Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема
Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в виде суспензий различных объемов в комбинированной среде с декстраном (15%) и ДМСО (5%). Установлено, что увеличение объема замораживаемых образцов и уменьшение скорости замораживания и отогрева не приводят к значительному росту потока ио...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2013 |
| Main Author: | |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68715 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема / В.В. Рамазанов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 124-134. — Бібліогр.: 29 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| id |
nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68715 |
|---|---|
| record_format |
dspace |
| spelling |
Рамазанов, В.В. 2014-09-27T12:36:29Z 2014-09-27T12:36:29Z 2013 Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема / В.В. Рамазанов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 124-134. — Бібліогр.: 29 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68715 57.043:577.352.4:547.42/43 Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в виде суспензий различных объемов в комбинированной среде с декстраном (15%) и ДМСО (5%). Установлено, что увеличение объема замораживаемых образцов и уменьшение скорости замораживания и отогрева не приводят к значительному росту потока ионов Н+ и потере барьерной функции мембран для глутатиона в клетках, отмытых от криоконсерванта. Полученные результаты позволяют предположить, что замораживание в комбинированной среде, независимо от скорости охлаждения, обеспечивает оптимальную дегидратацию клеток. Это определяется тем, что включение в криоконсервант с декстраном ДМСО и поступление его в клетки уменьшает степень дегидратации и гипертонического стресса, которые обусловлены концентрированием непроникающих компонентов среды при замораживании. Ослабление гипертонического стресса является условием устойчивости мембран эритроцитов к постгипертоническому стрессу при размораживании и обеспечивает сохранение осмотических свойств клеток, отмытых от криоконсерванта. Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених у вигляді суспензій різних об'ємів у комбінованому середовищі із декстраном (15%) і ДМСО (5%). Встановлено, що збільшення об'єму заморожених зразків і зменшення швидкості заморожування та відігріву не призводять до значного зростання потоку іонів Н+ і втрати бар’єрної функції мембран для глутатіону у клітинах, відмитих від кріоконсерванта. Отримані результати дозволяють припустити, що заморожування у комбінованому середовищі, незалежно від швидкості охолодження, забезпечує оптимальну дегідратацію клітин. Це визначається тим, що включення у кріоконсервант з декстраном ДМСО і надходження його в клітини призводить до зменшення ступеня дегідратації та гіпертонічного стресу, які обумовлені концентруванням непроникаючих компонентів середовища при заморожуванні. Ослаблення гіпертонічного стресу є умовою стійкості мембран еритроцитів до постгіпертонічного стресу при розморожуванні та забезпечує збереження осмотичних властивостей клітин, відмитих від кріоконсерванта. Osmotic properties of erythrocytes, frozen in suspesions with different volumes in combined medium with 15% dextran and 5% DMSO were studied. It was established that the increasing of sample volume subjected to freezing and reduction of freezing and thawing rate did not result in a significant rise of H+ ion flow and loss of membrane barrier function in respect of glutathione in cells washed free of cryopreservative. The obtained results allowed to suggest that freezing in combined medium independent on cooling rate provided optimal dehydration of cells. It was determined that inclusion of DMSO into a cryopreservative based on dextran and its penetration into cells decreased dehydration and hypertonic stress rate, stipulated by concentrating of nonpenetrating components of medium during freezing. Lowering of hypertonic stress was a pre-condition of erythrocyte membrane resistance to post-hypertonic stress during freeze-thawing and contributed to preservation of osmotic properties of cells washed free of cryopreservative. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема Cryoprotective Efficiency of Medium Combining Non-Penetrating and Penetrating Cryoprotectants When Freezing Erythrocyte Suspensions of Various Volumes Article published earlier |
| institution |
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| collection |
DSpace DC |
| title |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| spellingShingle |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема Рамазанов, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title_short |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| title_full |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| title_fullStr |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| title_full_unstemmed |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| title_sort |
криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема |
| author |
Рамазанов, В.В. |
| author_facet |
Рамазанов, В.В. |
| topic |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet |
Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| publishDate |
2013 |
| language |
Russian |
| container_title |
Проблемы криобиологии и криомедицины |
| publisher |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| format |
Article |
| title_alt |
Cryoprotective Efficiency of Medium Combining Non-Penetrating and Penetrating Cryoprotectants When Freezing Erythrocyte Suspensions of Various Volumes |
| description |
Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в виде суспензий различных объемов в комбинированной среде с декстраном (15%) и ДМСО (5%). Установлено, что увеличение объема замораживаемых образцов и уменьшение скорости замораживания и отогрева не приводят к значительному росту потока ионов Н+ и потере барьерной функции мембран для глутатиона в клетках, отмытых от криоконсерванта. Полученные результаты позволяют предположить, что замораживание в комбинированной среде, независимо от скорости охлаждения, обеспечивает оптимальную дегидратацию клеток. Это определяется тем, что включение в криоконсервант с декстраном ДМСО и поступление его в клетки уменьшает степень дегидратации и гипертонического стресса, которые обусловлены концентрированием непроникающих компонентов среды при замораживании. Ослабление гипертонического стресса является условием устойчивости мембран эритроцитов к постгипертоническому стрессу при размораживании и обеспечивает сохранение осмотических свойств клеток, отмытых от криоконсерванта.
Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених у вигляді суспензій різних об'ємів у комбінованому середовищі із декстраном (15%) і ДМСО (5%). Встановлено, що збільшення об'єму заморожених зразків і зменшення швидкості заморожування та відігріву не призводять до значного зростання потоку іонів Н+ і втрати бар’єрної функції мембран для глутатіону у клітинах, відмитих від кріоконсерванта. Отримані результати дозволяють припустити, що заморожування у комбінованому середовищі, незалежно від швидкості охолодження, забезпечує оптимальну дегідратацію клітин. Це визначається тим, що включення у кріоконсервант з декстраном ДМСО і надходження його в клітини призводить до зменшення ступеня дегідратації та гіпертонічного стресу, які обумовлені концентруванням непроникаючих компонентів середовища при заморожуванні. Ослаблення гіпертонічного стресу є умовою стійкості мембран еритроцитів до постгіпертонічного стресу при розморожуванні та забезпечує збереження осмотичних властивостей клітин, відмитих від кріоконсерванта.
Osmotic properties of erythrocytes, frozen in suspesions with different volumes in combined medium with 15% dextran and 5% DMSO were studied. It was established that the increasing of sample volume subjected to freezing and reduction of freezing and thawing rate did not result in a significant rise of H+ ion flow and loss of membrane barrier function in respect of glutathione in cells washed free of cryopreservative. The obtained results allowed to suggest that freezing in combined medium independent on cooling rate provided optimal dehydration of cells. It was determined that inclusion of DMSO into a cryopreservative based on dextran and its penetration into cells decreased dehydration and hypertonic stress rate, stipulated by concentrating of nonpenetrating components of medium during freezing. Lowering of hypertonic stress was a pre-condition of erythrocyte membrane resistance to post-hypertonic stress during freeze-thawing and contributed to preservation of osmotic properties of cells washed free of cryopreservative.
|
| issn |
2307-6143 |
| url |
https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68715 |
| citation_txt |
Криозащитная эффективность комбинированной среды с непроникающим и проникающим криопротекторами при замораживании эритроцитарных суспензий различного объема / В.В. Рамазанов // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 2. — С. 124-134. — Бібліогр.: 29 назв. — рос., англ. |
| work_keys_str_mv |
AT ramazanovvv kriozaŝitnaâéffektivnostʹkombinirovannoisredysnepronikaûŝimipronikaûŝimkrioprotektoramiprizamoraživaniiéritrocitarnyhsuspenziirazličnogoobʺema AT ramazanovvv cryoprotectiveefficiencyofmediumcombiningnonpenetratingandpenetratingcryoprotectantswhenfreezingerythrocytesuspensionsofvariousvolumes |
| first_indexed |
2025-11-27T09:09:29Z |
| last_indexed |
2025-11-27T09:09:29Z |
| _version_ |
1850807933779050496 |
| fulltext |
УДК 57.043:577.352.4:547.42/43
В.В. Рамазанов
Криозащитная эффективность комбинированной среды
с непроникающим и проникающим криопротекторами
при замораживании эритроцитарных суспензий
различного объема
UDC 57.043:577.352.4:547.42/43
V.V. Ramazanov
Cryoprotective Efficiency of Medium Combining Non-Penetrating
and Penetrating Cryoprotectants When Freezing
Erythrocyte Suspensions of Various Volumes
Реферат: Исследовали осмотические свойства эритроцитов, замороженных в виде суспензий различных объемов в
комбинированной среде с декстраном (15%) и ДМСО (5%). Установлено, что увеличение объема замораживаемых образцов
и уменьшение скорости замораживания и отогрева не приводят к значительному росту потока ионов Н+ и потере барьерной
функции мембран для глутатиона в клетках, отмытых от криоконсерванта. Полученные результаты позволяют пред-
положить, что замораживание в комбинированной среде, независимо от скорости охлаждения, обеспечивает оптимальную
дегидратацию клеток. Это определяется тем, что включение в криоконсервант с декстраном ДМСО и поступление его в
клетки уменьшает степень дегидратации и гипертонического стресса, которые обусловлены концентрированием не-
проникающих компонентов среды при замораживании. Ослабление гипертонического стресса является условием
устойчивости мембран эритроцитов к постгипертоническому стрессу при размораживании и обеспечивает сохранение
осмотических свойств клеток, отмытых от криоконсерванта.
