Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей
В работе методом импульсной кондуктометрии впервые определены значения удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши после экспозиции в этиленгликоль-сахарозной среде и полного цикла криоконсервирования методом витрификации. Показано, что после экспозиции эмбрионов в среде витрифика...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2013 |
| Main Authors: | , , , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68728 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей / Е.И. Смольянинова, В.А. Шигимага, О.А. Стриха, Л.И. Попивненко, Е.Г. Лисина // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 228-239. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1859896885456666624 |
|---|---|
| author | Смольянинова, Е.И. Шигимага, В.А. Стриха, О.А. Попивненко, Л.И. Лисина, Е.Г. |
| author_facet | Смольянинова, Е.И. Шигимага, В.А. Стриха, О.А. Попивненко, Л.И. Лисина, Е.Г. |
| citation_txt | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей / Е.И. Смольянинова, В.А. Шигимага, О.А. Стриха, Л.И. Попивненко, Е.Г. Лисина // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 228-239. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | В работе методом импульсной кондуктометрии впервые определены значения удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши после экспозиции в этиленгликоль-сахарозной среде и полного цикла криоконсервирования методом витрификации. Показано, что после экспозиции эмбрионов в среде витрификации увеличиваются значения их электрической проводимости по сравнению с контрольными ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м и (1,54 ± 0,11)÷ (6,12 ± 0,34)×10–3 См/м соответственно). Увеличение времени экспозиции с 1,5 до 3 мин снижает устойчивость плазматических мембран эмбрионов к действию импульсного электрического поля. Проведенные исследования показали, что электрическая проводимость может быть чувствительным диагностическим клеточным параметром, отражающим нарушения морфофункциональной целостности клеток на различных этапах криоконсервирования.
У роботі методом імпульсної кондуктометрії вперше визначені значення питомої електричної провідності 2-клітинних ембріонів мишей після експозиції в етиленгліколь-сахарозному середовищі та повного циклу кріоконсервування методом вітрифікації. Показано, що після експозиції ембріонів у середовищі вітрифікації збільшуються значення їх електричної провідності у порівнянні з контрольними ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м і (1,54 ± 0,11) ÷ (6,12 ± 0,34)×10–3, відповідно). Збільшення часу експозиції від 1,5 до 3 хв знижує стійкість плазматичних мембран ембріонів до дії імпульсного електричного поля. Проведені дослідження показали, що електрична провідність може бути чутливим діагностичним клітинним параметром, який віддзеркалює порушення у морфофункціональній цілісності клітин на різних етапах кріоконсерування.
In this study the values of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos after their exposure in ethylene glycol and sucrose medium and complete cryopreservation cycle by vitrification were determined using the method of impulse conductometry. It has been shown that embryo exposure in vitrifying medium led to an increase in their electric conductivity values in comparison with the control ones ((2.24 ± 0.64) ÷ (3.86 ± 0.68)×10–3 S/m) and (1.54 ± 0.11)÷ (6.12 ± 0.34)×10–3 S/m, respectively). Extension of exposure time from 1.5 min to 3 min led to a decrease in embryo plasma membrane resistance to pulse electric field action. The investigation showed that electric conductivity could be a sensitive diagnostic cell parameter reflecting disturbances in cell morphofunctional integrity at various stages of cryopreservation.
|
| first_indexed | 2025-12-07T15:55:06Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 57.043:611.013:57.043
Е.И. Смольянинова1*, В.А. Шигимага2, О.А. Стриха1, Л.И. Попивненко1, Е.Г. Лисина2
Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации
в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую
проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей
UDC 57.043:611.013:57.043
E.I. Smolyaninova1*, V.A. Shigimaga2, O.A. Strikha1, L.I. Popivnenko1, E.G. Lisina2
Effect of Cryopreservation Stages by Vitrification
in Ethylene Glycol and Sucrose Medium on 2-Cell Murine
Embryos Electric Conductivity
Реферат: В работе методом импульсной кондуктометрии впервые определены значения удельной электрической
проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши после экспозиции в этиленгликоль-сахарозной среде и полного цикла крио-
консервирования методом витрификации. Показано, что после экспозиции эмбрионов в среде витрификации увеличиваются
значения их электрической проводимости по сравнению с контрольными ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м и (1,54 ±
0,11)÷ (6,12 ± 0,34)×10–3 См/м соответственно). Увеличение времени экспозиции с 1,5 до 3 мин снижает устойчивость
плазматических мембран эмбрионов к действию импульсного электрического поля. Проведенные исследования показали,
что электрическая проводимость может быть чувствительным диагностическим клеточным параметром, отражающим
нарушения морфофункциональной целостности клеток на различных этапах криоконсервирования.
Ключевые слова: эмбрион мыши, электропорация, электрический пробой, витрификация, этиленгликоль, криокон-
сервирование.
Реферат: У роботі методом імпульсної кондуктометрії вперше визначені значення питомої електричної провідності 2-
клітинних ембріонів мишей після експозиції в етиленгліколь-сахарозному середовищі та повного циклу кріоконсервування
методом вітрифікації. Показано, що після експозиції ембріонів у середовищі вітрифікації збільшуються значення їх електричної
провідності у порівнянні з контрольними ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м і (1,54 ± 0,11) ÷ (6,12 ± 0,34)×10–3, відповідно).
Збільшення часу експозиції від 1,5 до 3 хв знижує стійкість плазматичних мембран ембріонів до дії імпульсного електричного
поля. Проведені дослідження показали, що електрична провідність може бути чутливим діагностичним клітинним параметром,
який віддзеркалює порушення у морфофункціональній цілісності клітин на різних етапах кріоконсерування.
Ключові слова: ембріон миші, електропорація, електричний пробій, вітрифікація, етиленгліколь, кріоконсервування.
Abstract: In this study the values of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos after their exposure in ethylene glycol
and sucrose medium and complete cryopreservation cycle by vitrification were determined using the method of impulse conductometry.
It has been shown that embryo exposure in vitrifying medium led to an increase in their electric conductivity values in comparison with
the control ones ((2.24 ± 0.64) ÷ (3.86 ± 0.68)×10–3 S/m) and (1.54 ± 0.11)÷ (6.12 ± 0.34)×10–3 S/m, respectively). Extension of
exposure time from 1.5 min to 3 min led to a decrease in embryo plasma membrane resistance to pulse electric field action. The
investigation showed that electric conductivity could be a sensitive diagnostic cell parameter reflecting disturbances in cell
morphofunctional integrity at various stages of cryopreservation.
Key words: mouse embryo, electroporation, electric breakdown, vitrification, ethylene glycol, cryopreservation.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-31-87, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: esmolyaninova@rambler.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3187, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: esmolyaninova@rambler.ru
1Department of Low Temperature Preservation, Institute for Prob-
lems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy
of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine
2Department of Animal Reproduction Biotechnology, Institute of
Animal Breeding of the National Academy of Agrarian Sciences,
Kharkov, Ukraine
1Отдел низкотемпературного консервирования, Институт проб-
лем криобиологии и криомедицины НАН Украины, г. Харьков
2Отдел биотехнологии репродукции сельскохозяйственных
животных, Институт животноводства НААН, г. Харьков
Поступила 21.05.2013
Принята в печать 19.06.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №3. – С. 228–239.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received May, 21, 2013
Accepted June, 19, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 3. – P. 228–239.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
В настоящее время метод витрификации для
криоконсервирования гамет и ранних эмбрионов
млекопитающих является одним из самых рас-
пространенных в современных вспомогательных
репродуктивных технологиях [17, 19, 21, 23–26]. Та-
кой подход позволяет сократить длительность
цикла криоконсервирования по сравнению с медлен-
ным замораживанием и свести к минимуму изме-
Nowadays, application of vitrification to cryopreser-
ve mammalian gametes and early embryos is one of
the most widespread in the contemporary assisted
reproductive technologies [17, 19, 21, 23–26]. This
approach allows to reduce the duration of preparation
steps in comparison with slow freezing protocols and
to minimize the changes in cell volume at the steps of
cooling and warming. However, high concentrations
оригинальное исследование research article
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
229
нения клеточного объема на этапах замораживания
и оттаивания. Вместе с тем высокие концентрации
криопротекторов в криозащитных средах оказы-
вают токсичное влияние на эмбрионы, тем самым
снижая их конечную жизнеспособность, что огра-
ничивает внедрение этого метода в практику [4, 8,
10, 11, 26]. При этом следует различать истинно
химическую токсичность и «кажущуюся» токсич-
ность, вызванную действием осмотического фак-
тора, которую можно устранить путем усовер-
шенствования композиционного состава среды
замораживания и условий экспозиции в них эмб-
рионов.
