Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы
Проведено изучение свойств мезенхимальных стромальных клеток при монослойном и объемном культивировании в составе трехмерных матриц-носителей различной природы....
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии |
|---|---|
| Date: | 2012 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2012
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68491 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы / Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 144-147. — Бібліогр.: 5 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860252255374016512 |
|---|---|
| author | Петренко, Ю.А. |
| author_facet | Петренко, Ю.А. |
| citation_txt | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы / Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 144-147. — Бібліогр.: 5 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии |
| description | Проведено изучение свойств мезенхимальных стромальных клеток при монослойном и объемном культивировании в составе трехмерных матриц-носителей различной природы.
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:44:51Z |
| format | Article |
| fulltext |
144
Тканевая инженерия – междисциплинарное на-
правление биотехнологии, основанное на принципах
биологии, химии, медицины, технических наук и на-
правленное на создание in vitro биологических экви-
валентов для восстановления и поддержания функции
тканей или органов. Данное направление включает в
себя несколько основных составляющих: выбор био-
совместимых носителей, способствующих адгезии,
пролиферации и дифференцировке клеток, а также
выбор адекватного типа и источника клеток [1].
В данной работе проведено изучение свойств ме-
зенхимальных стромальных клеток (МСК) при моно-
слойном и объемном культивировании в составе трех-
мерных матриц-носителей различной природы.
В работе использовали МСК, выделенные из раз-
личных источников. Исследования были одобрены
Биоэтическим комитетом ИПКиК НАН Украины.
Культивирование клеток проводили в среде
α-MEM («Sigma», США), дополненной 10% эмбрио-
нальной сыворотки (ЭС) крови крупного рогатого
скота («Биолот», Россия), 2 мМ L-глютамина,
50 ед./мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина при
37°С, 5% СО2 и 95% влажности.
Метаболическую и пролиферативную активность
клеток оценивали с использованием Alamar Blue- и
МТТ-тестов.
Иммунофенотипические исследования проводили
методом проточной цитометрии при окрашивании
клеток на CD29, CD34, CD73, CD90, CD105.
Для индукции остеогенеза применяли среду
α-МЕМ, содержавшую 10% ЭС, 0,1 мкМ дексамета-
зона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глице-
ролфосфата. Остеогенез выявляли по экспрессии ще-
лочной фосфатазы и наличию минерализации внекле-
точного матрикса (окрашивание по von Kossa).
Tissue engineering is an interdisciplinary field of bio-
technology based on the principles of biology, chemistry,
medicine and technical sciences, and is directed to the
development of biological equivalents in vitro to recover
and maintain the functions of tissues and organs in vivo.
This direction includes several basic components: the
selection of biocompatible carriers enabling cell adhesion,
proliferation and differentiation as well as selection of
adequate type and source of cells [1].
This research was directed to the assessment of the
properties of mesenchymal stromal cells (MSCs) during
2D and 3D culture within scaffolds of different nature.
The investigation was performed using MSCs iso-
lated from different sources. The studies were appro-
ved by the Committee on Bioethics of the Institute for
Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine.
Cell culturing was performed in α-MEM (Sigma,
USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS)
(Biolot, Russia), 2 mM of L-glutamine, 50 units/ml of
penicillin and 50 mg/ml of streptomycin under 37°C,
5% CO2 and of 95% humidity.
Cell metabolic and proliferative activity was assessed
by Alamar Blue- and MTT-tests.
Immunophenotypic analysis was carried-out by flow
cytometry with staining the cells for CD29, CD34, CD73,
CD90, CD105.
Induction of osteogenesis was made in α-MEM
medium containing 10% FBS, 0.1 mM of dexamethaso-
ne, 0.05 mM of ascorbic acid, 10 mM of glycerol-phos-
phate. Osteogenesis was revealed by expression of alka-
line phosphatase and presence of extracellular matrix
mineralization (staining according to von Kossa method).
