Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека
Перспективным направлением при разработке криозащитных сред для криоконсервирования эритроцитов является использование смеси криопротекторов, относящихся к разным классам химических соединений. В данном исследовании оценивали криозащитную активность комбинаций представителя класса полиолов – непрони...
Saved in:
| Published in: | Проблемы криобиологии и криомедицины |
|---|---|
| Date: | 2013 |
| Main Authors: | , , |
| Format: | Article |
| Language: | Russian |
| Published: |
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
2013
|
| Subjects: | |
| Online Access: | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68761 |
| Tags: |
Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
|
| Journal Title: | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| Cite this: | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека / А.В. Николенко, О.В. Вязовская, В.В. Чеканова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 297-308. — Бібліогр.: 28 назв. — рос., англ. |
Institution
Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine| _version_ | 1860204106839228416 |
|---|---|
| author | Николенко, А.В. Вязовская, О.В. Чеканова, В.В. |
| author_facet | Николенко, А.В. Вязовская, О.В. Чеканова, В.В. |
| citation_txt | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека / А.В. Николенко, О.В. Вязовская, В.В. Чеканова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 297-308. — Бібліогр.: 28 назв. — рос., англ. |
| collection | DSpace DC |
| container_title | Проблемы криобиологии и криомедицины |
| description | Перспективным направлением при разработке криозащитных сред для криоконсервирования эритроцитов является использование смеси криопротекторов, относящихся к разным классам химических соединений. В данном исследовании оценивали криозащитную активность комбинаций представителя класса полиолов – непроникающего криопротектора оксиэтилированного метилцеллозольва со степенью полимеризации n = 33–35 и класса амидов – проникающего криопротектора диметилацетамида (ДМАц).
Перспективним напрямком при розробці кріозахисних середовищ для кріоконсервування еритроцитів є використання суміші кріопротекторів, які належать до різних класів хімічних сполук. У цьому дослідженні оцінювали кріозахисну активність комбінацій представника класу поліолів – непроникаючого кріопротектора оксиетильованого метилцелозольву зі ступенем полімерізації n = 33–35 і класу амидів – проникаючого кріопротектора диметилацетаміду (ДМАц).
Using the media, which combine cryoprotectants being chemicals of different classes, is prospective when developing cryoprotective solutions to cryopreserve erythrocytes. This investigation was performed to evaluate cryoprotective activity of media combining representative of polyols, non-penetrating cryoprotectant oxyethylated methyl cellosolve with polymerization degree of n = 33–35 and the representative of amides, penetrating cryoprotectant dimethyl acetamide (DMAc).
|
| first_indexed | 2025-12-07T18:11:19Z |
| format | Article |
| fulltext |
УДК 57.043:611.013:57.043
А.В. Николенко*, О.В. Вязовская, В.В. Чеканова
Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации
оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при
замораживании-отогреве эритроцитов человека
UDC 57.043:611.013:57.043
A.V. Nikolenko*, O.V. Vyazovska, V.V. Chekanova
Cryoprotective Efficiency of Media Combining
Oxyethylated Methylcellosolve and Dimethyl Acetamide during
Freeze-Thawing of Human Erythrocytes
Реферат: Перспективным направлением при разработке криозащитных сред для криоконсервирования эритроцитов
является использование смеси криопротекторов, относящихся к разным классам химических соединений. В данном иссле-
довании оценивали криозащитную активность комбинаций представителя класса полиолов – непроникающего криопротектора
оксиэтилированного метилцеллозольва со степенью полимеризации n = 33–35 (ОЭМЦn=33–35) и класса амидов – проникающего
криопротектора диметилацетамида (ДМАц). Комбинации ОЭМЦn=33–35 и ДМАц в весовых соотношениях 1:1 (10 и 10%); 2:1 (10
и 5%); 3:1 (15 и 5%); 4:1 (20 и 5%); 5:1 (25 и 5%) сравнивали с 20 и 30%-ми растворами ОЭМЦn=33–35. Растворы добавляли к
эритромассе в соотношении 1:1 (объем/объем) при температуре 20...22°С, клеточные суспензии замораживали путем
погружения в жидкий азот. Установлено, что включение ДМАц в криозащитные среды на основе ОЭМЦn=33–35 повышало
осмотическую устойчивость эритроцитов после замораживания-отогрева. Использование растворов криопротекторов
ОЭМЦn=33–35 и ДМАц в соотношении 1:1 (10 и 10%) и 3:1 (15 и 5%) обеспечивало высокую сохранность эритроцитов после
замораживания-отогрева. Установлена корреляционная связь осмотической хрупкости эритроцитов с показателями внут-
риклеточного содержания калия и натрия после замораживания-отогрева и гематокрита на этапе экспозиции с криозащит-
ными средами.
Ключевые слова: эритроциты, криоконсервирование, многокомпонентные криозащитные среды, оксиэтилированный
метилцеллозольв, диметилацетамид.