Жизнеспособность деконсервированных эмб-
рионов оценивают по их морфологическим призна-
кам и способности развиваться в условиях in vivo
или in vitro. Однако по этим критериям невозможно
определить роль отдельных факторов, действую-
щих на различных этапах протокола криоконсер-
вирования. Расширение спектра диагностических
клеточных параметров и методов их измерения
позволит решить эту проблему и создать экспери-
ментально-теоретическую базу для оптимизации
режимных параметров существующих протоколов
и разработки новых. В частности показано, что та-
кие электрические характеристики клеток, как
мембранный потенциал и транспорт ионов через
плазматические мембраны являются чувстви-
тельными параметрами, отражающими состояние
клеток и его изменение под действием различных
эндогенных и экзогенных факторов, например сте-
пени зрелости ооцитов млекопитающих [20, 32].
В современной биотехнологии широко исполь-
зуется метод импульсной кондуктометрии, или
электропорации [12, 16, 22, 28, 29], основанный на
следующем явлении. При воздействии на клетку
однородного электрического поля происходит рез-
кое увеличение мембранного потенциала. Превы-
шение некоторого критического значения мембран-
ного потенциала приводит к локальным перестрой-
кам в липидном бислое и резкому увеличению
электрической проводимости клеточной мембраны
вследствие появления в ней кратковременных де-
фектов типа гидрофобных или гидрофильных пор
[31, 33, 34]. Различают обратимый и необратимый
электрический пробой. Если радиус гидрофильной
поры не превышает некоторое критическое значе-
ние, то по истечении определенного времени пора
залечивается, т. е. имеет место так называемый
обратимый электрический пробой. Если радиус
гидрофильной поры превышает некоторое крити-
ческое значение, то происходит необратимый
электрический пробой мембраны, сопровождаю-
щийся разрушением и лизисом клетки. Напряжен-
ность импульсного электрического поля (ИЭП),
of cryoprotectants in cryoprotective media render toxic
effects on the embryos, thereby reducing their final
viability, which restricts the introduction of this method
into practice [4, 8, 10, 11, 26]. Herewith, one should
distinguish between true chemical toxicity and
‘apparent’ toxicity caused by osmotic factors that could
be eliminated by improving the composition of vitrifying
media and conditions of embryos exposure in the media.
Viability of devitrified embryos is being evaluated
by their morphological characteristics and the ability
to develop in vivo or in vitro. However, these criteria
could not show the impact of individual factors acting
at different stages of the cryopreservation protocol.
Expanding the range of characteristic cell parameters
and methods for their assessment would allow to solve
this problem and to create experimental and theoretical
basis for optimization of regime parameters of exis-
ting protocols and to develop new ones. In particular,
it was shown that the electrical characteristics such
as cell membrane potential and the transport of ions
via plasma membranes are sensitive parameters re-
flecting the state of the cells and its changes under the
influence of various endogenous and exogenous fac-
tors, e.g. the maturity stage of mammalian oocytes
[20, 32].
Contemporary biotechnology widely utilize the me-
thod or pulse conductometry or electroporation [12,
16, 22, 28, 29], based on the following phenomenon.
Uniform electric field exposure on the cells causes
sharp increase in the membrane potential. Exceeding
of certain critical membrane potential leads to local
modifications in the lipid bilayer and a sharp increase
in the electric conductivity of cell membrane due to
appearance of short-living defects such as hydrophobic
or hydrophilic pores [31, 33, 34]. One discern reversible
and irreversible electrical breakdown. If the radius of
a hydrophilic pore does not exceed a certain critical
value, after some time the pore ‘heals’, i. e. so-called
reversible electrical breakdown occurs. If the radius
of the hydrophilic pores exceeds certain critical value,
the irreversible electrical breakdown of the membrane
occurs, accompanied by the destruction and lysis of
cell. The intensity of pulsed electric field (PEF) causing
the electrical breakdown, could be an important para-
meter characterizing the structural integrity of the
membrane. It was shown that even small changes in
the structure of the membrane under the exposure of
external chemical or physical factors affected the value
of the critical electric breakdown [3, 12, 30]. The
electric pulse action is conventionally applied to intro-
duce into cells the foreign DNA or the substances
which normally do not penetrate, as well as for cell fu-
sion [16, 22, 28, 29]. Electric characteristic of this pro-
cess is the electric conductivity of the cell, which chan-
ges significantly with an increase in the electric field
230 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
вызывающего электрический пробой, может слу-
жить важным параметром, характеризующим це-
лостность структуры мембраны. Показано, что да-
же малые изменения в структуре мембраны под
воздействием внешних химических или физичес-
ких факторов влияют на значение критической на-
пряженности электрического пробоя [3, 12, 30]. Тра-
диционно действие электрического импульса ис-
пользуют для введения в клетки не проникающих
в норме агентов, введения в клетки чужеродной
ДНК, слияния клеток [16, 22, 28, 29]. Электричес-
кой характеристикой этого процесса является элек-
трическая проводимость клетки, которая сущест-
венно изменяется при нарастании напряженности
электрического поля [13–15]. В предыдущих иссле-
дованиях нами было показано, что электрическая
проводимость также может быть клеточным пара-
метром, характеризующим изменения в функцио-
нальном состоянии ооцитов и эмбрионов мыши в
зависимости от степени их зрелости [3, 7] и стадии
развития в процессе деления дробления [6]. Также
было показано, что значения электрической прово-
димости ооцитов мыши меняются под действием
растворов проникающих криопротекторов [15].
Целью настоящей работы явилось исследо-
вание влияния различных этапов протокола крио-
консервирования методом витрификации в этилен-
гликоль-сахарозной среде на электрическую прово-
димость 2-клеточных эмбрионов мышей.
Материалы и методы
Объектом исследования служили 2-клеточные
эмбрионы мышей F1 (C57Bl × СВА) возрастом 6–
8 недель. Для стимуляции суперовуляции самок
мышей подвергали гормональной обработке путем
внутрибрюшинного введения 5 МЕ гонадотропина
сыворотки жеребых кобыл («Folligon», Нидерлан-
ды) и 7,5 МЕ человеческого хорионического гона-
дотропина (чХГ) («Chоrulon», Нидерланды) с ин-
тервалом 46–48 ч. Самок после введения чХГ
подсаживали к самцам для осеменения. На сле-
дующий день проверяли наличие копуляционных
пробок, что соответствовало первому дню бере-
менности самок. Через 48 ч после введения чХГ
самок забивали дислокацией шейных позвонков.
Эмбрионы на стадии двух бластомеров получали
промыванием отпрепарированных яйцеводов фи-
зиологической средой Дюльбекко с добавлением
5%-й фетальной телячьей сыворотки («Sigma»,
США) при комнатной температуре по стандартной
методике [1]. Затем клетки трижды отмывали фи-
зиологической средой и немедленно использовали
в экспериментах.
Эксперименты на животных проводили в соот-
ветствии с «Общими принципами экспериментов
[13–15]. We have shown previously that the electric
conductivity may also be a cell parameter characteriz-
ing the changes in the functional state of mouse oocytes
and embryos, depending on their maturity [3, 7] stage
of development during cleavage [6]. The electric con-
ductivity of murine oocytes was also shown to change
after exposure in solutions of cryoprotectants [15].
The aim of our study was to investigate the effect
of different stages of cryopreservation protocol by
means of vitrification in ethylene glycol and sucrose
medium on the electric conductivity of two-cell mouse
embryos.
