Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня

Показано, что из бульбарного региона (БР) волосяного фолликула взрослых животных получена культура клеток с высоким пролиферативным потенциалом и способностью к мультилинейной дифференцировке. Данная популяция экспрессирует антигены, характерные для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток...

Full description

Saved in:
Bibliographic Details
Published in:Проблемы криобиологии
Date:2012
Main Author: Васильев, Р.Г.
Format: Article
Language:Russian
Published: Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2012
Subjects:
Online Access:https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68496
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
Journal Title:Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Cite this:Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня / Р.Г. Васильев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 165-168. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ.

Institution

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
_version_ 1859595527577927680
author Васильев, Р.Г.
author_facet Васильев, Р.Г.
citation_txt Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня / Р.Г. Васильев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 165-168. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ.
collection DSpace DC
container_title Проблемы криобиологии
description Показано, что из бульбарного региона (БР) волосяного фолликула взрослых животных получена культура клеток с высоким пролиферативным потенциалом и способностью к мультилинейной дифференцировке. Данная популяция экспрессирует антигены, характерные для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (CD44, CD73, CD90 и Sea-1) и CD117 (маркер мигрирующих клеток нервного гребня (НГ) и меланобластов). В культуре in vitro клетки БР демонстрируют признаки стволовых клеток - способность к клональному росту и способность к самообновлению. Рост в виде флотирующих сфер и экспрессия нестина указывают на то, что данные клетки являются производными НГ, а их способность выживать в составе 3D гелей с различной динамикой и механизмами их ремоделирования дает потенциальную возможность создавать конструкции для восстановления дефектов различных структур - производных НГ, в частности костей черепа и периферических нервов.
first_indexed 2025-11-27T21:05:54Z
format Article
fulltext 165 Волосяной фолликул (ВФ) на протяжении всей жизни млекопитающих находится в динамическом жизненном цикле: фаза роста (анаген) сменяется пе- реходной фазой (катаген), за которой следует короткая фаза покоя (телоген). Подобный жизненный цикл предполагает наличие стволовых клеток, за счет кото- рых происходят генерация дифференцированных кле- ток и восстановление утрачиваемых в фазе катагена структур. Бульбарный регион (БР) является постоян- ной частью ВФ и представлен утолщением наружного корневого влагалища в месте крепления мышцы arrector pili. Бульбарный регион является нишей для эпидермальных стволовых клеток [2] и меланоцитар- ных стволовых клеток [6]. Группа M. Sieber-Blum сообщила о получении из БР ВФ мультипотентных стволовых клеток с необычайно широким дифферен- цировочным потенциалом и, используя «двойных» трансгенных мышей Wnt1-Cre/Rosa26R, доказала их происхождение из нервного гребня (НГ) [8]. Целью данной работы было получение культуры мультипо- тентных стволовых клеток из БР ВФ, исследование их фенотипа и особенностей культивирования in vitro. Эксперименты были выполнены на 5-клеточных культурах из БР ВФ вибрисс, полученных от самцов мышей линии FVB 4–6-месячного возраста с соблю- дением принципов биоэтики и норм биологической безопасности. Культуру клеток из БР получали методом эксплан- татов по M. Sieber-Blum [8]. Клетки культивировали в среде DMEM:F12 («Sigma», США) с 10% ЭТС («Sigma»), 1% В27 («РАА», Австрия) и 2 ммоль глута- мина («Sigma», США) при 37°С и 5% СО2. Способность клеток к росту в условиях клональ- ной плотности определяли путем засева 100 клеток в чашку Петри (диаметр 100 мм, «Corning», США). Способность клеток к самообновлению определяли Hairfollicle (HF) through-out mammal lifetime possess a dynamic cycle, when the growth phase (ana- gen) is alternated with a transitional phase (catagen), and followed by a short resting phase (telogen). Such a cycle requires stem cell pool giving rise to the differen- tiated cells and restoring lost structures in catagen phase. Bulbar region (BR) is a permanent part of HF and appears as a thickening of the