Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания
В работе изучено влияние различных скоростей охлаждения в области эвтектических температур водных растворов криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин, полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500, 1,2-пропандиол) на жизнеспособность клеточных суспензий Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli. В...
Gespeichert in:
| Datum: | 2013 |
|---|---|
| Hauptverfasser: | , , |
| Format: | Artikel |
| Sprache: | Russian |
| Veröffentlicht: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Schriftenreihe: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| Schlagworte: | |
| Online Zugang: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68700 |
| Tags: |
Tag hinzufügen
Keine Tags, Fügen Sie den ersten Tag hinzu!
|
| Назва журналу: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Zitieren: | Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания / Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев, А.Л. Полякова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 15-25. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68700 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-687002025-02-09T09:34:12Z Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания Effect of Cooling Rate in the Vicinity of Eutectic Temperature Characteristic for Cryoprotectant Aqueous Solution on Post-Thaw Viability of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli Cells Гурина, Т.М. Высеканцев, И.П. Полякова, А.Л. Теоретическая и экспериментальная криобиология В работе изучено влияние различных скоростей охлаждения в области эвтектических температур водных растворов криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин, полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500, 1,2-пропандиол) на жизнеспособность клеточных суспензий Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli. В указанном температурном интервале образцы клеточных суспензий охлаждали с контролируемыми (1 и 25 град/мин) и неконтролируемыми (погружение в жидкий азот) скоростями охлаждения. Показано преимущество применения контролируемых скоростей охлаждения в области эвтектических температур исследуемых растворов криопротекторов для повышения жизнеспособности микроорганизмов после криоконсервирования. Наилучшие показатели жизнеспособности S. cerevisiae и E. coli были получены при скорости охлаждения 25 град/мин. Эта тенденция сохранялась для всех изученных концентраций криопротекторных веществ (5, 10, 15, 20%). Полученные результаты рекомендуется учитывать при разработке режимов замораживания других биологических объектов. В роботі вивчено вплив різних швидкостей охолодження в області евтектичних температур водних розчинів кріопротекторів (диметилсульфоксид, гліцерин, поліетиленоксид з молекулярною масою 1500, 1,2-пропандіол) на життєздатність клітинних суспензій Saccharomyces cerevisiae і Escherichia coli. В зазначеному температурному інтервалі зразки клітинних суспензій охолоджували з контрольованими (1 и 25 град/хв) та неконтрольованими (занурення в рідкий азот) швидкостями охолодження. Показано перевагу застосування контрольованих швидкостей охолодження в області евтектичних температур розчинів кріопротекторів, що досліджувалися, для підвищення життєздатності мікроорганізмів після кріоконсервування. Найкращі показники життєздатності S. cerevisiae і E. coli було отримано при швидкості охолодження 25 град/хв. Ця тенденція зберігалася для всіх концентрацій (5, 10, 15, 20%) кріопротекторних речовин, що досліджувалися. Отримані результати рекомендовано враховувати при розробці режимів заморожування інших біологічних об'єктів. The effect of various cooling rates in the range of eutectic temperatures of aqueous solutions of cryoprotectants (dimethyl sulfoxide, glycerol, polyethylene oxide with molecular mass 1500, 1,2-propane diol) on viability in cell suspesion of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli was studied. The cell suspensions were cooled in these temperature ranges with controlled (1 and 25 deg/min) and non-controlled (plunging into liquid nitrogen) rates. Application of controlled cooling rates in eutectic temperature range of the studied cryoprotectant solutions was shown to be prospective for increase the post-thaw viability of microorganisms. The highest indices of viability of S. cerevisiae and E. coli were obtained for the cooling rate of 25 deg/min. This tendency was kept for all the studied concentrations of cryoprotective agents (5, 10, 15, 20%). The findings are recommended to be considered when developing the freezing protocols for other biological specimens. 2013 Article Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания / Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев, А.Л. Полякова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 15-25. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68700 57.043:612.111:536.54 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| language |
Russian |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| spellingShingle |
Теоретическая и экспериментальная криобиология Теоретическая и экспериментальная криобиология Гурина, Т.М. Высеканцев, И.П. Полякова, А.Л. Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description |
В работе изучено влияние различных скоростей охлаждения в области эвтектических температур водных растворов криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин, полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500, 1,2-пропандиол) на жизнеспособность клеточных суспензий Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli. В указанном температурном интервале образцы клеточных суспензий охлаждали с контролируемыми (1 и 25 град/мин) и неконтролируемыми (погружение в жидкий азот) скоростями охлаждения. Показано преимущество применения контролируемых скоростей охлаждения в области эвтектических температур исследуемых растворов криопротекторов для повышения жизнеспособности микроорганизмов после криоконсервирования. Наилучшие показатели жизнеспособности S. cerevisiae и E. coli были получены при скорости охлаждения 25 град/мин. Эта тенденция сохранялась для всех изученных концентраций криопротекторных веществ (5, 10, 15, 20%). Полученные результаты рекомендуется учитывать при разработке режимов замораживания других биологических объектов. |
| format |
Article |
| author |
Гурина, Т.М. Высеканцев, И.П. Полякова, А.Л. |
| author_facet |
Гурина, Т.М. Высеканцев, И.П. Полякова, А.Л. |
| author_sort |
Гурина, Т.М. |
| title |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания |
| title_short |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания |
| title_full |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания |
| title_fullStr |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания |
| title_full_unstemmed |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания |
| title_sort |
влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток saccharomyces cerevisiae и escherichia coli после оттаивания |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| publishDate |
2013 |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68700 |
| citation_txt |
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической температуры водного раствора криопротектора на жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli после оттаивания / Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев, А.Л. Полякова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 1. — С. 15-25. — Бібліогр.: 25 назв. — рос., англ. |
| series |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| work_keys_str_mv |
AT gurinatm vliânieskorostiohlaždeniâvoblastiévtektičeskojtemperaturyvodnogorastvorakrioprotektoranažiznesposobnostʹkletoksaccharomycescerevisiaeiescherichiacoliposleottaivaniâ AT vysekancevip vliânieskorostiohlaždeniâvoblastiévtektičeskojtemperaturyvodnogorastvorakrioprotektoranažiznesposobnostʹkletoksaccharomycescerevisiaeiescherichiacoliposleottaivaniâ AT polâkovaal vliânieskorostiohlaždeniâvoblastiévtektičeskojtemperaturyvodnogorastvorakrioprotektoranažiznesposobnostʹkletoksaccharomycescerevisiaeiescherichiacoliposleottaivaniâ AT gurinatm effectofcoolingrateinthevicinityofeutectictemperaturecharacteristicforcryoprotectantaqueoussolutiononpostthawviabilityofsaccharomycescerevisiaeandescherichiacolicells AT vysekancevip effectofcoolingrateinthevicinityofeutectictemperaturecharacteristicforcryoprotectantaqueoussolutiononpostthawviabilityofsaccharomycescerevisiaeandescherichiacolicells AT polâkovaal effectofcoolingrateinthevicinityofeutectictemperaturecharacteristicforcryoprotectantaqueoussolutiononpostthawviabilityofsaccharomycescerevisiaeandescherichiacolicells |
| first_indexed |
2025-11-25T09:26:12Z |
| last_indexed |
2025-11-25T09:26:12Z |
| _version_ |
1849753915027881984 |
| fulltext |
УДК 57.043:612.111:536.54
Т.М. Гурина*, И.П. Высеканцев, А.Л. Полякова
Влияние скорости охлаждения в области эвтектической
температуры водного раствора криопротектора на
жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae
и Escherichia coli после оттаивания
UDC 57.043:612.111:536.54
T.M. Gurina*, I.P. Vysekantsev, A.L. Polyakova
Effect of Cooling Rate in the Vicinity of Eutectic Temperature
Characteristic for Cryoprotectant Aqueous Solution
on Post-Thaw Viability of Saccharomyces
cerevisiae and Escherichia coli Cells
Реферат. В работе изучено влияние различных скоростей охлаждения в области эвтектических температур водных
растворов криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин, полиэтиленоксид с молекулярной массой 1500, 1,2-пропандиол)
на жизнеспособность клеточных суспензий Saccharomyces cerevisiae и Escherichia coli. В указанном температурном
интервале образцы клеточных суспензий охлаждали с контролируемыми (1 и 25 град/мин) и неконтролируемыми (погружение
в жидкий азот) скоростями охлаждения. Показано преимущество применения контролируемых скоростей охлаждения в
области эвтектических температур исследуемых растворов криопротекторов для повышения жизнеспособности микро-
организмов после криоконсервирования. Наилучшие показатели жизнеспособности S. cerevisiae и E. coli были получены
при скорости охлаждения 25 град/мин. Эта тенденция сохранялась для всех изученных концентраций криопротекторных
веществ (5, 10, 15, 20%). Полученные результаты рекомендуется учитывать при разработке режимов замораживания дру-
гих биологических объектов.