Materials and methods
Experiments were performed in 2-cell embryos of
6–8 week-old mice F1 (C57Bl × CBA). Superovulation
was stimulated by hormonal treatment: intraperitoneal
injection of 5 IU pregnant mare serum gonadotropin
(Folligon, Netherlands) and 7.5 IU of human chorionic
gonadotropin (HCG) (Chorulon, Netherlands), 46-48
hours post HCG administration the females were trans-
ferred to males for insemination. The next day, the
presence of copulatory plugs was checked, which cor-
responded to the first day of pregnancy. Females were
sacrificed by means of cervical dislocation 48 hours
post hCG administration. Two cell embryos were iso-
lated by washing the cut-out oviducts with Dulbecco’s
physiological medium supplemented with 5% fetal calf
serum (Sigma, USA) at room temperature using stan-
dard method [1]. The cells were then washed thrice
with physiological medium and used immediately in the
experiments.
The experiments in animals were carried out in
compliance with the General principles of experiments
in animals, approved by 3rd National Congress on Bio-
ethics (Kiev, 2007), and with the European Convention
for the Protection of Vertebrate Animals used for
Experimental and other Scientific Purposes (Stras-
bourg, 1986).
In the present study we analyzed the cryopreser-
vation protocol based on vitrification method described
previously [2, 4, 8]. Embryos were divided into five
groups: the control and four experimental groups. The
control group (n = 32) consisted of fresh 2-cell embryos
without signs of morphological abnormalities.
The first series of experiments were targeted to
elucidate the effect of duration of exposure in solution
of cryoprotectants and vitrifying medium on electric
conductivity in the murine embryo. Embryos of experi-
mental groups I (n = 25), and II (n = 28) were treated
with 10% solution of ethylene glycol (EG) during 5
minutes, transferred to a vitrifying medium (30% EG +
0.7 M sucrose) and incubated during 1.5 minutes
(group I) and 3 minutes (group II). Then the embryos
were transferred into drops of 0.5 M sucrose solution,
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
231
на животных», одобренными I–III Национальными
конгрессами по биоэтике (Киев, 2001–2007 гг.) и
согласованными с положениями «Европейской
конвенции о защите позвоночных животных, ис-
пользуемых для экспериментальных и других
научных целей» (Страсбург, 1986 г.).
В работе анализировали протокол криоконсер-
вирования методом витрификации, описанный
ранее [2, 4, 8]. Эмбрионы были разделены на пять
групп: контрольную и четыре экспериментальных.
В контрольную группу (n = 32) входили свежевыде-
ленные 2-клеточные эмбрионы без признаков мор-
фологических нарушений.
В первой серии экспериментов исследовали
влияние времени инкубации в растворе криопро-
тектора и среде витрификации на электрическую
проводимость эмбрионов мыши. Эмбрионы I (n =
25) и II (n = 28) экспериментальных групп подвер-
гали обработке 10%-м раствором этиленгликоля
(ЭГ) в течение 5 мин, после чего переносили в сре-
ду витрификации (30% ЭГ + 0,7 М сахарозы) и
выдерживали в ней 1,5 мин (I группа) и 3 мин (II
группа). Затем зародыши переносили в капли раст-
вора 0,5 М сахарозы, выдерживали 10 мин и пере-
носили в физиологическую среду Дюльбекко для
удаления криопротектора.
Во второй серии экспериментов исследовали
влияние полного цикла низкотемпературного кон-
сервирования 2-клеточных эмбрионов мыши на их
электрическую проводимость. Эмбрионы III и IV
экспериментальных групп (n = 26 и n = 18 соответ-
ственно) после предварительной эквилибрации в
10%-м растворе ЭГ и среде витрификации пере-
носили (по 5–7 эмбрионов) в заранее подготовлен-
ные пластиковые соломинки диаметром 2 мм («Pa-
cific Vet», Австралия), содержащие 5 мкл среды
витрификации. Соломинки быстро погружали в
жидкий азот и хранили 3–7 суток. Время экспозиции
в этиленгликоль-сахарозной среде перед охлажде-
нием для III группы составило 1,5 мин, для IV
группы – 3 мин. Соломинки отогревали на водяной
бане (38°С). Для удаления криопротектора эмбрио-
ны, извлеченные из соломинок, переносили в раст-
вор сахарозы с концентрацией 0,5 М, выдерживали
в нем 10 мин и затем трижды отмывали физиоло-
гической средой при комнатной температуре. Со-
хранность деконсервированных зародышей оцени-
вали по морфологическим признакам: целостности
бластомеров и прозрачности их цитоплазмы. В
дальнейших экспериментах использовали эмбрио-
ны без морфологических нарушений.
Электрическую проводимость эмбрионов мы-
ши определяли методом импульсной кондукто-
метрии [30] с использованием аппаратурного комп-
лекса, в состав которого входил генератор одиноч-
ных прямоугольных импульсов с линейно возрас-
kept for 10 minutes and thereafter transfered into a
Dulbecco’s physiological medium to wash-out the
cryoprotectant.
In the second series of experiments we investigated
the effect of complete cycle of low temperature pre-
servation of two-cell murine embryos on their electric
conductivity. Embryos of groups III and IV (n = 26
and n = 18, respectively) were transferred after pre-
equilibration in 10% EG solution and vitrifying medium
(5–7 embryos at once) into plastic straws of 2 mm
diameter (Pacific Vet, Australia) containing 5 µl of vitri-
fying medium. Straws were rapidly plunged into liquid
nitrogen and stored for 3–7 days. Duration of exposure
in the ethylene glycol and sucrose medium before
freezing for the group III and IV was 1.5 and 3 minu-
tes, correspondingly. Straws were warmed in a water
bath (38°C). To remove the cryoprotectant the emb-
ryos retrieved from straws were transferred into a
0.5 M sucrose solution, exposed during 10 minutes and
then washed thrice with physiological medium at room
temperature. Survival of devitrified embryos was as-
sessed by morphological criteria: integrity of blasto-
meres and transparency of their cytoplasm. Further
experiments were conducted in embryos without mor-
phological abnormalities.
The electric conductivity of mouse embryos was
determined by pulsed conductometry method [30] using
the device with the generator of single rectangular
pulses with linearly increasing amplitude. The gene-
rated voltage was applied to the gold thread microelect-
rodes sealed in glass capillaries. Each embryo was
washed twice in an isotonic sucrose solution to remove
the traces of salt buffer, and then placed between the
microelectrodes in a drop of sucrose solution. The spe-
cific conductivity was determined indirectly by mea-
suring the voltage amplitude on the calibrated resistor
sequentially connected with microelectrodes. Specific
electric conductivity of individual oocytes was calcu-
lated according to the previously developed algorithm
[14, 30].
Eventually, there were plotted the experimental
curves of specific electric conductivity for individual
2-cell murine embryos vs. the electric field between
the micro-electrodes.
Statistical processing of the results was performed
using the parametric data analysis and software Micro-
soft Office Excel 2010, and Student t-test to evaluate
the significance of differences. Data are presented as
M ± SE.
Results and discussion
Fig. 1 shows the dependence of electric conduc-
tivity of murine two-cell embryos of the control group
vs. the electric field intensity. The dependencies of
the electric conductivity of individual embryos were
of monotonous increasing character as amplitude of
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
232 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
тающей амплитудой. Напряжение с генератора
подавалось на микроэлектроды из золотой нити,
запаянной в стеклянные капилляры. Каждый эмб-
рион дважды отмывали в изотоническом растворе
сахарозы для удаления следов солевого буфера, а
затем в капле раствора сахарозы помещали между
микроэлектродами. Удельную проводимость опре-
деляли косвенно – путем измерения амплитуды
напряжения на калиброванном резисторе, последо-
вательно соединенном с микроэлектродами.
Удельную электрическую проводимость отдель-
ных ооцитов рассчитывали согласно разработан-
ному ранее алгоритму [14, 30].