outer root sheath at the attachment site of arrector pili muscle. Bulbar region is a niche for epidermal stem cells [2] and melanocyte stem cells [6]. M. Sieber-Blum group announced an isolation of the multipotent stem cells with an unusually ample differen- tiation potential from BR HF and using a system of ‘double’ transgenic mice Wnt1-Cre/Rosa26R, they pro- ved their origin from the neural crest (NC) [8]. The aim of this work was to obtain a culture of multipotent stem cells from BR of HF, their phenotype exploring and in vitro culturing features. The experiments were performed with 5 cell cultures from BR of whisker HF obtained from 4–6 months old FVB mice males with respect of bioethics principles and biosafety regulations. Bulbar region cell cultures were obtained by explant method according to M. Sieber-Blum [8]. The cells were cultured in DMEM:F12 medium (Sigma, USA) supple- mented with 10% FBS (Sigma), 1% B27 (PAA, Austria) and 2 mM L-glutamine (Sigma) at 37°C and 5% CO2. The ability of cells to grow at clonal density was determined via 100 cells’ plating into 100 mm Petri dish (Corning, USA). The ability of cells to self-renew has been defined by mean of clonal colony replating using the cloning cylinders (Sigma). Adipogenic and osteogenic differentiation tests were performed by conventional methods [7]. The specificity of adipogenic and osteogenic differentiation was confir- med by OilRed O and Alizarin Red S staining (Sigma). УДК 576.3+612.014.2/3 Р.Г. ВАСИЛЬЕВ Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня# UDC 611.018.46.085.23:014.41:018.2/6:57.08 R.G. VASYLIEV Multipotent Stem Cells of Bulbar Region of Hair Follicle with Properties of Neural Crest Derivatives# *Адрес для корреспонденции: ул. Вышгородская, 67; г. Киев, Украина 04114; электронная почта: rvasiliev@ukr.net *Address for correspondence: 67, Vyshgorodskaya str., Kyiv, Ukraine 04414; e-mail: rvasiliev@ukr.net Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kiev, Ukraine ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины» #This reseach was presented at minisimposium Stem Cell Day, held in Kharkov, Ukraine, on the 22th of May, 2012. #Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме «День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в г. Харькове. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 166 пересевом клональной колонии с помощью клони- рующих цилиндров («Sigma»). Адипо- и остеогенную дифференцировку осущест- вляли по общепринятым методикам [7]. Специфич- ность адипо- и остеогенной дифференцировки под- тверждали окрашиванием Oil Red О и Alizarin Red S (все – «Sigma»). Культивирование в бессывороточных условиях осуществляли по методике получения нейросфер из ЦНС в модификации K. Fernandes для клеток кожи [4]. Клетки также культивировали в коллагеновом и фибриновом гелях. Коллагеновый гель готовили по методу E. Bell [1]. Фибриновый гель готовили путем смешивания 0,5 мл 4%-го раствора фибриногена с 0,5 мл питательной среды с клетками и 1 Ед тромбина («Технология-Стандарт», Россия). Клетки засевали в концентрации 5×105 на мл геля и культивировали на протяжении 14–21 суток. Для определения экспрессии клетками белка про- межуточных филаментов нестина сферы помещали на покрытые поли-L-лизином («Sigma») покровные стекла и культивировали 24 ч для их адгезии. Затем фиксировали 4%-м параформальдегидом, пермеа- билизировали 0,2%-м раствором Triton X-100 и ок- рашивали антинестин – антителами («BD Pharmingen», США), конъюгированными с флуорохромом Alexa 647. Фенотип определяли на проточном цитофлуори- метре-сортере «BD FACSAria» с программным обес- печением «FACSDiva 6.1.1» с использованием анти- мышиных моноклональных антител к CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 и Sca-1 (все – «Becton Dickin- son», США). Визуализацию и фотодокументирование клеточ- ных культур осуществляли при помощи инверти- рованного флуоресцентного микроскопа IX71 («Olym- pus», Япония), оснащенного цифровой камерой DP20 и программным обеспечением «Quick Photo Micro». Все числовые данные представлены в виде сред- Culturing under serum-free conditions was perfor- med according to the method of neurospheres’ genera- tion from the CNS with a modification of K. Fernandes for skin cells [4]. The cells were cultured as well in collagen and fibrin gels. Collagen gel was prepared according to E. Bell method [1]. The fibrin gel was prepared by mixing of 0.5 ml of 4% fibrinogen, 0.5 ml nutrient medium supp- lemented with cells and 1U