesingh M., Gaarn A., Rothstein A. The locations of the
three cysteine residues in the primary structure of the intrinsic
References
1. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology. – Kiev: Naukova
Dumka. – 1994. – 432 p.
2. Ershov S.S. Osmotic and temperature sensitivity of mammalian
erythrocytes: Author’s abstract of the Thesis ... Cand. Biol.
Sci. – Kharkov, 2009. – 20 p.
3. Kudokotseva E.V., Ramazanov V.V., Timchenko L.N. et al.
Effect of cytoskeleton modifiers on structural spectrum of
human erythrocyte cytoskeletal proteins // Problems of
Cryobiology. – 1998. – N4. – P. 22–25.
4. Nardid Ya.O., Danilenko N.A., Ramazanov V.V., Bondaren-
ko V.A. Effect of aluminum chloride and different cryoprotec-
tants on development of hypertonic cryohemolysis of human
erythrocytes// Problems of Cryobiology. – 2005. – Vol. 15,
N4. – P. 607–613.
5. Shpakova N.M., Semenchenko A.Yu., Bondarenko V.A. Modi-
fying effect of concanavalin-A and diamide on sensitivity of
erythrocytes to cold shock// Biochemistry (Moscow). – 1991. –
Vol. 56, N5. – P. 923–299.
6. Brahm J. Diffusional water permeability of human erythrocytes
and their ghosts // J. Gen. Physiol. – 1982. – Vol. 79, №5. –
P. 791–819.
7. Deuticke B. The role of membrane sulfhydryls in passive,
mediated transport processes and for the barrier function of
the erythrocyte membrane // Membrane biochemistry. – 1986. –
Vol. 6, N4. – P. 309–326.
8. Green F.A., Jung C.Y., Cuppoletti J., Owens N. Hypertonic
cryohemolysis and cytoskeletal system // Biochem. Biophys.
Acta. – 1981. – Vol. 648. – P. 225–230.
9. Haest C.W.M., Kamp D., Deuticke B. Topology of membrane
sulfhydryl groups in the human erythrocyte. Demonstration
of a non–reactive population in intrinsic proteins // Biochem.
Biophys. Acta. – 1981. – Vol. 643, N2. – Р. 219–326.
10.Jarolim P., Lahav M., Liu S.C., Pale K.J. Effect hemoglobin
oxidation products on the stability of red cell membrane
skeletons and the associations of skeletal proteins: correlation
with a release of hemin // Blood. – 1990. – Vol. 76, N10. –
P. 2125–2131.
11.Kanias T., Acker J.P. Biopreservation of red blood cells – the
struggle with hemoglobin oxidation // FEBS J. – 2010. – Vol. 277,
N2. – P. 343–356.
12.Kuniboto M., Shibata K., Miura T. p–chlormercuribenzoate-
induced dissociation of cytoskeletal protein in red blood cell of
rats // Biochem. Biophys. Acta. – 1987. – Vol. 905, N2. – P. 257–
267.
13.Ralston G.B., Crisp E.A. The action of organic mercurials on
the erythrocyte membrane // Biochem. Biophys. Acta. – 1981. –
Vol. 649, N1. – P. 98–104.
14.Ramjeesingh M., Gaarn A., Rothstein A. The locations of the
three cysteine residues in the primary structure of the intrinsic
Conclusions
Thus, the modification of erythrocyte protein com-
ponent with IAA and PCMB results in lowered
efficience of both penetrating and non-penetrating
cryoprotectants under hypertonic cryohemolysis of
human erythrocytes.
Author aknowledges V.V. Ramazanov, PhD, senior re-
search fellow of the Institute for Problems of Cryobiology
and Cryomedicine for assistance during planing the ex-
periments.
Выводы
Модификация цитоскелет-мембранного комп-
лекса с помощью IAA и p-CMB снижает эффек-
тивность как проникающих, так и непроникающих
криопротекторов в условиях гипертонического
криогемолиза эритроцитов человека.
Автор выражает благодарность с.н.с., к.б.н. Ин-
ститута проблем криобиологии и криомедицины НАН
Украины Рамазанову В.В. за содействие в планирова-
нии экспериментов.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
132
segments of band 3 proteins, and implications concerning the
arrangement of band 3 protein in the bilayer // Biochem.
Biophys. Acta. – 1983. – Vol. 729, №1. – P. 150–160.