Ключевые слова: комбинированные криоконсерванты, декстран, диметилсульфоксид, эритроциты, осмотические
свойства, барьерные свойства мембран, глутатион, сульфат.
Реферат: Досліджували осмотичні властивості еритроцитів, заморожених у вигляді суспензій різних об'ємів у
комбінованому середовищі із декстраном (15%) і ДМСО (5%). Встановлено, що збільшення об'єму заморожених зразків і
зменшення швидкості заморожування та відігріву не призводять до значного зростання потоку іонів Н+ і втрати бар’єрної
функції мембран для глутатіону у клітинах, відмитих від кріоконсерванта. Отримані результати дозволяють припустити, що
заморожування у комбінованому середовищі, незалежно від швидкості охолодження, забезпечує оптимальну дегідратацію
клітин. Це визначається тим, що включення у кріоконсервант з декстраном ДМСО і надходження його в клітини призводить
до зменшення ступеня дегідратації та гіпертонічного стресу, які обумовлені концентруванням непроникаючих компонентів
середовища при заморожуванні. Ослаблення гіпертонічного стресу є умовою стійкості мембран еритроцитів до пост-
гіпертонічного стресу при розморожуванні та забезпечує збереження осмотичних властивостей клітин, відмитих від кріокон-
серванта.
Ключові слова: комбіновані кріоконсерванти, декстран, диметилсульфоксид, еритроцити, осмотичні властивості,
бар’єрні властивості мембран, глутатіон, сульфат.
Abstract: Osmotic properties of erythrocytes, frozen in suspesions with different volumes in combined medium with 15%
dextran and 5% DMSO were studied. It was established that the increasing of sample volume subjected to freezing and reduction of
freezing and thawing rate did not result in a significant rise of H+ ion flow and loss of membrane barrier function in respect of
glutathione in cells washed free of cryopreservative. The obtained results allowed to suggest that freezing in combined medium
independent on cooling rate provided optimal dehydration of cells. It was determined that inclusion of DMSO into a cryopreservative
based on dextran and its penetration into cells decreased dehydration and hypertonic stress rate, stipulated by concentrating of non-
penetrating components of medium during freezing. Lowering of hypertonic stress was a pre-condition of erythrocyte membrane
resistance to post-hypertonic stress during freeze-thawing and contributed to preservation of osmotic properties of cells washed
free of cryopreservative.
Key words: combined cryopreservatives, dextran, dimethyl sulfoxide, erythrocytes, osmotic properties, membrane barrier
properties, glutathione, sulfate.
*Адрес для корреспонденции:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: ramazanov.viktor@mail.ru
*Address for correspondence:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.: +380 57 373 4135, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: ramazanov.viktor@mail.ru
Department of Cell Cryophysiology, Institute for Problems of Cryo-
biology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криофизиологии клетки, Институт проблем криобиологии
и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 05.07.2011
Принята в печать 10.04.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №2. – С. 124–134.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received July 5, 2011
Accepted April 10, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 2. – P. 124–134.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
125
Комбинированные криоконсерванты с непрони-
кающими и проникающими криопротекторами
используются при замораживании различных
клеток [11, 15, 16, 18, 22, 24, 28]. Показана эффек-
тивность среды, содержащей диметилсульфоксид
(ДМСО) и гидроксиэтилированный крахмал (ГЭК),
при замораживании стволовых клеток перифери-
ческой крови [11, 22, 24], нефракционированных
клеток костного мозга [25, 26], гемопоэтических
клеток кордовой крови [16], клеток поджелудочной
железы человека [18]. Кроме того, отмечена крио-
защитная эффективность сред, содержащих поли-
этиленгликоль (ПЭГ-1500) или поливинилпир-
ролидон (ПВП) в комбинации с 1,2-пропандиолом
(1,2-ПД), при замораживании эритроцитов [2, 3].
При изучении сохранности эритроцитов после
замораживания-отогрева в комбинированных сре-
дах с различными полимерами (ПЭГ-1500, ПВП)
и проникающим криопротектором 1,2-ПД установ-
лено, что такое сочетание позволяет снизить
концентрацию 1,2-ПД и получить высокую сохран-
ность размороженных эритроцитов в ресуспенди-
рующей среде в течение 3-х суток после отмыва-
ния [2, 3].
Исследование эффективности трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после
замораживания в среде, содержащей ДМСО (10%)
или ДМСО (5%) + ГЭК (6%), показало, что на 10-е
сутки в крови реципиентов, которым вводили
клетки, замороженные-отогретые в комбиниро-
ванном криоконсерванте, содержание белых клеток
составляло 1×109 клеток/л. Такое же содержание
клеток отмечено на 11-е сутки у реципиентов, кото-
рым вводили ГСК, замороженные-отогретые в
среде с ДМСО. Концентрация нейтрофилов в крови
увеличивалась до (0,5–1)×109 клеток/л быстрее у
реципиентов, которым вводили ГСК, заморожен-
ные-отогретые в комбинированной среде [24].
Замораживание клеток костного мозга в ком-
бинированной среде ДМСО (5%) + ГЭК (5%)
сопровождалось уменьшением степени переохлаж-
дения клеточных образцов по сравнению со сре-
дой, содержащей только ДМСО (10%) [17]. Кроме
того, при сочетании ДМСО и ГЭК оказалось воз-
можным неконтролируемое (без использования
программного замораживателя) охлаждение при
замораживании гемопоэтических клеток кордовой
крови [16], стволовых клеток периферической крови
[11], клеток поджелудочной железы [18], нефрак-
ционированных клеток костного мозга [25, 26].
Таким образом, применение комбинированной
среды ДМСО + ГЭК эффективно при заморажи-
вании различных клеток позволяет исключить
программное замораживание и в некоторых слу-
чаях улучшить функциональные показатели раз-
мороженных клеток. Не исключено, что подобной
Combined cryopreservatives with non-penetrating
and penetrating cryoprotectants are used when freezing
various cells [11, 15, 16, 18, 22, 24, 28]. There was
shown the efficiency of medium, containing dimethyl
sulfoxide (DMSO) and hydroxyethyl starch (HES)
when freezing stem cells from peripheral blood [11,
22, 24], non-fractionated cells of bone marrow [25,
26], hemopoietic cells of cord blood [16] and human
pancreas cells [18]. In addition when freezing erythro-
cytes [2, 3] there was found a cryoprotective efficiency
of the media containing either polyethylene glycol
(PEG-1500) or polyvinyl pyrrolidone (PVP) combined
with 1,2-propanediol (1,2-PD) [2, 3].
Assessing the erythrocyte survival after freeze-
thawing in combined media with different polymers
(PEG-1500, PVP) and penetrating cryoprotectant 1,2-
PD it was established that this combination enabled to
reduce concentration of 1,2-PD and obtain a high sur-
vival of frozen-thawed erythrocytes in re-suspending
medium during 3 days after washing [2, 3].
Transplantation of hemopoietic stem cells (HSCs)
frozen-thawed in the medium, containing either DMSO
(10%) or DMSO (5%) + HES (6%) resulted in rising
the content of white blood cells up to 1×109 cells/l in
blood of recipients to the 10th day after transfusion of
the cells, frozen-thawed in a combined cryopreser-
vative. The same content of cells was found to the
11th day in the recipients underwent transfusion with
HES frozen-thawed in the medium with DMSO.
