Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых

В обзоре освещены основные проблемы криоконсервирования репродуктивных продуктов насекомых, а также разработанные на сегодняшний день подходы к их решению. Особенности процедур криоконсервирования эмбрионов и сперматозоидов насекомых обсуждаются в сравнительном аспекте с методами криоконсервирования...

Повний опис

Збережено в:

Бібліографічні деталі
Дата:	2013
Автори:	Релина, Л.И., Гулевский, А.К.
Формат:	Стаття
Мова:	Russian
Опубліковано:	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 2013
Назва видання:	Проблемы криобиологии и криомедицины
Теми:	Обзоры
Онлайн доступ:	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68727
Теги:	Додати тег Немає тегів, Будьте першим, хто поставить тег для цього запису!
Назва журналу:	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
Цитувати:	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых / Л.И. Релина, А.К. Гулевский // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 205-227. — Бібліогр.: 69 назв. — рос., англ.

Репозитарії

Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine

id	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68727
record_format	dspace
spelling	nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-687272025-02-09T14:17:44Z Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых Cryopreservation of Insect Germplasm Релина, Л.И. Гулевский, А.К. Обзоры В обзоре освещены основные проблемы криоконсервирования репродуктивных продуктов насекомых, а также разработанные на сегодняшний день подходы к их решению. Особенности процедур криоконсервирования эмбрионов и сперматозоидов насекомых обсуждаются в сравнительном аспекте с методами криоконсервирования репродуктивных продуктов других видов. Представлена краткая характеристика видов, на которых рассмотрены протоколы криоконсервирования, обосновывающая необходимость долгосрочного хранения их генетического материала. Виды насекомых, для которых приведены разработанные методики низкотемпературного хранения, сгруппированы в обзоре по систематическим таксонам (отрядам). Рассматриваются перспективы дальнейших разработок данного направления. Висвітлено основні проблеми кріоконсервування репродуктивних продуктів комах, а також розроблені підходи до їх вирішення. Особливості процедур кріоконсервування ембріонів і сперматозоїдів комах обговорюються в порівняльному аспекті з методами кріоконсервування репродуктивних продуктів інших видів. Представлена коротка характеристика видів, на яких розглянуто протоколи кріоконсервування, що обгрунтовує необхідність довгострокового зберігання їх генетичного матеріалу. Види комах, для яких наведені розроблені методики низькотемпературного зберігання, згруповані в огляді по систематичним таксонам (рядам). Розглядаються перспективи подальших розробок даного напрямку. The review describes the basic problems of cryopreservation of insect germplasm as well as approaches to their solution, which have been developed to date. The peculiarities of cryopreservation procedures for insect embryos and sperm are discussed in comparison with cryopreservation methods for reproductive products of other species. A brief description of species, for which the cryopreservation protocols are considered, substantiates the need for long-term storage of their genetic material. In the review we categorized the insect species, for which the designed low-temperature storage techniques are presented, in systematic taxa (orders). The prospects for the further development in this area are discussed. 2013 Article Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых / Л.И. Релина, А.К. Гулевский // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 205-227. — Бібліогр.: 69 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68727 591.463/.465-57:615.014.41 ru Проблемы криобиологии и криомедицины application/pdf Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
institution	Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine
collection	DSpace DC
language	Russian
topic	Обзоры Обзоры
spellingShingle	Обзоры Обзоры Релина, Л.И. Гулевский, А.К. Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых Проблемы криобиологии и криомедицины
description	В обзоре освещены основные проблемы криоконсервирования репродуктивных продуктов насекомых, а также разработанные на сегодняшний день подходы к их решению. Особенности процедур криоконсервирования эмбрионов и сперматозоидов насекомых обсуждаются в сравнительном аспекте с методами криоконсервирования репродуктивных продуктов других видов. Представлена краткая характеристика видов, на которых рассмотрены протоколы криоконсервирования, обосновывающая необходимость долгосрочного хранения их генетического материала. Виды насекомых, для которых приведены разработанные методики низкотемпературного хранения, сгруппированы в обзоре по систематическим таксонам (отрядам). Рассматриваются перспективы дальнейших разработок данного направления.
format	Article
author	Релина, Л.И. Гулевский, А.К.
author_facet	Релина, Л.И. Гулевский, А.К.
author_sort	Релина, Л.И.
title	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
title_short	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
title_full	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
title_fullStr	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
title_full_unstemmed	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
title_sort	криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых
publisher	Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
publishDate	2013
topic_facet	Обзоры
url	https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68727
citation_txt	Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых / Л.И. Релина, А.К. Гулевский // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 205-227. — Бібліогр.: 69 назв. — рос., англ.
series	Проблемы криобиологии и криомедицины
work_keys_str_mv	AT relinali kriokonservirovaniereproduktivnyhproduktovnasekomyh AT gulevskijak kriokonservirovaniereproduktivnyhproduktovnasekomyh AT relinali cryopreservationofinsectgermplasm AT gulevskijak cryopreservationofinsectgermplasm
first_indexed	2025-11-26T18:34:58Z
last_indexed	2025-11-26T18:34:58Z
_version_	1849879014487883776
fulltext	УДК 591.463/.465-57:615.014.41 Л.И. Релина, А.К. Гулевский Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых UDC 591.463/.465-57:615.014.41 L.I. Relina, A.K. Gulevsky Cryopreservation of Insect Germplasm Реферат: В обзоре освещены основные проблемы криоконсервирования репродуктивных продуктов насекомых, а также разработанные на сегодняшний день подходы к их решению. Особенности процедур криоконсервирования эмбрионов и сперматозоидов насекомых обсуждаются в сравнительном аспекте с методами криоконсервирования репродуктивных продуктов других видов. Представлена краткая характеристика видов, на которых рассмотрены протоколы криоконсер- вирования, обосновывающая необходимость долгосрочного хранения их генетического материала. Виды насекомых, для которых приведены разработанные методики низкотемпературного хранения, сгруппированы в обзоре по систематическим таксонам (отрядам). Рассматриваются перспективы дальнейших разработок данного направления. Ключевые слова: криоконсервирование, насекомые, репродуктивные продукты. Реферат: Висвітлено основні проблеми кріоконсервування репродуктивних продуктів комах, а також розроблені підходи до їх вирішення. Особливості процедур кріоконсервування ембріонів і сперматозоїдів комах обговорюються в порівняльному аспекті з методами кріоконсервування репродуктивних продуктів інших видів. Представлена коротка характеристика видів, на яких розглянуто протоколи кріоконсервування, що обгрунтовує необхідність довгострокового зберігання їх генетичного матеріалу. Види комах, для яких наведені розроблені методики низькотемпературного зберігання, згруповані в огляді по систематичним таксонам (рядам). Розглядаються перспективи подальших розробок даного напрямку. Ключові слова: кріоконсервування, комахи, репродуктивні продукти. Abstract: The review describes the basic problems of cryopreservation of insect germplasm as well as approaches to their solution, which have been developed to date. The peculiarities of cryopreservation procedures for insect embryos and sperm are discussed in comparison with cryopreservation methods for reproductive products of other species. A brief description of species, for which the cryopreservation protocols are considered, substantiates the need for long-term storage of their genetic material. In the review we categorized the insect species, for which the designed low-temperature storage techniques are presented, in systematic taxa (orders). The prospects for the further development in this area are discussed. Key words: cryopreservation, insects, reproductive products. Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию: ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38 057) 373-31-87, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта: lianaisaakovna@rambler.ru To whom correspondence should be addressed: 23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084, e-mail: lianaisaakovna@rambler.ru Department of Biochemistry of Cold Adaptation, Institute for Prob- lems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine Отдел биохимии холодовой адаптации, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков Поступила 30.04.2013 Принята в печать 05.07.2013 Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №3. – С. 205–227. © 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины Received April, 30, 2013 Accepted August, 05, 2013 Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 3. – P. 205–227. © 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine Развитие молекулярной генетики и биологии при- вело к созданию тысяч новых линий эксперимен- тальных животных, включая насекомых. Можно ожидать, что этот процесс будет только ускорять- ся, и все уменьшающееся число линий можно будет поддерживать в виде размножающихся популяций. Многие полезные линии животных могут быть утеряны, если не будут созданы банки их репродук- тивных продуктов (germplasm): эмбрионов и спер- матозоидов. В связи с актуальностью проблемы в ряде стран организованы и функционируют низко- температурные банки репродуктивных продуктов животных. Например, в лаборатории Джексона (г. Бар Харбор, штат Мэн, США) законсервировано около 5500 репродуктивных продуктов уникальных линий мышей [29]. Семь лет назад была основана Международная федерация ресурсов генетическо- го материала мышей, которая объединяет 17 гене- The progress of molecular genetics and biology was manifested in the creation of thousands of new lines of experimental animals, including insects. This process will likely develop more and more, and only few lines could be maintained as propagating populations. Many valuable lines of animals may be lost, if there would be no banks for germplasm, i. e. embryos and sperm. Due to the urgency of the problem, low-temperature banks of animal germplasm are already established and operate in several countries. For example, the Jackson’s Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) stocks about 5,500 germplasm specimens of unique mice strains [29]. Seven years ago, the Federation of International Mouse Resources was founded and com- prised 17 genetic centres in North America, Europe, Japan and Australia. The main goal of this organization is to ensure the preservation of the mice lines collection using cryopreservation [6]. Omaha Zoo stocks in liquid обзор review тических центров в Северной Америке, Европе, Японии и Австралии. Основная цель деятельности этой организации – обеспечить сохранение коллек- ции линий мышей в виде криоконсервированных ресурсов [6]. В зоопарке Омахи в жидком азоте хранится свыше 20000 образцов спермы и эмбрио- нов от более 40 видов животных [37]. В Националь- ном институте сельскохозяйственных исследова- ний Франции существует банк генетического материала рыб и моллюсков [2]. При Департаменте сельского хозяйства США с 2005 по 2011 годы осу- ществлялись научно-исследовательские проекты «Разработка технологии холодового хранения эмбрионов насекомых, разводимых в массовых количествах и в лабораторных популяциях» («Development of cold storage technology for mass- reared and laboratory-colonized insects») и «Оценка системы массового криоконсервирования эмбрио- нов насекомых» (Evaluation of a mass-cryopreserva- tion system for insect embryos) по разработке мето- дов долгосрочного хранения генетического мате- риала насекомых для их массового воспроизвод- ства в лабораторных условиях [46, 47]. В Респу- блике Корея при Информационном банке генети- ческих ресурсов успешно осуществлено криокон- сервирование материала 321 линии шелкопряда и планируется разработка протоколов хранения не только коммерчески востребованных линий шелко- пряда, но и диких шелкопрядов, а также предста- вителей редких видов насекомых [44]. К сожале- нию, методы криоконсервирования репродуктив- ных продуктов насекомых не удовлетворяют пот- ребности в сохранении разнообразия их генетичес- кого материала. В мире существует около 20000 мутантных линий дрозофил [26], и их содержание в виде размножающихся популяций представляет собой трудоемкий и дорогостоящий процесс. Кро- ме того, существует вероятность генетического дрейфа, контаминации и т.п., что может привести к потере линий. Криоконсервирование генетичес- кого материала Drosophila и других насекомых, представляющих интерес для современной био- логии, позволило бы сохранить генетическое разно- образие насекомых. При поиске генетических под- ходов борьбы с вредителями было создано мно- жество линий, содержание которых экономически дорого. Разработка способа долгосрочного хране- ния репродуктивных продуктов этих линий в крио- банках могла бы решить эту проблему. В таблице приведен перечень видов насекомых, для которых была исследована возможность низ- котемпературного хранения и разработаны техно- логические подходы для некоторых этапов этого процесса. nitrogen over 20,000 semen and embryos specimens from more than 40 animal species [37]. French Na- tional Institute for Agricultural Research has the bank of fish and shellfish germplasm [2]. Since 2005 to 2011 the U.S. Department of Agriculture supported the research projects ‘Development of Cold Storage Tech- nology for Mass-Reared and Laboratory-Colonized Insects’ and ‘Evaluation of a Mass-Cryopreservation System For Insect Embryos’ aimed to develop the me- thods for long-term storage of insect germplasm for their mass reproduction in laboratory [46, 47]. The Ko- rean Information Bank of Genetic Resources repor- ted successful cryopreservation of germplasm from 321 lines of silkworm and the planned development of storage protocols for not only commercially valuable lines of silkworms, but also for wild silkworms, as well as for representatives of the rare insect species [44]. Unfortunately, the existing methods of insect germ- plasm cryopreservation do not satisfy the need to preserve their genetic diversity. There are about 20,000 mutant strains of Drosophila [26], and their main- tenance as a propagating population is time-consuming and costly. Furthermore, there is a possibility of genetic drift, contamination, etc., which may result in the loss of lines. Cryopreservation of germplasm from Droso- phila and other insects, being valuable for contempo- rary biology, would allow to preserve the genetic diver- sity of insects. Seeking the genetic approaches for pest control led to appearance of number of lines, main- tenance of which is expensive. Creation of a method for long-term storage of germplasm of these lines in low-temperature banks could solve this problem. The Table represents the list of species for which the possibility of low temperature storage was investi- gated and some technological issues of the process developed. Cryopreservation of Diptera germplasm Cell survival at cryogenic temperatures depends on the ability to avoid the intracellular crystallization and if the saturation of cells with cryoprotectants was accomplished. To achieve these goals, the cells are to be permeable to water and cryoprotectants. Drosophila embryos are surrounded by vitelline membrane with a high content of wax [20], which makes it impermeable both for water and cryoprotectants. The process of cryopreservation should primarily