В результате были построены эксперименталь-
ные зависимости удельной электрической проводи-
мости отдельных 2-клеточных эмбрионов мышей
от напряженности электрического поля между
микроэлектродами.
Статистическую обработку результатов выпол-
няли с использованием пакета параметрического
анализа данных программы Microsoft Office Excel
2010 и t-критерия Стьюдента для оценки достовер-
ности различий. Данные представлены в виде
М ± SE.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены зависимости удельной
электрической проводимости 2-клеточных эмбрио-
нов мышей контрольной группы от напряженности
электрического поля. Зависимости электрической
проводимости отдельных эмбрионов по мере уве-
личения амплитуды подаваемого импульса (рис. 1, A)
имели монотонно возрастающий характер. При
этом фиксировали заметные колебания значений
проводимости, которые свидетельствовали о мно-
гократной порации плазматических мембран блас-
томеров. Численные значения электрической про-
водимости 2-клеточных эмбрионов мыши конт-
рольной группы при увеличении амплитуды пода-
ваемого импульса менялись в диапазоне ((1,54 ±
0,11) ÷ (6,12 ± 0,34))×10–3 См/м (рис. 1, B). В диа-
пазоне напряженностей ИЭП от 1×104 до 5×104 В/м
электрическая проводимость эмбрионов обуслов-
лена наличием «естественных» флуктуационных
пор в липидном бислое и белковых каналов в
плазматических мембранах эмбрионов, поэтому
индивидуальные различия между отдельными эмб-
рионами выражены слабо. При превышении значе-
ний напряженности электрического поля 5×104 В/м
электрическая проводимость обусловлена индук-
цией процесса порообразования под действием
приложенного электрического импульса, который,
в свою очередь, является вероятностным процес-
сом [12, 33, 34] и зависит от индивидуальных осо-
бенностей (электромеханических свойств) мемб-
Рис. 1. Зависимость удельной электрической проводи-
мости 2-клеточных эмбрионов мыши контрольной
группы от напряженности ИЭП: A – зависимости для
отдельных эмбрионов; B – статистически обработан-
ные данные.
Fig. 1. Dependence of specific electric conductivity of 2-cell
murine embryos of control group vs. PEF intensity: A – sin-
gle embryos dependencies; B – statistically processed
data.
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
0
2
4
6
8
10
0 5 10 15 20 25 30 35
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
A
B
the applied pulse increased (Fig. 1A).Herewith, signi-
ficant fluctuations in the conductivity values were regis-
tered, which indicated to occurred multiple blastomere
plasma membrane poration. The numerical values of
the electric conductivity of murine 2-cell embryos of
the control group with an increase in the amplitude of
the applied pulse varied in the range ((1,54 ± 0,11) ÷
(6,12 ± 0,34))×10–3 S/m (Fig. 1B). In the PEF intensity
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
233
ран эмбрионов. При этом в исследованном диапа-
зоне значений напряжённостей ИЭП необратимый
электрический пробой мембран и лизис бластоме-
ров не наблюдали, что свидетельствует об устой-
чивости плазматических мембран 2-клеточных
эмбрионов контрольной группы к действию элект-
рического импульса.
После 1,5-минутной экспозиции эмбрионов в
этиленгликоль-сахарозной среде (I группа) и уда-
ления криопротектора значения удельной элект-
рической проводимости эмбрионов были выше по
сравнению с таковыми эмбрионов контрольной
группы и менялись в диапазоне ((2,24 ± 0,64) ÷
(3,86 ± 0,68))×10–3 См/м (рис. 2). Достоверные раз-
личия (p < 0,05) между начальными значениями
электрической проводимости эмбрионов I группы
и контрольной свидетельствуют о влиянии крио-
защитных растворов на структуру плазматических
мембран эмбрионов, а также об изменении их
электромеханических свойств. Эмбрионы этих
групп демонстрировали схожую устойчивость к
действию электрического импульса в исследуемом
диапазоне напряженностей. Необратимый пробой
и лизис бластомеров также не наблюдали.
После 3-минутной экспозиции эмбрионов в эти-
ленгликоль-сахарозной среде численные значения
проводимости эмбрионов практически совпадали
с полученными после 1,5-минутной экспозиции
(((2,3 ± 0,87) ÷ (4,1 ± 1,7))×10–3 См/м). Однако по
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
A B
Рис. 2. Зависимость удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши от напряженности
ИЭП после 1,5 мин экспозиции в среде витрификации: A – зависимости для отдельных эмбрионов; B –
статистически обработанные данные.
Fig. 2. Dependence of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos vs. PEF intensity after 1.5 min long exposure
in vitrifying medium: A – single embryos dependencies; B – statistically processed data.
range of 1×104 to 5×104 V/m the electric conductivity
of the embryos was due to the presence of ‘natural’
fluctuation pores in the lipid bilayer as well as protein
channels in the embryo plasma membranes, so indi-
vidual differences among individual embryos are insig-
nificant. Exceeding the values of the electric field of
5×104 V/m the electric conductivity resulted from the
induced pore formation process due the applied electric
pulse, which in its turn was a probabilistic process [12,
33, 34], depending on the individual characteristics
(electromechanic properties) of embryo membranes.
In the studied range of PEF intensity values no irre-
versible electrical breakdown of membranes and lysis
of blastomeres were observed, which indicated the
stability of the plasma membranes of 2-cell embryos
of the control group to an electric pulse exposure.
After 1.5 minutes of exposure of embryos in ethy-
lene glycol and sucrose medium (group 1) and cryopro-
tectant removal the specific conductivity values revea-
led in the embryos were higher if compared with those
in the control group embryos and varied in the range
((2,24 ± 0,64)÷(3.86 ± 0,68))×10–3 S/m (Fig. 2). Signi-
ficant differences (p < 0,05) between the initial values
of electric conductivity of embryos in group 1 and the
control group testified the effect of cryoprotective
solution on the embryo plasma membranes structure,
resulted in the changes of their electro-mechanical
properties. Embryos of group 1 exhibited resistance to
the action of electric pulse in the studied range of
234 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
достижении некоторого значения напряженности
ИЭП наблюдался резкий рост электрической про-
водимости у мембран всех эмбрионов, сопровож-
дающийся лизисом бластомеров, что свидетельст-
вовало о необратимом электрическом пробое плаз-
матической мембраны (рис. 3, B).
На рис. 4 представлены микрофотографии, де-
монстрирующие явление необратимого электри-
ческого пробоя 2-клеточного эмбриона мыши.
Во второй серии экспериментов мы определяли
электрическую проводимость и устойчивость 2-кле-
точных эмбрионов мышей к действию ИЭП после
полного цикла криоконсервирования.
На рис. 5 представлены зависимости электри-
ческой проводимости эмбрионов IV группы после
полного цикла криоконсервирования. Численные
значения этого параметра для эмбрионов III и IV
групп практически не отличались и изменялись в
пределах ((2,38 ± 0,83) ÷ (9,49 ± 1,18))×10–3 См/м.
Необратимый электрический пробой и лизис блас-
томеров эмбрионов наблюдался для эмбрионов IV
группы. Однако для эмбрионов III группы он отсут-
ствовал.
Как видно из представленных данных, этап
витрификации-отогрева не оказывает существен-
ного влияния на численные значения электри-
ческой проводимости эмбрионов мыши. Сущест-
венное увеличение электрической проводимости
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
0 10 20 30 40 50 60 70 80 Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
A B
Рис. 3. Зависимость удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши от напряженности
ИЭП после 3 мин экспозиции в среде витрификации: A – зависимости для отдельных эмбрионов; B – статистически
обработанные данные.
Fig. 3. Dependence of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos vs. PEF intensity after 3 min long exposure
in vitrifying medium: A – single embryos dependencies; B – statistically processed data.
intensities similar to that of the control group. No irre-
versible breakdown or blastomeres lysis was also obser-
ved.