Concentration of neutrophils in blood was increased
up to (0.5–1)×109 cells/l earlier in the patients
underwent transfusion with HES frozen-thawed in a
combined medium [24].
Freezing of bone marrow cells in combined medium
of 5% DMSO + 5% HES was accompanied with lower
supercooling rate if compared with the medium, con-
taining only 10% DMSO [17]. In addition, combination
of DMSO and HES allowed to perform uncontrolled
(without using of a programmable freezer) cooling for
freezing hemopoietic cells from cord blood [16], stem
cells of peripheral blood [11], pancreatic cells [18], non-
fractionated cells of bone marrow [25, 26].
Thus, application of DMSO + HES combined
medium was effective for freezing different cells and
enabled to exclude programmed freezing and in some
cases improved functional indices of frozen-thawed
cells. It can not be excluded that the combined cryo-
preservatives based on other non-penetrating and
penetrating cryoprotectants possess the same effi-
ciency independently on used cooling regimens. The
increasing of volume of frozen cell suspensions could
result in reduction of cooling rate, therefore it is
nesessary to assess the effect of cooling regimens if
different volumes of samples are used.
Sulfate transport into erythrocytes when using
sulfate medium is coupled with transport of H+ ions
126 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
эффективностью обладают комбинированные
криоконсерванты, включающие другие непрони-
кающие и проникающие криопротекторы, незави-
симо от используемых режимов охлаждения.
Увеличение объема замораживаемых клеточных
суспензий приведет к уменьшению скорости их ох-
лаждения, поэтому для оценки влияния режимов
охлаждения необходимо использовать разные
объемы образцов.
Транспорт сульфата внутрь эритроцитов при
использовании сульфатной среды сопряжен с
транспортом ионов Н+ [23]. Можно предположить,
что при повреждении мембран анионы SO4
2– и со-
ответственно ионы Н+ будут проникать в эритро-
циты дополнительным неспецифическим путем.
При этом вычисляемые скорости транспорта ионов
могут превышать таковые показатели для интакт-
ных клеток. Поэтому результаты исследования
транспорта ионов Н+ и анионов SO4
2– могут ис-
пользоваться для оценки барьерной функции
мембран эритроцитов после замораживания-ото-
грева. При замораживании в мембранах эритро-
цитов возможно появление повреждений, которые
при отмывании криоконсерванта будут способство-
вать образованию гемолитических пор, проницае-
мых для гемоглобина. При этом эритроциты обыч-
но разрушаются. В неразрушенных клетках могут
также присутствовать поры, однако меньшего
размера – недостаточного для проникновения ге-
моглобина (м. м. 64500), но не для малых молекул,
таких как глутатион (м. м. 307). Эти клетки
утрачивают барьерную функцию мембран для глу-
татиона. И это также может быть тестом на це-
лостность мембраны.
Цель работы – исследовать барьерную функ-
цию мембран для сульфата и глутатиона в суспен-
зиях эритроцитов, замороженных с различными их
объемами в комбинированной среде, содержащей
декстран и ДМСО.
Материалы и методы
В работе использовали NaCl (х.ч.), сахарозу
(ч.д.а.), декстран с м.м. 35000 («Serva», Германия)
и ДМСО («Sigma», США).
Среды замораживания, приготовленные на изо-
тоническом сахарозо-солевом растворе (0,3%
NaCl и 6,85% сахарозы), содержали 15% декстрана
или 15% декстрана и 5% ДМСО. Как показано ра-
нее [4], при использовании первой среды наблю-
дался эффект «упаковки» (т.е. проявление большей
степени повреждения эритроцитов при замора-
живании клеточной суспензии с высоким гематок-
ритом по сравнению с низким гематокритом за
счет прироста постгипертонического стресса при
отогреве), тогда как во второй среде он отсутст-
вовал, при этом устойчивость эритроцитов к осмо-
[23]. It may be suggested that, if the membrane would
be damaged, SO4
2– anions and, accordingly, H+ ions
would penetrate into erythrocytes by other non-specific
way. Herewith the evaluated rates of ion transport
would exceed such indices for intact cells. Therefore
the results of the assessment of H+ ions and SO4
2–
anions transport might be used to assess barrier
function of frozen-thawed erythrocyte membranes.
Freezing could lead to appearance of damages in
erythrocyte membranes, which during washing-out of
cryopreservative would result in formation of hemolytic
pores, permeable for hemoglobin. The erythrocytes in
this case would be destroyed. In the non-destroyed
cells the pores could be present as well, but of lesser
size, being not enough for hemoglobin penetration
(m.w. 64,500), but passable for small molecules, such
as glutathione (m.w. 307). These cells lose barrier func-
tion of membranes for glutathione that may be the
membrane integrity test as well.
The research aim was to study barrier function of
membranes for sulfate and glutathione in suspensions
of erythrocytes frozen with different volumes in the
combined medium, containing dextran and DMSO.
Materials and methods
The research was performed using NaCl (chemi-
cally pure grade), sucrose (pure for analysis grade),
dextran with molecular weight of 35,000 (Serva,
Germany) and dimethyl sulfoxide DMSO (Sigma,
USA).
The freezing media were based on isotonic sucrose-
saline solution (0.3% NaCl and 6.85% sucrose) and
contained 15% dextran or 15% dextran with 5%
DMSO. It was reported [4] that using of the first
medium was accompanied by the ‘packing’ effect (i.e.
a higher extent of erythrocyte damage after freeze-
thawing of cell suspension with a high hematocrit if
compared with a low hematocrit due to increase of
posthypertonic stress during thawing), and there was
no such an effect in the second medium, while the
resistance of erythrocytes to osmotic (posthypertonic)
stress during thawing was preserved.
Erythrocytes were derived from donor blood of the
II group. After removal of plasma the erythromass
was twice washed by centrifugation at 3,000 rpm for
3 min in a 10-fold volume of NaCl isotonic solution
(0.9%), then it was centrifuged for 10 minutes. Eryth-
rocytes were stored at 4°C as a dense sediment.
The erythrocyte samples (hematocrit of 40%) were
incubated with cryopreservative for 30 min at 25°C in
steel containers of 1, 10 or 120 ml, thereafter immer-
sed into liquid nitrogen (–196°C) and exposed for
30 min. Then the containers were thawed in water
bath at 40°C. Frozen-thawed suspension (1 ml) was
diluted 10-fold by warm (37°C) NaCl isotonic solution
(0.9%) (0.3 ml/sec with slow agitation) and centrifuged
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
127
тическому (постгипертоническому) стрессу при
отогреве сохранялась.
Эритроциты получали из донорской крови груп-
пы II. После удаления плазмы эритромассу дваж-
ды отмывали центрифугированием при 3000 об/мин
в течение 3 мин в 10-кратном объеме изотони-
ческого раствора NaCl (0,9%), затем центрифуги-
ровали 10 мин. Эритроциты в виде плотного осадка
хранили при 4°С.
Образцы эритроцитов (гематокрит 40%) инку-
бировали с криоконсервантом в стальных контей-
нерах объемом 1, 10 или 120 мл при 25°С в течение
30 мин, погружали в жидкий азот (–196°С) и
выдерживали 30 мин. После этого контейнеры
отогревали на водяной бане при 40°С. Разморожен-
ную суспензию (1 мл) медленно разводили 1:10
теплым (37°С) изотоническим 0,9%-м раствором
NaCl, постоянно перемешивая (скорость добав-
ления 0,3 мл/с), затем центрифугировали при
3000 об/мин в течение 5 мин и удаляли надосадоч-
ную жидкость. Процедуру разведения и центрифу-
гирования повторяли еще один раз. Затем клетки
трижды отмывали изотоническим раствором NaCl
(0,9%) при 37°С без контролируемой скорости
разведения.
В суспензиях определяли процент гемолизиро-
вавших клеток, для этого спектрофотометрически
устанавливали количество гемоглобина в суперна-
танте, измеряя оптическую плотность на длине
волны 543 нм. Уровень гемолиза вычисляли по
формуле:
[А1/А2]×100,
где А1 – оптическая плотность супернатанта экспе-
риментального образца; А2 – оптическая плотность
при полном гемолизе контрольного образца (после
добавления тритон Х-100).
Для определения скорости замораживания и
отогрева образцов использовали вольтметр, са-
мописец и дифференциальную медь-константа-
новую термопару [7].