include the removal of the barrier compounds. Cryopreservation of Dipte- ra embryos could be implemented solely if they became permeable (scheme of the preparation stage is shown in Figure). Permeabilization of D. melanogaster emb- ryos includes: 1) dechorionization with 50% solution of domestic bleach Clorox or 2.6% solution of sodium hypochlorite; 2) rinsing in water flow; 3) immersion 206 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue3, 2013 дяртО redrO диВ seicepS лаиретаМ nemicepS йыннатобарорП патэ egatsderolpxE aretpiD alihposorD retsagonalem ыноирбмЭ soyrbmE лкицйынлоП -ивреснокоирк яинавор foelcyclluF noitavreserpoyrc acsuM acitsemod ailicuL anirpuc ailicuL atacires ahpertsanA snedul ahpertsanA asnepsus sititareC atatipac aiymoilhcoC xarovinimoh aiymoilhcoC airallecam sediociluC sisneronos arohponitceP alleipyssog selehponA eaibmag патЭ иицазилибаемреп noitazilibaemreP egats aretpodipeL iromxibmoB ;ыдиозотамрепС иикинчия икиннемес seiravo,mrepS setsetdna лкицйынлоП -ивреснокоирк яинавор foelcyclluF noitavreserpoyrc airellaG allenollem ыноирбмЭ soyrbmE aretponemyH sipA arefillem ыдиозотамрепС mrepS easorailahtA elihcageM atadnutor ииклокуK еынтараф огами dnaeapuP ogamietarahp еоксечимретопиГ еиненарх cimrehtopyH egarots Криоконсервирование генетического ма- териала Двукрылых Выживание клеток при криогенных температу- рах зависит от возможности избежать внутрикле- точной кристаллизации и от насыщения клеток криопротекторами. Для достижения этих целей клетки должны быть проницаемы для воды и крио- протекторов. Эмбрионы дрозофил окружены ви- теллиновой мембраной с высоким содержанием восков [20], что делает их непроницаемыми как для воды, так и для криопротекторов. Процесс криоконсервирования должен, прежде всего, вклю- чать удаление этих барьерных соединений. Эмб- рионы двукрылых удается криоконсервировать только, если сделать их проницаемыми (схема подготовки приведена на рисунке). Пермеабилиза- ция эмбрионов D. melanopgaster включает: 1) дехо- рионизацию в 50%-м растворе хозяйственного от- беливателя «Clorox» или в 2,6%-м растворе гипо- хлорита натрия; 2) промывание в потоке воды; 3) погружение в изопропанол для удаления большей части внеэмбриональной воды; 4) высушивание на воздухе в течение 2 мин для удаления основного количества изопропанола; 5) 90-секундную экспо- зицию в n-гептане, содержащем 0,3%-й 1-бутанол; 6) 15-секундную экспозицию в чистом n-гептане [24, 27]. После пермеабилизации в смеси бутанол- гептан выживает более 80% 12-часовых эмбрио- нов D. melanogaster линии Oregon R-P2 [26]. Для криоконсервирования отбирали эмбрионы дрозофилы не старше 12 ч, так как между 14 и 16 ч развития кутикула становится нечувствитель- ной к обработке бутанол-гептановой смесью, пред- положительно, из-за появления в ней липидов [1, 30]. Однако позднее было установлено, что при криоконсервировании 15-часовых эмбрионов вы- луплялось 30% личинок по сравнению с 12%-й вы- живаемостью 12-часовых эмбрионов [28], а в ра- боте P.L. Steponkus и S. Caldwell [54] процент вы- лупления после криоконсервирования 15-часовых эмбрионов составил 49–55% по сравнению с 18% у 12-часовых. Точный контроль времени и темпера- туры развития эмбрионов дрозофилы перед отбо- ром для криоконсервирования позволил достичь средних значений вылупляемости 68%, при этом большая часть (40%) вылупившихся личинок раз- вивалась в фертильных имаго [26], т. е. общая эф- фективность криоконсервирования (процент фер- тильных имаго от количества витрифицированных эмбрионов) составила 25%. По аналогии с криоконсервированием эмбрио- нов мышей и нематод Caenorhabditis elegans можно было предположить, что эмбрионы ранних стадий развития, состоящие из малодифференци- into isopropanol to remove bulk of the extra-embryonic water; 4) air drying for 2 minutes to remove bulk of isopropanol; 5) 90-second-long exposure in n-heptane supplemented with 0.3% 1-butanol; 6) 15-second-long exposure to pure n-heptane [24, 27]. After permea- bilization in heptane-butanol more than 80% 12-hour- Виды насекомых, для которых разработаны протоколы низкотемпературного хранения репродуктивных продуктов Insect species for which the protocols of low temperature storage are developed проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 207 рованных клеток, будут лучше переносить проце- дуру криоконсервирования. Так, эмбрионы мышей обычно замораживают на стадии 8 клеток [50], а эмбрионы нематод – на стадии 558 клеток [50, 57]. В то же время эмбрионы дрозофил ранних стадий развития более уязвимы при криоконсервировании, чем 12- и 13-часовые эмбрионы, несмотря на то, что эмбрион дрозофилы на 13-м часе развития состоит примерно из 50000 клеток [1], которые уже высоко дифференцированы и образуют ткани и органы, включая мышцы и нервы (вылупление личинок дро- зофил при 24°С происходит на 21-м часе развития). Стандартным подходом при криоконсервирова- нии является медленное охлаждение клеток, при котором внутриклеточная вода покидает клетки, и риск внутриклеточной кристаллизации становит- ся минимальным [25]. Myers S.P. и соавт. [35] рас- считали, что для эмбрионов дрозофилы скорость охлаждения должна составлять менее 1 град/мин. Однако для эмбрионов дрозофилы такая скорость охлаждения неприемлема, поскольку они характе- ризуются чрезвычайно высокой холодочувстви- тельностью. Практически все 12-часовые эмбрио- ны D. melanogaster дикого типа линии Oregon R- P2 гибнут при скорости охлаждения 1 град/мин до –25°С без образования кристаллов льда [30, 34, 36], 3- и 6-часовые эмбрионы гибнут уже при 0°С. Mazur Р. и соавт. [30] указали на несколько возмож- ных причин чрезвычайной чувствительности эм- брионов насекомых к охлаждению без кристалло- образования. Во-первых, накопление «ошибочных» продуктов ферментативных реакций в результате того, что взаимозависимые реакции при низких температурах теряют синхронность из-за различ- ных энергий активации для разных реакций. Во- вторых, белки эмбрионов дрозофилы (и других ви- дов) чрезвычайно чувствительны к холодовой де- натурации [7]. В третьих, клетки гибнут в результа- те термоэластического стресса в охлажденных мем- бранах [31]. Единственным выходом в такой ситу- ации может быть попытка «обогнать» холодовые повреждения при очень быстром охлаждении со скоростью 20000 град/мин [30]. Наиболее эффек- тивным подходом для достижения таких скоростей оказалось погружение образца в поток жидкого азо- та [55], так как при простом погружении в жидкий азот кипение вокруг образца приводит к медленной теплопередаче. К сожалению, при обычных кон- центрациях криопротекторов (1–1,5 М) невозможно избежать летальной внутриклеточной кристал- лизации. Следовательно, приходится использовать очень высокие концентрации криопротекторов (≥ 50 вес. %), которые обеспечивают стеклование во время охлаждения и предупреждают рекристал- old D. melanogaster embryos of Oregon R-P2 line survived [26]. Drosophila embryos, intended for cryopreserva- tion, were no older than 12 hours, since the cuticle of 14 to 16 hour-old embryos became insensitive to treat- ment with a mixture of heptane-butanol, presumably because of appeared lipids [1, 30]. However, it was later found 30% post-thaw larvae hatching in case of 15 hour-old embryos unlike 12% survival in the case of 12-hour-old embryos [28], moreover Steponkus and Caldwell reported the 49–55% post-thaw hatching after cryopreservation of 15-hour-old embryos unlike to 18% for 12 hour-old embryos [54]. Precise control of time and temperature of Drosophila embryos development prior to cryopreservation prior allowed to reach average post-thaw hatchability of 68%, herewith the majority Схема основных этапов подготовки эмбрионов насеко- мых к криоконсервированию (на примере D. melano- gaster). Scheme of main stages of insect embryos preparation to cryopreservation (D. melanogaster as an example). 208 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 лизацию при отогреве. Наиболее широко для крио- консервирования эмбрионов D. melanogaster ис- пользуется криопротектор этиленгликоль (ЭГ) [26, 55]. Типичный протокол включает инкубацию эмб- рионов в растворе 2 М ЭГ в течение 30 мин при ком- натной температуре и последующую инкубацию в растворе ЭГ 8,5 М в течение 5 мин при 5°С. В раст- вор 8,5 М ЭГ часто добавляют 10% (вес/объем) по- ливинилпирролидона (ПВП) или 6–12% бычьего сывороточного альбумина. Они не способны про- никнуть в дехорионизированные эмбрионы, тем бо- лее за 5 мин при 5°С. Mazur Р. и соавт. [28] предпо- лагают, что защитная функция этих веществ мо- жет заключаться в снижении жесткости внеэмб- риональной стекловидной массы. Кроме того, они повышают осмолярность внешней среды и способ- ствуют большей дегидратации эмбрионов по срав- нению с чистым ПВП. Поскольку криоконсервиро- ванию подвергаются эмбрионы с хорошо дифферен- цированными тканями и органами, они могут иметь компартменты, плохо проницаемые для ЭГ. Авторы связывают гибель эмбрионов при криоконсерви- ровании с рекристаллизацией при отогреве [28]. Для предотвращения рекристаллизации и дости- жения приемлемых значений выживаемости необ- ходима скорость отогрева порядка 100000 град/мин. Криоконсервирование репродуктивных продук- тов D. melanogaster вызывает особый интерес у генетиков и специалистов в области эволюционной биологии, поэтому до использования криоконсер- вированного материала в экспериментах необходи- мо убедиться, что оно не является мутагенным фактором. Несмотря на рутинное использование криотехнологий для хранения разнообразных биообъектов, существует очень мало исследова- ний, посвященных количественной оценке частоты мутаций после криоконсервирования. Houle D. и соавт. [12] впервые количественно оценили мута- генное действие криоконсервирования на зароды- шах многоклеточного организма. Тестирование проводили на эмбрионах линии D. melanogaster, несущей рецессивные летали, сцепленные с Х-хро- мосомой. Уровень мутаций у контрольных мух и мух, развившихся из криоконсервированных эмб- рионов, достоверно (95%) не отличался. Эмбрионы домашней мухи Musca domestica для криоконсервирования отбирают на тех же ста- диях, что и эмбрионы дрозофил. Однако для каж- дого вида требуется подбор оптимальных условий пермеабилизации вителлиновой оболочки. Оказа- лось, что протоколы криоконсервирования эмбрио- нов D. melanogaster не пригодны для эмбрионов других мух. Wang W.B. и соавт. [67] разработали протокол хранения эмбрионов домашней мухи (40%) of hatched larvae developed into fertile imago [26], i. e., the overall efficiency of cryopreservation (the percentage of fertile imago vs. vitrified embryos) was 25%. Similarly to the cryopreservation of embryos of mice and Caenorhabditis elegans nematode it can be assumed that the early embryos, consisting of undif- ferentiated cells could better tolerate the cryopres- ervation. For example, the mouse embryos are usually frozen at 8 cell stage [50], and nematode embryos are at 558 cell stage [50, 57]. At the same time the early Drosophila embryo are more vulnerable during cryo- preservation unlike 12 and 13 hour-old embryos, despite the fact that 13 hour-old Drosophila embryo has appro- ximately 50,000 cells [1], which are highly differentiated and form tissues and organs, including muscles and nerves (Drosophila larvae hatching at 24°C occurs at the 21st hour of development). Slow cooling of cells, when intracellular water leaves the cells, and the risk of intracellular crystalliza- tion is minimal, is a standard approach for cryopreser- vation [25]. Myers et al. [35] calculated that in case of Drosophila embryos the cooling rate should be less than 1 deg/min. However, for Drosophila embryos this cooling rate is not acceptable, as they are extremely cold sensitive. Almost all 12-hour-old D. melanogaster embryos of wildtype Oregon R-P2 line died after being cooled down to –25°C with rate of 1 deg/min without ice crystals formation [30, 34, 36], 3 and 6 hour-old embryos died already at 0°C. Mazur et al. [30] hypothesed several possible causes of the extreme sensitivity of insect embryos to cooling without crystallization. First, this could be the accumulation of ‘erroneous’ products of enzymatic reactions as a result of lost synchronicity of interrelated reactions at low temperatures due to the different activation energies. Second, the proteins in Drosophila embryos (and in other species) are highly sensitive to cold denaturation [7]. And the third, the cells die as the result of thermo- elastic stress in chilled membranes [31]. The only so- lution here could be the attempt to ‘outrun’ the cold da- mages using ultra-rapid cooling rates of 20,000 deg/min [30]. The most effective approach to achieve such rates was an immersion of sample into flowing liquid nitrogen [55], since the simple plunging into it resulted in boiling around the sample and thereby in slower heat transfer. Unfortunately, the conventionally applied con- centrations of cryoprotectants (1 to 1.5 M) could not exclude the lethal intracellular crystallization. There- fore, it is necessary to use very high concentrations of cryoprotectants (more than 50% w/w), which could provide the glass transition during cooling and prevent recrystallization during warming. Ethylene glycol (EG) is the most common cryoprotectant used for cryopre- проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 209 M. domestica: витрифицирующийся раствор содер- жал ЭГ, полиэтиленгликоль и трегалозу, стадии охлаждения и отогрева включали этап пребывания эмбрионов в парах жидкого азота. Более 70% эмб- рионов M. domestica выдерживали процедуры дехорионизации, пермеабиализации, нагрузки крио- протектором и дегидратации в витрифицирую- щемся растворе, однако витрификация и отогрев резко снижали их выживаемость. Около 53% эмб- рионов M. domestica после витрификации и ото- грева достигали стадии личинки, и всего лишь 13% эмбрионов, подвергнутых данной процедуре, разви- вались в фертильных имаго по сравнению с контро- лем. Потомство F1, полученное от мух, развивших- ся из криоконсервированных эмбрионов, не отлича- лось от контроля. Использование изопропанола для пермеабилизации резко снижало процент вылупив- шихся личинок [67]. Электронно-микроскопичес- кий анализ показал, что смесь гексан-изопропанол проникает сквозь вителлиновую мембрану и по- вреждает периферические клетки эмбриона. Тонко- слойная хроматография слоя, покрывающего вителлиновую мембрану M. domestica, показала, что он не содержит восков [67] в отличие от анало- гичного слоя у дрозофил [40]. Наилучшие результа- ты выживаемости эмбрионов M. domestica были получены при их пермеабилизации гептаном или гексаном без добавления изопропанола, что, по всей видимости, обусловлено особенностями хи- мического состава липидного слоя вителлиновой оболочки. Витрифицирующийся раствор для эм- брионов M. domestica содержал 34% ЭГ, 5,4 % по- лиэтиленгликоля (ПЭГ 6000–7500) и 15,5% трега- лозы [67]. После пермеабилизации эмбрионы инку- бировались в растворе 1,8 М ЭГ в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем 10 мин в вит- рифицирующемся растворе на льду. Добавление ПЭГ и трегалозы позволило добиться витрифика- ции при снижении концентрации ЭГ, что снизило токсический эффект ЭГ. Эмбрионы выдерживали в парах азота в течение 1 мин, а затем погружали в поток жидкого азота, что давало неоспоримое преимущество по сравнению с погружением в поток азота без предварительной экспозиции в его парах. При непосредственном погружении в поток азота вителлиновые мембраны эмбрионов M. do- mestica повреждаются, и после отогрева процент вылупления составлял всего лишь 2%. Экспозиция в парах жидкого азота позволяла достичь необхо- димой скорости охлаждения. При отогреве эмбрио- ны также выдерживали в парах азота в течение 1 мин, а затем погружали в инкубационную среду при комнатной температуре. Wang W.B. и соавт. [67] считают, что одной из причин столь невысокой servation of D. melanogaster embryos [26, 55]. A typical protocol involves incubation of embryos in 2 M EG solution for 30 minutes at room temperature and subsequent incubation in a 8.5 M EG solution for 5 mi- nutes at 5°C. Solution of 8.5 M EG is often supple- mented with 10% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) or 6–12% bovine serum albumin (BSA). They are not able to penetrate into dechorionized embryos, especial- ly for 5 minutes at 5°C. Mazur et al. [28] suggested the protective function of these substances to be con- sisted in reducing the rigidity of the extraembryonic vitreous mass. Furthermore, they increased the osmo- larity of the environment and contributed to greater dehydration of embryos if compared with pure PVP solution. Since the procedure was performed in emb- ryos with well differentiated tissues and organs, they may have compartments poorly permeable to EG. The authors associated the death of embryos with re- crystallization during warming [28]. To prevent re- crystallization and to achieve an acceptable survival the warming should be provided with rate of about 100,000 deg/min. Cryopreservation of D. melanopgaster reproduc- tive products is of particular interest to geneticists and evolutionary biologists, therefore the application of cryopreserved speciemens in experiments is possible if proving that cryopreservation is not a mutagenic factor. Despite the routine use of cryogenic techno- logies for the storage of various biological specimens, there are only few studies on the quantification of the mutation frequency post cryopreservation. Houle et al. [12] for the first time quantified the mutagenic effect of cryopreservation on the embryos of a multicellular organism. The investigation was performed in D. me- lanogaster embryos of the line carrying recessive X- linked lethals. Mutation rate in the control flies and those developed from cryopreserved embryos did not significantly differ (95%). The embryos of housefly Musca domestica are selected for cryopreservation at the same stages like Drosophila embryos. However, each species require the selection of optimal conditions for permeabilization of the vitelline membrane. It was found that the pro- tocols for cryopreservation of D. melanogaster emb- ryos were not suitable for preservation of embryos of other flies. Wang et al. [67] developed a protocol for housefly M. domestica embryos: vitrifying solution contained EG, polyethylene glycol, trehalose; cooling and warming steps included keeping of embryos in liquid nitrogen vapors. More than 70% of the M. do- mestica embryos survived dechorionization procedu- res, permeabialization, loading with cryoprotectants and dehydration in vitrifying solution, but vitrification and following warming sharply reduced their survival. 