Adipogenesis induction was prepared in α-MEM me-
dium with 0.5 mM of 3-isobutile-1-methyl-xanthine,
УДК 611.018.46.085.23:014.41:018.2/6:57.08
Ю.А. ПЕТРЕНКО
Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном
культивировании в составе трехмерных носителей различной природы#
UDC 611.018.46.085.23:014.41:018.2/6:57.08
YU.A. PETRENKO
Properties of Mesenchymal Stromal Cells
During 3D Culturing Within Scaffolds of Different Origin#
* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38
057) 373-30-34, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:
yu.a.petrenko@gmail.com
* To whom correspondence should be addressed: 23,
Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373
3034, fax: +380 57 373 3084, e-mail: yu.a.petrenko@gmail.com
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-
tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
Институт проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины, г. Харьков
#This reseach was presented at minisimposium Stem Cell Day,
held in Kharkov, Ukraine, on the 22th of May, 2012.
#Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме
«День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в
г. Харькове.
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
145
Индукцию адипогенеза проводили в среде α-МЕМ,
содержащей 0,5 мM 3-изобутил-1-метил-ксантина,
1 мкM дексаметазона («Sigma-Aldrich», США),
10 мкг/мл инсулина и 100 мкM индометацина («Sig-
ma-Aldrich»). Адипогенную дифференцировку клеток
определяли по накоплению внутриклеточных нейт-
ральных липидов (окрашивание Oil Red O и нильским
красным).
Хондрогенную дифференцировку проводили после
перевода клеточной суспензии в плотный осадок и
последующего его культивирования в присутствии
TGF-β3 (10 нг/ мл).
В качестве трехмерных носителей использовали
широкопористые криогелевые скаффолды на основе
альгината и агарозы (ИНЭОС РАН, Москва), углерод-
ные волокна на основе каталитических осадков угле-
рода (ННЦ «ХФТИ», Украина), а также композитные
остеокондуктивные материалы на основе гидрокси-
апатита «Колапол» («Полистом», Россия), «Стимул-
Осс» («Белкозин», Россия), «Bio-Oss®» («Geistlich»,
Германия) и «OssaBase®-НА» («LASAK Ltd.», Чеш-
ская республика).
При культивировании МСК в составе широкопо-
ристых криогелевых скаффолдов на основе агарозы
или альгината адгезия клеток не наблюдалась, что
потребовало модификации трехмерных матриц. Ис-
пользовали 2 метода модификации носителей – меха-
ническое введение в состав носителей желатина либо
химическое присоединение желатина к поверхности
пор носителя. Установлено, что механическое введе-
ние желатина не влияло на адгезивные свойства мат-
рицы, клетки формировали агрегаты и не пролифери-
ровали. В то же время химическое присоединение
желатина к поверхностям пор носителей значительно
улучшало их адгезивные свойства – клетки расплас-
тывались и пролиферировали в объеме носителей, при
этом пролиферативные свойства не отличались от
монослойной культуры [2, 3]. Дальнейшие исследова-
ния показали, что МСК сохраняют способность к на-
правленной дифференцировке в адипо-, остео- и хонд-
рогенном направлениях при объемном культивиро-
вании в составе модифицированных широкопорис-
тых альгинатных матриц [2], а также способны к ади-
погенной дифференцировке в составе матриц на ос-
нове агарозы [3].
Отдельная серия экспериментов была проведена
для оценки биосовместимости и адгезивных свойств
остеокондуктивных носителей на основе гидрокси-
апатита и коллагена «Колапол», «Стимул-Осс», «Bio-
Oss®» и «OssaBase®-НА». Выявлено, что губки «Кола-
пол», гранулы «OssaBase®-НА» и «Bio-Oss®»не влияли
на жизнеспособность и метаболическую активность
МСК, а губки «Стимул-Осс» вызывали дегенератив-
ные изменения в клетках при совместном культиви-
ровании. При заселении губок «Колапол», гранул
1 mM of dexamethasone (Sigma-Aldrich, USA), 10 g/ml
of insulin and 100 M of indomethacine (Sigma-Aldrich).
Adipogenic differentiation was revealed by accumulation
of intracellular neutral lipids (staining with Oil Red O
and Nile Red).
Chondrogenic differentiation was performed after
sedimentation of cell suspension and following culturing
with TGF-β3 (10 ng/ml).