Транспорт ионов Н+ в эритроцитах в сульфатной
среде (0,11 ммоль/л Na2SO4) исследовали в термо-
статируемой ячейке (37°С) с рН-электродом при
постоянном перемешивании клеточной суспензии.
При внесении эритроцитов в изотонический раствор
Na2SO4, не содержащий буферные компоненты,
происходит двухфазное изменение рН внешней
среды: закисление с последующим защелачива-
нием. Такое изменение рН связано с обменом
внутриклеточного Cl– на внеклеточный SO4
2–. При
этом выход ионов Н+ из клетки определяется функ-
ционированием цикла Якобса-Стюарта, тогда как
их вход непосредственно связан с транспортом
SO4
2– в клетку [23].
at 3000 rot/min for 5 min with the following removal
of supernatant. Dilution and centrifugation were
repeated. Then the cells were thrice washed with
isotonic solution NaCl (0.9%) at 37°C, without regard
to their dilution rate.
In the suspensions there was determined a per-
centage of hemolyzed cells. Therefore hemoglobin
amount in a supernatant was spectrophotometrically
established, measuring optical density at 543 nm
wavelength. Hemolysis percentage was calculated by
the formula:
[А1/А2]×100,
where A1 was the optical density of supernatant of
experimental sample; A2 was the optical density after
complete hemolysis of control sample (after addition
of Triton X-100).
Freezing and thawing rate of samples was measured
using voltmeter, plotter and differential copper-constan-
tan thermocouple [7].
Transport of H+ ions in erythrocytes in sulfate me-
dium (0.11 µmol/l Na2SO4) was investigated in a ther-
mostated well (37°C) equiped with pH electrode, and
with continuos agitation of the cell suspension. Intro-
duction of erythrocytes into isotonic solution Na2SO4
without buffer components resulted in two-phase pH
change of extracellular medium: acidulation and
following alkalization. This change of pH was asso-
ciated with interchange of intracellular Cl– with extra-
cellular SO4
2–. Herewith, the outflux of H+ ions from
cell was determined with Jacobs-Stewart cycle func-
tion, whereas their influx was directly associated with
transport of SO4
2– into the cell [23].
Unidirectional flow of H+ ions was calculated after
transformation of the formula [10]:
J = k·d·Ci (µmol·(3.1×1013 cells·min)–1),
where Ci was concentration of intracellular Cl–; d was
the ratio of cell water volume, l, to erythrocyte solid
residue, kg; k was rate constant, s–1 [5]. Ci in the for-
mula was replaced by ∆H, i. e. the change of H+ ion
concentration in extracellular medium during exchange
of Cl– and SO4
2–. The number of 3.1·1013 normal cells
corresponded to 1 kg of erythrocyte solid residue with
4.4·107 cm2 membrane surface [10]. H+ ion flow Jin/out
in and out of the cell may be calculated by the formula:
Jin/out = kin/out·d·∆Н (µmol·(kg·s)–1).
where kin/out was rate constant of H+ ions influx/outflux
into/out of the cell [5].
Glutathione content in cell sediment was determined
using 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) [9].
Erythrocyte sediment (75 µl) was mixed with water
128 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
Однонаправленный поток ионов Н+ вычисляли
после преобразования формулы [10]:
J = k·d·Ci (ммоль·(3,1×1013 клеток·мин)–1),
где Ci – концентрация внутриклеточного Cl–; d –
отношение объема клеточной воды, л; к сухо-
му остатку эритроцитов, кг; k – константа скорос-
ти, с–1 [5]. Множитель Ci в формуле замещали на
∆Н – изменение концентрации ионов Н+ во внеш-
ней среде при обмене Cl– на SO4
2–. Количество
3,1×1013 нормальных клеток соответствует 1 кг су-
хого остатка эритроцитов с площадью мембран
4,4×107 см2 [10]. Таким образом, поток ионов Н+ в
клетку/из клетки Jin/Jout можно рассчитать по фор-
муле:
Jin/out = kin/out·d·∆Н (ммоль·(кг·с)–1),
где kin/out – константы скорости входа/выхода
ионов Н+ в клетку/из клетки [5].
Концентрацию глутатиона в клеточном осадке
определяли с использованием 5,5’-дитиобис-2-
нитробензойной кислоты (ДТНБ) [9]. Осадок эрит-
роцитов (75 мкл) смешивали с водой (500 мкл),
добавляли трихлоруксусную кислоту в концентра-
ции 7% и перемешивали. Полученную смесь
центрифугировали в течение 3 мин при 3000 об/мин.
Далее 200 мкл супернатанта смешивали с 2,5 мл
среды, содержащей 50 ммоль/л трис-НСl и
5 ммоль/л ЭДТА (рН 8,5). К смеси добавляли
200 мкл NaOH (0,1 моль/л), перемешивали и
добавляли 25 мкл раствора ДТНБ, приготовлен-
ного на метаноле (4 г/л). Реакционную смесь вы-
держивали 5 мин при 22°С, затем измеряли оп-
тическую плотность при длине волны 412 нм.
Содержание глутатиона (мкмоль/г гемоглобина)
вычисляли по формуле [9]:
[Глут] = ОП×А/(ε×[Hb]),
где ОП – оптическая плотность образца; А – фак-
тор разведения; ε – коэффициент молярной экс-
тинкции, равный 11400 моль–1см–1; [Hb] – концент-
рация гемоглобина, г/л.
Статистические расчеты выполняли на основе
результатов, полученных на эритроцитах крови 5
доноров. Данные представляли как среднее зна-
чение ± стандартная ошибка. Для определения ста-
тистической достоверности результатов использо-
вали непараметрический метод Манна-Уитни [1].
Результаты и обсуждение
Замораживание-отогрев эритроцитов в среде,
содержащей 15% декстрана, приводит к значитель-
ному гемолизу после отмывания криоконсерванта.
(500 µl) and supplemented with 7% trichloracetic acid
and agitated. Resulted mixture was centrifuged for
3 min at 3,000 rpm. Then 200 µl of supernatant was
mixed with 2.5 ml of medium, containing 50 µmol/l of
Tris-HCl and 5 µmol/l of EDTA (pH 8.5). The mixture
was supplemented by 200 µl of NaOH (0.1 mol/l),
agitated and then 25 µl of DTNB in methanol (4 g/l)
were added. Reaction mixture was exposed for 5 min
(22°C) and then optical density was measured at
412 nm. Glutathione content (µmol/l) was calculated
by the formula [9]:
[Glut] = OD×А/(ε×[Hb]),
where OD was the optical density of the sample; A
was the dilution factor; ε was coefficient of molar
extinction equal to 11400 mol–1cm–1; [Hb] was hemo-
globin concentration (g/l).
Statistical calculations were performed on the base
of the results obtained in erythrocytes from 5 donors.
The data were presented as a mean ± standard error.
Non-parametric Mann-Whitney’s method was used to
determine a statistical significance of the results [1].
Results and discussion
Erythrocyte freeze-thawing in the medium with 15%
dextran resulted in significant hemolysis after washing-
out the cryopreservative. If the volume of samples
underwent freeze-thawing was elevated from 1 up to
10 and 120 ml a rise in level of cell hemolysis was
observed (Table 1). Glutathione content in erythrocytes
right after freeze-thawing was not changed if com-
pared with the intact cells, however, after washing-
out the cryopreservative a significant decrease of this
metabolite content in the remained cells was observed.
The obtained results testified to the fact that freeze-
thawing of erythrocytes resulted in formation of
damages of the mebranes which during washing-out
the cryopreservative became a hemolytic pores,
through which hemoglobin was released. In the
undestroyed cells these damages probably were
transformed to a smaller pores, impermeable for
hemoglobin, but permeable for glutathione. The
membranes of these cells lost barrier function for
glutathione. Moreover the indices of H+ ion flow rate
in the remained erythrocytes were significantly higher
than in the intact cells (Table 1). It should be noted
that transport of H+ ions in erythrocytes in sulfate
medium is coupled with chloride-sulfate interchange
[23], therefore the rised H+ ion flow in frozen-thawed
cells could be associated with formation of pores,
permeable for sulfate.
Erythrocytes frozen-thawed in a combined medium
with dextran and DMSO had significantly lower da-
mage rate (Table 2) if compared with the cells, frozen-
thawed in the medium, containing dextran (Table 1).