thrombin (Tekhnologia- Standart, Russia). Cells were plated at 5×105 per ml of gel and cultured for 14–21 days. To determine the expression of nestin, a cell inter- mediate filament protein, the spheres were placed onto poly-L-lysine (Sigma) coated cover slips and cultured within 24 hrs for adhesion, and then fixed with 4% para- formaldehyde, permeabilized with 0.2% Triton X-100 and stained with anti-nestin antibody conjugated with fluorochrome Alexa 647 (BD Pharmingen, USA). Phenotyping was performed determined with the flow cytometer-sorter BD FACSAria and FACSDiva 6.1.1 software, using anti-mouse monoclonal antibodies to CD44, CD45, CD73, CD90, CD117 and Sca-1 (Bec- ton Dickinson, USA). Cell cultures’ visualization and photo-documentation were carried-out using the inverted fluorescent micro- scope IX71 (Olympus, Japan) equipped with DP20 di- gital cameraand Quick Photo Micro software. All numerical data are presented as mean and standard deviation (M ± s). At culture day 3–4 the migration of fibroblastoid cells had started from BR explants, which further actively proliferated and formed a primary confluent culture up to day 11–15 (Fig. 1). BR of HF cell culture was charac- terized by high proliferative activity (the average cell po- pulation doubling time at passage 1, P1, was of 23.02 ± 0.68 hrs) and easily cultured up to P10 with 1:10 split ratio. Cultured BR fibroblastoid cells at P3 expressed: CD44 (98.92 ± 0.78% of cells), CD73 (86.52 ± 4.78%), CD90 Рис. 1. Культура фибробластоидных клеток из БР ВФ: A – эмиграция клеток из эксплантата БР; B – конфлуэнтная первичная культура; ×100; рельефный контраст. Fig. 1. Fibroblastoid cell culture obtained from BR of HF: A – emigration of cells from the BR explant; B – primary confluent culture; ×100; relief contrast. него значения и стандартного отклонения (М ± s). На 3–4-е сутки культиви- рования из эксплантатов БР начиналась миграция фибро- бластоидных клеток, которые в дальнейшем активно проли- ферировали и к 11–15 суткам формировали конфлуэнтную первичную культуру (рис. 1). Культура клеток из БР ВФ ха- рактеризовалась высокой про- лиферативной активностью (среднее время удвоения кле- точной популяции на 1-м пас- A B problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 167 Эффективность колониеобразования при поста- новке КОЕ-теста для клеток первичной культуры составила 49,27 ± 7,05%. При субклонировании коло- ний наблюдалось формирование новых колоний. При культивировании в адипо- и остеоиндуктивных средах клетки БР дифференцировались в соответ- ствующих направлениях (рис. 2). При культивировании в бессывороточных усло- виях часть клеток выживала и начинала пролифери- ровать, что приводило к образованию флотирующих сфер в течение 2–3 недель культивирования (рис. 3, A). Клетки в составе сфер были жизнеспособными, могли быть переведены в адгезивное состояние при смене условий культивирования и экспрессировали белок промежуточных филаментов нестин – маркер прогениторных клеток (рис. 3, B). Клетки выживали в составе как коллагенового, так и фибринового гелей. Однако поведение клеток и механизмы ремоделирования гелей отличались. Рис. 3. Сферогенез и экспрессия нестина: A – сформированная фибробластоид- ными клетками из бульбарного региона ВФ флотирующая сфера при культи- вировании в бессывороточных условиях, ×100, рельефный контраст; B – экс- прессия клетками белка промежуточных филаментов нестина; ×100, флуорес- центная микроскопия. Fig. 3. Sphere formation and nestin expression: A – a floating sphere formed by fibroblastoid cells from bulbar region of HF when cultured under serum-free con- ditions; ×100; relief contrast; B – expression of nestin, an intermediate filament pro- tein, by BR cells; ×100; fluorescence microscopy. (97.24 ± 3.24 %) and Sca-1 (95.5 ± 2.81%). There was no expression of CD45 in culture. Of note, a significant cell number (42.43 ± 11.86%) expressed CD117 (c-kit) – a Stem Cell Factor receptor. The colony-forming efficiency at CFU-assay for the primary cell culture was 49.27 ± 7.05%. At subcloning, the new colonies’ formation was observed. When cultured in adipo- and osteoinductive media,the BR cells differentiated in appropriate directions (Fig. 2). When cultured under serum-free conditions, a part of cells survived and started to proliferate, resulting in the formation of floating spheres within 2–3 weeks of culture (Fig. 3A). The cells within the spheres were viable, transferrable to an adhesive state via changing the culture conditions and