Ключевые слова: криоконсервирование, микроорганизмы, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, криопротекторный
раствор, эвтектическая температура, скорость охлаждения.
Реферат. В роботі вивчено вплив різних швидкостей охолодження в області евтектичних температур водних розчинів
кріопротекторів (диметилсульфоксид, гліцерин, поліетиленоксид з молекулярною масою 1500, 1,2-пропандіол) на
життєздатність клітинних суспензій Saccharomyces cerevisiae і Escherichia coli. В зазначеному температурному інтервалі
зразки клітинних суспензій охолоджували з контрольованими (1 и 25 град/хв) та неконтрольованими (занурення в рідкий
азот) швидкостями охолодження. Показано перевагу застосування контрольованих швидкостей охолодження в області
евтектичних температур розчинів кріопротекторів, що досліджувалися, для підвищення життєздатності мікроорганізмів
після кріоконсервування. Найкращі показники життєздатності S. cerevisiae і E. coli було отримано при швидкості охолодження
25 град/хв. Ця тенденція зберігалася для всіх концентрацій (5, 10, 15, 20%) кріопротекторних речовин, що досліджувалися.
Отримані результати рекомендовано враховувати при розробці режимів заморожування інших біологічних об'єктів.
Ключові слова: кріоконсервування, мікроорганізми, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, кріопротекторний розчин,
евтектична температура, швидкість охолодження.
Abstract. The effect of various cooling rates in the range of eutectic temperatures of aqueous solutions of cryoprotectants
(dimethyl sulfoxide, glycerol, polyethylene oxide with molecular mass 1500, 1,2-propane diol) on viability in cell suspesion of
Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli was studied. The cell suspensions were cooled in these temperature ranges with
controlled (1 and 25 deg/min) and non-controlled (plunging into liquid nitrogen) rates. Application of controlled cooling rates in eutectic
temperature range of the studied cryoprotectant solutions was shown to be prospective for increase the post-thaw viability of
microorganisms. The highest indices of viability of S. cerevisiae and E. coli were obtained for the cooling rate of 25 deg/min. This
tendency was kept for all the studied concentrations of cryoprotective agents (5, 10, 15, 20%). The findings are recommended to be
considered when developing the freezing protocols for other biological specimens.
Key words: cryopreservation, microorganisms, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, eutectic temperature range,
cooling rate.
оригинальное исследование research article
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-41-11, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: gladiolus_@mail.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 4111, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: gladiolus_@mail.ru
Department of Long Term Storage of Biological Objects under
Low Temperatures and Microbiology, Department of Low Tempe-
rature Preservation, Institute for Problems of Cryobiology and
Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine,
Kharkov, Ukraine
Отдел долгосрочного хранения биологических объектов при низ-
ких температурах и микробиологии, отдел низкотемпературного
консервирования, Институт проблем криобиологии и криомеди-
цины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 25.12.2012
Принята в печать 30.01.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №1. – С. 15–25.
© 2013, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received December, 25, 2012
Accepted January, 30, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 1. – P. 15–25.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
Низкотемпературное консервирование клеток,
тканей и органов позволяет сохранять их биоло-
гические свойства длительное время за счет тор-
можения метаболических и физиологических про-
цессов. Для эффективного криоконсервирования
необходимо учитывать процессы, протекающие в
биологических объектах при замораживании-от-
таивании. Такие процессы связаны с фазовыми
превращениями, происходящими в используемых
при замораживании криопротекторных растворах.
При разработке протоколов криоконсервирования
основное внимание уделяется влиянию разных
скоростей охлаждения на фазовый переход вода-
лед, который является одним из основных повреж-
дающих факторов. Чаще всего образцы охлажда-
ют с постоянной скоростью до температуры –30…
–40°С, а затем погружают в жидкий азот, что приво-
дит к неконтролируемым скоростям охлаждения
в диапазоне температур от указанной температуры
до температуры жидкого азота [12, 17, 21].
В ряде работ показано, что во время заморажи-
вания существует также механизм повреждения
клеток, связанный с эвтектической кристаллиза-
цией [2, 16, 18, 25].
В процессе замораживания клетки вытесняют-
ся фронтом кристаллизации в межкристалличес-
кие прослойки, которые в основном состоят из
криопротекторного раствора [11, 19, 20], поэтому
фазовый переход в прослойках оказывает влияние
на жизнеспособность клеток после заморажива-
ния-оттаивания. Таким образом, изменением ско-
рости охлаждения образца в температурном интер-
вале эвтектической кристаллизации можно влиять
на степень повреждения криоконсервируемого
биообъекта.
Во многих исследованиях замораживание мик-
роорганизмов Saccharomyces cerevisiae и Escheri-
chia coli в интервале температур от комнатной до
температуры жидкого азота проводили с постоян-
ными скоростями охлаждения [13, 14, 23], т. е.
скорость охлаждения биообъектов в температур-
ных интервалах кристаллизации основной массы
воды в образце и кристаллизации смеси эвтекти-
ческой концентрации раствора криопротектора
была одинаковой. Исследования влияния скорос-
тей охлаждения на жизнеспособность и функцио-
нальные характеристики клеток (микроорганиз-
мов) Saccharomyces cerevisiae показали, что опти-
мальная постоянная скорость охлаждения состав-
ляла от 3 до 10 град/мин [22, 24].
При криоконсервировании биообъектов (клетки
опухоли простаты крыс АТ-1, Saccharomyces cere-
visiae) было показано повреждающее действие
эвтектической кристаллизации растворов NaCl и
КСl [16, 22]. В то же время повреждения микроорга-
Low-temperature preservation of cells, tissues and
organs allows keeping their biological properties for a
long time due to inhibition of metabolic and physio-
logical processes. For effective cryopreservation one
should consider the processes occurring in biological
objects during freeze-thawing. These processes are
associated with the phase transitions proceeding in the
cryoprotectant solutions used for freeze-thawing. The
development of cryopreservation protocols is focused
to the impact of different cooling rates on water-ice
phase transition which is one of the main damaging
factors. Usually the samples are cooled with the con-
stant rate down to –30…–40°C, then they are plun-
ged into liquid nitrogen that causes the appearance of
non-controlled cooling rates in the temperature range
from the mentioned temperature down to the one of
liquid nitrogen [12, 17, 21].
Several investigators reported the existence of
mechanism of cell injury associated with eutectic
crystallization during freezing [2, 16, 18, 25].