210 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 эффективности криоконсервирования эмбрионов домашней мухи может быть размер яиц. Средний размер яйца D. melanogaster составляет 150×420 мкм [52], тогда как у M. domestica размер яйца гораздо больше – 260×1000 мкм [3]. Падальница Lucilia cuprina представляет со- бой серьезную проблему для овцеводства, по- скольку вызывает миаз, зачастую приводящий к гибели животных [53]. Для хранения ее генетичес- кого материала был модифицирован протокол, разработанный для криоконсервирования эмбрио- нов D. melanogaster [17]. В экспериментах исполь- зовали 6–7-часовые эмбрионы, при этом на стадии 6,5 ч эмбрионы оказались наиболее подходящими, поскольку после их замораживания-оттаивания процент вылупления личинок был наиболее вы- сок – 20,2 ± 3,5%. Данная стадия развития эмбрио- нов падальницы как раз предшествует инволюции головы и дорсальному закрытию, что соответст- вует стадии развития эмбрионов D. melanogaster, на которой они наиболее устойчивы к факторам криоконсервирования. В 7-часовые эмбрионы пло- хо проникает криопротектор, о чем свидетельст- вует характер их сжатия и набухания. Природа пов- реждений 6,5- и 6,75-часовых эмбрионов не вполне ясна, поскольку многие из них развиваются до стадии вылупления, но неспособны выбраться из вителлиновой оболочки. Наилучший результат (20,2 ± 3,5%) был получен при использовании в качестве криопротектора ЭГ в концентрациях 3,0 М для нагрузочного раствора и 7,5 М – для дегидра- тирующего. Однако данное вещество оказывает пагубное воздействие на эмбрионы L. сuprina, поскольку значительное их количество погибает на этапе дегидратации. Тестирование других криопро- текторов положительных результатов не имело. При этом ЭГ не является специфичным только для эмбрионов L. сuprina, поскольку он оказался вре- ден и для других видов двукрылых [16]. При этом уровень выживаемости, достигнутый для D. mela- nogaster (до 50% насекомых, превратившихся в имаго из личинок, вылупившихся из криоконсерви- рованных яиц) [26] не приемлем для L. сuprina, поэтому для использования криоконсервирования как надежного способа сохранения линий этого на- секомого требуется тестирование других криопро- текторов, их смесей и различных добавок к витри- фицирующимся растворам для снижения негатив- ных эффектов на этапе дегидратации [17]. Сохранение генетического материала вреди- телей необходимо для лабораторных исследований и массового воспроизводства мух при реализации программ аутоцидного контроля (программы выпуска стерильных насекомых-вредителей). Де- About 53% of vitrified-warmed M. domestica emb- ryos achieved the larvae stage, and only 13% of the embryos evolved fertile imago if compared with the control. F1 flies that evolved from cryopreserved emb- ryos did not differ from the control. The use of isopropa- nol for permeabilization sharply reduced the percentage of hatched larvae [67]. Electron microscopic analysis indicated that the hexane-isopropanol mixture pene- trated through the vitelline membrane and damaged the peripheral cells of the embryo. Thin layer chroma- tography assay of the layer covering the vitelline mem- brane of M. domestica, showed that it did not contain waxes [67] unlike the same layer in Drosophila [40]. The highest survival of M. domestica embryos was obtained after permeabilization with heptane or hexane, without isopropanol added, apparently due to the pecu- liarities of chemical composition of the vitelline mem- brane lipid layer. Vitrifying solution for M. domestica embryos contained 34% of EG, 5.4% of polyethylene glycol (PEG 6000–7500), and 15.5% of trehalose [67]. After permeabilization the embryos were incubated for 20 min in 1.8 M EG solution at room temperature and then for 10 min on ice in vitrifying solution. Adding of PEG and trehalose allowed to obtain vitrification at lower concentrations of EG, which reduced its negative effect. Embryos were kept in nitrogen vapors for 1 mi- nute, and then plunged into flowing liquid nitrogen, which was more beneficial if compared with immersion into the nitrogen stream without pre-exposure to nitro- gen vapor: direct immersion into the flowing liquid nitrogen resulted in injury of M. domestica embryo vitelline membrane damaged and post-warming hat- ching was only 2%. Exposure in liquid nitrogen vapors allowed reaching the necessary cooling rate. During warming the embryos were also kept in nitrogen vapors for 1 minute, and then plunged into incubation medium of room temperature. Wang et al. [67] believed that one of the reasons for low efficiency of the house-fly embryos cryopreservation may be the size of eggs. The average size of the D. melanogaster eggs is 150×420 mm [52], whereas the size of the M. domes- tica eggs is much bigger, 260×1000 mm [3]. Sheep blowfly Lucilia cuprina is a major problem for sheep breeding because it causes myasis, often leading to death of the animals [53]. To store its germ- plasm the protocol developed for the cryopreservation of D. melanogaster embryos has been modified [17]. The experiments were conducted in 6–7 hour-old embryos, herewith the embryos at the 6.5 hour stage were most appropriate: post-thaw hatching was the highest among studied cases, 20.2 ± 3.5%. This stage of sheep blowfly embryo development just precedes the involution of the head and dorsal closure, and this corresponds to the stage of D. melanogaster embryo проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 211 партамент сельского хозяйства США выпускает в неделю 25 млн стерильных мексиканских плодо- вых мух Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Teph- ritidae), которые представляют серьёзную угрозу для цитрусовых и других плодовых в Техасе, Калифорнии и Флориде, что позволяет свести к ми- нимуму фумигацию экспортируемых плодов [10]. Исследования на дрозофиле показали, что одним из ключевых моментов успешного криоконсерви- рования эмбрионов является правильный выбор стадии эмбрионального развития. Поэтому важно установить структурный маркер нужной стадии [42]. В качестве таких маркеров для A. ludens бы- ли выбраны количество желтка, этап развития ротового аппарата и кишечника, поскольку при ис- пользовании морфологии кишечника как единст- венного маркера были получены неоднозначные результаты. Высокое содержание желтка счи- талось критическим фактором, влияющим на ус- пех криоконсервирования, при разработке протокола для долгосрочного хранения эмбрионов средизем- номорской плодовой мухи Ceratitis capitata [43] (см. ниже). Делипидизация была одним из под- ходов, позволяющих повысить выживаемость криоконсервированных эмбрионов других видов [14, 22, 63]. Даже яйца, отложенные на протяжении 30 мин, развиваются с разной скоростью вслед- ствие естественной индивидуальной вариабель- ности. Отбор эмбрионов вручную позволил повы- сить вылупляемость личинок из криоконсервиро- ванных эмбрионов до 80%. Прямое погружение эмбрионов A. ludens в жидкий азот оказалось ме- нее эффективным, чем погружение после предва- рительного выдерживания в парах жидкого азота. Длительность хранения в жидком азоте на резуль- таты криоконсервирования не влияла, поскольку вылупляемость личинок из витрифицированных эмбрионов, хранящихся в жидком азоте в течение года, не отличалась от таковой при хранении 15 мин. Наибольшая вылупляемость (при простой синхронизации образцов без отбора эмбрионов вручную) личинок A. ludens была достигнута при использовании витрифицирующегося раствора, содержащего 40% ЭГ и 5% ПЭГ8000 (49,1 ± 12,2%) [42]. Из этих личинок 66,5±17,8% окукливались, и 89,1 ± 7,6% куколок превращались в имаго. Таким образом, конечный выход мух из криоконсер- вированных эмбрионов A. ludens составил 29,2%. Еще один представитель семейства Tephritidae, эмбрионы которого удалось криоконсервировать, – это средиземноморская плодовая муха Ceratitis capitata. Она повреждает около 200 видов плодо- вых растений. К маркерным признакам, служащим для отбора нужной стадии эмбрионального разви- development, which is namely the most resistant to the factors of cryopreservation. The 7 hour-old emb- ryos are hardly permeable for the cryoprotectant, as was evidenced by the course of their shrinkage and following swelling. The reason of injuries in 6.5 and 6.75 hour-old embryos is not clear, because many of them develop to the stage of hatching, but are unable to get out of the vitelline membrane. The highest sur- vival (20.2 ± 3.5%) was obtained after using EG as a cryoprotectant in concentrations of 3.0 M for loading solution and 7.5 M for dehydrating one. Nevertheless, this substance has also a detrimental effect on the L. cuprina embryos, since a significant number of them do not survive the dehydration step. Screening for other cryoprotectants did not deliver a positive results. In addition the negative action of EG was not specific only for the L. cuprina embryos, since it was harmful to other species of Diptera too [16]. Moreover the survival rate achieved for D. melanogaster (up to 50% of the insects developed to imago from larvae hatched from cryopreserved eggs) [26] is not suitable for L. cuprina, so to apply cryopreservation as a reliable way to preserve the lines of this insect the thorough screening for other cryoprotectants is needed, as well as their mixtures and various supplements to cryopreservating solutions to reduce the negative effects at the stage of dehydration [17]. Preservation of the pest germplasm is necessary for laboratory investigations and mass reproduction of flies during implementation of autocide projects (project of sterile pest insects releasing). U.S. Department of Agriculture release 25,000,000 sterile Mexican fruit fly Anastrepha ludens (Loew) (Diptera: Tephritidae) each week. These insects seriously threaten citrus and other fruit in Texas, California and Florida, and these measures minimize the need of the fumigation of exported fruits [10]. Studies in Drosophila have shown that one of the key points in successful cryopre- servation of embryos is choosing the right stage of embryonic development. Therefore it is important to establish the structural marker for appropriate stage [42]. As markers for A. ludens the amount of yolk, stages of mouthparts and intestine development were selected, whereas using only intestinal morphology as a marker gave diverse results. The high content of yolk was considered as a critical factor in the success of cryopreservation during development of a protocol for long-term storage of Mediterranean fruit fly Cera- titis capitata embryos [43] (see below). Delipidization was one of the approaches that increased the survival of cryopreserved embryos of other species [14, 27, 63]. Natural individual variability resulted in different rate of development even in the eggs laid during 30 min. The manual selection of embryos allowed to increase 212 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 the hatchability of larvae from cryopreserved embryos up to 80%. Direct plunging of A. ludens embryos into liquid nitrogen was less effective than the plunging preceded by exposure in liquid nitrogen vapors. Dura- tion of storage in liquid nitrogen did not affect the out- come of cryopreservation, as the hatchability of larvae from the vitrified-warmed embryos stored in liquid nitrogen for a year, did not differ from that after 15 minutes of storage. The highest hatchability (in the case of simple synchronization of specimens without manual embryos selection) of A. ludens larvae was achieved using a vitrifying solution containing 40% EG, 5% PEG-8000 (49.1 ± 12.2%) [42]. Pupation was observed in 66.5 ± 17.8% of these larvae, and 89.1 ± 7.6% of these pupae developed to imago. Thus, the final yield of flies from cryopreserved A. ludens embryos was 29.2%. Another member of the family Tephritidae, emb- ryos of which were successfully cryopreserved, is the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata, which affects about 200 species of fruit plants. As the mar- kers for selection of the desired stage of embryonic development served characteristic spiral shape of the intestine and the absence of yolk [43]. Of interest is the fact that the term of embryonic development, suitab- le for cryopreservation for C. capitata, reached almost 2 hours [43], while for M. domestica the ‘gap’ was only 20 minutes, and even less for Cochliomyia homi- nivorax [19, 67]. The absence or minimum amount of yolk, apparently, is a common feature of validity for Diptera embryos for vitrification. Wang et al. [67] showed in research on M. domestica embryos that an elevation of the vitelline membrane permeability by means of isopropanol was followed by a sharp decrease in their hatchability. Rajamohan et al. [43] also ob- served necrotic areas in dying embryos when the concentration of isopropanol in hexane solution ex- ceeded 0.5%, and believed that the presence of necrotic tissue is a good indicator of the isopropanol toxicity at the permeabilization step. Vitrification solu- tion contained 40% of EG. Its supplementation with 0.5 M trehalose and 5% PEG did not substantially af- fect the survival of devitrified C. capitata embryos. Hardening of C. capitata embryos in liquid nitrogen vapors prior the plunging into liquid nitrogen allowed to achieve higher survival, similarly to the previously shown in other Diptera species [42, 67]. The need to hardening in liquid nitrogen vapors is probably deter- mined by the dimensions of eggs. Eggs of domestic fly, Mediterranean fruit fly and blowfly are 3,5 to 13 times bigger than the Drosophila eggs and 7 to 25 times bigger than biting midge eggs [43]. For small embryos the fractures in vitrifying solution are not so dangerous. The risk of fractures appearance during тия, относятся характерная спиральная форма ки- шечника и отсутствие желтка [43]. Интересно, что период эмбрионального развития, пригодный для криоконсервирования у C. capitata, достигает поч- ти 2 ч [43], в то время как для M. domestica такое «окно» составляет лишь 20 мин, а для Cochliomyia hominivorax – еще меньше [19, 67]. При этом отсутствие или минимальное количество желтка, по-видимому, является общим признаком пригод- ности эмбрионов