As 3D scaffolds the macroporous alginate and aga-
rose cryogel scaffolds (A.N. Nesmeyanov Institute of
Organoelement Compounds of Russian Academy of
Sciences, Moscow), carbon fibers based on carbon cata-
lytic deposits (National Science Center Kharkov Institute
of Physics and Technology, Ukraine) as well as the com-
posite osteoconductive materials based on hydroxyapa-
tite: Kolapol (Polistom, Russia), Stimul-Oss (Belkozin,
Russia), Bio-Oss® (Geistlich, Germany), and OssaBase®-
HA (LASAK Ltd., Czech Republic) were applied.
Culturing of MSCs in macroporous agarose and algi-
nate cryogel scaffolds did not result in cell adhesion,
determining the necessity for the modification of 3D
matrices. Two methods of scaffold modification were
applied: mechanical introduction of gelatin into carriers
or chemical coupling of gelatin to the carrier pore surface.
It was established that mechanical introduction of gelatin
did not affect the adhesive properties of the matrix, the
cells formed aggregates and did not proliferate. At the
same time the chemical coupling of gelatin to the pore
surfaces of the carriers significantly improved their
adhesive properties: the cells flattened and proliferated
inside the scaffolds, thereat the proliferative properties
did not differ from MSCs during the monolayer culture
[2, 3]. Further investigations showed that MSCs pre-
served the ability to a directed differentiation towards
adipo-, osteo- and chondrogenic lineages during 3D cul-
turing inside the modified macroporous alginate matrices
[2] as well as they were able for adipogenic differentiation
inside agarose-based matrices [3].
Separate set of the experiments was performed to
estimate biocompatibility and adhesive properties of
osteoconductive carriers based on the hydroxyapatite
and collagen: Colapol, Stimul-Oss, Bio-Oss®, OssaBase®-
HA. We have revealed that the sponges Colapol, granules
OssaBase®-HA and Bio-Oss® did not affect the viability
and metabolic activity of MSCs, however the sponges
Stimul-Oss caused degenerative changes in the cells
during co-culturing. Under culture inside the sponges
Colapol, granules OssaBase®-HA and Bio-Oss® the MSCs
attached to the carrier’s surface, flattened and proliferated
during culturing, that testified to the perspective of ap-
plication of these materials for development of bioengi-
neered constructs using MSCs to recover bone defects
in maxillofacial surgery and dentistry.
Appication of carbon materials as 3D carriers for
mesenchymal stromal cells is promising for tissue engi-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
146
OssaBase®-НА и Bio-Oss® МСК прикреплялись к по-
верхностям носителя, распластывались и пролифери-
ровали в ходе культивирования, что свидетельствова-
ло о перспективности применения этих материалов
для разработки биоинженерных конструкций с ис-
пользованием МСК для восстановления костных де-
фектов в челюстно-лицевой хирургии и стоматологии.
Использование углеродных материалов в качестве
трехмерных носителей для мезенхимальных стро-
мальных клеток является перспективным для ткане-
вой инженерии костной или хрящевой ткани, однако
поведение и свойства МСК при объемном культивиро-
вании в составе углеродных скаффолдов изучены
недостаточно. В наших экспериментах по культивиро-
ванию МСК на углеродных волокнах на основе ката-
литических осадков углерода клетки адгезировали к
поверхностям волокон, распластывались и пролифе-
рировали, формируя мембраны между близлежащи-
ми волокнами. После проведения направленной хонд-
рогенной дифференцировки МСК было выявлено на-
копление внеклеточного матрикса, позитивного по
окраске альциановым синим. Таким образом, угле-
родные волокна на основе каталитических осадков
углерода являются биосовместимым по отношению
к МСК материалом, позволяющим обеспечить адге-
зию, пролиферацию, распределение и индуцирован-
ную дифференцировку клеток в трехмерном носителе,
что свидетельствует о перспективности его использо-
вания в тканевой инженерии [4].