After 3 minute-long exposure of the embryos in
ethylene glycol and sucrose medium the numerical
values of the conductivity of the embryos were almost
equal to the of previous ones: ((2,3 ± 0,87)÷(4,1 ±
1,7))×10–3 S/m. However, after reaching a certain
value of PEF intensity there was a sharp increase in
the electric conductivity observed in the membranes
of all the embryos, which was accompanied by lysis
of blastomeres, indicating an irreversible electrical
breakdown of the plasma membrane (Fig. 3B) .
Fig. 4 shows photomicrographs depicting the phe-
nomenon of irreversible electrical breakdown of 2-cell
murine embryo.
In the second series of experiments, we determined
the electric conductivity and resistance of murine 2-
cell embryos to the action of PEF after a full cycle of
cryopreservation.
Fig. 5 shows the dependencies of the electric con-
ductivity of embryos in group IV of after full cryopre-
servation cycle. The numerical values of this parameter
for embryos in groups 3 and 4 did not differ and were
in range of ((2,38 ± 0,83)÷(9,49 ± 1,18))×10–3 S/m.
Irreversible electrical breakdown and lysis of embryos
blastomeres was observed for the embryos of group
4. However it was not observed in embryos of group 3.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
235
мости эмбрионов экспериментальных групп. Важен
тот факт, что диапазон значений электрической
проводимости эмбрионов экспериментальных
групп существенно уже, чем контрольных эмбрио-
нов. Можно предположить, что при нарушении упо-
рядоченности структуры плазматических мемб-
ран эмбрионов под действием криозащитных
растворов изменяются электромеханические
свойства мембран и, как следствие, характер
распределения и размеры мембранных пор, инду-
цированных действием ИЭП. Кроме того, извест-
но, что напряжение электрического пробоя
Рис. 4. Микрофотографии 2-клеточных эмбрионов мыши до (A) и после
(B) необратимого электрического пробоя. Масштабная линейка 50 мкм.
Fig. 4. Photomicrographs of murine 2-cell embryos before (A) and after (B)
irreversible electric breackdown. Bar 50 µm.
A B
эмбрионов I и II групп по сравне-
нию с проводимостью эмбрионов
контрольной группы свидетель-
ствует об изменении свойств плаз-
матических мембран бластомеров
эмбрионов после экспозиции в
растворе ЭГ и среде витрификации.
Можно предположить, что в ре-
зультате обработки эмбрионов
криозащитными растворами в
плазматических мембранах блас-
томеров формируются структур-
ные дефекты, в области которых
под действием электрического им-
пульса могут формироваться по-
ры, что и приводит к увеличению
значений электрической проводи-
0
2
4
6
8
10
12
0 10 20 30 40 50
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
Э
ле
кт
ри
че
ск
ая
п
ро
во
ди
м
ос
ть
G
×1
0–3
,
С
м
/м
El
ec
tri
c
co
nd
uc
tiv
ity
G
×1
0–3
, S
/m
Напряженность поля E×104, В/м
Field intensity E×104, W/m
A B
Рис. 5. Зависимость удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши от напряженности
ИЭП после полного цикла криоконсервирования; экспозиция в среде витрификации – 3 мин.: A – зависимости
для отдельных эмбрионов; B – статистически обработанные данные.
Fig. 5. Dependence of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos vs. PEF intensity after full cycle of cryo-
preservation; 3 min of exposyre in vitrifying medium: A – single embryos dependencies; B – statistically processed data.
As can be seen from the presented data, freeze-
thawing had no significant effect on numerical values
of the electric conductivity exhibited by the murine
embryos. A substantial increase in the electric conduc-
tivity of embryos from groups 1 and 2 if compared
with conductivity in the control group embryos indicated
the occurrence of changes in properties of embryo
blastomere plasma membranes after exposure in EG
solution and vitrifying medium. It can be assumed that
processing of embryos in cryoprotectant solutions
resulted in appearance of structural defects in blasto-
mere plasma membranes, around which the pores
236 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
(обратимого) пропорционально толщине мембраны
[33]. Адсорбция криопротектора на мембране
увеличивает так называемую «эффективную» тол-
щину мембраны, изменяет ее диэлектрическую
проницаемость, что, в свою очередь, увеличивает
значение напряжения пробоя, необходимого для
формирования поры, и тем самым снижая значение
электрической проводимости. Следует отметить,
что увеличение времени экспозиции от 1,5 до 3 мин
приводит к снижению устойчивости мембран
эмбрионов к действию ИЭП, что отражается в яв-
лении необратимого электрического пробоя. По-
видимому, увеличение электрической проводи-
мости плазматических мембран после действия
криозащитных растворов может быть следствием
изменения проницаемости мембраны для ионов и
нарушения ионного гомеостаза, если время экспо-
зиции в этих растворах превышает оптимальное
значение. Ранее методом электронно-зондового
микроанализа нами было показано, что при увели-
чении времени экспозиции 2-клеточных эмбрионов
мыши в этиленгликоль-сахарозной среде от 1,5 до
3 мин происходит трехкратное снижение цитоплаз-
матической концентрации основных неорганичес-
ких элементов – калия и натрия [9, 27]. Снижение
внутриклеточной концентрации этих элементов
после экспозиции в среде витрификации приводит
к нарушению интегральной целостности мембраны
и ее связи с цитоскелетными структурами, что
отражается в резком возрастании электрической
проводимости и наблюдаемом необратимом элект-
рическом пробое мембраны при воздействии ИЭП.
Также было установлено, что внутриклеточная
концентрация калия в эмбрионах мыши в норме не
является постоянной величиной и претерпевает
циклические изменения в зависимости от стадий
клеточного цикла [5]. Такие концентрационные ко-
лебания основного клеточного элемента коррели-
руют с синхронными молекулярными перестрой-
ками в цитоплазме и имеют важное физиологичес-
кое значение [18]. Нарушение ионного гомеостаза
за счет снижения внутриклеточных концентраций
калия и натрия приводит к разобщению координа-
ции цито- и кариокинеза и запуску апоптотических
процессов в цитоплазме. В пользу данного предпо-
ложения свидетельствуют результаты работы
J.R. Trimarchi и соавт. [32], в которой было показа-
но, что вследствие воздействия на эмбрионы мыши
фактором, индуцирующим апоптоз, происходит
выход калия из бластомеров. Ранее нами было ус-
тановлено, что при увеличении экспозиции эмбрио-
нов в среде витрификации перед погружением в
жидкий азот с 1,5 до 3 мин морфофункциональная
сохранность деконсервированных 2-клеточных
could be formed due to effect of electric pulse, which
led to an increase in the electric conductivity values in
the experimental groups embryos. Interestigly, the
range of electric conductivity values exhibited by
experimental group embryos was significantly narrow
comparing to those of the control embryos. It can be
assumed that violation of ordered structure of embryo
plasma membranes under the influence of cryopro-
tective solutions could result in the changed electro-
mechanical properties of the membranes and, as a
consequence, in the distribution and size of the memb-
rane pores induced by the action of the PEF. Further-
more it is known that intensity of electric breakdown
(reversible) was proportional to the thickness of the
membrane [33]. Adsorption of cryoprotectant on the
membrane increased the so-called ‘effective’ thickness
of the membrane, changed its dielectric constant, which
in turn increased the breakdown intensity value, requi-
red for the formation of pore, thus reducing the value
of electric conductivity. It should be noted that increa-
sing the exposure time of 1.5 to 3 min reduced the
resistance of embryo membranes to the effect of PEF,
which was reflected in the phenomenon of irreversible
electric breakdown. Apparently, the increased electric
conductivity of the plasma membranes after exposure
in cryoprotective solutions could result from changed
membrane permeability for ions and disordered ion
homeostasis, if the exposure time in these solutions
exceeded a certain optimal value. It was shown pre-
viously using electron-probe micro-analysis that increa-
sing the exposure time of murine 2-cell embryos in
ethylene glycol and sucrose medium from 1.5 to 3 minu-
tes resulted in threefold decrease in cytoplasmic con-
centration of inorganic basic elements, potassium and
sodium [9, 27]. Reduction in the intracellular concent-
ration of these elements after exposure in vitrifying
medium led to a impairment of the membrane integrity
and its association with cytoskeletal structures, which
was reflected in a sharp increase in the electrical con-
ductivity and appearance of irreversible electrical
breakdown of the membrane under the influence of
PEF. It was also found that normally the intracellular
concentration of potassium in murine embryos was not
constant and underwent cyclic changes depending on
the cell cycle stage [5]. Such fluctuations in the concent-
ration of basic cell substances correlate with synchro-
nous molecular rearrangements in cytoplasm and are
of physiological significance [18]. Disturbing of ionic
homeostasis in terms of reducing intracellular concent-
rations of potassium and sodium results in the broken
coordination of cyto- and karyokinesis and initiation of
apoptotic processes in the cytoplasm. This assumption
is supported by observation of Trimarchi et al. [32],
reported that if murine embryos were subjected to a
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
237
эмбрионов мышей достоверно снижается. В про-
цессе их последующего развития in vitro увеличи-
вается количество апоптотических эмбрионов [8].