During freezing the cells are expelled by crystalli-
zation front to the intercrystalline layers which mainly
consist of cryoprotectant solution [11, 19, 20], so the
phase transition in the layers influences the cells viability
during freeze-thawing. Thus the level of injury of
cryopreserved biospecimen can be affected by the
change of cooling rate of a sample within the tempe-
rature range of eutectic crystallization.
Many researchers performed the freezing of Sac-
charomyces cerevisiae and Escherichia coli micro-
organisms in the interval of temperatures from the room
one to the temperature of liquid nitrogen using constant
cooling rates [13, 14, 23], i. e. the rates of biospecimen
cooling were equal for the temperature intervals where
crystallization of bulk water occurs and where does
crystallization of cryoprotectant solution mixture of
eutectic concentration. Investigation of impact of cool-
ing rates on viability and functional characteristics of
Saccharomyces cerevisiae cells (microorganisms)
showed that optimal constant cooling rate varied from
3 to 10 deg/min [22, 24].
During cryopreservation of bioobjects (tumor cells
of rat prostate AT-1, Saccharomyces cerevisiae) the
damaging effect of eutectic crystallization of NaCl and
KCl solutions has been shown [16, 22]. At the same
time the impairments in microorganisms stipulated by
crystallization of cryoprotectant solution mixture of
eutectic concentration have not been studied yet.
The research aim was to study the effect of cont-
rolled cooling rates within the range of eutectic tempe-
rature of cryoprotectant aqueous solutions: dimethyl
sulfoxide (DMSO), glycerol, polyethylenoxide with an
average molecular weight of 1500 (PEO-1500), 1,2-
propanediol (1,2-PD) on viability of cell suspensions
of Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli
16 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
низмов, обусловленные кристаллизацией смеси
эвтектической концентрации растворов криопротек-
торов, еще не изучены.
Цель работы – изучение влияния контролируе-
мых скоростей охлаждения в области эвтектичес-
кой температуры водных растворов криопротек-
торов: диметилсульфоксида (ДМСО), глицерина,
полиэтиленоксида со средней молекулярной мас-
сой 1500 (ПЭО-1500), 1,2-пропандиола (1,2-ПД) на
жизнеспособность суспензий клеток Saccharomy-
ces cerevisiae и Escherichia coli, суспендирован-
ных при различных исходных концентрациях ука-
занных криопротекторов.
Использование клеток S. cerevisiae в качестве
объекта исследования обусловлено тем, что, с од-
ной стороны, эти клетки аналогичны по строению
с клетками многих микроорганизмов, с другой –
являясь низшими эукариотами, они имеют сходные
с большинством эукариотических клеток разных
видов внутриклеточные метаболические, генети-
ческие и сигнальные механизмы. Строение клеточ-
ной стенки и цитоплазматической мембраны у
E. coli менее сложное, чем у дрожжей. Клеточная
стенка этих бактерий состоит из двух слоев – плас-
тичного и ригидного, содержащего два слоя пепти-
догликана [6]. Физико-химические факторы, дейст-
вующие на клетки в процессе замораживания-
оттаивания, могут разрушать связи между компо-
нентами клеточной стенки, что делает этот объект
интересным для криобиологических исследований.
Материалы и методы
Объекты исследования: дрожжи Saccharomyces
cerevisiae (раса 608, получена из Сп.ПО РНИИХП,
Санкт-Петербург) и бактерии Escherichia coli В
(штамм получен из ГНИИ генетики и селекции
промышленных микроорганизмов, Москва).
Дрожжи S. cerevisiae выращивали 48 ч при 30°С
на агаризованной среде Сабуро, затем подращи-
вали в жидкой среде Сабуро 24 ч с аэрацией. Бак-
терии E. coli выращивали в мясопептонном бульо-
не при 37°С с аэрацией 18 ч (начало стационарной
фазы роста). Затем клетки осаждали центрифуги-
рованием (1500g, 15 мин) и ресуспендировали в
водных растворах криопротекторов: ДМСО,
глицерина, ПЭО-1500 и 1,2-ПД с концентрациями
криопротекторного вещества 5, 10, 15 и 20% (об.).
Концентрация клеток в полученных суспензиях
составляла 108 КОЕ/мл.
Микроорганизмы замораживали на програм-
мном замораживателе «Cryoson» (Германия), кото-
рый прошел государственную метрологическую
аттестацию в ННЦ «Институт метрологии» (аттес-
тационное свидетельство №1895 от 26.03.2008 г.).
Данный программный замораживатель позволяет
варьировать скорость охлаждения в интервале 0,1–
suspended in the solutions with different initial con-
centrations of the mentioned cryoprotectants.
The use of S. cerevisiae cells as an object of inves-
tigation is preconditioned by the fact that on the one
hand these cells are similar by structure with the cells
of many microorganisms; on another hand, being a
lower eukaryotes, they have intracellular metabolic,
genetic and signal mechanisms similar to most euka-
ryotic cells of different types. The composition of a
cell wall and cytoplasmic membrane in E. coli is less
complex than in yeasts. Cell wall of these bacteria
consists of two layers, plastic and rigid ones, containing
two layers of peptidoglycan [6]. Physical and chemical
factors affecting the cells during freeze-thawing can
destruct the bonds between components of cell wall
making the object interesting for cryobiological studies.
Materials and methods
The objects of research were Saccharomyces cere-
visiae yeast (race 608 procured by Russian R&D Insti-
tute of Baking Industry, Saint-Petersburg, Russia) and
Escherichia coli B bacteria (the strain was received
from the State Research Institute for Genetics and
Selection of Industrial Microorganisms, Moscow).
S. cerevisiae yeast were cultured for 48 hrs at 30°C
with Sabouraud agar for 24 hrs with aeration. E. coli
bacteria were cultured in meat-infused broth at 37°C
with 18 hrs aeration (initiation of stationary growth
phase). Afterwards the cells were centrifuged (1500g,
15 min) and re-suspended in cryoprotectant aqueous
solutions: DMSO, glycerol, PEO-1500 and 1,2-PD with
concentrations of cryoprotective substance of 5, 10,
15, 20% (v/v). Cell concentration in the obtained
suspensions made 108 CFUs/ml.
Microorganisms were frozen with programmable
freezer Cryoson (Germany) which was metrologically
certified at National Scientific Center Institute of
Metrology (certification Nr 1895 dated of 26.03.2008).
This programmable freezer allows to vary the cooling
rate within 0.1–40 deg/min. Cooling regimens were
set by the temperature of cooling flow in the chamber
of programmable freezer. Freezing programs were
recorded using the control sample with copper-
constantan thermocouple connected to data plotter En-
dim 622.01 (Germany). The samples were frozen in
polypropylene cryovials (Nunc, Germany) with an
effective volume of 1.8×10–6 m3. Measuring thermo-
couple junction was located in geometric center of the
control sample. Cell suspension of 1×10–6 m3 volume
was poured into cryovials for further freezing.
The samples were frozen by three regimens
involving the varying of cooling rate in the range of
eutectic temperature of the corresponding cryoprotec-
tant solution. To estimate the values of this temperature
range we used the reported data on the temperature
of eutectics Teut of aqueous solutions of the studied
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
17
40 град/мин. Режимы охлаждения задавали по
температуре охлаждающего потока в камере прог-
раммного замораживателя. Программы заморажи-
вания регистрировали по эталонному образцу с
помощью медь-константановой термопары и са-
мописца «Endim 622.01» (Германия). Образцы за-
мораживали в полипропиленовых криопробирках
(«Nunc», Германия) с рабочим объемом 1,8×10–6 м3.
Измерительный спай термопары находился в гео-
метрическом центре эталонного образца. Суспен-
зию клеток объемом по 1×10–6 м3 разливали в крио-
пробирки для последующего замораживания.