15.Salzer U., Zhu R., Luten M. et al. Vesicles generated during
storage of red cells are rich in the lipid raft marker stomatin //
Transfusion. – 2008. – Vol. 48, №3. – P. 451–462.
16.Zhang Z.H., Solomon A.K. Effect of PCMB on anion transport
in human red cell membranes // Biochem. Biophys. Acta. –
1992. – Vol. 1106, №1. – P. 31–39.
Поступила 05.07.2011
segments of band 3 proteins, and implications concerning the
arrangement of band 3 protein in the bilayer // Biochem.
Biophys. Acta. – 1983. – Vol. 729, N1. – P. 150–160.
15.Salzer U., Zhu R., Luten M. et al. Vesicles generated during
storage of red cells are rich in the lipid raft marker stomatin //
Transfusion. – 2008. – Vol. 48, N3. – P. 451–462.
16.Zhang Z.H., Solomon A.K. Effect of PCMB on anion transport
in human red cell membranes // Biochem. Biophys. Acta. –
1992. – Vol. 1106, N1. – P. 31–39.
Accepted 05.07.2011
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68488 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:32:17Z |
| publishDate | 2012 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Черкашина, Я.О. 2014-09-25T07:10:18Z 2014-09-25T07:10:18Z 2012 Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом / Я.О. Черкашина // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 126-132. — Бібліогр.: 16 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68488 57.043:577.352.4:611.018.51:547.422 Исследовано развитие гипертонического криогемолиза эритроцитов, модифицированных iodoacetamide (IAA) и p-chlormercuribenzoate (p-CMB) в средах, содержащих криопротекторы (глицерин, 1,2-пропандиол, полиэтиленгликоль-1500). Показано, что независимо от присутствия в среде инкубации криозащитных соединений модификация белкового компонента эритроцитов IAA и p-CMB приводит к повышению чувствительности эритроцитов к гипертоническому криогемолизу, что может быть обусловлено изменением конформации белков, прямо или опосредованно вовлеченных в механизмы адаптации клеток к стрессовым воздействиям. Досліджували розвиток гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів, що модифіковані iodoacetamide (IAA) та p-chlormercuribenzoate (p-CMB) у середовищах, що містять кріопротектори (гліцерин, 1,2-пропандіол, поліетиленгліколь-1500). Показано, що незалежно від присутності у середовищі інкубування кріозахисних сполук, модифікація білкового компонента IAA та p-CMB призводить до підвищення чутливості клітин до гіпертонічного кріогемолізу, що може бути обумовлено зміною конформації білків, прямо чи опосередковано залучених у механізми адаптації клітин до стресових дій. There was studied the development of hypertonic cryohemolysis of erythrocytes, modified with iodoacetamide (IAA) and pchlormercuribenzoate (p-CMB) in the media containing cryoprotectants (glycerol, 1,2-propane diol, polyethylene glycerol-1500). It has been shown that independently on the presence in the incubation medium of cryoprotective compounds when modifying the protein component of erythrocytes with IAA and p-CMB the sensitivity of erythrocytes to hypertonic cryohemolysis increases. This may be stipulated with the change in conformation of the proteins directly or indirectly involved into adaptation mechanisms of cells to stress effects. Автор выражает благодарность с.н.с., к.б.н. Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Рамазанову В.В. за содействие в планировании экспериментов. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом Effect of Cryoprotectants on Hypertonic Cryohemolysis Rate of Human Erythrocytes with Modified Cytoskeleton-Membrane Complex Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом Черкашина, Я.О. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| title_alt | Effect of Cryoprotectants on Hypertonic Cryohemolysis Rate of Human Erythrocytes with Modified Cytoskeleton-Membrane Complex |
| title_full | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| title_fullStr | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| title_full_unstemmed | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| title_short | Влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| title_sort | влияние криопротекторов на уровень гипертонического криогемолиза эритроцитов человека с модифицированным цитоскелет-мембранным комплексом |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68488 |
| work_keys_str_mv | AT čerkašinaâo vliâniekrioprotektorovnaurovenʹgipertoničeskogokriogemolizaéritrocitovčelovekasmodificirovannymcitoskeletmembrannymkompleksom AT čerkašinaâo effectofcryoprotectantsonhypertoniccryohemolysisrateofhumanerythrocyteswithmodifiedcytoskeletonmembranecomplex |