двукрылых для витрификации. Wang W.B. и соавт. [67] в исследованиях на эмб- рионах M. domestica показали, что увеличение про- ницаемости вителлиновой оболочки с помощью изопропанола сопровождается резким снижением вылупляемости. Rajamohan A. и соавт. [43] также наблюдали участки некроза в умирающих эмбрио- нах, когда концентрация изопропанола в гексане превышала 0,5%. Они считают, что наличие некро- тической ткани является хорошим индикатором уровня токсичности изопропанола на этапе пермеа- билизации. Витрифицирующийся раствор содер- жит 40% ЭГ. Добавление 0,5 М трегалозы и 5% ПЭГ существенно на уровень выживаемости крио- консервированных эмбрионов C. capitata не влия- ло. «Закалка» эмбрионов C. capitata в парах жид- кого азота перед погружением в жидкий азот позво- ляет достичь более высоких результатов выживае- мости, что ранее было показано на других видах двукрылых [42, 67]. Необходимость этапа «закал- ки» в парах жидкого азота, возможно, определяется размером яиц. Яйца домашней, средиземноморской плодовой и мясной мух в 3,5–13 раз больше, чем яйца дрозофилы и в 7–25 раз больше, чем яйца мокреца [43]. Для малых эмбрионов разломы вит- рифицирующегося раствора не столь опасны. Риск возникновения разломов во время витрификации можно снизить экспозицией нагруженных криопро- тектором эмбрионов при более высоких темпера- турах в парах жидкого азота, что было предложено W.F. Rall и T.K. Meyer [41]. Эмбрионы падальницы даже больше, чем эмбрионы мясной мухи. Не ис- ключено, что низкая вылупляемость личинок, полу- ченная при витрификации эмбрионов падальницы [17], объясняется именно отсутствием этапа «за- каливания». При наиболее оптимальных режимах пермеабилизации, витрификации и последующего восстановления выход имаго из криоконсерви- рованных эмбрионов C. capitata составил 35,4% (47,3 ± 0,7% вылупившихся личинок, из которых окуклилось 80,3 ± 7,9%; 92,9 ± 7,96% этих куколок за- вершили метаморфоз и превратились в имаго) [43]. Протокол криоконсервирования эмбрионов D. melanogaster был модифицирован для низко- температурного хранения эмбрионов эктопарази- проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 213 vitrification can be reduced by exposure of cryopro- tectant loaded embryos at higher temperatures in liquid nitrogen vapors, which was proposed by Rall and Meyer [41]. Sheep blowfly embryos are even bigger than the blowfly embryos. It could not be excluded that the low hatchability of larvae obtained from de- vitrified sheep blowfly embryos [17] resulted from ab- sence of ‘hardening’ stage. The most optimal con- ditions of permeabilization, vitrification and following reviving the yield of imago from devitrified C. capitata embryos was 35,4% (47,3 ± 0,7% of hatched larvae, of which 80,3 ± 7,9% pupated; and 92,9 ± 7,96% of these pupae completed metamorphosis and transfor- med to imago) [43]. Cryopreservation protocol for D. melanogaster embryo was modified for low temperature storage of embryos of an ectoparasite, blowfly Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) [19], causing myasis in humans and animals. It was the first insect eliminated due to the mass production of sterile indivi- duals. In North and Central America, it was fully elimi- nated [68]. Leopold and Rinehart [18] proposed the method for cryopreservation of embryos of this species as the basis for the development of cryopreservation methods for embryos of insects. For successful cryo- preservation of C. hominivorax embryos, it was im- portant to determine the stage of embryonic develop- ment in which embryos were the most resistant to the factors of cryopreservation. This was the stage at which the development was completed by 75–80%. There is still no fair explanation, why this step has been the most resistant. Leopold and Rinehart [18] suggested that the presence of yolk and/or multiple cell division may be a cause of the extreme sensitivity of embryo at earlier stages of development. Moreover, the dura- tion of incubation in vitrifying solution was also crucial, since its extension even for 2 minutes caused the death of insects [67]. This may be the result of both adverse effects of EG and concentrating of intracellular solutes as well. The first assumption seemed as more rea- sonable since Mazur et al. [28] have shown that in- creasing of intracellular concentration of EG caused more detrimental effect on the D. melanogaster emb- ryos than dehydration. Approximately 53% of the larvae hatched from devitrified C. hominivorax embryos, 22% of them pupated, and 75% of the pupae developed to the imago. The yield of imago from devitrified C. hominivorax embryos thus was about 9%, but it was enough to propagate the colonies of different lines, as the offspring of flies developed from devitrified embryos had no quantitative differences from the control level. Cryopreservation of blowfly Cochliomyia macella- ria embryos (Diptera: Calliphoridae), also causing та – мясной мухи Cochliomyia hominivorax (Dip- tera: Calliphoridae) [19], вызывающей миаз у лю- дей и животных. Это было первое насекомое, эли- минированное благодаря массовому выпуску сте- рильных особей. На территории Северной и Цент- ральной Америки оно исчезло [68]. Leopold R.A. и Rinehart J.P. [18] предлагают метод криоконсерви- рования эмбрионов этого вида взять как основу для криоконсервирования эмбрионов насекомых. Для успешного криоконсервирования эмбрионов C. ho- minivorax важно было определить стадии эмбрио- нального развития, на которых эмбрионы наиболее устойчивы к факторам криоконсервирования. Это стадия, на которой развитие завершено на 75–80%. Пока нет удовлетворительного объяснения, почему именно эта стадия оказалась наиболее устойчивой. Leopold R.A. и Rinehart J.P. [18] предположили, что наличие желтка и/или многочисленные деления клеток могут быть причинами чрезвычайной чув- ствительности эмбрионов более ранних стадий раз- вития. Кроме того, важно время инкубации в витри- фицирующемся растворе, так как его продление всего на 2 мин приводит к гибели насекомых [67]. Это может являться результатом и негативного воздействия ЭГ, и концентрирования внутриклеточ- ных веществ. Первое предположение кажется бо- лее обоснованным, поскольку Mazur P. и соавт.[28] показали, что внутриклеточное повышение кон- центрации этиленгликоля более пагубно влияет на эмбрионы D. melanogaster, чем дегидратация. Приблизительно 53% личинок вылупляется из крио- консервированных эмбрионов C. hominivorax, из них окукливается 22%, и 75% этих куколок развивается до стадии имаго. Выход имаго из крио- консервированных эмбрионов C. hominivorax сос- тавлял около 9%, но этого достаточно для вос- произведения колоний различных линий, поскольку потомство мух, развившихся из криоконсервиро- ванных эмбрионов количественно не отличается от контрольного уровня. При криоконсервировании эмбрионов мясной мухи Cochliomyia macellaria (Diptera: Callipho- ridae), также вызывающей миаз, удалось достичь 63,7% вылупляемости личинок из витрифицирован- ных эмбрионов, однако при витрификации эмбрио- нов падальницы зеленой Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae), вызывающей луцилиоз, вылупля- лось только 20,2% личинок [66]. Это еще раз свиде- тельствует о необходимости отработки каждого этапа криоконсервирования для каждого вида насе- комых, несмотря на их принадлежность к одному семейству. Витрифицирующийся раствор для криоконсер- вирования эмбрионов карибской плодовой мухи 214 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 myiasis, resulted in 63.7% larvae hatchability of devitri- fied embryos, nevertheless vitrification of green blow- fly Lucilia sericata embryos (Diptera: Calliphori- dae), causing luciliosis, resulted only in 20.2% hatched larvae [66]. This highlights again the need for refining each step of cryopreservation protocol for each spe- cies, despite their belonging to the same family. Vitrifying solution for cryopreservation of Caribbean fruit fly Anastrepha suspensa embryos contained EG, PEG and trehalose. The stages of cooling and warming included the exposure of embryos in liquid nitrogen vapors. Up to 46.5% of A. suspensa embryos (Di- ptera: Tephritidae) survived vitrification and develo- ped to the larvae stage after devitrification [66], 29% of the larvae pupated, and thereafter fertile imago emerged from the pupae. Another species of pests, embryos of which were successfully cryopreserved, was midge Culicoides sonorensis (Diptera: Ceratopogonidae). The biting midges C. sonorensis are carriers of the bluetongue virus and cause ceratopogonidosis. Eggs of C. sono- rensis were resistant to procedures of dechorionisation, permeabilization and saturation with EG [38]. After these steps, 80.3% of treated embryos in average developed to the larvae stage. Dehydration in the vitri- fying solution reduced the viability of the embryos down to 42.7%, after vitrification in liquid propane the num- ber of embryos that developed after warming to the stages of larvae, pupae and imago was 40.1, 22.9 and 18.8%, respectively. Within the frames of the project supported by the U.S. Department of Agriculture the technology of mass cryopreservation of blowfly C. hominivorax embryos was developed, which provided preservation of up to 5,000 or more embryos in a single cycle [46–48]. To create low temperature bank for germplasm of blowfly and other Diptera it is necessary to develop an auto- mated cryopreservation protocol. The optimization of cryopreservation protocol for cotton moth Pectino- phora gossypiella embryos (Lepidoptera: Gelechii- dae) was also performed, according to which it was possible to omit the use of sodium hypochlorite before removing the chorion or at least to reduce its negative effect by supplementation of the medium with Tween 80 surfactant. This approach could also be used for an automated procedure for cryopreservation of Diptera embryos, e. g. blowfly. Moreover, a project ‘Develop- ment of a Robotic System for High Through-Put Insect Embryo Cryopreservation’ was started in 2011 to improve robotic system intended for cryopreservation of insect embryos, which is planned to test in M. do- mestica fly, Cochliomyia macellaria blowfly and green blowfly Lucilia sericata [45]. Cryopreservation of germplasm of Anopheles gambiae mosquito would facilitate the creation of the Anastrepha suspensa содержит ЭГ, ПЭГ и трегалозу. Стадии охлаждения и отогрева включают этапы проведения эмбрионов через пары жидкого азота. До 46,5% эмбрионов A. suspensa (Diptera: Tephri- tidae) выдерживают витрификацию и развиваются до стадии личинок [66], 29% этих личинок окукли- ваются, и из куколок вылупляются фертильные имаго. Еще один вид вредителей, эмбрионы которого удалось криоконсервировать, это мокрец Culicoi- des sonorensis (Diptera: Ceratopogonidae). Мок- рец C. sonorensis является переносчиком вируса африканской катаральной лихорадки и вызывает цератопогонидоз. Яйца C. sonorensis устойчивы к процедурам дехорионизации, пермеабилизации и насыщения ЭГ [38]. После этих этапов в среднем 80,3% обработанных эмбрионов развиваются до стадии личинки. Дегидратация в витрифицирую- щемся растворе снижает жизнеспособность эмб- рионов до 42,7%, после замораживания в жидком пропане число эмбрионов, развившихся до стадии личинки, куколки и имаго, составило 40,1, 22,9 и 18,8% соответственно. В рамках проекта Департамента сельского хо- зяйства США была создана технология массового криоконсервирования эмбрионов мясной мухи C. ho- minivorax, благодаря которой за один цикл можно законсервировать до 5000 эмбрионов и более [46– 48]. Для создания криобанка генетического ма- териала мясной мухи и других двукрылых необхо- дима разработка протокола автоматизированного криоконсервирования. Также был усовершенство- ван протокол криоконсервирования эмбрионов хлоп- ковой моли Pectinophora gossypiella (Lepidoptera: Gelechiidae), согласно которому гипохлорит натрия перед удалением хориона можно не использовать или, по крайней мере, снизить его отрицательное влияние добавлением в среду поверхностно-актив- ного вещества Tween 80. Этот подход можно также использовать и для процедуры автоматизирован- ного криоконсервирования эмбрионов двукрылых, например мясной мухи. Кроме того, в 2011 г. был начат проект «Разработка роботизированной сис- темы с высокой пропускной способностью для криоконсервирования эмбрионов насекомых» («De- velopment of a Robotic System for High Through-Put Insect Embryo Cryopreservation») по усовершенст- вованию роботизированной системы криоконсер- вирования эмбрионов насекомых, тестирование которой планируется на домашней мухе M. domes- tica, мясной мухе Cochliomyia macellaria и зеленой падальной мухе Lucilia sericata [45]. Криоконсервирование генетического материала комара Anopheles gambiae облегчило бы создание банка линий, неспособных к передаче малярии [21]. Интактные эмбрионы комара приблизительно в 50 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 215 bank of the lines incapable of transmitting malaria [21] Intact mosquito embryos were about 50 times more permeable for water vapors than Drosophila embryos. Therefore, during drying on air they can be dehydrated more effectively than Drosophila embryos at similar development stages. Permeability for water of de- chorionized A. gambiae embryos was many times higher than that found in D. melanogaster embryos. However, both intact and dechorionized mosquito emb- ryos were impermeable for EG [64]. Application of permeabilization protocol developed for Drosophila embryos resulted in 100% mortality of mosquito A. gambiae embryos [65]. The death of a part of the embryos was due to the influence of 50% solution of bleach and immersion into isopropanol resulted in death of all the mosquito embryos. Replacing of Clorox by 10% solution of sodium hypochlorite, also providing dechorionization of eggs, substantially reduced the toxicity of this stage. Toxic stage of plunging the eggs into isopropanol solution was replaced by air drying to remove surface water. This process was monitored microscopically and ceased when the embryo started to shrink. Such modified procedure of permeabilization allowed to get 30% survival rate of permeabilized A. gambiae embryos. There was also an attempt to cryopreserve the first instar larvae of A. gambiae [21], consisting of 81% water. Air drying allowed removing 90% of this water for about 20 minutes, but the larvae were not able to survive the loss of more than 70% of body water. At the same time, pre-exposure of larvae in 0.2 M tre- halose solution allowed to reach 63% survival at 75% water loss. Further increase in the trehalose concent- ration led to a decrease of survival rates. Similar results were obtained in case of using sucrose. There was no mechanism found, which underlie the protective effect of presence of sugars on the outer surface of the lar- vae. Moreover, there were no reports about successful cryopreservation of any insects in the larval stage. Cryopreservation of Lepidoptera germplasm The germplasm of Lepidoptera is also of interest for cryobiologists. There is a huge number of silkworm Bombix mori lines (Bombycidae: Lepidoptera), which are widely used for experimental purposes and the production of silk, which makes the issue of the pre- servation of the germplasm of this species highly rele- vant. Tamura and Sakate [60] succeded to freeze sperm of B. mori, but after storage in liquid nitrogen they lost their fertility. Since the ovaries of B. mori larvae could be successfully transplanted into ovari- ectomized caterpillars [62], the idea of low-tempe- rature storage of the silkworm gonads appeared. Ima- go ovarian discs were isolated from 5th instar larvae раз более проницаемы для водяных паров, чем эмб- рионы дрозофилы. Следовательно, при высушива- нии на воздухе они могут быть дегидратированы более эффективно, чем эмбрионы дрозофил на ана- логичных стадиях развития. Проницаемость для воды дехорионизированных эмбрионов A. gambiae многократно превышает данный показатель у эм- брионов D. melanogaster. Тем не менее как интакт- ные, так и дехорионизированные эмбрионы комара непроницаемы для ЭГ [64]. Применение протокола пермеабилизации, разработанного для эмбрионов дрозофилы, привело к 100%-й летальности эмбрио- нов малярийного комара A. gambiae [65]. Гибель некоторой части эмбрионов была вызвана воздей- ствием 50%-го раствора отбеливателя, а после по- гружения в изопропанол погибали