Образцы замораживали по трем режимам,
предусматривающим варьирование скорости ох-
лаждения в области эвтектической температуры
соответствующего раствора криопротектора. При
определении численных значений этой температур-
ной области использовали известные из литерату-
ры данные о температуре эвтектики Teut водных
растворов рассматриваемых видов криопротекто-
ров. Начало и конец области эвтектической темпера-
туры обозначали Tb
e ut = Teut + 20°С и Te
eut = Teut – 20°С
соответственно.
В работе использовали следующие режимы за-
мораживания.
Режим 1: от 20…22°С до температуры Tb
e ut об-
разцы охлаждали со скоростью 2 град/мин, затем
выдерживали их при температуре Te
eut 5 мин и далее
погружали в жидкий азот.
Режим 2: от 20…22°С до температуры Tb
e ut об-
разцы охлаждали со скоростью 2 град/мин, выдер-
живали их при температуре Te
eut 5 мин, в области
эвтектической температуры соответствующего
вида криопротектора (от Tb
e ut до Te
eut) скорость ох-
лаждения составляла 0,5–1 град/мин, после чего
образцы погружали в жидкий азот.
Режим 3: от 20…22°С до температуры Tb
e ut об-
разцы охлаждали со скоростью 2 град/мин, выдер-
живали их при Te
eut 5 мин, в области эвтектической
температуры соответствующего вида криопротек-
тора (от Tb
e ut до Te
eut) скорость охлаждения состав-
ляла 20–25 град/мин, после чего образцы погру-
жали в жидкий азот.
Замороженные образцы оттаивали на водяной
бане при 37°С при постоянном встряхивании до
исчезновения твердой фазы, которое определяли
визуально.
Жизнеспособность дрожжевых клеток S. cerevi-
siae и бактерий E. coli определяли чашечным ме-
тодом Коха [3] по количеству макроколоний, сфор-
мировавшихся на агаризованных средах. Серий-
ные разведения клеточных суспензий проводили в
0,9%-м водном растворе NaCl. Контролем были
суспензии клеток в соответствующих средах кон-
сервирования, не подвергавшиеся замораживанию.
cryoprotectants. Onset and termination of eutectic
temperature range were denoted as Tb
e ut = Teut + 20°С
and Te
eut = Teut – 20°С respectively.
In the experiments we used the following freezing
regimens.
Regimen 1: from 20…22°C to the Tb
e ut temperature
the samples were cooled with the rate of 2 deg/min,
then held at Te
eut temperature for 5 min and plunged
into liquid nitrogen.
Regimen 2: from 20…22°C to the Tb
e ut temperature
the samples were cooled with the rate of 2 deg/min,
then held at Te
eut temperature for 5 min, in the range of
eutectic temperature of the corresponding cryo-
protectant type (from Tb
e utto Te
eut ) the cooling rate was
0.5–1 deg/min, thereafter the samples were plunged
into liquid nitrogen.
Regimen 3: from 20…22°C to the Tb
e uttemperature
the samples were cooled with the rate of 2 deg/min,
then held at Te
eut temperature for 5 min, in the range of
eutectic temperature of corresponding cryoprotectant
type (from T b
e ut to Te
eut ) the cooling rate was 20–
25 deg/min, thereafter the samples were plunged into
liquid nitrogen.
The frozen samples were thawed in water bath at
37°C with constant shaking until disappearing of solid
phase which was visually determined.
Viability of S. cerevisiae yeast cells and E. coli
bacteria was assessed with Koch’s Plate method [3]
by the number of macrocolonies formed in agar media.
Serial dilutions of cell suspensions were performed in
0.9% aqueous NaCl solution. The control was the cell
suspensions in the corresponding preservation media
which were not exposed to freezing.
The used Koch’s plate method is an integral one
and characterizes the preservation of cell proliferative
properties. Each macrocolony formed on the surface
of medium is initiated by cells-descendants of single
microbial cell. This is undoubted advantage versus
other methods for assessment of cell viability based
on testing the change in permeability of cell membranes
and barrier function of microorganism wall, metabolic
and synthetic processes, cell ultrastructure etc. Here-
with the obtained data can be surely extrapolated for the
experiments with other eukaryotic cells for which the
cryopreservation regimens have not been developed yet.
The obtained results were statistically processed
in MS Excel using Student’s test [7] considering the
differences as significant at p < 0.05. The data were
presented as M ± m, where M is a mean value derived
in 6 similar experiments, m denotes a standard error.
Results and discussion
The selection of the studied cryoprotectant set is
stipulated by their wide application for microorganisms
cryopreservation.
18 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
Используемый чашечный метод Коха является
интегральным и характеризует сохранение про-
лиферативных свойств клеток. Каждая макроко-
лония, сформировавшаяся на поверхности среды,
образована дочерними клетками-потомками одной
микробной клетки. Это является несомненным
преимуществом перед другими методами оценки
жизнеспособности клеток, основанными на тести-
ровании изменения проницаемости клеточных
мембран и барьерной функции стенки микроорга-
низмов, метаболических и синтетических процес-
сов, ультраструктуры клеток и т. д. В связи с этим
полученные данные можно с уверенностью экстра-
полировать на эксперименты с другими клетками
эукариот, для которых до сих пор отсутствуют
эффективные режимы криоконсервирования.
Статистическую обработку полученных ре-
зультатов проводили с использованием пакета про-
грамм MS Excel по методу Стьюдента [7], считая
достоверными различия с показателем значимости
р<0,05. Данные представляли как M ± m, где M –
среднее значение, полученное в 6 аналогичных
экспериментах, m – стандартное отклонение.
Результаты и обсуждение
Выбор исследуемого ряда криопротекторов
обусловлен тем, что они наиболее часто применя-
ются для криоконсервирования микроорганизмов.
Отправной точкой для определения граничных
значений области эвтектической температуры бы-
ли известные из литературных источников зна-
чения эвтектической температуры Teut водных
растворов криопротекторов: ДМСО Teut = – 66°С,
1,2-ПД Teut = –57°С, глицерина Teut = –46,5°С [1, с.
91], полиэтиленоксидов в зависимости от молеку-
лярной массы Teut снижается от –11°С для ПЭО-
900 до –14°С для ПЭО-2000 [8, с. 81]. В то же
время известно [1, с.78], что после завершения
первичной кристаллизации, когда растворитель пол-
ностью вымораживается, наступает вторичная
кристаллизация, тесно связанная с процессами эв-
тектической кристаллизации, при которой и раство-
ренные вещества начинают затвердевать после
достижения эвтектической температуры. Посколь-
ку при криоконсервировании клеток используют
сложные криоконсервирующие среды, содержащие
соли, белки, органические молекулы и криопротек-
торы, эвтектическая зона этих веществ оказывает-
ся довольно размытой, и определить точку эвтек-
тики очень трудно. В связи с этим вторичная крис-
таллизация, связанная с затвердеванием смесей
эвтектического состава, в микроканальцах растя-
гивается по температурной шкале.
Согласно экспериментальным данным, получен-
ным методом термопластической деформации [4,
Starting point for estimating the boundary values
of eutectic temperature range were known from the
literature values of Teut for cryoprotectant aqueous
solutions: DMSO Teut = –66°C, 1,2-PD Teut = –46.5°C,
for glycerol Teut = –46.5°С [1, p. 91]; Teut of polyethy-
lenoxides depends on the molecular weight and decrea-
ses from –11°C for PEO-900 down to –14°C for PEO-
2000 [8, p. 81]. At the same time it is known [1] that
after completion of initial crystallization when the sol-
vent entirely freezes-out, the secondary crystallization
starts, which is tightly associated with eutectic crystal-
lization during which the dissolved substances start to
solidify after reaching the eutectic temperature. Whe-
reas during cryopreservation of cells the complex cryo-
preservation media are used, the eutectic zone of these
substances appears to be quite indistinct and the point
of eutectics is hardly to determine. Due to this the se-
condary crystallization associated with the solidification
of mixtures of eutectic composition in microchannels
extends along the temperature scale.