expressed the nestin, an inter- mediate filament protein, which is a marker of progenitor cells (Fig. 3B). Cells survived both within collagen and fibrin gels. However, the cell behavior and gel remodeling mecha- Рис.2. Адипогенная и остеогенная дифференциация; A – окрашивание Oil Red O, контрастирование по Романовскому; B – окрашивание Alizarin Red S; ×100. Fig. 2. Adipogenic and osteogenic differentiation: A – Oil Red O stain, Romanowsky counterstain; B – Alizarin Red S stain. саже – 23,02 ± 0,68 ч) и легко культивировалась вплоть до 10-го пассажа с коэффициен- том пассирования 1:10. Культивируемые фибро- бластоидные клетки из БР ВФ на 3-м пассаже экспрессиро- вали: CD44 (98,92 ± 0,78% кле- ток), CD73 (86,52 ± 4,78%), CD90 (97,24 ± 3,24%) и Sca-1 (95,5 ± 2,81%). В культуре от- сутствовала экспрессия CD45. Необходимо отметить, что зна- чительная часть клеток (42,43 ± 11,86%) экспрессировала CD117 (c-kit) – рецептор к фактору стволовых клеток. nisms were different. Thus, BR cells within collagen gel formed a network of intercellular con- tacts and then contracted the gel. In the fibrin gel the occu- rrence of cell clusters, as a re- sult of their proliferation, was observed, and the active gel degradation accompanied with its complete resorption at cul- ture day 14–21 took place. Thus, cell culture with high proliferative potential and capa- city for multilineage differen- tiation has been derived from BR of HF of adult animal. This population expressesthe anti- gens characteristic to the multi- potent mesenchymal stromal A B A B problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2 168 Литература 1. Bell E., Ehrich H., Buttle D., Nakatsuji T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thick- ness // Science – 1981. – Vol. 211, №4486. – P. 1052–1054. 2. Cotsarelis G. Epithelial stem cells: a folliculocentric view // J. Invest. Dermatol. – 2006. – Vol. 126, №7. – P. 1459–1468. 3. Delfino-Machin M., Chipperfield T., Rodriges F., Kelsh R. The proliferating field of neural crest stem cells // Dev. Dyn. – 2007. – Vol. 236, №12. – P. 3242–3254. 4. Fernandes K.J., McKenzie I.A., Mill P. et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells // Nat. Cell Biol. – 2004. – Vol. 6, №11. – P. 1082–1093. 5. Motohashi T., Yamanaka K., Chiba K. et al. Unexpected multipo- tency of melanoblasts isolated from murine skin // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27, №4. – P. 888–897. 6. Nishimura E., Jordan S., Oshima H. et al. Dominant role of the niche in melanocyte-stem cell fate determination // Nature. – 2002. – Vol. 416, №6883. – P. 854–860. 7. Prockop D.J., Phinney D.G., Bunnell B.A. Mesenchymal stem cells: methods and protocols. – Totowa, NJ: Humana Press, 2008. – 192 p. 8. Sieber-Blum M., Grim M., Hu Y., Szeder V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle // Dev. Dyn. – 2004. – Vol. 231, №2. – P. 258–269. Поступила 01.06.2012 References 1. Bell E., Ehrich H., Buttle D., Nakatsuji T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thick- ness // Science – 1981. – Vol. 211, N4486. – P. 1052–1054. 2. Cotsarelis G. Epithelial stem cells: a folliculocentric view // J. Invest. Dermatol. – 2006. – Vol. 126, N7. – P. 1459–1468. 3. Delfino-Machin M., Chipperfield T., Rodriges F., Kelsh R. The proliferating field of neural crest stem cells // Dev. Dyn. – 2007. – Vol. 236, N12. – P. 3242–3254. 4. Fernandes K.J., McKenzie I.A., Mill P. et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells // Nat. Cell Biol. – 2004. – Vol. 6, N11. – P. 1082–1093. 5. Motohashi T., Yamanaka K., Chiba K. et al. Unexpected multipo- tency of melanoblasts isolated from murine skin // Stem Cells. – 2009. – Vol. 27, N4. – P. 888–897. 6. Nishimura E., Jordan S., Oshima H. et al. Dominant role of the niche in melanocyte-stem cell fate determination // Nature. – 2002. – Vol. 416, N6883. – P. 854–860. 