все эмбрионы комара. При замене «Clorox» на 10%-й раствор гипохлорита натрия, который также осуществляет дехорионизацию яиц, существенно снижалась ток- сичность данного этапа. Токсичный этап погру- жения яиц в изопропанол был заменен их воздуш- ным высушиванием для удаления поверхностной воды. Этот процесс контролировали микроскопи- чески и прекращали, когда эмбрионы начинали сжи- маться. Такая модифицированная процедура пер- меабилизации позволила достичь 30%-й выживае- мости пермеабилизованных эмбрионов A. gambiae. Была также предпринята попытка криоконсер- вировать личинки первого возраста A. gambiae [21], которые состоят на 81% из воды. Высушивание на воздухе удаляет 90% этой воды примерно за 20 мин, однако личинки не способны пережить потерю бо- лее 70% воды тела. В то же время предваритель- ная экспозиция личинок в растворе 0,2 М трегалозы позволяла достичь выживаемости на уровне 63% при 75%-й потере воды. При дальнейшем увеличе- нии концентрации трегалозы показатели выживае- мости снижались. Аналогичные результаты были получены при применении сахарозы. Механизм, благодаря которому наличие сахаров на внешней поверхности личинок оказывает защитное дейст- вие, пока не изучен. Кроме того, отсутствуют со- общения о результатах успешного криоконсерви- рования каких-либо насекомых на стадии личинок. Криоконсервирование генетического ма- териала Чешуекрылых Генетический материал Чешуекрылых также является предметом изучения криобиологов. Существует огромное количество линий тутового шелкопряда Bombix mori (Bombycidae: Lepido- ptera), которые широко используются для экспери- ментальных целей и при производстве шелка, что делает вопрос о сохранении генетического мате- 216 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 and exposed in glycerol solutions of various concentra- tions, cooled thereafter with rate of 1 deg/min down to –35°C and stored in liquid nitrogen for at least 2 days and then thawed at a rate of 500 deg/min [15]. Post- thaw ovaries were transplanted into B. mori larvae of 5th instar. More than 20% of ovaries normally developed and produced mature eggs. After parthenogenetic acti- vation, embryogenesis began in these eggs. Depending on the recipient line hatchability varied from 10 to 50%. Hatched larvae completed post-embryonic develop- ment like the control individuals. Shinbo [51] used a similar protocol to cryopreserve B. mori ovaries and testes. The gonads were incubated in a series of solu- tions with increasing concentrations of glycerol (0.5, 1 and 1.5 M), then cooled with a rate of 1 deg/min down to –7°C, kept at this temperature for 10 min, then slowly cooled down to –35°C and plunged into liquid nitrogen. Thawing of the gonads occurred at 37°C. Post-thaw gonads were transplanted in preliminarily sterilized lar- vae of the same age as the donor individuals. After hatching of imago the males and females were mated with normal males and females. The experiments were coducted in larvae of 3rd, 4th and 5th instars. Up to 33.3 and up to 7.3% of the females, which underwent transplantation of cryopreserved ovaries from 4th and 5th instar larvae, respectively, produced fertilized eggs. Mochida et al. [32, 33] reported the development of a reliable method of long-term storage of B. mori ovaries. Ovaries were isolated from the caterpillars of 3rd, 4th and 5th instars and incubated in Grace's medium sup- plemented with 1.5 M DMSO, at room temperature for 10 min. Cryovials of 1.2 ml were filled with 120- 150 ovaries suspended in the cryopreservation medium, cooled in liquid nitrogen vapors for 30 minutes and plunged into liquid nitrogen. Immediately after thawing in a water bath at 37°C the ovaries were incubated in DMSO solutions of reducing concentrations (1.0, 0.5 and 0 M) for 10 min at room temperature. Post-thaw ovaries were transplanted into surgically sterilized ca- terpillar females of different ontogenic stages. It was found that the highest percentage of female recipients capable of oviposition, was achieved if larvae of 3rd instar were used as ovaries donors and recipients as well (22.1%). After natural mating the recipient but- terflies produced fertilized eggs. The results of cryopre- servation of testes were less successful [51]. Only in one case the oviposition was achieved in 9.1% of fe- males mated with the males which were transplanted with cryopreserved testes of 3rd instar larvae (the testes were frozen in a medium contained 1.5 M glycerol, in 0.5 ml plastic straws, cooling rate was 1 deg/min in range from 0 down to –7°C, then 10 min exposure at –7°C, and thereafter the cooling rate was 0.3 deg/min from –7 down to –35°C, followed by immersion in риала этого вида особенно актуальным. Tamura T. и Sakate S. [60] сообщили об удачном криоконсер- вировании сперматозоидов B. mori, однако после хранения в жидком азоте они утрачивали фертиль- ность. Поскольку яичники личинок B. mori могут быть успешно трансплантированы гусеницам, под- вергнутым овариэктомии [62], возникла идея низ- котемпературного хранения гонад тутового шелко- пряда. Овариальные имагиальные диски извлекали из гусениц 5 возраста и выдерживали в растворах глицерина различных концентраций, после чего ох- лаждали со скоростью 1 град/мин до –35°C и хранили в жидком азоте в течение, как минимум, 2 суток, а затем оттаивали со скоростью 500 град/мин [15]. Деконсервированные яичники трансплантировали личинкам B. mori 5 возраста. Более 20% яичников развивались нормально и продуцировали зрелые яйца. После партеногенетической активации в этих яйцах начинался эмбриогенез. В зависимости от линии реципиента вылупляемость составляла около 10 или 50%. Вылупившиеся личинки, как и конт- рольные особи, завершили постэмбриональное раз- витие. Shinbo Н. [51] использовал подобный прото- кол для криоконсервирования яичников и семенни- ков B. mori. Гонады инкубировали в серии раство- ров с повышающимися концентрациями глицерина (0,5, 1 и 1,5 М), затем охлаждали со скоростью 1 град/мин до –7°C, выдерживали при данной тем- пературе в течение 10 мин, медленно охлаждали до –35°C и погружали в жидкий азот. Оттаивание гонад происходило при 37°C. Деконсервированные гонады трансплантировали предварительно стери- лизованным личинкам такого же возраста, что и доноры. После вылупления имаго самки и самцы спаривались с нормальными самцами и самками. В экспериментах были использованы личинки 3, 4 и 5 возрастов. До 33,3 и 7,3% самок, которым были пересажены криоконсервированные яичники на стадии личинок 4 и 5 возрастов соответственно, отложили оплодотворенные яйца. Mochida Y. и соавт. [32, 33] сообщили о разработке надежного метода долговременного хранения яичников B. mori. Яичники извлекали из гусениц 3, 4 и 5 воз- растов и инкубировали в среде Грейса, содержащей 1,5 М ДМСО, при комнатной температуре в тече- ние 10 мин. В криопробирки объемом 1,2 мл поме- щали 120–150 яичников в виде суспензии в витри- фицирующейся среде, охлаждали их в парах жид- кого азота в течение 30 мин и погружали в жидкий азот. Непосредственно после оттаивания на водя- ной бане при 37°С яичники инкубировали в раство- рах ДМСО понижающихся концентраций (1,0, 0,5 и 0 М) в течение 10 мин при комнатной темпера- туре. Деконсервированные яичники транспланти- проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 217 liquid nitrogen). As a result of experiments with cryo- preservation of testes obtained from larvae of other ages and varying cooling rates within the range of –7 to –35°C the expected increase in the number of ferti- lized eggs were not achieved. Maybe, future success could be achieved by choosing proper cryopreservation solutions and freeze-thawing regimes. There are the reports about cryopreservation of silk-worm sperm. B. mori females artificially insemina- ted with sperm stored at –196°C for 356 days were able to oviposit, and the fertility rate and the number of eggs laid was almost the same as in normally mated butterflies [58]. As a cryoprotectant in the studies ser- ved 10% DMSO solution in Grace’s medium, which was added to an equal volume of semen. Then the sperm was frozen in 0.25 ml straws. To achieve a high post-thaw fertilizing ability of sperm the optimal cooling rate was reported to be within 5–65 deg/min. The authors proposed a simple and reliable method for cryopreservation: containers with sperm were pla- ced into a freezer (–80°C) for 10 minutes, then transfer- red to liquid nitrogen. When butterfly females of mu- tant line with white colored eggs (recessive mutation ‘white 2’) were fertilized with a mixture of frozen- thawed sperm from males with the gene of wild-type colored eggs (eggs of wild-type butterflies are dark brown) and non-frozen-thawed sperm from males carrying the allele ‘w-2’, butterflies produced mostly white and only a very small amount of dark brown eggs. These results suggest that there was a com- petition between the sperm during fertilization and that cooling down to –196°C significantly reduced the fertilizing ability of sperm. Some species of Lepidoptera constantly form apy- rene spermatozoa (sperm cells lacking nuclei), and the process of fertilization in B. mori requires the presence of apyrene and eupyrene (with normal haploid set of chromosomes) of sperm. It was found that eupirenous sperm tolerate cryopreservation procedure better than apirenous [59]. The silkworm female artificially fer- tilized with cryopreserved sperm showed the fertility rate ranged from 0 to 76.9%, depending on the line. Adding fresh semen from triploid males (infertile, but with apyrene spermatozoa in the semen) significantly increased the fertilizing ability of cryopreserved sperm of normal diploid males. Frozen-thawed apyrene sperm from triploid males also increased the fertility of females, fertilized with cryopreserved sperm of normal males, but to a lesser extent compared with fresh sperm of triploid males. Takemura et al. [59] recommend to add apyrene sperm of triploid donors as an auxiliary agent for cryopreserved semen during artificial insemi- nation, which can contribute in turning cryopreservation into a routine technology for genetic conservation of the silkworm. ровали стерилизованным хирургическим путем гусеницам-самкам на разных стадиях онтогенеза. Было установлено, что наиболее высокий процент самок-реципиентов, способных отложить яйца, был получен при использовании гусениц 3 возраста в качестве как доноров яичников, так и реципиентов (22,1%). После естественного спаривания бабочки- реципиенты откладывали оплодотворенные яйца. Результаты криоконсервирования семенников ока- зались менее успешными [51]. Только в одном ва- рианте удалось достичь того, чтобы 9,1% самок, спарившихся с самцами, которым были пересаже- ны криоконсервированные семенники на стадии личинок 3 возраста, отложили оплодотворенные яйца (семенники замораживали в среде, содержа- щей 1,5 М глицерина в пластиковых соломинках объемом 0,5 мл; скорость охлаждения составляла 1 град/мин от 0 до –7°С, экспозиция в течение 10 мин при –7°С, скорость охлаждения 0,3 град/мин от –7 до –35°C, затем образцы погружали в жидкий азот). В результате экспериментов с криоконсерви- рованием семенников, полученных от личинок других возрастов, и варьированием скоростей ох- лаждения на этапе от –7 до –35°C ожидаемого уве- личения количества отложенных оплодотворенных яиц получено не было. Возможно, в будущем удаст- ся добиться лучших результатов путем подбора криоконсервирующих растворов и режимов замора- живания-оттаивания. Имеются сообщения о криоконсервировании спер- матозоидов тутового шелкопряда. Самки B. mori, ко- торых искусственно оплодотворили сперматозои- дами, хравшимися при –196°С в течение 356 суток, были способны откладывать яйца, при этом пока- затель оплодотворяемости и число отложенных яиц практически не отличались от показателей нор- мально спаривавшихся бабочек [58]. В качестве криопротектора использовали 10% ДМСО в среде Грейса, который добавляли к равному объему спермы. Затем сперму замораживали в соломин- ках объемом 0,25 мл. Для достижения высокой оп- лодотворяющей способности спермиев оптималь- ная скорость охлаждения должна быть в пределах 5–65 град/мин. Авторы считают, что простой и на- дежный способ криоконсервирования следующий: контейнеры со спермой помещают в морозильную камеру (–80°С) на 10 мин, затем переносят в жид- кий азот. Когда самки бабочек мутантной линии с белым цветом яиц (рецессивная мутация «white 2») оплодотворяли смесью деконсервированной спермы от самцов с геном окраски яиц дикого типа (яйца бабочек дикого типа темно-коричневые) и незамороженной спермы от самцов, несущих ал- лель «w-2», бабочки откладывали в основном бе- лые яйца и лишь очень небольшое количество 218 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 Mochida et al. [32] also investigated the possibility of cryopreservation of silkworm sperm. Frozen-thawed sperm was used in artificial insemination of females developed from eggs produced by the females, that were the recipients of frozen-thawed ovaries in the most optimal variant of the experiment. Only a small number of fertilized butterflies produced eggs (8–0.3%) if compared to the control (100%). Furthermore, fertili- ty of eggs from experimental female was much lower than that of the control ones: 40.3–88 and 97.5%, res- pectively. In the next series of experiments the eggs were surgically excised from ovarioles of B. mori recipient female after transplantation of frozen-thawed ovaries and were subjected to parthenogenetic activa- tion followed by an artificial hatching. All obtained in such a way butterfly females were mated naturally or insemi-nated artificially with frozen-thawed sperm, giving a high yield of normal offspring in both cases. Cosi et al. [5] tested various protocols of dechorio- nization and permeabilization of wax moth Galleria mellonella eggs (Lepidoptera: Pyralidae), damaging the wax honeycomb, honey brood stocks, bee-bread, frames and heat insulation of beehives. The study was performed in early (24 h after oviposition) and late (72 h after oviposition) embryos. Lepidopteran eggs unlike eggs of Diptera are surrounded by outer pro- tective layers, that require a new approach for their dechorionization and permeabilization. After permeabi- lization with heptane G. mellonella hatchability was low: 0.1–4.2% in the early embryos and 4.3–11.2% in late ones. Replacement of heptane with a surfactant allowed to achieve better results. Exposure of eggs in 1.25% solution of NaOCl, containing 0,08% Tween 80 for 2 minutes, altered the permeability of egg en- veloppe, like did the 10 second-long exposure in heptane, according to the rate of eggs shrinkage, but the hatchability level was thereafter significantly higher: 68.2 ± 1.5 and 22.4 ± 3.7% for early and late embryos, respectively. One day old eggs of G. mellonella, dechorionized in sodium hypochlorite aqueous solution supplemented with Tween 80, were rapidly cooled by immersion into liquid nitrogen and stored at –140°C for 48 hours [49]. After the storage the survival rate was 0,6 ± 0,2%. 