According to the experimental data obtained by the
method of thermoplastic deformation [4, 5] the exten-
sion of the studied temperature interval depending on
the experimental conditions and cryoprotectant type
could vary from 20 to 40 degrees. Thus the limits of
onset and termination of eutectic temperature interval
are as follows: Tb
e ut = Teut + 20°С and Te
eut = Teut – 20°С,
respectively.
Based on the above-mentioned and for convenient
comparison of the obtained data the eutectic tempe-
rature intervals of the used cryoprotectant aqueous
solutions were considered as: from –40 down to –86°C
for DMSO; from –40 down to –77°C for 1,2-PD;
from –30 down to –67°C for glycerol; and from –12
down to –55°C for PEO-1500.
Rate of cooling from the room temperature to the
temperature of onset of the eutectic temperature
interval Tb
eut of the corresponding cryoprotectant solu-
tion for all the used protocols of cooling made 2 deg/min.
This rate provided the highest survival of some micro-
organisms [24]. Then the samples were held at Tb
eut
for 5 min. Temporary stabilization is necessary to equi-
librate the temperature of sample in eutectic tempe-
rature interval. After stabilization the samples were
either plunged into liquid nitrogen (regimen 1) or under-
went the following cooling with certain constant rate
down to Te
eut temperature and only then plunged into
liquid nitrogen (regimens 2 and 3).
Thus, the cooling regimen 1 provided uncontrolled
(UC) cooling rate in the investigated range from
Tb
eut down to Te
eut for all three types of cryoprotectant
solutions independently of their concentrations while
the regimens 2 and 3 guaranteed respectively low
(1 deg/min) and high (20 deg/min) controlled cooling
rates in this temperature range.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
19
5], протяженность исследуемого нами температур-
ного интервала в зависимости от условий экспери-
мента и вида криопротектора может варьировать
от 20 до 40 градусов. Таким образом, границы на-
чала и конца эвтектического температурного ин-
тервала: Tb
e ut = Teut + 20°С и Te
eut = Teut – 20°С соот-
ветственно.
С учетом вышеизложенного и для удобства
сравнения полученных результатов эвтектические
температурные интервалы используемых водных
растворов криопротекторов были определены: от
–40 до –86°С (ДМСО); от –40 до –77°С (1,2-ПД);
от –30 до –67°С (глицерин); от –12 до –55°С (ПЭО-
1500).
Скорость охлаждения от комнатной темпера-
туры до температуры начала эвтектического тем-
пературного интервала Tb
eut соответствующего раст-
вора криопротектора для всех используемых нами
протоколов охлаждения составляла 2 град/мин. Та-
кая скорость охлаждения обеспечивает наиболее
высокую сохранность ряда микроорганизмов [24].
Затем образцы выдерживали при температуре Tb
eut
в течение 5 мин. Временная стабилизация необхо-
дима для выравнивания температуры образца по
всему объему перед изменением скорости охлаж-
дения в эвтектическом температурном интервале.
После стабилизации образцы или погружали в
жидкий азот (режим 1), или продолжали охлаждать
с определенной постоянной скоростью до темпера-
туры Te
eut и только тогда погружали в жидкий азот
(режимы 2 и 3).
Таким образом, режим охлаждения 1 для всех
трех видов растворов криопротекторов и выбран-
ных значений их концентраций обеспечивал неконт-
ролируемую (НК) скорость охлаждения в иссле-
дуемом диапазоне от Tb
eut до Te
eut, в то время как
режимы 2 и 3 гарантировали соответственно низ-
кую (1 град/мин) и высокую (20 град/мин) контро-
лируемые скорости охлаждения в этой области
температур.
Данные по жизнеспособности микроорганизмов
после криоконсервирования с водными растворами
ДМСО, 1,2-ПД, глицерина и ПЭО-1500 различной
концентрации согласно трем вышеописанным ре-
жимам охлаждения для клеток S. cerevisiae пред-
ставлены на рис. 1.
Из рис. 1 видно, что для всех четырех видов
водных растворов криопротекторов, применяемых
для криоконсервирования клеток S. cerevisiae,
замораживание согласно режиму 1, который пре-
дусматривает неконтролируемую скорость охлаж-
дения после температуры Tb
e ut, жизнеспособность
клеток была достоверно ниже, чем при использова-
нии режимов 2 и 3 с контролируемыми скоростями
охлаждения в том же температурном интервале.
При этом разница показателей жизнеспособности
The data on viability of microorganisms after cryo-
preservation in aqueous solutions of DMSO, 1,2-PD,
glycerol and PEO-1500 of different concentrations
according to three foregoing cooling regimens for S.
cerevisiae cells are presented in Fig. 1.
Fig. 1 shows that for all four types of cryoprotectant
aqueous solutions, applied for freeze-thawing of
S. cerevisiae cells, the freezing by regimen 1 providing
an uncontrolled cooling rate after Tb
eut temperature, the
cell viability was significantly lower than the ones
resulted after implementing regimens 2 and 3 with
controlled cooling rates within the same temperature
interval. Moreover, the differences in the indices of
S. cerevisiae viability in the case of regimens 2 and 3,
which differ by the value of controlled cooling rate
within the eutectic temperature interval (low one for
regimen 2 and high one for regimen 3) were less pro-
nounced for aqueous solutions of DMSO and PEO-
1500 that those for 1,2-PD and glycerol. At the same
time, there was observed a stable tendency to in-
creasing of S. cerevisiae cell viability when using high
cooling rate (regimen 3) within the eutectic tempe-
rature range of certain cryoprotectant solution.
The data on viability of microorganisms after freeze-
thawing in aqueous solutions of DMSO, 1,2-PD, gly-
cerol and PEO-1500 of different concentration accor-
ding three regimens for E. coli cells are presented in
Fig. 2.
Freeze-thawing of E. coli bacteria in aqueous so-
lutions of DMSO and PEO-1500 (Fig. 2A and D) like
in the case of S. cerevisiae using regimen 1 with un-
controlled cooling rates resulted in lower cell viability
if compared with the controlled cooling rates (regimens
2 and 3) applied in the eutectic temperature range for
certain cryoprotectant solution. Furthermore, the high-
est indices of viability were provided by high cooling
rates applied in this temperature range (regimen 3).
Viability of E. coli cells after freeze-thawing in
aqueous solutions of 1,2-PD and glycerol (Fig. 2B and
C) significantly differed from the values obtained when
using DMSO and PEO-1500 solutions as cryoprotective
media. In this case the lowest indices of cell viability
were obtained for low cooling rate in the eutectic
temperature range (regimen 2), and the highest viability
was reached when using high controlled cooling rate
in the same temperature interval (regimen 3). Uncont-
rolled cooling rates applied after Tb
eut also reduced
E. coli viability but these were still higher than those
in case of regimen 2.