ыцзарбО
вотицортирэ
etycorhtyrE
selpmas
меъбО
,воцзарбо
лм
foemuloV
,selpmas
lm
,зиломеГ
%
,sisylomeH
%
,аноитатулгеинажредоС
bHг/ьломкм
,tnetnocenoihtatulG
µ bHg/lom
НвоноикотоП +
H+ wolfnoi
оД
яинавымто
otroirP
gnihsaw
елсоП
яинавымто
retfA
gnihsaw
J tuo × 01 7
гк/ьлом
с·котелк
gk/lom
s·sllec
J ni × 01 7
гк/ьлом
с·котелк
gk/lom
s·sllec
-еыннежоромаЗ
еытергото
dewaht-nezorF
1 0,3±0,72 4,1±8,9 3,1±5,8 09,0±65,6 37,0±79,4
01 3,3±0,43 6,1±2,9 4,1±3,8 29,0±47,6 77,0±59,4
021 0,3±0,24 5,1±6,9 6,1±8,8 99,0±96,6 47,0±88,4
еынткатнИ
tcatnI – – 6,1±5,01 65,0±34,5 24,0±20,4
ыцзарбО
вотицортирэ
etycorhtyrE
selpmas
меъбО
,воцзарбо
лм
foemuloV
lm,selpmas
,зиломеГ
%
,sisylomeH
%
,аноитатулгеинажредоС
bHг/ьломкм
,tnetnocenoihtatulG
µ bHg/lom
НвоноикотоП +
H+ wolfnoi
оД
яинавымто
otroirP
gnihsaw
елсоП
яинавымто
retfA
gnihsaw
J tuo × 01 7
гк/ьлом
с·котелк
gk/lom
sllec s·
J ni × 01 7
гк/ьлом
с·котелк
gk/lom
s·sllec
-еыннежоромаЗ
еытергото
dewaht-nezorF
1 2,3±5,24 4,1±3,01 *6,0±3,4 01,1±01,8 # 38,0±09,5 #
01 5,3±7,05 3,1±2,01 *5,0±5,4 51,1±03,8 # 39,0±01,6 #
021 3,3±0,95 6,1±0,01 *6,0±1,4 32,1±52,8 # 88,0±00,6 #
еынткатнИ
tcatnI – – 6,1±5,01 65,0±34,5 24,0±20,4
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
129
мембранах эритроци-
тов образуются повреж-
дения, которые при от-
мывании криоконсер-
ванта вызывают фор-
мирование гемолитичес-
ких пор, через которые
выходит гемоглобин. В
оставшихся клетках,
очевидно, формируются
поры меньшего разме-
ра, непроницаемые для
гемоглобина, но прони-
цаемые для глутатио-
на. Мембраны этих кле-
ток утрачивают барьер-
ную функцию по отно-
шению к глутатиону.
Кроме того, показатели
потока ионов Н+ в остав-
шихся эритроцитах су-
щественно выше, чем в
интактных (табл. 1).
Необходимо отметить,
что транспорт ионов Н+
в эритроцитах в суль-
фатной среде сопряжен
с обменом хлорида на
сульфат [23], поэтому
ускорение потока ионов
Н+ в замороженных-
отогретых клетках, ве-
роятно, связано с обра-
зованием пор, проницае-
мых для сульфата.
Эритроциты, замо-
роженные-отогретые в
комбинированной сре-
де с декстраном и
ДМСО, имеют мень-
шую степень повреж-
дения (табл. 2) по
сравнению с клетками,
замороженными-ото-
гретыми в среде, со-
держащей только декс-
Glutathione content in erythrocytes after freeze-thaw-
ing in combined medium and washing from cryopreser-
vative did not significantly change if compared with
the intact cells. The indices of H+ ion flow in the remai-
ned erythrocytes did not significantly exceed the ones
of intact cells (Table 2). These results testified to the
fact that during freeze-thawing in combined medium
with dextran and DMSO the barrier function of mem-
branes in respect of glutathione and H+ ions (and res-
pectively for sulfate) was insignificantly affected.
Таблица 1. Осмотические показатели эритроцитов,
замороженных-отогретых в среде с декстраном (15%)
Table 1. Osmotic indices of erythrocytes,
frozen-thawed in the medium with 15% dextran
Примечания: * – статистически достоверно по сравнению с соответствующими показате-
лями содержания глутатиона до отмывания криоконсерванта (р < 0,05); # – статистически
достоверно по сравнению с интактными клетками (р < 0,05).
Notes: * – statistically significant if compared with corresponding indices of glutathione content
prior to washing from cryopreservative (p < 0.05); # – statistically significant if compared with intact
cells (p < 0.05).
При увеличении объема замораживаемых образ-
цов от 1 до 10 и 120 мл наблюдается увеличение
уровня гемолиза клеток (табл. 1). Содержание глу-
татиона в эритроцитах сразу после замораживания-
отогрева не изменяется по сравнению с интакт-
ными клетками, однако после отмывания от крио-
консерванта отмечается значительное уменьше-
ние концентрации данного метаболита в оставших-
ся клетках. Полученные результаты свидетель-
ствуют о том, что при замораживании-отогреве в
Таблица 2. Осмотические показатели эритроцитов, замороженных
в среде с декстраном (15%) и ДМСО (5%)
Table 2. Osmotic indices of erythrocytes, frozen in the medium
with 15% dextran and 5% DMSO
130 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
There was also observed an increase of erythrocyte
hemolysis level along with the elevation of volume from
1 up to 10 and 120 ml of samples underwent freezing
(Table 2).
The bigger volume of erythrocyte samples under-
going freezing increased the lower are the cooling and
thawing rates (Table 3). The results of freezing of eryth-
rocytes samples with different volumes may be used
for evaluation of effect of freezing regimens on the
studied indices of cells. Reduction of freezing and
thawing rates in a combined medium under the used
regimens did not affect the studied indices of H+ ion
flow and barrier function of membranes in respect of
glutathione in washed cells (Table 2). It was also re-
ported by other authors that freezing different types
of cells in combined cryopreservative containing non-
penetrating (HES) and penetrating (DMSO) cryopro-
tectants eliminated the necessity of controlled rate
freezing and enabled to freeze the cells without a prog-
rammable freezer [11, 16, 18, 25, 26].
Luo K. et al. [17] performed freezing of bone mar-
row mononuclear cells in the media with DMSO (5%) +
HES (5%) and DMSO (10%) down to –80°C with
the following plunging into liquid nitrogen without cont-
rol of freezing rate in the case of the first cryopreser-
vative and stepwise cooling when using the second
one. A comparison of freezing curves showed that
the supercooling rate of cell samples was reduced in
the case of combined cryopreservative. Clapisson G.
et al. [11] investigated the freezing of stem cells from
peripheral blood in two-step cooling regimen using the
medium with DMSO (10%) or HES (3%) + DMSO
(5%) without control of freezing rate down to –80°C.
The post-thaw viability indices of cells were higher in
the case of combined cryopreservative [11]. Application
of the combined medium DMSO (5%) + HES (5%)
тран (см. табл. 1). Содержание глутатиона в эрит-
роцитах после замораживания-отогрева в комбини-
рованной среде и отмывания от криоконсерванта
значительно не изменяется по сравнению с интакт-
ными клетками. Показатели потока ионов Н+ в ос-
тавшихся эритроцитах существенно не превышают
показатели интактных клеток (табл. 2). Эти резуль-
таты указывают на то, что при замораживании-
отогреве в комбинированной среде с декстраном
и ДМСО барьерная функция мембран для глута-
тиона и ионов Н+ (соответственно для сульфата)
нарушается незначительно. Отмечается также по-
вышение уровня гемолиза эритроцитов при увели-
чении объема замораживаемых образцов от 1 до
10 и 120 мл (табл. 2).
Увеличение объема замораживаемых образцов
эритроцитов приводит к уменьшению скорости ох-
лаждения и отогрева (табл. 3). Поэтому результаты
замораживания разных объемов эритроцитов могут
использоваться для оценки влияния режимов замо-
раживания на исследуемые показатели клеток.
Уменьшение скорости замораживания и отогрева
в комбинированной среде при использованных ре-
жимах не влияет на исследованные показатели
потока ионов Н+ и барьерной функции мембран для
глутатиона в отмытых клетках (табл. 2). Ранее бы-
ло показано, что замораживание различных типов
клеток в комбинированном криоконсерванте с не-
проникающим (ГЭК) и проникающим (ДМСО)
криопротекторами устраняет необходимость про-
граммного замораживания и позволяет заморажи-
вать клетки без контроля скорости охлаждения [11,
16, 18, 25, 26].