92.9% of the larvae hatched from cryopreserved eggs underwent metamorphosis and turned into fertile imago. Hatchability in the F1 and F2 generations was above 90%. Roversi et al. [49] succeded to create a colony of the descendants of butterflies hatched from cryopreserved eggs. The attempt to cryopreserve late (45–48 hour-old) cutworm Spodoptera exigua embryos (Lepidoptera: Noctuidae), being a pest of many agricultural and wild plants, was not successful [23]. Ethylene glycol was the least toxic to cutworm embryos compared with темно-коричневых. Эти результаты свидетельст- вуют о том, что существует конкуренция между спермиями при оплодотворении и что заморажи- вание до –196°С значительно снижает оплодотво- ряющую способность спермиев. У некоторых видов чешуекрылых постоянно об- разуются апиренные спермии (спермии, лишенные ядра), причем процесс оплодотворения у B. mori требует присутствия и апиренных и эупиренных (имеющих нормальный гаплоидный набор хромо- сом) спермиев. Было установлено, что эупиренные спермии переносят процедуру криоконсервиро- вания лучше, чем апиренные [59]. Самок шелкоп- ряда искусственно оплодотворяли криоконсервиро- ванными сперматозоидами, и фертильность опло- дотворенных самок составляла от 0 до 76,9% в зависимости от линии. Добавление свежей спермы от триплоидных самцов, которые являются бес- плодными и сперма которых содержит интактные апиренные сперматозоиды, значительно увеличи- вало оплодотворяющую способность криоконсер- вированных сперматозоидов нормальных диплоид- ных самцов. Замороженная апиренная сперма три- плоидных самцов также повышала плодовитость самок, оплодотворенных криоконсервированной спермой нормальных самцов, однако в меньшей степени по сравнению со свежей спермой триплоид- ных самцов. Takemura Y. и соавт. [59] рекомендуют добавлять апиренную сперму триплоидных доно- ров как вспомогательный агент к криоконсервиро- ванной сперме при искусственном оплодотворении, что может способствовать превращению криокон- сервирования в рутинную технологию сохранения генетических ресурсов тутового шелкопряда Mochida Y. и соавт. [32] также исследовали воз- можность криоконсервирования спермы тутового шелкопряда. Деконсервированной спермой ис- кусственно оплодотворяли самок, развившихся из яиц, отложенных самками-реципиентами деконсер- вированных яичников в наиболее оптимальном ва- рианте эксперимента. Только небольшое коли- чество оплодотворенных бабочек откладывало яйца (8–10,3%) по сравнению с контролем (100%). Кроме того, фертильность яиц экспериментальных самок была гораздо ниже, чем контрольных: 40,3– 88 и 97,5% соответственно. В следующей серии экспериментов яйца хирургически извлекали из ова- риол самок-реципиентов B. mori после трансплан- тации деконсервированных яичников и подвергали партеногенетической активации с последующим искусственным вылуплением. Всех полученных таким образом бабочек-самок спаривали естест- венным путем либо искусственно оплодотворяли деконсервированной спермой, что давало высокий выход нормального потомства в обоих случаях. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 219 other tested cryoprotectants (methanol, 1,3-propane- diol, glycerol, 2-amino-1-ethanol, 3-amino-1-propanol and 3-methoxy-1,2-propanediol) but the larvae hatched from frozen-thawed embryos were not able to feed and develop. Luo et al. [23] believed that this was due to the formation of crystals in the body of the late embryos with developed midgut. Cryopreservation of Hymenoptera germplasm Hymenoptera is another order of insects, some members of which are promising for the development of methods for low-temperature storage of their germpalsm. The number of bee colonies is reduced due to colony collapse syndrome and defeating by var- roa mites. Cryopreservation of honeybee germplasm becomes increasingly important because of the emer- gence of new pests and diseases that are not treatable with antibiotics. Bee embryos, like other insects are cold sensitive. Collins and Mazur [4] estimated the cold sensitivity of bee embryos of 24 to 62 hours of deve- lopment after exposure at 0, –6.6 and –15°C and showed that hatchability decreased sharply with dec- reasing temperature of exposure. The most stable in the conducted experiments were the 48 hour-old em- bryos. Using of genetic markers allowed to reveal that honey bee Apis mellifera L. sperm (Hymenoptera) can produce progeny after storage at –196°C in cryo- protective medium containing DMSO and egg yolk within 2 years [9]. Unlike many studies suggested that the period of storage in liquid nitrogen did not affect the final result, in this report, it has been suggested that the loss of viability may occur between day 4 and 2 years of storage. Nine of queen bees, fertilized by sperm stored during 4 days, produced 22% of worker bees (fertility ranged from 8 to 55%), while eight females, fertilized by sperm stored for 2 years produced 8% of worker bees (range from 1 to 25%). Survival after cryopreservation is usually presented as the mean percentage of survivors. Obviously, that even more important is fraction of samples with survival close to zero. A wide range of survival in this case served as an alert, and meant that there was a factor of cryo- preservation being at extremely dangerous level, or that there was an off-design change in the cryopre- servation protocol. In addition, the sample with extre- mely low survival prejudice the quality of the material stored in the repository on the whole. Taylor et al. [61] tested three cryoprotectants (DMSO, dimethyl acetamide and glycerol), six media and five variations of solvent/sperm ratio (1:1, 3:1, 6:1, 9:1 and 12:1) for purpose of enhancing the viability of honey bee A. mellifera sperm after freeze-thawing. Exposure in the medium of fresh sperm per se de- creased spermatozoa motility. Hypotonic antioxidant Cosi E. и соавт. [5] протестировали различные протоколы дехорионизации и пермеабилизации яиц восковой огневки Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae), повреждающей восковые соты, расплод, запасы мёда, пергу, рамки и утеплительный мате- риал ульев. В работе были использованы ранние (24 ч после откладки яиц) и поздние (72 ч после откладки яиц) эмбрионы. Яйца чешуекрылых, в отличие от яиц двукрылых, окружены наружными защитными слоями, что требует подбора новых подходов к их дехорионизации и пермеабилизации. После пермеа- билизации гептаном вылупляемость G. mellonella была низкой: 0,1–4,2% у ранних эмбрионов и 4,3– 11,2% у поздних. Замена гептана поверхностно- активным веществом позволила добиться лучших результатов. Экспозиция яиц в 1,25%-м растворе NaOCl, содержащем 0,08% Tween 80, в течение 2 мин изменяла проницаемость оболочек яйца, как и 10- секундная экспозиция в гептане, судя по степени сжатия яиц, но уровень вылупляемости после нее был достоверно выше: 68,2 ± 1,5 и 22,4 ± 3,7% для ранних и поздних эмбрионов соответственно. Однодневные яйца G. mellonella, дехориони- зированные в водном растворе гипохлорита натрия и Tween 80, быстро охлаждали погружением в жид- кий азот и хранили при –140°С в течение 48 ч [49]. После хранения выживаемость составила 0,6 ± 0,2%. Из тех личинок, которые вылупились из криокон- сервированных яиц, 92,9% прошли метаморфоз и превратились в фертильных имаго. Вылупляемость в поколениях F1 и F2 была выше 90%. Roversi P.F. и соавт. [49] удалось создать колонию из потомков ба- бочек, вылупившихся из криоконсервированных яиц. Попытка криоконсервировать поздние (45–48- часовые) эмбрионы совки наземной малой Spodo- ptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae), которая яв- ляется вредителем многих сельскохозяйственных и дикорастущих растений, не увенчалась успехом [23]. Этиленгликоль оказался наименее токсичен для эмбрионов совки по сравнению с другими про- тестированными криопротекторами (метанолом, 1,3-пропандиолом, глицерином, 2-амино-1-этано- лом, 3-амино-1-пропанолом и 3-метокси-1,2-про- пандиолом), однако личинки, вылупившиеся из деконсервированных эмбрионов, были не способны питаться и развиваться далее. Luo L. и соавт. [23] полагают, что это объясняется образованием крис- таллов в теле поздних эмбрионов, которые имеют сформированную среднюю кишку. Криоконсервирование генетического ма- териала Перепончатокрылых Перепончатокрылые – еще один отряд насеко- мых, некоторые представители которого являются перспективными объектами для разработки мето- 220 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 дов низкотемпературного хранения их репродук- тивных продуктов. Численность пчелиных колоний сокращается вследствие синдрома краха колоний и поражения клещами варроа. Криоконсервиро- вание генетического материала медоносных пчел приобретает большую актуальность из-за появле- ния новых паразитов и болезни, которая не под- дается лечению антибиотиками. Эмбрионы пчел, так же как и других насекомых, холодочувстви- тельны. Collins A.M. и Mazur P. [4] оценили холодо- чувствительность пчелиных эмбрионов между 24 и 62 ч развития после экспозиции при 0, –6,6 и –15°С и показали, что вылупляемость резко сни- жается с понижением температуры экспозиции. Наиболее устойчивыми в проведенных экспери- ментах оказались 48-часовые эмбрионы. При использовании генетических маркеров ус- тановлено, что сперматозоиды медоносной пчелы Apis mellifera L. (Hymenoptera) могут давать по- томство после хранения при –196°C в криозащит- ной среде, содержащей ДМСО и яичный желток в течение 2 лет [9]. В отличие от многих исследова- ний, свидетельствующих о том, что срок хранения в жидком азоте не влияет на конечный результат, в данной работе было высказано предположение, что потеря жизнеспособности может происходить между 4 сутками и 2 годами хранения. Девять пче- линых маток, оплодотворенных сперматозоидами, хранившимися в течение 4 суток, произвели 22% рабочих пчел (диапазон значений плодовитости 8– 55%), в то время как восемь маток, оплодотворен- ных сперматозоидами, хранившимися в течение 2 лет, произвели 8% рабочих пчел (диапазон 1–25%). Выживание после криоконсервирования обычно представляют как средний процент выживших особей. Очевидно, что даже более важна доля об- разцов с выживаемостью, близкой к нулевой. Широ- кий диапазон выживаемости в этом случае являет- ся тревожным сигналом и означает, что один из факторов криоконсервирования находится на пре- дельно опасном уровне либо произошло какое-то неучтенное изменение протокола криоконсервиро- вания. Кроме того, выборки с предельно низкой выживаемостью вообще ставят под сомнение ка- чество консервированного в хранилище материала. Taylor M.A. и соавт. [61] протестировали три криопротектора (ДМСО, диметилацетамид и гли- церин), шесть сред и пять вариантов соотношений растворитель/сперма (1:1, 3:1, 6:1, 9:1 и 12:1) с целью повысить жизнеспособность спермато- зоидов медоносной пчелы A. mellifera после замо- раживания-оттаивания. Сама по себе обработка средой свежей незамороженной спермы снижала подвижность сперматозоидов. Гипотоническая medium which contained highly diluted catalase and comprised DMSO allowed to reach the highest sperm viability (68.3 ± 5.4%). No differences in viability of sperm from different lines of bees were found. Kafta- noglu and Peng [13] reported an artificial insemination of 15 females with sperm frozen-thawed in the pre- sence of 10% DMSO and 3–4 deg/min cooling rate. Area occupied by juveniles obtained from surviving females was 345 ± 60 cm2. It should be noted that 47% yield of worker bees obtained from the queen bees fertilized with cryopreserved sperm indicated rather low level of fertilization performed in these conditions. Later, Hopkins and Herr [11] succeeded in achieving better results. Slow freezing under the protection of 10% DMSO and 3 deg/min cooling rate resulted in post-thaw viability of A. mellifera sperm of 93%, moreover the post-thaw motility did not differ from that of fresh sperm. This research group proposed an alternative method of freezing honey bee sper- matozoa which provided 93.13% viability of the sperm assessed by fluorescent dye staining [56]. Other tested in this study methods of cryopreservation were ranged by the efficiency which was expressed as percentage of viable cells assessed by fluorescent staining and made the following descending row: 1) slow cooling from 5 down to –40°C with rate of 3 deg/min and fol- lowing plunging into liquid nitrogen, DMSO as cryopro- tectants, resulting viability was 78.84%; 2) rapid cooling achieved by plunging of microglass cryostraws into liquid nitrogen accompanied with constant stirring to prevent the formation of vapor layer around straws, glycerol as cryoprotectant, resulting viability made 38.90%; and 3) slow cooling with glycerol as cryo- protectants resulted in 26% post-thaw viability. Since the females fertilized with semen, containing more than 50% of viable sperm, are highly probably to exhibit normal reproduction during the whole season, these results are of importance for beekeepers. Next stage of this research are the field experiments. Turnip sawfly Athalia rosae (Hymenoptera: Ten- thredinidae) is a dangerous pest of oilseed rape, turnip, cabbage and other cruciferae. Moreover, this insect is an extremely interesting object for research on the genetics of sex, since it is a representative of a unique group of animals for which arrhenotoky (a kind of haploidy when diploid females develop from fertilized eggs and haploid males do from unfertilized eggs) is the normal way of reproduction [39]. Hatakeyama and Sumitani [8] procured sperm from males of transgenic A. rosae line, carrying reporter genes of green fluores- cent protein (GFP), froze it in liquid nitrogen and stored thereafter at –80°C for a year. Thawed sperm was injected into mature unfertilized eggs isolated excised from the ovaries of wild-type females. Some of the проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 221 антиоксидантная среда, содержащая каталазу при сильном разведении в сочетании с ДМСО дала наилучшие результаты жизнеспособности сперма- тозоидов (68,3 ± 5,4%). Различий в жизнеспособ- ности сперматозоидов пчел различных линий обна- ружено не было. Kaftanoglu O. и Peng Y.S. [13] про- вели инструментальное оплодотворение 15 маток сперматозоидами, замороженными с 10% ДМСО со скоростью 3–4 град/мин. Площадь молоди от 13 выживших маток составила 345 ± 60 см2. Сле- дует отметить, что 47%-е производство рабочих пчел от пчелиных маток, оплодотворенных крио- консервированными сперматозоидами, указывает на достаточно низкий уровень оплодотворения в данных условиях. Позднее Hopkins B.K. и Herr C. [11] удалось добиться более высоких результатов. При медленном замораживании под защитой 10% ДМСО со скоростью 3 град/мин жизнеспособ- ность сперматозоидов A. mellifera достигала 93%, причем их подвижность после замораживания- оттаивания не отличалась от подвижности натив- ных сперматозоидов. Эта же исследовательская группа [56] предложила альтернативный способ замораживания сперматозоидов пчелы, с помощью которого им удалось достичь 93,13%-й жизнеспо- собности сперматозоидов по результатам окраши- вания флуоресцентными красителями. Другие протестированные в этой работе методы криокон- сервирования по своей эффективности, выражен- ной как доля жизнеспособных клеток при флуорес- центном окрашивании, располагаются в следую- щем порядке: 1) медленное охлаждение от 5 до –40°C со скоростью 3 град/мин с последующим погружением в жидкий азот и ДМСО в качестве криопротектора, жизнеспособность 78,84%; 2) быс- трое охлаждение, достигнутое погружением крио- соломинок из микростекла в жидкий азот при по- стоянном перемешивании для предотвращения образования прослойки пара вокруг соломинок, глицерин как криопротектор, жизнеспособность 38,90%; 3) медленное охлаждение, криопротектор глицерин, жизнеспособность 26%. Поскольку мат- ки, оплодотворенные спермой, содержащей более 50% жизнеспособных сперматозоидов, с высокой вероятностью способны к нормальному воспроиз- водству в течение сезона, данные результаты имеют большое значение для пчеловодов. Сле- дующим этапом исследований является проведе- ние экспериментов в полевых условиях. Рапсовый пилильщик Athalia rosae (Hymeno- ptera: Tenthredinidae) – опасный вредитель рапса, турнепса, капусты и других растений семейства крестоцветных. Кроме того, это чрезвычайно инте- ресный объект для исследований по генетике пола, eggs were fertilized and developed into diploid females expressing BFP. Haploid males descended from these females segregate to BFP-positive and for BFP-ne- gative individuals in 1:1 ratio, that indicated hetero- zygosity of the parental females and preservation of genetic markers for cryopreservation of semen. Cold could be used not only for the conservation of collections of different genetic lines, but for synchro- nization of insects development as well. This approach was used for the synchronization of flowering period of alfalfa Medicago sativa with the development of its pollinator, alfalfa leafcutter bee Megachile rotun- data (Hymenoptera: Megachilidae) [69]. The deve- lopment of pupae and pharate imago in late spring was interrupted by short low-temperature storage. Insects of three stages of ontogeny: pupae with pigmented eyes, pupae with the pigmented body and pharate imago, were subjected to exposure at 6, 12 or 18°C for 28 days. The insects of all the studied stages of deve- lopment collected in April and July survived the storage at 12 and 18°C during 14 days. The temperature of –18°C was the most optimal from the studied ones because the insects continued to develop slowly in these conditions. Storage at 6°C during 14 days signi- ficantly reduced the life span period of hatched bees. Conclusion It should be recognized that the cryopreservation of insect embryos was accompanied by appearance