Одним из важнейших этапов создания биоинже-
нерных конструкций является выбор метода заселения
трехмерного носителя клетками, поскольку особен-
ности распределения клеток по объему матрицы в
дальнейшем определяют успешность формирования
полноценной ткани. Нами было проведено сравни-
тельное исследование локализации, распределения,
метаболической активности и поверхностных свойств
МСК при статическом и перфузионном заселении
широкопористых альгинатных криогелей. Для выпол-
нения перфузионного метода заселения использовали
2 шприца объемом 1 мл, соединенных между собой
эластичной пластиковой трубкой. В один из шприцов
помещали пористый альгинатный носитель, диаметр
которого совпадал с внутренним диаметром шприца.
Во второй шприц помещали суспензию клеток, после
чего путем поочередных мягких поступательно-возв-
ратных туров поршней шприцов медленно насыщали
носитель клетками [5]. Предложенная перфузионная
система заселения МСК в широкопористые губки на
основе альгинатного криогеля позволяла быстро и
равномерно распределить клетки по всему объему
носителя, сохраняя при этом их функциональные и
морфологические свойства.
Таким образом, в работе рассмотрены пролифе-
ративно-дифференцировочные свойства мезенхи-
neering of bone and cartilaginous tissues, but the be-
havior and properties of MSCs during 3D culturing
within carbon scaffolds have been studied insufficiently.
During the culturing of MSCs on carbon fibers based
on the carbon catalytic deposits the cells adhered to the
fibers surfaces, flattened and proliferated forming the
membranes between neighboring fibers. After perfor-
ming the directed chondrogenic differentiation the accu-
mulation of extracellular matrix positive by alcian blue
was revealed. Thus the carbon fibers based on carbon
catalytic deposits are biocompatible with MSCs materials
that can provide the adhesion, proliferation, allocation
and induced differentiation of cells inside the 3D carrier
that attests its prospect application in tissue engineering
[4].
One of the most important stages in the development
of bioengineered constructs is the selection of method
for seeding cells to the 3D carriers, since the peculiarities
of cell allocation within the matrix volume determine
the success of following formation of functional tissue.
The comparative study of localization, allocation, meta-
bolic activity and surface properties of MSCs after their
static and perfusion seeding to macroporous alginate
cryogels was prepared.
The perfusion seeding was performed using two 1 ml
syringes connected together with elastic plastic pipe.
One of the syringes contained porous alginate carrier,
with diameter equal to the inner diameter of the syringe.
The cell suspension was supplied from the second syrin-
ge to slowly enrich the carrier with cells by repeated
mild back-and-forward syringe plunger movements [5].
The suggested perfusion system for seeding of MSCs
into macroporous alginate cryogel sponges enabled the
rapid and homogeneous allocation of cells within the
whole volume of a carrier preserving their functional
and morphological properties.
Hereby this investigation outlined the proliferative-
differential properties of mesenchymal stromal cells du-
ring 3D culturing inside the carriers of different structure
and nature as well as demonstrated several methods of
the improvement of 3D culturing technique. These data
may serve as the basis for the development of different
tissue bioequivalents utilizing tissue engineering ap-
proaches.
The investigation was supported by the grant of
President of Ukraine for young scientists Nr. GP/F36/123.
References
1. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering // Science. – 1993. –
Vol. 260, N5110. – P. 920–926.
2. Petrenko Y.A., Ivanov R.V., Petrenko A.Y., Lozinsky V.I. Coupling
of gelatin to inner surfaces of pore walls in spongy alginate-
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
147
Литература
1. Langer R., Vacanti J.P. Tissue engineering // Science. – 1993. –
Vol. 260, №5110. – P. 920–926.
2. Petrenko Y.A., Ivanov R.V., Petrenko A.Y., Lozinsky V.I. Coupling
of gelatin to inner surfaces of pore walls in spongy alginate-
based scaffolds facilitates the adhesion, growth and diffe-
rentiation of human bone marrow mesenchymal stromal cells //
J. Mater. Sci. Mater. Med. – 2011. – Vol. 22, №6. – P. 1529–
1540.
3. Petrenko Y.A., Petrenko A.Y., Damshkaln L.G., et al. Growth
and adipogenic differentiation of mesenchymal stromal bone
marrow cells during culturing in 3D macroporous agarose
cryogel sponges // Bull. Exp. Biol. Med. – 2008. – Vol. 146,
№1. – P. 129–132.