Luo K. и соавт. [17] замораживали мононуклеар-
ные клетки костного мозга в средах с ДМСО
(5%) + ГЭК (5%) и ДМСО (10%) до –80°С с по-
Таблица 3. Скорости охлаждения и отогрева образцов
эритроцитов различного объема в среде
с декстраном (15%) и ДМСО (5%)
Table 3. Cooling and thawing rates of erythrocyte samples with
different volumes in the medium with 15% dextran and 5% DMSO
следующим погружением в жидкий азот
без контроля скорости замораживания
при применении первого криоконсер-
ванта и ступенчатого охлаждения – вто-
рого. Сравнение кривых замораживания
показало, что при использовании комби-
нированного криоконсерванта умень-
шается степень переохлаждения кле-
точных образцов. Clapisson G. и соавт.
[11] замораживали стволовые клетки
периферической крови с использовани-
ем двухступенчатого режима охлажде-
ния в среде с ДМСО (10%) или ГЭК
(3%) + ДМСО (5%) без контроля ско-
рости замораживания до –80°С. Пока-
затели жизнеспособности разморожен-
ных клеток были выше после примене-
ния комбинированного криоконсерванта
[11]. Использование комбинированной
среды ДМСО (5%) + ГЭК (5%) при за-
меъбО
лм,воцзарбо
foemuloV
lm,selpmas
ьтсорокС
одяинеджалхо
,С°53-...52-
ним/дарг
nwodetargnilooC
,C°53-52-ot
nim/ged
ьтсорокС
ежиняинеджалхо
,С°53-...52-
ним/дарг
wolebetargnilooC
,C°53-...52-
nim/ged
яаньлачаН
ьтсорокс
,авергото
ним/дарг
,etargniwahtlaitinI
nim/ged
1 003-081 0021-0001 0021-009
01 07-05 0011-008 0001-058
021 03-02 007-005 005-004
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
131
мораживании клеток поджелудочной железы по-
зволило проводить процедуру замораживания-
отогрева без программного замораживателя в
отличие от среды с ДМСО (10%) [18].
Таким образом, комбинирование в криоконсер-
ванте ДМСО и ГЭК позволяет упростить техно-
логию замораживания и в некоторых случаях улуч-
шить качественные показатели замороженных-
отогретых клеток.
Для сохранения клеток при замораживании
необходимы специальные подходы, включающие
подбор вида и концентрации криопротектора, а
также скорости охлаждения до промежуточной
температуры ниже 0°С для обеспечения оптималь-
ной дегидратации клеток и минимизации отрица-
тельного воздействия последующего охлаждения
до более низкой температуры. Выбор оптимальной
программы замораживания основан на осмоти-
ческом поведении клеток. Чтобы предотвратить
образование внутриклеточных кристаллов льда,
степень переохлаждения клеточных образцов не
должна превышать ~2°С. Оптимальная скорость
охлаждения определяется проницаемостью кле-
точных мембран для молекул воды и криопро-
тектора, осмотически активным объемом и по-
верхностно-объемным отношением клеток [6, 29].
Температура начала нуклеации внутриклеточного
льда связана со степенью переохлаждения цито-
плазмы клеток [21], концентрацией криопротектора
и степенью дегидратации клеток [27]. Кристал-
лизация части внутриклеточной воды (5–7%)
может быть не опасной для клеток [12]. При замо-
раживании клеток в комбинированной среде
ДМСО + ГЭК выявлено уменьшение степени пере-
охлаждения по сравнению с замораживанием в
среде, содержащей только ДМСО [17].
При медленном замораживании эритроциты
концентрируются в каналах льда, в которых раз-
давливаются и гемолизируют, а при быстром – рас-
пределяются в толще льда. На основании этого
Pegg D.E. и Diaper M.P. заключили, что увеличение
степени повреждения эритроцитов при быстром за-
мораживании суспензий с высокой концентрацией
клеток не связано с их механической деформацией
образующимися кристаллами льда [20]. При замо-
раживании суспензий эритроцитов с высоким гемато-
критом в сравнении с низким повышается вероят-
ность образования внутриклеточных кристаллов
льда [20]. Однако повреждение клеток внутрикле-
точными кристаллами льда может быть не только
механическим, но и осмотическим при их плавлении
в ходе медленного отогрева [13]. При быстром
размораживании суспензии с высокой концентраци-
ей клеток степень повреждения увеличивается за
счет осмотического воздействия на конечной ста-
дии быстрого размораживания вследствие таяния
for freezing pancreas cells enabled to perform freeze-
thawing without a programmable freezer unlike the
medium with DMSO (10%) [18].
Thus, using of combined DMSO and HES cryopre-
servative enabled to simplify freezing technology and
in some cases to improve post-thaw qualitative indices
of cells.
Preservation of cells during freezing requires spe-
cial approaches, including selection of type and con-
centration of cryoprotectant, as well as the rate of
cooling down to transient temperature below 0°C to
provide optimal cell dehydration and minimization
of negative effect of the following cooling down to ultra-
low tem-peratures. Selection of optimal freezing prog-
ram is based on osmotic behavior of cells. To prevent
the formation of intracellular ice crystals the super-
cooling in cell samples should not exceed ~2°C. Opti-
mal cooling rate is determined by permeability of cell
mem-branes for water and cryoprotectant molecules,
as well as osmotically active volume and surface-to-
volume ratio of cells [6, 29]. Temperature of initiation
of intracellular ice nucleation is associated with the
cell cytoplasm supercooling [21], cryoprotectant con-
centrating and cell dehydration rate [27]. Partial crys-
tallization of intracellular liquids (5–7%) could be not
dramatic for cells [12]. Freezing of cells in DMSO +
HES com-bined medium was reported as accompanied
with a lower supercooling if compared with case of
medium based on DMSO [17].
Slow freezing is characterized by concentrating of
erythrocytes inside channels between ice crystals, they
undergo mechanical stress and hemolyze, and vice
versa during rapid freezing the cells are scattered in-
side ice crystals. On that basis Pegg D.E. and Dia-
per M.P. concluded that the increasing of erythrocyte
damage rate during rapid freezing of suspensions with
a high cell concentration is not associated with their
mechanical deformation by formed ice crystals [20].
When freezing the erythrocyte suspensions with a high
hematocrit unlike the low one the probability of intra-
cellular ice crystal formation is increased [20]. More-
over, it is suggested that cell damage due to intracellular
ice crystals might be not only mechanical, but also
osmotic following from melting of the crystals during
slow warming [13]. Rapid thawing of suspension with
a high cell concentration is characterized by rised cell
damage rate due to osmotic effect resulted from
melting of intracellular ice a bulk of which was formed
by intracellular liquid [14].
Thus, during rapid freeze-thawing of erythrocyte
suspensions with a high hematocrit the higher damage
rate may be stipulated by the increasing of osmotic
stress during thawing if compared with suspensions
with the low hematocrit.
Rapid freeze-thawing in a combined non-penetrating
and penetrating cryoprotectant mixture was shown as
132 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
внеклеточного льда, существенная часть которого
была образована из внутриклеточной воды [14].
Таким образом, при быстром замораживании-
отогреве суспензий эритроцитов с высоким гемато-
критом, в отличие от суспензий с низким гемато-
критом, большая степень повреждения клеток мо-
жет быть обусловлена увеличением осмотического
стресса при отогреве.
В условиях быстрого замораживания-отогрева
сочетание в среде непроникающих и проникающих
криопротекторов приводит к устранению эффекта
«упаковки», вероятно, вследствие ослабления ос-
мотического стресса при отогреве [4].
Считается, что криопротекторные свойства по-
лимеров в большей степени определяются их спо-
собностью снижать температуру кристаллизации
раствора при замораживании (до –35°С), а не пря-
мым воздействием на клеточную мембрану [8].