Выводы
Проведенные исследования показали, что
электрическая проводимость может быть чувст-
вительным диагностическим клеточным парамет-
ром, отражающим скрытые нарушения морфофунк-
циональной целостности клеток на различных
этапах криоконсервирования.
Основным этапом протокола криоконсервиро-
вания 2-клеточных эмбрионов мыши методом вит-
рификации в этиленгликоль-сахарозной среде,
оказывающим влияние на значения электрической
проводимости эмбрионов и их сохранность, яв-
ляется этап экспозиции в криозащитных растворах.
Этап охлаждения-отогрева не оказывает дополни-
тельного влияния на значения электрической про-
водимости.
Нарушения морфофункциональной целостности
эмбрионов в криозащитных растворах на основе
этиленгликоля и сахарозы вызваны, главным обра-
зом, действием осмотического фактора среды, при-
чем эти нарушения имеют обратимый характер,
если время экспозиции эмбрионов в среде витри-
фикации не превышает некоторое критическое
значение, и становятся необратимыми, если время
экспозиции не оптимально.
Литература
1. Биология развития млекопитающих. Методы / Под ред.
М. Манк. – М.: Мир, 1990. – 406 с.
2. Исаченко В.В., Грищенко В.И., Осташко Ф.И. и др. Сверх-
быстрое замораживание эмбрионов крыс и коров без
«классической эквилибрации» // Проблемы криобиоло-
гии. – 1994. – №3. – С. 3–6.
3. Колесникова А.А., Шигимага В.А., Смольянинова Е.И.
Влияние стимуляции созревания на электропроводность
и оплодотворяемость ооцитов мыши // Фундаментальные
исследования. – 2013. – Ч. 4, №4. – С. 896–899.
4. Кривохарченко А.С., Вильянович Л.И., Серобян Г.А. и др.
Выживаемость эмбрионов мышей после сверхбыстрого
замораживания разными способами с использованием
различных криопротекторов // Проблемы репродукции. –
1995. – №4. – С. 13–18.
5. Погорелов А.Г., Гольдштейн Д.В., Смольянинова Е.И.,
Сахарова Н.Ю. Электронно-зондовый микроанализ
внутриклеточной концентрации калия в клетках раннего
эмбриона мыши в доимплантационый период // ДАН. –
2005. – Т. 400, №2. – С. 276–278.
6. Смольянінова Є.І., Стриха О.А., Шигимага В.О. та ін.
Визначення електричної провідності ембріонів мишей
доімплантаційних стадій розвитку після гормональної
стимуляції яєчників тварин // Biotechnologia Acta. – 2013. –
Т. 6, №1. – С. 105–112.
7. Смольянінова Є.І., Шигимага В.О., Колеснікова А.О. Вплив
гормональної стимуляції на морфологічні та електричні
factor inducing apoptosis, the leakage of potassium
from the blastomeres was revealed. We have reported
previously that increasing the exposure duration of
embryo in vitrifying medium before plunging into liquid
nitrogen from 1.5 to 3 min resulted in significant decrea-
se in integrity of devitrified 2-cell murine embryos.
During following in vitro development, the number of
apoptotic embryos was increased [8].
Conclusions
Electric conductivity could be a sensitive diagnostic
parameter for the cell, reflecting the hidden impairments
in morphological and functional integrity of the cells at
different stages of cryopreservation.
The main step of cryopreservation protocol for 2-
cell murine embryos using vitrification in ethylene glycol
and sucrose medium which affected the electric
conductivity and survival of embryos was the exposure
in solution of cryoprotectants. Freeze-thawing step did
not additionally affect the values of the electric condu-
ctivity of 2-cell murine embryos.
Impairments in morphological and functional integ-
rity of the embryo in cryoprotectant solutions were
caused mainly by osmotic factor of the medium, and
these disorders were reversible if the exposure of
embryos in vitrifying medium did not exceed a certain
critical value, and became irreversible if the exposure
time was not optimal.
References
1. Developmental biology of mammals. Methods / Ed. by M. Monk. –
Academic Press, 1990. – 406 p.
2. Isachenko V.V., Grishchenko V.I., Ostashko F.I. et al. Ultrarapid
freezing of embryos of rats and cows without ‘classic equilib-
ration’// Problems of Cryobiology. – 1994. – N3. – P. 3–6.
3. Kolesnikova A.A., Shigimaga V.A., Smolyaninova E.I. Effect of
the stimulated maturation and fertilization on the electric
conductivity and fertilization of mouse oocytes // Fundamen-
talnye Issledovaniya. – 2013. – Part 4, N4. – P. 896–899.
4. Krivoharchenko A.S., Vilyanovich L.I., Serobyan G.A. et al.
Survival of mouse embryos after ultra-rapid freezing in diffe-
rent ways using different cryoprotectants // Problemy Repro-
duktsii. – 1995. – N4. – P. 13–18.
5. Pogorelov A.G., Goldstein D.V., Smolyaninova E.I., Sakha-
rova N.Yu. Electron probe microanalysis of the intracellular
concentration of potassium in the cells of the early mouse
embryo in the preimplantation period // Doklady Akademii
Nauk. – 2005. – Vol. 400, N2 – P. 276–278.
6. Smolyanіnova E.I., Strikha O.A., Shigimaga V.O. et al.
Determination of electric conductivity of murine embryos of
pre–implantation streges after hormonal stimulation of animal
oviducts // Biotechnologia Acta. – 2013 . – Vol. 6, N1. – P. 105–
112.
7. Smolyanіnova E.I., Shigimaga V.O., Kolesnіkova A.O. Effect of
hormonal stimulation on morphofunctional and electric para-
meters of murine oocytes// Bіologіya Tvarin. – 2009. – Vol. 11,
N1–2. – C. 329–338 .
238 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
параметри ооцитів миші // Біологія тварин. – 2009. – T. 11,
№ 1–2. – C. 329–338.
8. Смольянинова Е.И., Пишко О.В., Лисина Е.Г. и др. Анализ
влияния различных этапов криоконсервирования ме-
тодом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде
на жизнеспособность 2-клеточных эмбрионов мыши //
Проблемы криобиологии. – 2007. – Т. 17,№4. – С. 385–393.
9. Смольянинова Е.И., Погорелов А.Г., Лисина Е.Г. и др. Влия-
ние среды замораживания на жизнеспособность и ка-
тионный состав ранних эмбрионов мыши // Проблемы
криобиологии. – 2005. – Т. 15, №3. – С. 3–10.
10.Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г. В.,
Пишко О.В. Влияние эквилибрации в среде замораживания
на осмотическую устойчивость и жизнеспособность 8-
клеточных эмбрионов мыши // Проблемы криобиологии. –
2004. – №1. – С. 3–11.
11.Смольянинова Е.И., Хроменкова О.Б., Жерноклев Г.В.
Влияние различных этапов криоконсервирования ме-
тодом сверхбыстрого замораживания на осмотическую
устойчивость и морфофункциональную сохранность эмб-
рионов мыши // Проблемы криобиологии. – 2001. – №2. –
С. 49–55.
12.Чизмаджиев Ю.А., Черномордик Л.В., Пастушенко В.Ф.,
Абидор И.Г. Электрический пробой бислойных липидных
мембран // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика мемб-
ран. – 1982. – Т. 2. – 308 с.