Using as an example the S. cerevisiae and E. coli
microorganisms we have demonstrated that the appli-
cation of controlled cooling rate of 20 deg/min within
the eutectic temperature range for certain cryoprotec-
tant solution allowed the obtaining of higher viability
indices for microorganisms for all the studied cryo-
protectant solutions independently of their concentra-
20 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
*
*
*
* *
*
*
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
*
*
*
*
*
*
*
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
* * ** *
*
*
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
*
*
*
*
*
*
*
Рис. 1. Жизнеспособность клеток Saccharomyces cerevisiae (% от контроля)
после криоконсервирования с водными растворами криопротекторов
ДМСО (A), 1,2-ПД (B), глицерина (C), ПЭО-1500 (D) различной концентрации
(5, 10, 15 и 2%). Условия проведения эксперимента: – охлаждение до
температуры начала эвтектического интервала Tb
eut с постоянной скоростью
2 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (режим 1); – то
же, но охлаждение в эвтектическом температурном интервале со скорос-
тью 1 град/мин (режим 2); – то же, но охлаждение в эвтектическом темпе-
ратурном интервале со скоростью 20 град/мин (режим 3). Представлены
средние значения с учетом стандартных отклонений, вычисленных из 6
независимых определений. * – отличия статистически достоверны отно-
сительно показателей после замораживания согласно режиму 1, р < 0,05.
Fig. 1. Viability of Saccharomyces cerevisiae cells (% of the control) after cryopre-
servation in cryoprotectant aqueous solutions of DMSO (A), 1,2-PD (B), glyce-
rol (C), PEO-1500 (D) in different concentrations (5, 10, 15 and 20%). Experi-
mental conditions: – cooling down to the temperature of onset of eutectic
interval Tb
eut with the constant rate of 2 deg/min with following plunging into
liquid nitrogen (regimen 1); – the same conditions but with cooling in eutec-
tic temperature interval with the rate of 1 deg/min (regimen 2); – the same
conditions but with cooling in eutectic temperature interval with the rate of
20 deg/min (regimen 3). The data represent the mean values with standard
errors calculated from 6 independent equations. * – differences are statisti-
cally significant if compared to the indices after freezing according to the regi-
men 1, p < 0.05.
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
A B
C D
S. cerevisiae для режимов 2 и
3, которые отличались друг от
друга величиной контролируе-
мой скорости охлаждения в эв-
тектическом интервале темпе-
ратур (низкой для режима 2 и
высокой для режима 3), для
водных растворов ДМСО и
ПЭО-1500 была менее выра-
женной, чем для 1,2-ПД и гли-
церина. В то же время наблю-
дается устойчивая тенденция к
повышению жизнеспособности
клеток S. cerevisiae при исполь-
зовании высокой скорости ох-
лаждения (режим 3) в области
эвтектической температуры
раствора криопротектора.
Данные по жизнеспособнос-
ти микроорганизмов после
криоконсервирования с вод-
ными растворами ДМСО,
1,2-ПД, глицерина и ПЭО-1500
различной концентрации соглас-
но трем режимам охлаждения
для клеток E. coli представле-
ны на рис. 2.
При криоконсервировании
бактерий E. сoli с водными
растворами ДМСО и ПЭО-
1500 (рис. 2, A, D) как и S. ce-
revisiae, при использовании
режима 1 с неконтролируемыми
скоростями охлаждения жизне-
способность клеток меньше,
чем при контролируемых ско-
ростях охлаждения (режимы 2
и 3) в области эвтектической
температуры раствора криопро-
тектора. При этом наилучшие
показатели жизнеспособности
обеспечивали высокие скорос-
ти охлаждения в этой области
температур (режим 3).
Жизнеспособность клеток
E. сoli при криоконсервировании
с водными растворами 1,2-ПД
и глицерином (рис. 2, B, C)
существенно отличается от ре-
зультатов, полученных при ис-
пользовании в качестве криоза-
щитных сред водных растворов
ДМСО и ПЭО-1500. В этом слу-
чае наименьшие показатели
жизнеспособности клеток полу-
чены для низкой скорости ох-
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
21
лаждения в области эвтекти-
ческих температур (режим 2),
а наилучшая жизнеспособ-
ность достигалась при высокой
контролируемой скорости ох-
лаждения в той же темпера-
турной области (режим 3).
Неконтролируемые скорости
охлаждения после Tb
eut также
снижали жизнеспособность E.
сoli, но эти значения были вы-
ше, чем для режима 2.
На примере микроорганиз-
мов S. cerevisiae и E. coli было
показано, что применение конт-
ролируемой скорости охлаж-
дения 20 град/мин в области
эвтектической температуры
раствора криопротектора поз-
воляет получить более высо-
кие показатели жизнеспо-
собности микроорганизмов для
растворов всех видов криопро-
текторов вне зависимости от
их концентраций. По сравне-
нию с теми режимами замора-
живания, в которых использо-
вали неконтролируемую ско-
рость охлаждения в указанном
интервале температур, жизне-
способность увеличивалась в
среднем в 2–3 раза для S. cere-
visiae и в 1,5–2 раза для E. coli.
Таким образом, на жизне-
способность микроорганизмов
при их криоконсервировании
существенно влияют скорости
охлаждения в области эвтекти-
ческой температуры раствора
криопротектора. При этом, как
следует из экспериментальных
данных, более предпочтитель-
ными оказываются высокие
скорости охлаждения (порядка
20–25 град/мин) в области эв-
тектических температур. Сле-
дует отметить, что решающим
фактором при определении
наиболее эффективной контро-
лируемой скорости охлаждения
в области эвтектических тем-
ператур является сочетание
знания видовых особенностей
строения микроорганизмов с
выбором определенного раст-
вора криопротектора. Приме-
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
*
*
**
*
*
*
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
#
*
#
#
#
#
#
#
#
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
# #
#
#
# #
#
#
0
20
40
60
80
100
5 10 15 20
*
* * ** *
**
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
Концентрация криопротектора, %
Cryoprotectant concentration, %
Ж
из
не
сп
ос
об
но
ст
ь
кл
ет
ок
,
%
C
el
l v
ia
bi
lit
y,
%
A B
C D
Рис. 2. Жизнеспособность клеток Escherichia coli (% от контроля) после
криоконсервирования с водными растворами криопротекторов ДМСО (A),
1,2-ПД (B), глицерина (C), ПЭО-1500 (D) различной концентрации (5, 10,
15 и 20%). Условия проведения эксперимента: – охлаждение до темпе-
ратуры начала эвтектического интервала T b
eut с постоянной скоростью
2 град/мин с последующим погружением в жидкий азот (режим 1); – то
же, но охлаждение в эвтектическом температурном интервале со ско-
ростью 1 град/мин (режим 2); – то же, но охлаждение в эвтектическом
температурном интервале со скоростью 20 град/мин (режим 3). Пред-
ставлены средние значения с учетом стандартных отклонений, вычислен-
ных из 6 независимых определений. * – отличия статистически достоверны
относительно показателей после замораживания согласно режиму 1; # –
отличия статистически достоверны относительно показателей после
замораживания согласно режиму 2, р < 0,05.
Fig. 2. Viability of Escherichia coli cells (% of the control) after cryopreservation
in cryoprotectant aqueous solutions of DMSO (A), 1,2-PD (B), glycerol (C),
PEO-1500 (D) in different concentrations (5, 10, 15 and 20%). Experimental
conditions: – cooling down to the temperature of onset of eutectic interval
Tb
eut with the constant rate of 2 deg/min with following plunging into liquid
nitrogen (regimen 1); – the same conditions but with cooling in eutectic
temperature interval with the rate of 1 deg/min (regimen 2); – the same
conditions but with cooling in eutectic temperature interval with the rate of
20 deg/min (regimen 3). The data represent the mean values with standard
errors calculated from 6 independent equations. * – differences are statisti-
cally significant if compared to the indices after freezing according to the regi-
men 1, # – differences are statistically significant if compared to the indices
after freezing according to the regimen 2, p < 0.05.
22 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
ром такого сочетания может служить заморажива-
ние бактерий E. сoli с водными растворами 1,2-
ПД и глицерина, для которых более предпочтитель-
ными по показателям жизнеспособности являются
высокие скорости охлаждения как контролируе-
мые, так и неконтролируемые. Низкие скорости
охлаждения (0,5–1 град/мин) в этом интервале
температур дают наихудшие результаты по жизне-
способности. Это, по всей видимости, связано с
особенностями строения микроорганизмов и обус-
ловленной этими особенностями проницаемостью
их цитоплазматических мембран для молекул во-
ды и криопротекторов [9, 10].