Наряду с криозащитным эффектом концентрирова-
ние полимеров при вымораживании воды произво-
дит гипертонический стресс на клетки [8]. Криоза-
щитный эффект проникающих криопротекторов
связан с замедлением концентрирования раствора
и уменьшением степени дегидратации клеток [8],
однако проникающие криопротекторы (глицерин и
ДМСО) не способны к эффективной криозащите
клеток в ходе быстрого замораживания из-за высо-
кой вероятности образования внутриклеточного
льда [19]. Включение в состав среды непроникаю-
щего криопротектора может способствовать до-
стижению оптимальной дегидратации клеток и со-
ответственно снижению вероятности образования
кристаллов льда внутри клетки. При заморажива-
нии клеточных суспензий в присутствии непрони-
кающих криопротекторов необходимы высокие
скорости охлаждения для уменьшения времени
действия гипертонического стресса на клеточные
мембраны [8]. Включение в среду проникающего
криопротектора и его поступление в клетки будут
противодействовать чрезмерной дегидратации и
соответственно уменьшать гипертонический
стресс. Следовательно, комбинирование в криоза-
щитной среде проникающих и непроникающих
криопротекторов является эффективным подходом
для коррекции отрицательного влияния обоих
компонентов при замораживании-отогреве клеточ-
ных образцов.
Таким образом, установлено, что при исполь-
зовании комбинированной среды декстран +
ДМСО, независимо от объема замораживаемых
образцов эритроцитов и режимов замораживания-
отогрева, клетки, отмытые от криоконсерванта,
сохраняют барьерную функцию мембран для ио-
нов Н+ (соответственно для сульфата) и глутатио-
на. Полученные результаты позволяют предполо-
жить, что включение в среду с декстраном ДМСО
not accompanied with ‘packing’ effect, seemingly due
to the weakness of osmotic stress when thawing [4].
It is suggested that cryoprotective properties of
polymers are determined by their capacity to reduce
the crystallization temperature when freezing the
solution (down to –35°C), rather than with direct effect
on the cell membrane. Along with cryoprotective ef-
fect the concentrating of polymers during water
crystallization results in a hypertonic stress on cells
[8]. Cryoprotective effect of penetrating cryoprotec-
tants is associated with slowing-down of solution
concentrating and reduction of cell dehydration rate
[8], however, penetrating cryoprotectants (e. g. glycerol
and DMSO) are not capable of cell protection during
rapid freezing due to a high probability of intracellular
ice formation [19]. Supplementation of medium with
non-penetrating cryoprotectant may contribute to
optimal cell dehydration and correspondingly to reduce
the probability of ice crystal formation inside the cell.
Freezing of cell suspensions in the presence of non-
penetrating cryoprotectants requires high cooling rates
to reduce the period of hypertonic stress effect on cell
membranes [8]. Introduction of penetrating cryopro-
tectant into the medium and its penetration into cells
would prevent an extreme dehydration and correspon-
dingly decrease a hypertonic stress. Therefore, com-
bination of penetrating and non-penetrating cryopro-
tectants in a cryoprotective medium is an effective
approach to balance negative effect of both compo-
nents during freeze-thawing of cell samples.
Finally, it was established that using dextran +
DMSO combined medium allowed to preserve barrier
functions of membranes in respect of H+ ions (and
respectively for sulfate) and glutathione in the cells
washed from cryopreservative, and this effect did not
depend on volume of frozen-thawed erythrocyte samp-
les and freeze-thawing regimens. The obtained results
allowed to suggest that supplementation of the dextran
based medium with DMSO and its penetration into
the cells resulted in a reduced hypertonic stress during
freezing and preserved resistance of erythrocyte mem-
branes to post-hypertonic effect during thawing, pro-
viding preservation of cell osmotic properties after
removal of cryopreservative.
Conclusions
Freeze-thawing of erythrocyte suspension in the
medium with dextran (15%) resulted in high amount
of damaged cells. The remaining cells were characte-
rized by impaired barrier function of membranes in
respect to sulfate and glutathione revealed after cryo-
preservative wash-out.
Supplementation of dextran based medium with
DMSO (5%) significantly reduced the cell damage rate
and resulted in preservation of membrane barrier func-
tion.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
133
и его поступление в клетки приводят к ослаблению
гипертонического стресса при замораживании и со-
хранению устойчивости мембран эритроцитов к
постгипертоническому воздействию при размора-
живании, что обеспечивает сохранение осмотичес-
ких свойств отмытых от криоконсерванта клеток.
Выводы
В суспензии эритроцитов, замороженных-ото-
гретых в среде с декстраном (15%), отмечено боль-
шое количество разрушенных клеток, а в оставших-
ся клетках при отмывании криоконсерванта нару-
шается барьерная функция мембран для сульфата
и глутатиона.
Включение в среду с декстраном ДМСО (5%)
значительно уменьшило степень повреждения кле-
ток и привело к сохранению барьерной функции
мембран.
Уменьшение скорости замораживания и отогре-
ва в комбинированной среде с декстраном и ДМСО
при увеличении объема замораживаемых образцов
не ухудшает показатели барьерной функции мем-
бран отмытых после замораживания клеток.
Decrease of freezing and thawing rates when using
dextran and DMSO combined medium observed after
increasing the volume of samples did not impaired the
post-thaw and post-wash osmotic properties of cells.
Литература
1. Ашмарин И.П., Васильев И.П., Амбросов В.А. Быстрые
методы статистической обработки и планирование
экспериментов. – Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1975. – 76 с.
2. Межидов С.Х., Беляева И.М., Воротилин А.М., Моисеев В.А.
Влияние сочетания поливинилпирролидона и 1,2-
пропандиола на сохранность эритроцитов при криокон-
сервировании // Проблемы криобиологии. – 1996. – №2. –
С. 22–25.
3. Межидов С.Х., Моисеев В.А. Влияние сочетания высоко-
молекулярных криопротекторов с 1,2-пропандиолом на
сохранность эритроцитов при криоконсервировании //
Проблемы криобиологии. – 1995. – №3. – С. 46–48.
4. Рамазанов В.В. Влияние комбинированных сред на по-
вреждение эритроцитов, замороженных с различным
гематокритом // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16,
№2. – С. 155–163.
5. Рамазанов В.В., Забродский Р.Ф., Найдюк Я.Ю., Бондарен-
ко В.А. Функционирование системы транспорта ионов Н+
при модификации мембран эритроцитов в условиях, мо-
делирующих условия замораживания // Вісник проблем
біології і медицини. – 2010. – Вип. 3. – С. 186–192.
6. Сакун О.В. Аналіз ефективності кріоконсервування клітин-
них суспензій з постійною та змінною швидкістю охоло-
дження: Дис. ... канд. біол. наук. – Харків, 2009. – 120 с.
7. Справочник по физико-техническим основам криогеники /
Под ред. М.П.Малкова. – М.: Энергия, 1973. – 392 с.
8. Bakhach J. The cryopreservation of composite tissues. Prin-
ciples and resent advancement on cryopreservation of diffe-
rent type of tissues // Organogenesis. – 2009. – Vol. 5, №3. –
P. 119–126.
9. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical
methods. – New York: Grune&Stratton, 1975. – 160 p.
10.Brahm J. Temperature-dependent changes of chloride trans-
port kinetics in human red cells // J. Gen. Physiol. – 1977. –
Vol. 70, №3. – P. 283–306.
References
1. Ashmarin I.P., Vasil'ev I.P., Ambrosov V.A. Express methods of
statistical analysis and planning of experiments.– Leningrad,
1975.– 76 p.
2. Mezhidov S.Kh., Belyaeva I.M., Vorotilin A.M., Moiseev V.A.
Effect of combination of polyvinylpirrolidon and 1,2-propane-
diol to the erythrocytes survival at cryopreservation// Problems
of Cryobiology.– 1996.– N2. – P. 22–25.
3. Mezhidov S.Kh., Moiseev V.A. Effect of combination of high
molecular cryoprotectants with 1,2–propanediol to the
erythrocytes survival at cryopreservation // Problems of
Cryobiology.– 1995.– N3.– P. 46–48.
4. Ramazanov V.V. Effect of combined media to erythrocytes
destruction frozen with different hematocrit // Problems of
Cryobiology.– 2006.– Vol. 16, N2.– P. 155–163.
5. Ramazanov V.V., Zabrodsky R.F., Naydyuk Ya.Yu., Bondaren-
ko V.A. Functioning of H+ ion transport system during modi-
fication of erythrocyte membranes under conditions, modeling
freezing ones // Visnyk Problem Biologii i Medytsyny.– 2010.–
Issue 3.– P. 186–192.
6. Sakun O.V. Analysis of cryopreservation efficiency of cell
suspensions with constant and changed cooling rate: Thesis
of Candidate of Biol. Sciences.– Kharkiv, 2009.– 120 p.