of much more problems than would be expected if compared to embryos of other taxa representatives. Over the past few years much has been achieved in the development of low-temperature storage methods of the germplasm of the orders Diptera, Lepidoptera and Hymenoptera. However, despite a number of publications in this field of research, the developed protocols are still insufficient to make the process of cryopreservation of insect reproductive cells routine. In addition, there is still a lot of unstudied species, both pests and laboratory research targets, germplam of which should be stored in a cryopreserved state. Creation of cryobanks of such products would solve many fundamental and applied problems of genetics, bee-keeping, sericulture and other areas. One can expect further improvement of automated cryopreser- vation of germplasm from the species that are already objects of research in this area, as well as the develop- ment of methods of cryopreservation of embryos and sperm from new and promising species and members of other orders. It should be noted that insect embryos nowadays are among the most complex biological objects cryopreservation of which is an accomplished fact. This could be important for cryobiology in general, since the obtained results imply that the multi-cellular 222 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 так как является представителем уникальной груп- пы животных, для которых арренотокия (разновид- ность гаплодиплоидии, когда диплоидные самки развиваются из оплодотворенных яиц, а гаплоид- ные самцы – из неоплодотворенных яиц) – нор- мальный способ воспроизводства [39]. Hatakeya- ma M. и Sumitani M. [8] получили сперматозоиды от самцов трансгенной линии A. rosae, несущей ре- портерные гены белка зеленой флуоресценции (БЗФ), и заморозили их в жидком азоте, после чего хранили при –80°С в течение года. Деконсервиро- ванные сперматозоиды вводили в зрелые неопло- дотворенные яйца, извлеченные из яичников самок дикого типа. Часть яиц была оплодотворена и разви- лась в диплоидных самок, экспрессирующих БЗФ. Гаплоидные самцы от этих самок сегрегировались на БЗФ-положительных и БЗФ-негативных особей в соотношении 1:1, что указывает на гетерозигот- ность родительских самок и сохранение генетичес- ких маркеров при криоконсервировании спермы. Холод можно использовать не только для сохра- нения коллекций различных генетических линий, но и для синхронизации развития насекомых. Такой подход использовали для синхронизации цветения люцерны Medicago sativa с развитием опылителей пчел-листорезов люцерновых Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae) [69]. Развитие куко- лок и фаратных имаго поздней весной прерывали кратковременным низкотемпературным хране- нием. Насекомые на трех стадиях онтогенеза – куколки с пигментом глаз, куколки с пигментом тела и фаратные имаго – были подвергнуты экспо- зиции при 6, 12 или 18°С в течение 28 суток. Все исследованные стадии развития «апрельских» и «июльских» пчел можно хранить при 12 и 18°С в течение 14 суток без снижения выживаемости. Из всех протестированных температур наиболее оп- тимальной была 18°С, поскольку в этих условиях насекомые продолжают медленно развиваться. Хранение при 6°С в течение 14 суток существенно снижало продолжительность жизни вылупившихся пчел. Заключение Следует признать, что при криоконсервирова- нии эмбрионов насекомых возникло больше проб- лем, чем можно было ожидать в сравнении с эмб- рионами представителей других таксонов. За по- следние годы были достигнуты значительные результаты в разработке низкотемпературных ме- тодов хранения генетического материала отрядов двукрылых, чешуекрылых и перепончатокрылых. Тем не менее, несмотря на множество публикаций в этом направлении исследований, разработанные differentiated systems per se are not an insurmoun- table obstacle for the development of cryopreservation methods. References 1. Anderson K.V., Lengyel J.A. Changing rates of DNA and RNA synthesis in Drosophila embryos // Dev. Biol. – 1981. – Vol. 82, N1. – P.127–138. 2. AQUAGAMETE COST European Cooperation in Science and Technology Fish reproductive biology and biotechnology Fish Physiology and Genomics laboratory Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) [Electronic document] // [web- site] http://aquagamete.webs.upv.es/france/ (accessed on 24.04 2013). 3. Cantwell G.E., Nappi A.J. Stoffolano J.G. Embryonic and postembryonic development of the house fly (Musca domestica L.) Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Washington, DC. – 1976. – 69 p. 4. Collins A.M., Mazur P. Chill sensitivity of honey bee, Apis melli- fera, embryos // Cryobiology. – 2006. – Vol.53, N1. – P. 22–27. 5. Cosi E., Abidala M.T., Roversi P.F. The effect of Tween80 on eggshell permeabilization in Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera, Pyralidae) // Cryo-Letters. – 2010. – Vol. 31, N4. – P. 291–300. 6. Davisson M. FIMRe: Federation of International Mouse Resour- ces: global networking of resource centers // Mamm. genome – 2006. – Vol. 17, N5. – P. 363–364. 7. Gulevsky A.K., Relina L.I. Molecular and genetic aspects of protein cold denaturation // Cryo-Letters. – 2013. – Vol. 34, N1. – P. 62–82. 8. Hatakeyama M., Sumitani M. Preservation of a transgenic strain of the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera) by artificial fer- tilization using cryopreserved sperm // Insect Mol. Biol. – Vol. 14, N1. – P. 105–109. 9. Harbo J.R. Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa after two years in liquid nitrogen (–196°C) // Ann. Entomol. Soc. Am. – 1983. – Vol. 76, N 5. – P. 890–891. 10.Holler T.C., Davidson J.L., Suarez A., Garsia R. Release of sterile Mexican fruit flies for control of feral populations in the Rio Grande Valley of Texas and Mexico // J. Rio Grande Valley Hort. Soc. – 1984. – Vol.37 – P. 113–121. 11. Hopkins B.K., Herr C. Factors affecting the successful cryo- preservation of honey bee (Apis mellifera) spermatozoa // Apidologie. – 2010. – Vol. 41, Issue 5. –P. 548–556. 12. Houle D., Kondrashov A.S., Yampolsky L.Y. et al. The effect of cryopreservation on the lethal mutation rate in Drosophila melanogaster // Genet. Res. – 1997. – Vol.69, N 3. – P. 209– 213. 13.Kaftanoglu O., Peng Y.S. Preservation of honeybee sper- matozoa in liquid nitrogen // J. Apicult. Res.– 2012. – Vol. 23, N3. – P. 157–163. 14. Karja N.M., Otoi T., Wongstrikeao P. et al. In vitro development and post–thaw survival of blastocysts derived from delipidated zygotes from domestic cats // Theriogenology. – 2006. – Vol.65, N2. – P. 415–423. 15. Kusuda J., Noguchi T., Onimaru K., Yamashita O. Maturation and hatching of eggs from silkworm ovaries preserved in liquid nitrogen // J. Insect Physiol. – 1985. – Vol.31, N12. – P. 963–967. 16. Leopold R.A. Cold storage of insects: using cryopreservation and dormancy as an aid to mass rearing // Area-wide control of insect pests integrating the sterile insect and related nuclear and other techniques. FAO/IAEA International Conference, Penang, Malaysia. 1998. – P. 235–267. 17. Leopold R.A., Atkinson P.W. Cryopreservation of sheep blow fly embryos, Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) // Cryo- Letters. – 1999. – Vol. 20, N1. – P. 37–44. 18.Leopold R.A., Rinehart J.P. A template for insect cryopre- servation // Low Temperature Biology of Insect / Ed. by D.L. Denlinger, R.E. Lee. – Cambridge: University Press, 2010. – P. 325–341. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 223 протоколы все же являются недостаточно эффек- тивными для перевода процедуры криоконсерви- рования репродуктивных клеток насекомых на ру- тинную основу. Кроме того, остается еще множест- во неисследованных видов как вредителей, так и объектов лабораторных исследований, репродук- тивные продукты которых целесообразно хранить в криоконсервированном виде. Создание криобан- ков таких продуктов решило бы многие фундамен- тальные и прикладные проблемы генетики, пчело- водства, шелководства и других областей. Можно ожидать как дальнейшего усовершенствования систем автоматизированного криоконсервирования генетического материала видов, которые уже яв- ляются объектами исследований в этой области, так и разработки методов криоконсервирования эмбрионов и сперматозоидов новых перспектив- ных видов и представителей других отрядов. Следует отметить, что эмбрионы насекомых на сегодняшний день являются одними из самых сложных биообъектов, которые удалось криокон- сервировать. Данный факт может иметь важное значение для криобиологии в целом, так как из полученных результатов следует, что многокле- точные дифференцированные системы per se не являются непреодолимым препятствием для раз- работки методов криоконсервирования. Литература 1. Anderson K.V., Lengyel J.A. Changing rates of DNA and RNA synthesis in Drosophila embryos // Dev. Biol. – 1981. – Vol. 82, №1. – P.127–138. 2. AQUAGAMETE COST European Cooperation in Science and Technology Fish reproductive biology and biotechnology Fish Physiology and Genomics laboratory Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) [Электронный документ] // [веб-сайт] http://aquagamete.webs.upv.es/france/ (24.04 2013). 3. Cantwell G.E., Nappi A.J. Stoffolano J.G. Embryonic and postembryonic development of the house fly (Musca domestica L.) Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture, Washington, DC. – 1976. – 69 p. 4. Collins A.M., Mazur P. Chill sensitivity of honey bee, Apis melli- fera, embryos // Cryobiology. – 2006. – Vol.53, №1. – P. 22–27. 5. Cosi E., Abidala M.T., Roversi P.F. The effect of Twee№80 on eggshell permeabilization in Galleria mellonella (L.) (Lepi- doptera, Pyralidae) // CryoLetters. – 2010. – Vol. 31, №4. – P. 291–300. 6. Davisson M. FIMRe: Federation of International Mouse Resour- ces: global networking of resource centers // Mamm. genome – 2006. – Vol. 17, №5. – P. 363–364. 7. Gulevsky A.K., Relina L.I. Molecular and genetic aspects of protein cold denaturation // CryoLetters. – 2013. – Vol. 34, №1. – P. 62–82. 8. Hatakeyama M., Sumitani M. Preservation of a transgenic strain of the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera) by artificial fer- tilization using cryopreserved sperm // Insect Mol. Biol. – Vol. 14, №1. – P. 105–109. 9. Harbo J.R. Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa after two years in liquid nitrogen (–196°C) // Ann. Entomol. Soc. Am. – 1983. – Vol. 76, N 5. – P. 890–891. 19.Leopold R.A., Wang W.B., Berkebile D.R., Freeman T.P. Cryopreservation of embryos of the New World screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) // Ann. Entomol. Soc. Amer. – 2001. – Vol. 94, N5. – P. 695–701. 20. Limbourg B., Zalokar M. Permeabilization of Drosophila eggs // Dev. Biol. – 1973. – Vol. 35, N2. – P. 382–377. 21. Liu X.H., Mazur P. Effects of sugars on the kinetics of drying and on the survival of partially dehydrated larvae of Anopheles mosquitoes // J. Insect Physiol. – 2003. – Vol. 49, N7. – P. 685–695. 22.Liu X.H., Zhang T., Rawson T.M. Effect of cooling rate and partial removing of yolk on the chilling injury in zebrafish (Danio rerio) embryos // Theriogenology. – 2001. – Vol.55, N8. – P. 1719–1731. 23.Luo L., Pang Y., Chen Q., Li G. Cryopreservation of the late stage embryos of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noc- tuidae) // Cryo-Letters. – 2006. – Vol.27, N6. – P. 341–352. 24.Lynch D.V., Lin T.T., Myers S.P. et al. A two-step method for permeabilization of Drosophila eggs // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, N5. – P. 445–452. 25.Mazur P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophys. – 1990. – Vol. 17, N1. – P. 53–92. 26. Mazur P., Cole K.W., Hall J.W. et al. Cryobiological preservation of Drosophila embryos // Science. – 1992. – Vol. 258, N5090. – P. 1932–1935. 27.Mazur P, Cole K.W., Mahowald A.P. Critical factors affecting the premeabilization of Drosophila embryos by alkanes // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, N2. – P.210–239. 28.Mazur P., Cole K.W., Schreuders P.D., Mahowald A.P. Contri- butions of cooling and warming rate and developmental stage to the survival of Drosophila embryos cooled to –205°C // Cryo- biology. – 1993. – Vol. 30, N1 . – P. 45–73. 29.Mazur P., Leibo S.P., Seidel G.E.Jr. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status and future directions // Biol. Reprod. – 2008. – Vol. 78, N1. – P.1–12. 30.Mazur P., Schneider U., Mahowald A.P. Characteristics and kinetics of subzero chilling injury in Drosophila embryos // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, N1. – P. 39–68. 31.McGrath J.J. Cold shock: thermoelastic stress in chilled bio- logical membranes // Network thermodynamics, heat and mass transfer in biotechnology / Ed. by K.R. Diller. – New York: American Society of Mechanical Engineers, 1987. – P. 57–66. 32.Mochida Y., Takemura Y., Kanda T., Horie Y. Fertilized eggs obtained from transplantation of frozen ovaries and par- thenogenesis in combination with artificial insemination of frozen semen of the silkworm, Bombyx mori // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46, N2. – P. 153–160. 33.Mochida Y., Takemura Y., Ohnuma A. et al. Fertilization of eggs developed from the cryopreserved and transplanted ovaries by artificial insemination with cryopreserved semen in the silkworm, Bombyx mori // J. Insect Biotechnol. Sericol. – 2007. – Vol. 76, N2. – P. 97–100. 34.Myers S.P., Lynch D.V., Knipple D.C. et al. Low-temperature sensitivity of Drosophila melanogaster embryos // Cryobiolo- gy. – 1988. – Vol.25, N6 – P. 544–545. 35.Myers S.P., Pitt R.E., Lynch D.V., Steponkus P.L. Charac- terization of intracellular ice formation in Drosophila melano- gaster embryos // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, N5. – P. 472– 484. 36.Myers S.P., Steponkus P.L. Subzero chilling sensitivity of Drosophila melanogaster embryos // Cryobiology. – 1990. – Vol. 27, N6. – P. 651–652. 37.National Project Peproductive Cryobank (Omaha's Henry Doorly Zoo & Aquarium) [Electronic document] // [web-site] http://www.omahazoo.com/conservation/reproductive- sciences/national-projects/reproductive-cryobank (accessed on 24.04 2013). 38. Nunamaker R.A., Lockwood J.A. Cryopreservation of embryos of Culicoides sonorensis (Diptera: Ceratopogonidae) // J. Med. Entomol. – 2001. – Vol. 38, N1. – P. 55–58. 39. Oishi K., Sawa M., Hatakeyama M., Kageyama Y. Genetics and biology of the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera) // Ge- netica.– 1993. – Vol. 88, N2–3. – P.119–127. 224 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 10. Holler T.C., Davidson J.L., Suarez A., Garsia R. Release of sterile Mexican fruit flies for control of feral populations in the Rio Grande Valley of Texas and Mexico // J. Rio Grande Valley Hort. Soc. – 1984. – Vol.37 – P. 113–121. 11. Hopkins B.K., Herr C. Factors affecting the successful cryo- preservation of honey bee (Apis mellifera) spermatozoa // Apidologie. – 2010. – Vol. 41, Issue 5. – P. 548–556. 12. Houle D., Kondrashov A.S., Yampolsky L.Y. et al. The effect of cryopreservation on the lethal mutation rate in Drosophila melanogaster // Genet. Res. – 1997. – Vol.69, N 3. – P. 209–213. 13.Kaftanoglu O., Peng Y.S. Preservation of honeybee sper- matozoa in liquid nitrogen // J. Apicult. Res.– 2012. – Vol. 23, №3. – P. 157–163. 14. Karja N.M., Otoi T., Wongstrikeao P. et al. In vitro development and post–thaw survival of blastocysts derived from delipidated zygotes from domestic cats // Theriogenology. – 2006. – Vol.65, №2. – P. 415–423. 15. Kusuda J., Noguchi T., Onimaru K., Yamashita O. Maturation and hatching of eggs from silkworm ovaries preserved in liquid nitrogen // J. Insect Physiol. – 1985. – Vol.31, №12. – P. 963–967. 16. Leopold R.A. Cold storage of insects: using cryopreservation and dormancy as an aid to mass rearing // Area-wide control of insect pests integrating the sterile insect and related nuclear and other techniques. FAO/IAEA International Conference, Penang, Malaysia. – 1998. – P. 235–267. 17. Leopold R.A., Atkinson P.W. Cryopreservation of sheep blow fly embryos, Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) // Cryo- Letters. – 1999. – Vol. 20, №1. – P. 37–44. 18.Leopold R.A., Rinehart J.P. A template for insect cryopreser- vation // Low Temperature Biology of Insect / Ed. by D.L. Denlinger, R.E. Lee. – Cambridge: University Press, 2010. – P. 325–341. 