Когда в качестве криоконсервирующей среды
используется водный раствор криопротектора и
для видов криопротекторов с известной темпера-
турой эвтектики, в первом приближении для опре-
деления температурного интервала кристаллиза-
ции смеси эвтектической концентрации раствора
криопротектора можно применять методику, опи-
санную в данной статье. Если криоконсервирующая
среда имеет более сложный состав и кроме крис-
таллизации смеси эвтектической концентрации
раствора криопротектора могут присутствовать и
фазовые превращения, связанные с наличием дру-
гих компонентов, необходимо использовать более
сложные методики определения температурного
интервала фазовых превращений для варьирования
скоростей охлаждения с целью получения более
высоких показателей сохранности криоконсерви-
руемых биообъектов [15].
Выводы
Кристаллизация смеси эвтектической концент-
рации раствора криопротектора на сегодняшний
день является наименее изученным фазовым
превращением как с точки зрения кинетики проте-
кания процессов, так и их вклада в общее повреж-
дение биообъектов при криоконсервировании.
В работе установлено, что скорость охлаждения
в области эвтектической температуры раствора
криопротектора оказывает влияние на конечные
показатели жизнеспособности клеток микроорга-
низмов после их криоконсервирования. Причем это
влияние имеет место при криоконсервировании
S. cerevisiae и E. сoli со всеми исследуемыми
растворами криопротекторов (ДМСО, глицерин,
ПЭО-1500, 1,2-ПД) вне зависимости от их концент-
раций. Выбор конкретной контролируемой скорости
охлаждения в эвтектическом интервале темпера-
тур зависит от вида консервируемого биологичес-
кого материала. При определении наиболее эффек-
тивной контролируемой скорости охлаждения в
области эвтектических температур решающим
фактором является сочетание знаний видовых
Thus it can be concluded that post-thaw viability of
microorganisms is significantly affected by cooling
rates within the eutectic temperature range of certain
cryoprotectant solution. Moreover, the experimental
data evidently demonstrated that the most preferable
ones were high cooling rates (of about 20–25 deg/min)
within the eutectic temperature range. It is worth noting
that an essential factor during determination of the
most efficient controlled cooling rate within the eutectic
temperature interval is the combination of knowledge
about microorganism structure due to species peculiari-
ties and the choice of proper cryoprotectant type. As
an example of such combination could serve the freeze-
thawing of E. coli bacteria in an aqueous solutions of
1,2-PD and glycerol for which both controlled and un-
controlled high cooling rates are more preferable judging
by the indices of viability. Low cooling rates (0.5–
1 deg/min) within this temperature range provide the
worst results on viability. This is obviously associated
with the peculiarities of microorganism structure and
stipulated by these peculiarities permeability of their
cytoplasmic membranes for molecules of water and
cryoprotectants [9, 10].
If cryopreservation medium is the cryoprotectant
aqueous solution it is possible to apply the method
described in the paper for determining the crystal-
lization temperature interval of cryoprotectant solution
mixture of eutectic concentration in the first appro-
ximation for that cryoprotectants which eutectic tempe-
rature is known. If cryopreservation medium has more
complicated composition and in addition to crystalliza-
tion of cryoprotectant solution mixture of eutectic con-
centration the phase transitions associated with the
presence of other components may exist, one should
use more complicated methods for determining the tem-
perature interval of phase transitions to vary the cooling
rates aimed to obtain higher indices of post-thaw
survival of biospecimens [15].
Conclusions
Nowadays, the crystallization of cryoprotectant so-
lution mixture of eutectic concentration is a phase tran-
sition studied insufficiently both in terms of kinetics of
processes and their contribution to the general injury
of biospecimen during cryopreservation.
This study revealed that that the cooling rate within
the eutectic temperature range of cryoprotectant
solution affects a post-thaw viability of microbial cells.
Moreover this impact was found during cryopreser-
vation of S. cerevisiae and E. coli with all the studied
cryoprotectant solutions (DMSO, glycerol, PEO-1500,
1,2-PD) independently on their concentrations. The
choice of certain controlled cooling rate within the
eutectic temperature interval depends on the type of
biological specimen to be preserved. When determining
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
23
Литература
1. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. – Киев: Наук.
думка, 1994. – 432 с.
2. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотем-
пературного консервирования клеточных суспензий. –
Киев: Наук. думка, 1994. – 144 с.
3. Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспо-
собности микроорганизмов. – Пущино, 1990. – 186 с.
4. Осецкий А.И., Гурина Т.М. Исследование фазовых состоя-
ний замороженных растворов и биосистем методом
термопластической деформации // Проблемы криобиоло-
гии. – 1992. – №2. – C. 24–29.
5. Осецкий А.И. Кирилюк А.Л., Гурина Т.М. О возможном
механизме повреждения криоконсервируемых биологи-
ческих объектов за счет пластической релаксации давле-
ний в замкнутых жидкофазных включениях // Проблемы
криобиологии. – 2007. – Т. 17, №3. – С. 272–282.
6. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. В.И.
Покровского. – М.: ГЭОТАР–МЕД, 2001. – 768 с.
7. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологіч-
них експериментів: Навч. посібник. – Донецьк, 1999. – 210 с.
8. Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Иткин Ю.А. Низкотемпе-
ратурная кристаллизация в биологических системах. –
Киев: Наук. думка, 1977. – 243 с.
9. Сакун О.В., Марущенко В.В., Коваленко І.Ф. та ін. Вплив
температури на коефіцієнти проникності мембран дріж-
джів Saccharomyces cerevisiae для води та кріопротек-
торів // Проблемы криобиологии. – 2009. – Т. 19, № 1. –
С.41–48.
10. Сакун О.В. Механізм кріопошкодження дріжджових грибів
Saccharomyces cerevisiae при заморожуванні у водному
розчині диметилсульфоксиду з постійною швидкістю у кон-
тейнерах циліндричної форми // Проблемы криобиологии. –
2010. – Т. 20, №1. – С. 59–65.
11. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование
для создания банка клеток: современные концепции на
рубеже XXI столетия // Проблемы криобиологии. – 2003. –
№2. – С. 62–83.
12.Day J. G., Stacey G. N. Cryopreservation and freeze-drying
protocols. – Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2007. – 348 p.
13. Dumont F., Marechal P. A., Gervais P. Cell size and water
permeability as determining factors for cell viability after
freezing at different cooling rates // Applied and Environmental
Microbiology. – 2004. – Vol. 70, № 1. – P. 268–272.
14. Dumont F., Marechal P. A., Gervais P. Influence of cooling rate
on Saccharomyces cerevisiae destruction during freezing:
unexpected viability at ultra-rapid cooling rates // Cryobiology. –
2003. – Vol. 46, №1. – P. 33–42.
15. Gurina T.M., Pakhomov A.V., Kyryliuk A.L., Bozhok G.A. Deve-
loping protocol of testicular interstitial cell cryopreservation
with consideration of determining temperature intervals for
controlled cooling below –60°С // Cryobiology. – 2011. – Vol. 62,
№2. – P. 107–114.
the most efficient controlled cooling rate in the range
of eutectic temperatures a key factor is the combination
of the knowledge about species peculiarities of micro-
organism structure and the choice of certain cryopro-
tectant solution.
More preferable cooling rates appeared to be the
high ones (of about 20–25 deg/min) within the eutectic
temperature range of certain cryoprotectant solution.
Low cooling rates (0.5–1 deg/min) in this temperature
range yield the lowest viability values.