7. Reference book for physical and technological principals of
genetics // Ed. by M.P. Malkova.– Moscow: Energiya, 1973.–
392 p.
8. Bakhach J. The cryopreservation of composite tissues.
Principles and resent advancement on cryopreservation of
different type of tissues // Organogenesis. – 2009. – Vol. 5,
N3. – P. 119–126.
9. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical
methods. – New York: Grune&Stratton, 1975. – 160 p.
10.Brahm J. Temperature-dependent changes of chloride
transport kinetics in human red cells // J. Gen. Physiol. – 1977. –
Vol. 70, N3. – P. 283–306.
11.Clapisson G., Salinas С., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
gives better results than DMSO alone // Bull Cancer. – 2004. –
Vol. 91, N4. – P. E97–102.
12. Devireddy R.V., Swanlund D.J., Olin T. et al. Cryopreservation
of equine sperm: optimal cooling rates in the presence and
absence of cryoprotective agents determined using differential
scanning calorimetry // Biol Reprod. – 2002. – Vol. 66, №1. –
P. 222–231.
13. Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-step
cooling procedures to examine factors influencing cell survival
following freezing and thawing // Cryobiology. – 1977. –
Vol. 14, N3. – P. 273–286.
14. Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on
the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //
Cryobiology. – 1982. – Vol. 19, N6. – P. 669.
15. Lionetti F.J., Luscinskas F.W., Hant S.M. et al. Factors affecting
the stability of cryogenically preserved granulocytes //
Cryobiology. – 1980. – Vol. 17, N3. – P. 297–310.
16. Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-programmed
process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl starch as
cryoprotectants in cryopreservation of cord blood hemato-
poietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. – 2004. –
Vol. 12, N5. – P. 670–673.
17. Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide and
hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated human
134 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 2, 2013
11. Clapisson G., Salinas С., Malacher P. et al. Cryopreservation
with hydroxyethylstarch (HES) + dimethylsulphoxide (DMSO)
gives better results than DMSO alone // Bull. Cancer. – 2004. –
Vol. 91, №4. – P. E97–102.
12. Devireddy R.V., Swanlund D.J., Olin T. et al. Cryopreservation
of equine sperm: optimal cooling rates in the presence and
absence of cryoprotective agents determined using differential
scanning calorimetry // Biol. Reprod. – 2002. – Vol. 66, №1. –
P. 222–231.
13. Farrant J., Walter C.A., Lee H., McGann L.E. Use of two-step
cooling procedures to examine factors influencing cell survival
following freezing and thawing // Cryobiology. – 1977. –
Vol. 14, №3. – P. 273–286.
14. Levin R.L. The limiting effects of heat and mass transfer on
the osmotic behavior of cells during freezing and thawing //
Cryobiology. – 1982. – Vol. 19, №6. – P. 669.
15. Lionetti F.J., Luscinskas F.W., Hant S.M. et al. Factors affecting
the stability of cryogenically preserved granulocytes //
Cryobiology. – 1980. – Vol. 17, №3. – P. 297–310.
16. Liu K.Y., Dong W.C., Wang Y.L. et al. Study on non-programmed
process using dimethyl sulfoxide and hydroxyethyl starch as
cryoprotectants in cryopreservation of cord blood hemato-
poietic cells // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. – 2004. –
Vol. 12, №5. – P. 670–673.
17. Luo K., Wu G., Wang Q. et al. Effect of dimethylsulfoxide and
hydroxyethyl starch in the preservation of fractionated human
marrow cells // Cryobiology. – 1994. – Vol. 31, №4. – P. 349–354.
18. Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified
method for cryopreservation of islets using hydroxyethyl
starch and dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Transplant.
Proc. – 2004. – Vol. 36,№4. – P. 1133–1134.
19. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology. – 1977. – Vol. 14,
№3. – P. 251–272.
20. Pegg D.E., Diaper M.P. The paсking effect in erythrocyte freez-
ing // Cryo-Letters. – 1983. – Vol. 4, №2. – P. 129–136.
21. Pitt R.E., Chandrasekaran M., Parks J.E. Performance of a kinetic
model for intracellular ice formation based on the extent of
supercooling // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, №3. – P. 359–373.
22. Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an
additional cryoprotective agent in freeze preservation of
hematopoietic stem cells // Folia Haematol. Int. Mag. Klin.
Morphol. Blutforsch. – 1987. – Vol. 114, №2. – P. 264–272.
23. Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol. – 1984. –
Vol. 246. – P. 330–338.
24. Rowley S.D., Feng Z., Chen L. et al. A randomized phase III
clinical trial of autologous blood stem cell transplantation
comparing cryopreservation using dimethylsulfoxide vs
dimethylsulfoxide with hydroxyethylstarch // Bone Marrow
Transplant. – 2003. – Vol. 31, №11. – P. 1043–1051.
25. Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopreser-
ved in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without cont-
rolled-rate freezing // Blood. – 1987. – Vol. 70, №4. – P. 974–
978.
26. Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated human
marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide and
hydroxyethyl starch // Cryobiology. – 1983. – Vol. 20, №1. –
P. 17–24.
27. Tsuruta T., Ishimoto Y., Masuoka T. Effects of glycerol on
intracellular ice formation and dehydration of onion epidermis //
Ann. N.-Y. Acad. Sci. – 1998. – Vol. 858. – P. 217–226.
28. Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J. Bio-
chemical stabilization enhances red blood cell recovery and
stability following cryopreservation // Cryobiology. – 2002. –
Vol. 45, №2. – P. 153–166.
29. Woelders H., Chaveiro A. Theoretical prediction of 'optimal'
freezing programmes // Cryobiology. – 2004. – Vol. 49, №3. –
P. 258–271.
marrow cells // Cryobiology. – 1994. – Vol. 31, N4. – P. 349–
354.
18.Maruyama M., Kenmochi T., Sakamoto K. et al. Simplified method
for cryopreservation of islets using hydroxyethyl starch and
dimethyl sulfoxide as cryoprotectants // Transplant. Proc. –
2004. – Vol. 36, N4. – P. 1133–1134.
19. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells
cooled at supraoptimal rates // Cryobiology. – 1977. – Vol. 14,
N3. – P. 251–272.
20. Pegg D.E., Diaper M.P. The paсking effect in erythrocyte freez-
ing // Cryo-Letters. – 1983. – Vol. 4, N2. – P. 129–136.
21. Pitt R.E., Chandrasekaran M., Parks J.E. Performance of a
kinetic model for intracellular ice formation based on the extent
of supercooling // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, N3. – P. 359–
373.
22. Reiners B., Zintl F., Plenert W. Use of human albumin as an
additional cryoprotective agent in freeze preservation of
hematopoietic stem cells // Folia Haematol. Int. Mag. Klin.
Morphol. Blutforsch. – 1987. – Vol. 114, N2. – P. 264–272.
23. Romano L., Passow H. Characterization of anion transport
system in trout red blood cell // Am. J. Physiol. – 1984. –
Vol. 246. – P. 330–338.
24. Rowley S.D., Feng Z., Chen L. et al. A randomized phase III
clinical trial of autologous blood stem cell transplantation
comparing cryopreservation using dimethylsulfoxide vs
dimethylsulfoxide with hydroxyethyl starch // Bone Marrow
Transplant. – 2003. – Vol. 31, N11. – P. 1043–1051.
25. Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone
marrow transplantation using unfractionated cells cryopre-
served in dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch without
controlled-rate freezing // Blood. – 1987. – Vol. 70, N4. – P. 974–
978.
26. Stiff P.J., Murgo A.J., Zaroulis C.G. et al. Unfractionated human
marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide and
hydroxyethyl starch // Cryobiology. – 1983. – Vol. 20, N1. –
P. 17–24.
27. Tsuruta T., Ishimoto Y., Masuoka T. Effects of glycerol on
intracellular ice formation and dehydration of onion epidermis //
Ann. N.-Y. Acad. Sci. – 1998. – Vol. 858. – P. 217–226.
28. Wagner C.T., Martowicz M.L., Livesey S.A., Connor J.
Biochemical stabilization enhances red blood cell recovery
and stability following cryopreservation // Cryobiology. –
2002. – Vol. 45, N2. – P. 153–166.
29. Woelders H., Chaveiro A. Theoretical prediction of 'optimal'
freezing programmes // Cryobiology. – 2004. – Vol. 49, N3. –
P. 258–271.
|