4. Petrenko Y.A., Gurin I.V., Volkova N.A. et al. The use of cata-
lytic carbon deposits as 3D carriers for human bone marrow
stromal cells // Bull. Exp. Biol. Med. – 2011. – Vol. 151, №4. –
P. 539–542.
5. Petrenko Y.A, Ivanov R.V, Lozinsky V.I, Petrenko A.Y. Compa-
rison of the methods for seeding human bone marrow mesen-
chymal stem cells to macroporous alginate cryogel carriers//
Bull. Exp. Biol. Med. – 2011. – Vol. 150, №4. – P. 543–546.
Поступила 01.06.2012
мальных стромальных клеток при объемном культи-
вировании в составе трехмерных носителей различ-
ной структуры и природы, а также описаны некоторые
методические приемы, позволяющие совершенство-
вать технику объемного культивирования. Эти данные
могут послужить основой для разработки биоэквива-
лентов различных тканей с использованием подходов
тканевой инженерии.
Данное исследование проведено при поддержке
Гранта Президента Украины для молодых ученых №GP/
F36/123.
based scaffolds facilitates the adhesion, growth and diffe-
rentiation of human bone marrow mesenchymal stromal cells //
J. Mater. Sci. Mater. Med. – 2011. – Vol. 22, N6. – P. 1529–
1540.
3. Petrenko Y.A., Petrenko A.Y., Damshkaln L.G., et al. Growth
and adipogenic differentiation of mesenchymal stromal bone
marrow cells during culturing in 3D macroporous agarose
cryogel sponges // Bull. Exp. Biol. Med. – 2008. – Vol. 146,
N1. – P. 129–132.
4. Petrenko Y.A., Gurin I.V., Volkova N.A. et al. The use of catal-
ytic carbon deposits as 3D carriers for human bone marrow
stromal cells // Bull. Exp. Biol. Med. – 2011. – Vol. 151, N4. –
P. 539–542.
5. Petrenko Y.A, Ivanov R.V, Lozinsky V.I, Petrenko A.Y. Compa-
rison of the methods for seeding human bone marrow mesen-
chymal stem cells to macroporous alginate cryogel carriers//
Bull. Exp. Biol. Med. – 2011. – Vol. 150, N4. – P. 543–546.
Accepted 01.06.2012
problems
of cryobiology
Vol. 22, 2012, №2
проблемы
криобиологии
Т. 22, 2012, №2
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68491 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 0233-7673 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:44:51Z |
| publishDate | 2012 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Петренко, Ю.А. 2014-09-25T07:20:28Z 2014-09-25T07:20:28Z 2012 Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы / Ю.А. Петренко // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 144-147. — Бібліогр.: 5 назв. — рос., англ. 0233-7673 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68491 611.018.46.085.23:014.41:018.2/6:57.08 Проведено изучение свойств мезенхимальных стромальных клеток при монослойном и объемном культивировании в составе трехмерных матриц-носителей различной природы. Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме «День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в г. Харькове.
 Данное исследование проведено при поддержке Гранта Президента Украины для молодых ученых №GP/ F36/123. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии Краткие сообщения Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы Properties of Mesenchymal Stromal Cells During 3D Culturing Within Scaffolds of Different Origin Article published earlier |
| spellingShingle | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы Петренко, Ю.А. Краткие сообщения |
| title | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| title_alt | Properties of Mesenchymal Stromal Cells During 3D Culturing Within Scaffolds of Different Origin |
| title_full | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| title_fullStr | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| title_full_unstemmed | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| title_short | Свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| title_sort | свойства мезенхимальных стромальных клеток при объемном культивировании в составе трехмерных носителей различной природы |
| topic | Краткие сообщения |
| topic_facet | Краткие сообщения |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68491 |
| work_keys_str_mv | AT petrenkoûa svoistvamezenhimalʹnyhstromalʹnyhkletokpriobʺemnomkulʹtivirovaniivsostavetrehmernyhnositeleirazličnoiprirody AT petrenkoûa propertiesofmesenchymalstromalcellsduring3dculturingwithinscaffoldsofdifferentorigin |