The data presented in the paper should be considered
when developing the cryopreservation protocols for
other species of microorganisms.
особенностей строения микроорганизмов с вы-
бором определенного раствора криопротектора.
Более предпочтительными оказываются высо-
кие скорости охлаждения (порядка 20–25 град/мин)
в области эвтектической температуры раствора
криопротектора. Низкие скорости охлаждения
(0,5–1 град/мин) в этом интервале температур дают
наихудшие результаты по жизнеспособности.
Данные, представленные в работе, необходимо
учитывать при разработке протоколов криокон-
сервирования других видов микроорганизмов.
References
1. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology. – Kiev: Naukova
Dumka, 1994. – 432 p.
2. Gordiyenko E.A., Pushkar N.S. Physical grounds of low-tempe-
rature preservation of cell suspensions. – Kiev: Naukova Dum-
ka, 1994. – 144 p.
3. Lusta K.A., Fikhte B.A. Methods for assessment of microorga-
nism viability. – Puschino, 1990. – 186 p.
4. Osetsky A.I., Gurina T.M. Study of phase states of frozen so-
lutions and biosystems by method of thermoplastic deforma-
tion // Problems of Cryobiology. – 1992. – N2. – P. 24–29.
5. Osetsky A.I., Kirilyuk A.L., Gurina T.M. On possible mechanism
of damage in frozen-thawed biological objects due to pressure
plastic relaxation in close liquid phase inclusions // Problems
of Cryobiology. – 2007. – Vol. 17, N3. – P. 272–282.
6. Pozdeev O.K. Medical microbiology / Ed. By V.I. Pokrovsky. –
Moscow: GEOTAR-MED, 2001. – 768 p.
7. Prisedsky Yu.G. Statistical processing of biological experiments
results: Textbook. – Donetsk, 1999. – 210 p.
8. Pushkar N.S., Belous A.M., Itkin Yu.A. Low-temperature crystal-
lization in biological systems. – Kiev: Naukova Dumka, 1977. –
243 p.
9. Sakun O.V., Maruschenko V.V., Kovalenko I.F. et al. Temperature
effect on membrane permeability coefficient of yeast-like fungi
Saccharomyces cerevisiae for water and cryoprotectants //
Problems of Cryobiology. – 2009. – Vol. 19, N1. – P. 41–48.
10.Sakun O.V. Cryoinjury mechanisms in the yeast fungi Saccha-
romyces cerevisiae during freezing in dimethyl sulfoxide
aqueous solution at a constant rate in cylindrical containers //
Problems of Cryobiology. – 2010. – Vol. 20, N1. – P. 59–65.
11.Fuller B., Green C., Grischenko V.I. Cryopreservation for cell
banking: current concepts at the turn of the 21st century //
Problems of Cryobiology. – 2003. – N2. – P. 62–83.
12.Day J. G., Stacey G. N. Cryopreservation and freeze–drying
protocols. – Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2007. – 348 p.
13. Dumont F., Marechal P. A., Gervais P. Cell size and water
permeability as determining factors for cell viability after
freezing at different cooling rates // Applied and Environmental
Microbiology. – 2004. – Vol. 70, N 1. – P. 268–272.
14. Dumont F., Marechal P. A., Gervais P. Influence of cooling rate
on Saccharomyces cerevisiae destruction during freezing:
unexpected viability at ultra–rapid cooling rates // Cryo-
biology. – 2003. – Vol. 46, N1. – P. 33–42.
15. Gurina T.M., Pakhomov A.V., Kyryliuk A.L., Bozhok G.A. Deve–
loping protocol of testicular interstitial cell cryopreservation
with consideration of determining temperature intervals for
controlled cooling below –60°С // Cryobiology. – 2011. – Vol. 62,
N2. – P. 107–114.
16. Han B., Bischof J.C. Direct cell injury associated with eutectic
crystallization during freezing // Cryobiology. – 2004. – Vol. 48,
N1. – P. 8–21.
24 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
16. Han B., Bischof J.C. Direct cell injury associated with eutectic
crystallization during freezing // Cryobiology. – 2004. – Vol. 48,
№1. – P. 8–21.
17. Higgins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O.M. Effects
of freezing profile parameters on the survival of cryopreserved
rat embryonic neural cells // J. Neurosci. Meth. – 2011. –
Vol. 201, №1. – P. 9–16.
18.Kristiansen J. Leakage of a trapped fluorescent marker from
liposomes: effects of eutectic crystallization of NaСl and inter-
nal freezing // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, №5. – P. 575–
584.
19.Mazur P., Cole K.W. Roles of unfrozen fraction, salt concent-
ration and changes in cell volume in the survival of frozen hu-
man erythrocytes // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, №1. –
P. 1–29.
20.Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implica-
tions // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1984. – Vol. 247, №3. –
P. 125–142.
21.Meryman H. T. Cryopreservation of living cells: principles and
practice // Transfusion. – 2007. – Vol. 47, №5. – P. 935–945.
22. Morris G.J., Coulson G.E., Clarke K.J. Freezing injury in Saccha-
romyces cerevisiae: the effect of growth conditions // Cryo-
biology. – 1988. – Vol. 25, №5. – P. 471–482.
23.Seki S., Kleinhans F. W., Mazur P. Intracellular ice formation in
yeast cells vs. cooling rate: predictions from modeling vs. ex-
perimental observations by differential scanning calorimetry //
Cryobiology. – 2009. – Vol. 58, №2. – P. 157–165.
24.Smentek P., Windisch S.Z. Frage des Uberlebens von Hele-
stammen unter flussigem Stickstoff // Zbl. Bacteriol. – 1982. –
Vol. 3, №3. – S. 432–439.
25.Toscano W.M., Cravalho E.G., Silvares O.M., Huggins C.E. The
thermodynamics of intracellular ice nucleation in the freezing
of erythrocytes // J. Heat Transfer. – 1975. – Vol. 97, №3. –
P. 326–332.
17. Higgins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O.M. Effects
of freezing profile parameters on the survival of cryopreserved
rat embryonic neural cells // J. Neurosci. Meth. – 2011. –
Vol. 201, N1. – P. 9–16.
18.Kristiansen J. Leakage of a trapped fluorescent marker from
liposomes: effects of eutectic crystallization of NaСl and inter–
nal freezing // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, N5. – P. 575–
584.
19.Mazur P., Cole K.W. Roles of unfrozen fraction, salt concent–
ration and changes in cell volume in the survival of frozen hu–
man erythrocytes // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, N1. – P. 1–
29.
20.Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implica–
tions // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 1984. – Vol. 247, N3. – P.
125–142.
21.Meryman H. T. Cryopreservation of living cells: principles and
practice // Transfusion. – 2007. – Vol. 47, N5. – P. 935–945.
22. Morris G.J., Coulson G.E., Clarke K.J. Freezing injury in Saccha-
romyces cerevisiae: the effect of growth conditions // Cryo-
biology. – 1988. – Vol. 25, N5. – P. 471–482.
23.Seki S., Kleinhans F. W., Mazur P. Intracellular ice formation in
yeast cells vs. cooling rate: predictions from modeling vs. ex–
perimental observations by differential scanning calorimetry //
Cryobiology. – 2009. – Vol. 58, N2. – P. 157–165.
24.Smentek P., Windisch S. Z. Frage des Uberlebens von
Helestammen unter flussigem Stickstoff // Zbl. Bacteriol. –
1982. – Vol. 3, N3. – S. 432–439.
25.Toscano W.M., Cravalho E.G., Silvares O.M., Huggins C.E. The
thermodynamics of intracellular ice nucleation in the freezing
of erythrocytes // J. Heat Transfer. – 1975. – Vol. 97, N3. –
P. 326–332.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue1, 2013
25
|