13.Шигимага В.А., Мегель Ю.Е. Метод определения прово-
димости ооцитов и эмбрионов в различных условиях
диэлектрической среды // Новые решения в современной
технологии: Сб. трудов. – Харьков: НТУ ХПИ, 2011. – №9. –
С. 140–144.
14.Шигимага В.А. Определение проводимости эмбриональ-
ных клеток животных // Проблемы бионики. – 2003. –
Вып. 59. – С. 60–64.
15.Пат. №34333 Україна, МПК G01N33/483. Спосіб визначення
стійкості мембрани поодинокої клітини у розчині кріо-
протектора / В.О. Шигимага, Є. І. Смольянінова; заявник і
патентовласник ІПКіК НАН України – № U200802374;
Заявл. 25.02.2008; опубл.11.08.2008, Бюл. №15.
16.Сhehl J. Electroporation: theory and methods, perspectives
for drug delivery, gene therapy and research // Acta Physiol.
Scand. – 2003. – Vol. 177, №4. – P. 437–447.
17.Cobo A., de los Santos M.J., Castello D. et al. Outcomes of
vitrified early stages and blastocyst-stage embryos in
cryopreservation program: evaluation of 3,150 warming
cycles // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 98, N5. – P. 1138–1146.
18.Day M.L., Johnson M.H., Cook D.J. A cytoplasmic cell cycle
controls the activity of a K+ channel in preimplantation mouse
embryos // EMBO J. – 1998. – Vol. 17, №7. – P. 1952–1960.
19.Dovey S. Oocyte cryopreservation: advances and draw
back // Minerva Ginecol. – 2012. – Vol. 64, №6. – P. 485–500.
20.Emery B.R., Miller R.L., Carrell D.T. Hamster oocyte membrane
potential and ion permeability vary with prenatal cumulus cell
attachment and development and developmental stage // BMC
Dev. Biol. – 2001. – 1:14.
21.Gosden R. Cryopreservation: a cold look at technology for
fertility preservation // Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 96, №2. –
P. 264–268.
22.Guide to electroporation and electrofusion / Ed. by: D.C. Chang,
B.M. Chassy, J.A. Saunders, A.E. Sowers. – London:
Academic Press, 1992. – 571 p.
23.Harper J., Magli M.C., Lundin K. et al. When and how should
new technology be introduced into the IVF laboratory // Hum.
Reprod. – 2012. – Vol. 27, №2. – P. 303–313.
24.Jin B., Mochida K., Ogura A. et al. Equilibrium vitrification of
mouse embryos at various developmental stages // Mol.
Reprod. Dev. – 2012. – Vol. 79, №11. – P. 785–794.
25.Lin J., Phy J., Yeomans E. Theoretical considerations regarding
slow cooling and vitrification // Theriogenology. – 2012. –
Vol. 78, №8. – P. 1641–1652.
8. Smolyaninova E.I., Pishko O.V., Lisina E.G. et al. Analysis of
the effect of different stages of cryopreservation by vitrifi-
cation in ethylene glycol – sucrose medium on the viability of
two–cell mouse embryos // Problems of Cryobiology. – 2007. –
Vol. 17, N4. – P. 385–393.
9. Smolyaninova E.I., Pogorelov A.G., Lisina E.G. et al. Effect of
freezing medium on viability and the cationic composition of
early mouse embryos // Problems of Cryobiology. – 2005. –
Vol. 15, N3. – P. 3–10.
10.Smolyaninova E.I., Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V.,
Pischko O.V. Effect of equilibration in the freezing medium on
osmotic stability and viability of 8-cell mouse embryos //
Problems of Cryobiology. – 2004. – N1. – P. 3–11.
11. Smolyaninova E.I., Khromenkova O.B., Zhernoklev G.V. Effect
of different stages of cryopreservation method by ultra-rapid
freezing on osmotic stability and morphofunctional integrity of
mouse embryos // Problems of Cryobiology. – 2001. – N2. –
P. 49–55.
12.Chizmadzhiev Yu.A., Chernomordik L.V., Pastushenko V.F.,
Abidor I.G. Electric breakdown of bilayer lipid membranes //
Itogi Nauki i Tekhniki. Series: Biophysics of Membranes. –
1982. – Vol. 2. – 308 p.
13.Shigimaga V.A., Megel Yu.E. Method for determining the con-
ductivity of oocytes and embryos in different conditions of
the dielectric environment // New solutions in modern techno-
logy. Collection of papers. – Kharkov, 2011. – N9. – P. 140–144.
14.Shigimaga V.A. Determination of conductivity of embryonic cells
of animals // Problemy Bioniki. – 2003. – Issue 59. – P. 60–64.
15.Patent Nr 34333 of Ukraine, IPC G01N33/483. Method of
determination of resistance of single cell membrane in
cryoprotectant solution / V.O. Shigimaga, E.I. Smolyanіnova,
Applied by and owned by ІPC&C of the National Academy of
Sciences of Ukraine – Nr.U200802374; Filed 25.02.2008;
Published 11.08.2008, Bulletin Nr. 15.
16.Сhehl J. Electroporation: theory and methods, perspectives
for drug delivery, gene therapy and research // Acta Physiol.
Scand. – 2003. – Vol. 177, N4. – P. 437–447.
17.Cobo A., de los Santos M.J., Castello D. et al. Outcomes of
vitrified early stages and blastocyst-stage embryos in
cryopreservation program: evaluation of 3,150 warming
cycles // Fertil. Steril. – 2012. – Vol. 98, N5. – P. 1138–1146.
18.Day M.L., Johnson M.H., Cook D.J. A cytoplasmic cell cycle
controls the activity of a K+ channel in preimplantation mouse
embryos // EMBO J. – 1998. – Vol. 17, N7. – P. 1952–1960.
19.Dovey S. Oocyte cryopreservation: advances and draw
back // Minerva Ginecol. – 2012. – Vol. 64, N6. – P. 485–500.
20.Emery B.R., Miller R.L., Carrell D.T. Hamster oocyte membrane
potential and ion permeability vary with prenatal cumulus cell
attachment and development and developmental stage // BMC
Dev. Biol. – 2001. – 1:14.
21.Gosden R. Cryopreservation: a cold look at technology for fertility
preservation // Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 96, N2. – P. 264–268.
22.Guide to electroporation and electrofusion / Ed. by: D.C. Chang,
B.M. Chassy, J.A. Saunders, A.E. Sowers. – London: Academic
Press, 1992. – 571 p.
23.Harper J., Magli M.C., Lundin K. et al. When and how should
new technology be introduced into the IVF laboratory // Hum.
Reprod. – 2012. – Vol. 27, N2. – P. 303–313.
24.Jin B., Mochida K., Ogura A. et al. Equilibrium vitrification of
mouse embryos at various developmental stages // Mol.
Reprod. Dev. – 2012. – Vol. 79, N11. – P. 785–794.
25. Lin J., Phy J., Yeomans E. Theoretical considerations regarding
slow cooling and vitrification // Theriogenology. – 2012. –
Vol. 78, N8. – P. 1641–1652.
26.Mukaida T., Oka C. Vitrification of oocytes, embryos and blasto-
cysts // Best Pract. Res. Clin. Obst. Gynaecol. – 2012. – Vol. 26,
N6. – P. 789–803.
27.Pogorelov A.G., Katkov I.I., Smolyaninova E.I. Goldshtein D.V.
Changes in intracellular potassium and sodium content of 2-
cell mouse embryos induced by exposition to vitrification
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 3, 2013
239
26.Mukaida T., Oka C. Vitrification of oocytes, embryos and blasto-
cysts // Best Pract. Res. Clin. Obst. Gynaecol. – 2012. – Vol. 26,
№6. – P. 789–803.
27.Pogorelov A.G., Katkov I.I., Smolyaninova E.I. Goldshtein D.V.