19.Leopold R.A., Wang W.B., Berkebile D.R., Freeman T.P. Cryopreservation of embryos of the New World screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) // Ann. Entomol. Soc. Amer. – 2001. – Vol. 94, №5. – P. 695–701. 20. Limbourg B., Zalokar M. Permeabilization of Drosophila eggs // Dev. Biol. – 1973. – Vol. 35, №2. – P. 382–377. 21. Liu X.H., Mazur P. Effects of sugars on the kinetics of drying and on the survival of partially dehydrated larvae of Anopheles mosquitoes // J. Insect Physiol. – 2003. – Vol. 49, №7. – P. 685–695. 22.Liu X.H., Zhang T., Rawson T.M. Effect of cooling rate and partial removing of yolk on the chilling injury in zebrafish (Danio rerio) embryos // Theriogenology. – 2001. – Vol.55, №8. – P. 1719–1731. 23.Luo L., Pang Y., Chen Q., Li G. Cryopreservation of the late stage embryos of Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noc- tuidae) // CryoLetters. – 2006. – Vol.27, №6. – P. 341–352. 24.Lynch D.V., Lin T.T., Myers S.P. et al. A two-step method for permeabilization of Drosophila eggs // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, №5. – P. 445–452. 25.Mazur P. Equilibrium, quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophys. – 1990. – Vol. 17, №1. – P. 53–92. 26. Mazur P., Cole K.W., Hall J.W. et al. Cryobiological preservation of Drosophila embryos // Science. – 1992. – Vol. 258, №5090. – P. 1932–1935. 27.Mazur P, Cole K.W., Mahowald A.P. Critical factors affecting the premeabilization of Drosophila embryos by alkanes // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, №2. – P.210–239. 28.Mazur P., Cole K.W., Schreuders P.D., Mahowald A.P. Contri- butions of cooling and warming rate and developmental stage to the survival of Drosophila embryos cooled to –205°C // Cryobiology. – 1993. – Vol. 30, №1. – P. 45–73. 29.Mazur P., Leibo S.P., Seidel G.E. Jr. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status and future directions // Biol. Reprod. – 2008. – Vol. 78, №1. – P.1–12. 30.Mazur P., Schneider U., Mahowald A.P. Characteristics and kinetics of subzero chilling injury in Drosophila embryos // Cryobiology. – 1992. – Vol. 29, №1. – P. 39–68. 31.McGrath J.J. Cold shock: thermoelastic stress in chilled bio- logical membranes // Network thermodynamics, heat and mass 40. Papassideri I., Margaritis L.H., Gulik-Krzywicki T. The eggshell of Drosophila melanogaster VI. Structural analysis of the wax layer in laid eggs // Tissue Cell. – 1991. – Vol. 23, N4. – P. 567–575. 41. Rall W.F., Meyer T.K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos // Theriogenology. – 1989. – Vol. 31, N3. – P.683–692. 42. Rajamohan A., Leopold R.A. Cryopreservation of Mexican fruit flies by vitrification stage selection and avoidance of thermal stress // Cryobiology. – 2007. – Vol. 54, N1. – P. 44–54. 43.Rajamohan A., Leopold R.A., Wang W.B. et al. Cryopre- servation of Mediterranean fruit fly embryos // Cryo-Letters. – 2003. – Vol. 24, N2. – P. 125–132. 44.RDA-Genebank Information Center, Republic of Korea (Silk- worm breeding lab., Sericulture & Apiculture Division, Department of Sericulture and Entomology) [Electronic document] // [web-site] [http://www.genebank.go.kr/eng/ silkworm/introduction.jsp] (accessed on 24.04 2013). 45. Research Project: Development of A Robotic System for High Through-Put Insect Embryo Cryopreservation (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442-21220-027-04) [Electronic document] // [web- site] http://www.ars.usda.gov/research/projects/projects. htm?accn_no=421831 (accessed on 09.11 2012). 46.Research Project: Development of Cold Storage Technology for Mass-Reared and Laboratory-Colonized Insects (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442-22000-040-00) [Electronic document] /// [web-site] http://www.ars.usda.gov/research/projects/ projects.htm?accn_no=409603 (accessed on 09.11 2012). 47.Research Project: Evaluation of a Mass-Cryopreservation System for Insect Embryos (United States Department of Agri- culture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442- 21220-027-02) [Electronic document] // [web-site] http:// www.abadrl.ars.usda.gov/research/projects/projects.htm? ACCN_NO=414373] (accessed on 09.11 2012). 48.Research Project: Insect Cryopreservation, Dormancy, Genetics and Biochemistry (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research Project Number: 5442- 21220-027-00) [Electronic document] // [web-site] http:// www.larrl.ars.usda.gov/research/projects/projects.htm? ACCN_NO=421077 (accessed on 09.11 2012). 49.Roversi P.F., Cosi E., Irdani T. Chill sensitivity and cryopreser- vation of eggs of the great wax moth Galleria mellonella (Lepi- doptera, Pyralidae) // Cryobiology. – 2008. – Vol. 56, N1. – P. 1–7. 50.Schierenberg E. Developmental strategies during early embryo- genesis of Caenorhabditis elegans // J. Embryol. Exp. Mor- phol. – 1986. – Vol. 97. – P. 31–44. 51.Shinbo H. Survival of larval ovaries and testes frozen in liquid nitrogen in the silkworm, Bombyx mori // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, N4. – P.389–396. 52.Sonnenblick B.P. The early embryology of Drosophila melano- gaster // Biology of Drosophila / Ed. by M. Demerec. – New York: Hafner, Wiley and Son, 1965. – P. 62–167. 53.Spradbery J.P. A manual for the diagnosis of screwworm fly. – Canberra: CSIRO Division of Entomology. – 1991. – 19 p. 54.Steponkus P.L., Caldwell S. An optimized procedure for the cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos // Cryo- Letters. – 1993. – Vol.14, N6. – P. 375–380. 55.Steponkus P.L., Myers S.P., Lynch D.V. et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos // Nature. – 1990. – Vol. 345, N6271. – P. 170–172. 56.Stucky M., Hopkins B.K., Herr C. Cryopreservation of Honey Bee Spermatozoa // The 34th Annual IETS conference. – Denver, Colorado, 2008. – Р. 94. 57.Sulston J.E., Schierenberg E., White J.G., Thomson J.N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis ele- gans // Dev. Biol. – 1983 – Vol.100, N1. – P. 64–119. 58.Takemura Y., Kanda T., Horie Y. Artificial insemination using cryopreserved sperm in the silkworm, Bombyx mori // J. Insect Physiol. – 2000. – Vol. 46, N4. – P. 491–497. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 225 transfer in biotechnology / Ed. by K.R. Diller. – New York: American Society of Mechanical Engineers, 1987. – P. 57–66. 32.Mochida Y., Takemura Y., Kanda T., Horie Y. Fertilized eggs obtained from transplantation of frozen ovaries and par- thenogenesis in combination with artificial insemination of frozen semen of the silkworm, Bombyx mori // Cryobiology. – 2003. – Vol. 46, №2. – P. 153–160. 33.Mochida Y., Takemura Y., Ohnuma A. et al. Fertilization of eggs developed from the cryopreserved and transplanted ovaries by artificial insemination with cryopreserved semen in the silkworm, Bombyx mori // J. Insect Biotechnol. Sericol. – 2007. – Vol. 76, №2. – P. 97–100. 34.Myers S.P., Lynch D.V., Knipple D.C. et al. Low-temperature sensitivity of Drosophila melanogaster embryos // Cryobiolo- gy. – 1988. – Vol.25, №6 – P. 544–545. 35.Myers S.P., Pitt R.E., Lynch D.V., Steponkus P.L. Characteri- zation of intracellular ice formation in Drosophila melanogaster embryos // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, №5. – P. 472–484. 36. Myers, S.P., Steponkus P.L. Subzero chilling sensitivity of Drosophila melanogaster embryos // Cryobiology. – 1990. – Vol. 27, №6. – P. 651–652. 37.National Project Peproductive Cryobank (Omaha's Henry Doorly Zoo & Aquarium) [Электронный документ] // [веб-сайт] http:///www.omahazoo.com/conservation/reproductive- sciences/national-projects/reproductive-cryobank] (24.04 2013). 38. Nunamaker R.A., Lockwood J.A. Cryopreservation of embryos of Culicoides sonorensis (Diptera: Ceratopogonidae) // J. Med. Entomol. – 2001. – Vol. 38, №1. – P. 55–58. 39. Oishi K., Sawa M., Hatakeyama M., Kageyama Y. Genetics and biology of the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera) // Ge- netica .– 1993. – Vol. 88, №2–3. – P. 119–127. 40. Papassideri I., Margaritis L.H., Gulik-Krzywicki T. The eggshell of Drosophila melanogaster VI. Structural analysis of the wax layer in laid eggs // Tissue Cell. – 1991. – Vol. 23, №4. – P. 567–575. 41. Rall W.F., Meyer T.K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos // Theriogenology. – 1989. – Vol. 31, №3. – P.683–692. 42. Rajamohan A., Leopold R.A. Cryopreservation of Mexican fruit flies by vitrification stage selection and avoidance of thermal stress // Cryobiology. – 2007. – Vol. 54, №1. – P. 44–54. 43.Rajamohan A., Leopold R.A., Wang W.B. et al. Cryopre- servation of Mediterranean fruit fly embryos // CryoLetters. – 2003. – Vol. 24, №2. – P. 125–132. 44.RDA-Genebank Information Center, Republic of Korea (Silk- worm breeding lab., Sericulture & Apiculture Division, Department of Sericulture and Entomology) [Electronic document] // [web-site] [http://www.genebank.go.kr/eng/ silkworm/introduction.jsp] (accessed on 24.04 2013). 45. Research Project: Development of A Robotic System for High Through-Put Insect Embryo Cryopreservation (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442-21220-027-04) [Электронный документ] // [веб-сайт] http://www.ars.usda.gov/research/projects/ projects. htm?accn_no=421831 (09.11 2012). 46.Research Project: Development of Cold Storage Technology for Mass-Reared and Laboratory-Colonized Insects (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442-22000-040-00) [Электронный доку- мент] // [веб-сайт] http://www.ars.usda.gov/research/ projects/projects.htm?accn_no=409603 (09.11 2012). 47.Research Project: Evaluation of a Mass-Cryopreservation System for Insect Embryos (United States Department of Agri- culture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research, Project Number: 5442- 21220-027-02) [Электронный документ] // [веб-сайт] http://www.abadrl.ars.usda.gov/research/projects/projects. htm?ACCN_NO=414373] (09.11 2012). 48.Research Project: Insect Cryopreservation, Dormancy, Genetics and Biochemistry (United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service; Location: Insect Genetics and Biochemistry Research Project Number: 5442- 59.Takemura Y., Sahara K., Mochida Y., Ohnuma A. Apyrene sperm from the triploid donors restore fecundity of cryo- preserved semen in Bombyx mori // J. Insect Physiol. – 2006. – Vol. 52, N10. – P. 1021–1026. 60.Tamura T., Sakate S. Preservation of spermatozoa of the silk- worm, Bombyx mori, by freezing // Acta Sericologica. – 1985. – Vol. 13. – P. 123–128. 61.Taylor M.A., Guzman-Novoa E., Morfin N., Buhr M.M. Improving viability of cryopreserved honey bee (Apis mellifera L.) sperm with selected diluents, cryoprotectants, and semen dilution ratios // Theriogenology. – 2009. – Vol. 72, N2. – P. 149–159. 62.Umeya Y. Morphological study on ovarian transplantation in the silkworm, Bombyx mori // Zool. Magaz. Japan. – 1933. – Vol. 45, N2. – P. 59–66. 63. Ushijima H., Yamakawa H., Nagashima H. Cryopreservation of bovine pre-morula stage in vitro matured/in vitro fertilized embryos after delipidation and before use in nucleus transfer // Biol. Reprod. – 1999. – Vol.60, N2. – P. 534–539. 64. Valencia M.D., Miller L.H., Mazur P. Permeability of intact and dechorionated eggs of the Anopheles mosquito to water vapor and liquid water: a comparison with Drosophila // Cryobiology.– 1996. – Vol. 33, N1. – P. 142–148. 65. Valencia M.D., Miller L.H., Mazur P. Permeabilization of eggs of the malaria mosquito Anopheles gambiae // Cryobiology. – 1996. – Vol. 33, N1. – P. 149–162. 66.Wang W.B., Leopold R.A., Freeman T.P. Cryopreservation of Dipteran embryos // Cryobiology. – 2000. – Vol. 41, N4. – P. 349–350. 67.Wang W.B., Leopold R.A., Nelson D.R., Freeman T.P. Cryo- preservation of Musca domestica (Diptera: Muscidae) emb- ryos // Cryobiology. – 2000. – Vol. 41, N2. – P. 153–166. 68.Wyss J.H. Screwworm eradication in the Americas // Ann. NY Acad. Sci. – 2000. – Vol. 916. – P. 186–193. 69.Yocum G.D., Rinehart J.P., West M., Kemp W.P. Interrupted in- cubation and short-term storage of the alfalfa pollinator Me- gachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae): a potential tool for synchronizing bees with bloom // J. Econ. Entomol. – 2010. – Vol.103, N2. – P. 234–241. 226 проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 21220-027-00) [Электронный документ] // [веб-сайт] http://www.larrl.ars.usda.gov/research/projects/projects. htm?ACCN_NO=421077 (09.11 2012). 49.Roversi P.F., Cosi E., Irdani T. Chill sensitivity and cryo- preservation of eggs of the great wax moth Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae) // Cryobiology. – 2008. – Vol. 56, №1. – P. 1–7. 50.Schierenberg E. Developmental strategies during early embryo- genesis of Caenorhabditis elegans // J. Embryol. Exp. Mor- phol. – 1986. – Vol. 97. – P. 31–44. 51.Shinbo H. Survival of larval ovaries and testes frozen in liquid nitrogen in the silkworm, Bombyx mori // Cryobiology. – 1989. – Vol. 26, №4. – P.389–396. 52.Sonnenblick B.P. The early embryology of Drosophila melano- gaster // Biology of Drosophila / Ed. by M. Demerec. – New York: Hafner, Wiley and Son, 1965. – P. 62–167. 53.Spradbery J.P. A manual for the diagnosis of screwworm fly. – Canberra: CSIRO Division of Entomology. – 1991. – 19 p. 54.Steponkus P.L., Caldwell S. An optimized procedure for the cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos // Cryo- Letters. – 1993. – Vol.14, №6. – P. 375–380. 55.Steponkus P.L., Myers S.P., Lynch D.V. et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos // Nature. – 1990. – Vol. 345, №6271. – P. 170–172. 56.Stucky M., Hopkins B.K., Herr C. Cryopreservation of Honey Bee Spermatozoa // The 34th Annual IETS conference. – Denver, Colorado, 2008. – Р. 94. 57.Sulston J.E., Schierenberg E., White J.G., Thomson J.N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis ele- gans // Dev. Biol. – 1983 – Vol.100, №1. – P. 64–119. 58.Takemura Y., Kanda T., Horie Y. Artificial insemination using cryopreserved sperm in the silkworm, Bombyx mori // J. Insect Physiol. – 2000. – Vol. 46, №4. – P. 491–497. 59.Takemura Y., Sahara K., Mochida Y., Ohnuma A. Apyrene sperm from the triploid donors restore fecundity of cryo- preserved semen in Bombyx mori // J. Insect Physiol. – 2006. – Vol. 52, №10. – P. 1021–1026. 60.Tamura T., Sakate S. Preservation of spermatozoa of the silk- worm, Bombyx mori, by freezing // Acta Sericologica. – 1985. – Vol. 13. – P. 123–128. 61.Taylor M.A., Guzman-Novoa E., Morfin N., Buhr M.M. Improving viability of cryopreserved honey bee (Apis mellifera L.) sperm with selected diluents, cryoprotectants, and semen dilution ratios // Theriogenology. – 2009. – Vol. 72, №2. – P. 149–159. 62.Umeya Y. Morphological study on ovarian transplantation in the silkworm, Bombyx mori // Zool. Magaz. Japan. – 1933. – Vol. 45, №2. – P. 59–66. 63. Ushijima H., Yamakawa H., Nagashima H. Cryopreservation of bovine pre-morula stage in vitro matured/in vitro fertilized embryos after delipidation and before use in nucleus transfer // Biol. Reprod. – 1999. – Vol.60, №2. – P. 534–539. 64. Valencia M.D., Miller L.H., Mazur P. Permeability of intact and dechorionated eggs of the Anopheles mosquito to water vapor and liquid water: a comparison with Drosophila // Cryobiology.– 1996. – Vol. 33, №1. – P. 142–148. 65. Valencia M.D., Miller L.H., Mazur P. Permeabilization of eggs of the malaria mosquito Anopheles gambiae // Cryobiology. – 1996. – Vol. 33, №1. – P. 149–162. 66.Wang W.B., Leopold R.A., Freeman T.P. Cryopreservation of Dipteran embryos // Cryobiology. – 2000. – Vol. 41, №4. – P. 349–350. 67.Wang W.B., Leopold R.A., Nelson D.R., Freeman T.P. Cryo- preservation of Musca domestica (Diptera: Muscidae) emb- ryos // Cryobiology. – 2000. – Vol. 41, №2. – P. 153–166. 68.Wyss J.H. Screwworm eradication in the Americas // Ann. NY Acad. Sci. – 2000. – Vol. 916. – P. 186–193. 69.Yocum G.D., Rinehart J.P., West M., Kemp W.P. Interrupted in- cubation and short-term storage of the alfalfa pollinator Me- gachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae): a potential tool for synchronizing bees with bloom // J. Econ. Entomol. – 2010. – Vol.103, №2. – P. 234–241. проблемы криобиологии и криомедицины problems of cryobiology and cryomedicine том/volume 23, №/issue 3, 2013 227

Криоконсервирование репродуктивных продуктов насекомых

Репозитарії

Схожі ресурси