7. Prockop D.J., Phinney D.G., Bunnell B.A. Mesenchymal stem cells: methods and protocols. – Totowa, NJ: Humana Press, 2008. – 192 p. 8. Sieber-Blum M., Grim M., Hu Y., Szeder V. Pluripotent neural crest stem cells in the adult hair follicle // Dev. Dyn. – 2004. – Vol. 231, N2. – P. 258–269. Accepted 01.06.2012 cells (CD44, CD73, CD90 and Sca-1) and CD117 (a marker of migrating NC cells and melanoblasts) [7]. In vitro BR cell culture shows the characteristics of stem cells, such as the capacity for clonal growth and for self-renewal. Growth as floating spheres and nestin expression indicate these cells are neural crest-derived [8]. The ability of this cell type to survive within 3D gels with different dynamics and mechanisms of their remodeling potentially allows creating the constructs for the restoration of defects of various NC derivatives structures, such as skull bones and peripheral nerves. Так, в коллагеновом геле клетки БР формировали сеть межклеточных контактов и контрактировали гель. В фибриновом геле появлялись кластеры клеток в результате их пролиферации, и происходила актив- ная деградация геля с полной его резорбцией на 14– 21-е сутки культивирования. Таким образом, из БР ВФ взрослых животных получена культура клеток с высоким пролифера- тивным потенциалом и способностью к мультилиней- ной дифференцировке. Данная популяция экспресси- рует антигены, характерные для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (CD44, CD73, CD90 и Sca-1) и CD117 (маркер мигрирующих клеток НГ и меланобластов) [5]. В культуре in vitro клетки БР демонстрируют признаки стволовых клеток – способность к клональному росту и способность к самообновлению. Рост в виде флотирующих сфер и экспрессия нестина указывают на то, что данные клет- ки являются производными нервного гребня [3], а их способность выживать в составе 3D гелей с раз- личной динамикой и механизмами их ремодели- рования дает потенциальную возможность создавать конструкции для восстановления дефектов различных структур – производных НГ, в частности костей черепа и периферических нервов. problems of cryobiology Vol. 22, 2012, №2 проблемы криобиологии Т. 22, 2012, №2
id nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68496
institution Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
issn 0233-7673
language Russian
last_indexed 2025-11-27T21:05:54Z
publishDate 2012
publisher Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
record_format dspace
spelling Васильев, Р.Г.
2014-09-25T07:30:30Z
2014-09-25T07:30:30Z
2012
Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня / Р.Г. Васильев // Проблемы криобиологии. — 2012. — Т. 22, № 2. — С. 165-168. — Бібліогр.: 8 назв. — рос., англ.
0233-7673
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68496
576.3+612.014.2/3
Показано, что из бульбарного региона (БР) волосяного фолликула взрослых животных получена культура клеток с высоким пролиферативным потенциалом и способностью к мультилинейной дифференцировке. Данная популяция экспрессирует антигены, характерные для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (CD44, CD73, CD90 и Sea-1) и CD117 (маркер мигрирующих клеток нервного гребня (НГ) и меланобластов). В культуре in vitro клетки БР демонстрируют признаки стволовых клеток - способность к клональному росту и способность к самообновлению. Рост в виде флотирующих сфер и экспрессия нестина указывают на то, что данные клетки являются производными НГ, а их способность выживать в составе 3D гелей с различной динамикой и механизмами их ремоделирования дает потенциальную возможность создавать конструкции для восстановления дефектов различных структур - производных НГ, в частности костей черепа и периферических нервов.
Данное исследование было представлено на мини-симпозиуме «День стволовой клетки», проходившем 22 мая 2012 года в г. Харькове.
ru
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Проблемы криобиологии
Краткие сообщения
Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
Multipotent Stem Cells of Bulbar Region of Hair Follicle with Properties of Neural Crest Derivatives
Article
published earlier
spellingShingle Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
Васильев, Р.Г.
Краткие сообщения
title Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
title_alt Multipotent Stem Cells of Bulbar Region of Hair Follicle with Properties of Neural Crest Derivatives
title_full Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
title_fullStr Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
title_full_unstemmed Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
title_short Мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
title_sort мультипотентные стволовые клетки из бульбарного региона волосяного фолликула со свойствами производных нервного гребня
topic Краткие сообщения
topic_facet Краткие сообщения
url https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68496
work_keys_str_mv AT vasilʹevrg mulʹtipotentnyestvolovyekletkiizbulʹbarnogoregionavolosânogofollikulasosvoistvamiproizvodnyhnervnogogrebnâ
AT vasilʹevrg multipotentstemcellsofbulbarregionofhairfolliclewithpropertiesofneuralcrestderivatives