Changes in intracellular potassium and sodium content of 2-
cell mouse embryos induced by exposition to vitrification
concentrations of ethylene glycol // CryoLetters. – 2006. –
Vol. 27, №2. – P. 87–98.
28.Rols M. P. Mechanism by which electroporation mediates DNA
migration and entry into cells and targeted tissues // Methods
Mol. Biol. – 2008. – Vol. 423, №1. – P. 19–33.
29.Rols M.P. Electropermeabilization, a physical method for the
delivery of therapeutic molecules into cells // Biochim. Biophys.
Acta. – 2006. – Vol. 1758, №3. – P. 423–428.
30.Shigimaga V.A. Impulse conductometer for biological cells and
liquid media // Measurement Techniques. – 2013. – Vol. 55,
№11. – Р. 1294–1300.
31.Tsong T.Y. Electroporation of cell membrane // Biophys. J. –
1991. – Vol. 60, №2. – P. 297–306.
32.Trimarchi J.R., Lui L., Smith P.J.S., Keefe D.L. Noninvasive
measurement of potassium efflux as an early indicator of cell
death in mouse embryos // Biol. Reprod. – 2000. – Vol. 63,
№3. – P. 851–857.
33. Weaver J.C. Theory of electroporation: a review // Bioelectro-
chem. Bioenerg. – 1996. – Vol. 41, №2. – P. 135–160.
34.Zimmermann U. Electric field mediated fusion and related
electrical phenomena // Biochim. Biophys. Acta. – 1982. –
Vol. 694, №3. – P. 227–277.
concentrations of ethylene glycol // CryoLetters. – 2006. –
Vol. 27, N2. – P. 87–98.
28.Rols M. P. Mechanism by which electroporation mediates DNA
migration and entry into cells and targeted tissues // Methods
Mol. Biol. – 2008. – Vol. 423, N1. – P. 19–33.
29.Rols M.P. Electropermeabilization, a physical method for the
delivery of therapeutic molecules into cells // Biochim. Biophys.
Acta. – 2006. – Vol. 1758, N3. – P. 423–428.
30.Shigimaga V.A. Impulse conductometer for biological cells and
liquid media // Measurement Techniques. – 2013. – Vol. 55,
N11. – Р. 1294–1300.
31.Tsong T.Y. Electroporation of cell membrane // Biophys. J. –
1991. – Vol. 60, N2. – P. 297–306.
32.Trimarchi J.R., Lui L., Smith P.J.S., Keefe D.L. Noninvasive
measurement of potassium efflux as an early indicator of cell
death in mouse embryos // Biol. Reprod. – 2000. – Vol. 63,
N3. – P. 851–857.
33.Weaver J.C. Theory of electroporation: a review // Bioelectro-
chem. Bioenerg. – 1996. – Vol. 41, №2. – P. 135–160.
34.Zimmermann U. Electric field mediated fusion and related
electrical phenomena // Biochim. Biophys. Acta. – 1982. –
Vol. 694, N3. – P. 227–277.
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68728 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T15:55:06Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Смольянинова, Е.И. Шигимага, В.А. Стриха, О.А. Попивненко, Л.И. Лисина, Е.Г. 2014-09-27T16:20:10Z 2014-09-27T16:20:10Z 2013 Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей / Е.И. Смольянинова, В.А. Шигимага, О.А. Стриха, Л.И. Попивненко, Е.Г. Лисина // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 3. — С. 228-239. — Бібліогр.: 34 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68728 57.043:611.013:57.043 В работе методом импульсной кондуктометрии впервые определены значения удельной электрической проводимости 2-клеточных эмбрионов мыши после экспозиции в этиленгликоль-сахарозной среде и полного цикла криоконсервирования методом витрификации. Показано, что после экспозиции эмбрионов в среде витрификации увеличиваются значения их электрической проводимости по сравнению с контрольными ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м и (1,54 ± 0,11)÷ (6,12 ± 0,34)×10–3 См/м соответственно). Увеличение времени экспозиции с 1,5 до 3 мин снижает устойчивость плазматических мембран эмбрионов к действию импульсного электрического поля. Проведенные исследования показали, что электрическая проводимость может быть чувствительным диагностическим клеточным параметром, отражающим нарушения морфофункциональной целостности клеток на различных этапах криоконсервирования. У роботі методом імпульсної кондуктометрії вперше визначені значення питомої електричної провідності 2-клітинних ембріонів мишей після експозиції в етиленгліколь-сахарозному середовищі та повного циклу кріоконсервування методом вітрифікації. Показано, що після експозиції ембріонів у середовищі вітрифікації збільшуються значення їх електричної провідності у порівнянні з контрольними ((2,24 ± 0,64) ÷ (3,86 ± 0,68)×10–3 См/м і (1,54 ± 0,11) ÷ (6,12 ± 0,34)×10–3, відповідно). Збільшення часу експозиції від 1,5 до 3 хв знижує стійкість плазматичних мембран ембріонів до дії імпульсного електричного поля. Проведені дослідження показали, що електрична провідність може бути чутливим діагностичним клітинним параметром, який віддзеркалює порушення у морфофункціональній цілісності клітин на різних етапах кріоконсерування. In this study the values of specific electric conductivity of 2-cell murine embryos after their exposure in ethylene glycol and sucrose medium and complete cryopreservation cycle by vitrification were determined using the method of impulse conductometry. It has been shown that embryo exposure in vitrifying medium led to an increase in their electric conductivity values in comparison with the control ones ((2.24 ± 0.64) ÷ (3.86 ± 0.68)×10–3 S/m) and (1.54 ± 0.11)÷ (6.12 ± 0.34)×10–3 S/m, respectively). Extension of exposure time from 1.5 min to 3 min led to a decrease in embryo plasma membrane resistance to pulse electric field action. The investigation showed that electric conductivity could be a sensitive diagnostic cell parameter reflecting disturbances in cell morphofunctional integrity at various stages of cryopreservation. ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей Effect of Cryopreservation Stages by Vitrification in Ethylene Glycol and Sucrose Medium on 2-Cell Murine Embryos Electric Conductivity Article published earlier |
| spellingShingle | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей Смольянинова, Е.И. Шигимага, В.А. Стриха, О.А. Попивненко, Л.И. Лисина, Е.Г. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| title_alt | Effect of Cryopreservation Stages by Vitrification in Ethylene Glycol and Sucrose Medium on 2-Cell Murine Embryos Electric Conductivity |
| title_full | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| title_fullStr | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| title_full_unstemmed | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| title_short | Влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| title_sort | влияние этапов криоконсервирования методом витрификации в этиленгликоль-сахарозной среде на электрическую проводимость 2-клеточных эмбрионов мышей |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68728 |
| work_keys_str_mv | AT smolʹâninovaei vliânieétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenaélektričeskuûprovodimostʹ2kletočnyhémbrionovmyšei AT šigimagava vliânieétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenaélektričeskuûprovodimostʹ2kletočnyhémbrionovmyšei AT strihaoa vliânieétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenaélektričeskuûprovodimostʹ2kletočnyhémbrionovmyšei AT popivnenkoli vliânieétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenaélektričeskuûprovodimostʹ2kletočnyhémbrionovmyšei AT lisinaeg vliânieétapovkriokonservirovaniâmetodomvitrifikaciivétilenglikolʹsaharoznoisredenaélektričeskuûprovodimostʹ2kletočnyhémbrionovmyšei AT smolʹâninovaei effectofcryopreservationstagesbyvitrificationinethyleneglycolandsucrosemediumon2cellmurineembryoselectricconductivity AT šigimagava effectofcryopreservationstagesbyvitrificationinethyleneglycolandsucrosemediumon2cellmurineembryoselectricconductivity AT strihaoa effectofcryopreservationstagesbyvitrificationinethyleneglycolandsucrosemediumon2cellmurineembryoselectricconductivity AT popivnenkoli effectofcryopreservationstagesbyvitrificationinethyleneglycolandsucrosemediumon2cellmurineembryoselectricconductivity AT lisinaeg effectofcryopreservationstagesbyvitrificationinethyleneglycolandsucrosemediumon2cellmurineembryoselectricconductivity |