Реферат: Перспективним напрямком при розробці кріозахисних середовищ для кріоконсервування еритроцитів є викорис-
тання суміші кріопротекторів, які належать до різних класів хімічних сполук. У цьому дослідженні оцінювали кріозахисну
активність комбінацій представника класу поліолів – непроникаючого кріопротектора оксиетильованого метилцелозольву
зі ступенем полімерізації n = 33–35 (ОЕМЦn=33–35) і класу амидів – проникаючого кріопротектора диметилацетаміду (ДМАц).
Комбінації ОЕМЦn=33–35 і ДМАц у вагових співвідношеннях 1:1 (10 і 10%); 2:1 (10 і 5%); 3:1 (15 і 5%); 4:1 (20 і 5%); 5:1 (25 і 5%)
порівнювали з 20 и 30%-ми розчинами ОЕМЦn=33–35. Розчини додавали до еритромаси в співвідношенні 1:1 (об’єм/об’єм) при
температурі 20...22°С, клітинні суспензії заморожували шляхом занурення в рідкий азот. Встановлено, що включення ДМАц
у кріозахисні середовища на основі ОЕМЦn=33–35 підвищувало осмотичну стійкість еритроцитів після заморожування-відігріву.
Використання розчинів кріопротекторів ОЕМЦn=33–35 і ДМАц у співвідношенні 1:1 (10 і 10%) та 3:1 (15 і 5%) забезпечувало
високу збереженість еритроцитів після заморожування-відігріву. Встановлено кореляційний зв’язок осмотичної крихкості
еритроцитів з показниками внутрішньоклітинного вмісту калію та натрію після заморожування-відігріву та гематокриту на
етапі експозиції з кріозахисними середовищами.
Ключові слова: еритроцити, кріоконсервування, багатокомпонентні кріозахисні середовища, оксиетильований
метилцелозольв, диметилацетамід.
Abstract: Using the media, which combine cryoprotectants being chemicals of different classes, is prospective when developing
cryoprotective solutions to cryopreserve erythrocytes. This investigation was performed to evaluate cryoprotective activity of media
combining representative of polyols, non-penetrating cryoprotectant oxyethylated methyl cellosolve with polymerization degree of
n = 33–35 (OEMCn=33–35) and the representative of amides, penetrating cryoprotectant dimethyl acetamide (DMAc). Combinations of
OEMCn=33–35 and DMAc in concentration (w/w) ratios 1:1 (10 and 10%); 2:1 (10 and 5%); 3:1 (15 and 5%); 4:1 (20 and 5%); 5:1 (25 and
5%) were compared with 20 and 30% OEMCn=33–35 solutions. Addition of DMAc to cryoprotective media based on OEMCn=33–35 increased
the post-thaw osmotic resistance of erythrocytes. Application of the media combining OEMCn=33–35 and DMAc in ratios of 1:1 (10 and
10%) and 3:1 (15 and 5%) provided a high post-thaw survival of erythrocytes. Osmotic fragility of erythrocytes was found to
correlate with the indices of intracellular content of potassium and sodium and with hematocrit value during exposure of the cells in
cryoprotective media.
Key words: erythrocytes, cryopreservation, multicomponent cryoprotective media, oxyethylated methyl cellosolve, dimethyl
acetamide.
*Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:
ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015;
тел.: (+38 057) 373-30-07, факс: (+38 057) 373-30-84,
электронная почта: nikolav54@rambler.ru
* To whom correspondence should be addressed:
23, Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015;
tel.:+380 57 373 3007, fax: +380 57 373 3084,
e-mail: nikolav54@rambler.ru
Department of Cryoprotectants, Institute for Problems of Cryobiol-
ogy and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of
Ukraine, Kharkov, Ukraine
Отдел криопротекторов, Институт проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины, г. Харьков
Поступила 23.09.2013
Принята в печать 14.10.2013
Проблемы криобиологии и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №4. – С. 297–308.
© 2013 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
Received September, 23, 2013
Accepted October, 14, 2013
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23, Nr. 4. – P. 297–308.
© 2013 Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine
оригинальное исследование research article
Разработка криозащитных сред для заморажи-
вания эритроцитов на основе непроникающих крио-
протекторов связана с необходимостью создания
безотмывочных методов, значительно упрощаю-
щих технологию криоконсервирования и практичес-
кое применение эритроцитов [12, 16].
Перспективным направлением при разработке
криозащитных сред является использование сме-
сей криопротекторов, относящихся к разным клас-
сам химических соединений. Сочетание низко- и
высокомолекулярных криопротекторов с сахарами
(декстраном, сахарозой, трегалозой, глюкозой)
эффективно при замораживании эритроцитов, тром-
боцитов, стволовых клеток [15, 20, 21, 23–25].
Выраженную криозащитную эффективность проя-
вили смеси амидов и полиолов, поскольку по ряду
физико-химических свойств они дополняют друг
друга; комбинирование сред на основе представи-
телей этих классов позволило снизить концент-
рацию каждого из криопротекторов и уменьшить
токсичность среды [9]. Криозащитное действие
амидов связывают с их способностью быстро про-
никать через клеточную мембрану и взаимодейст-
вовать как с липидными компонентами мембран,
так и с молекулами воды, что является следствием
биполярной структуры амидов и относительно
малых размеров их молекул [3, 8, 13]. Установлено,
что в присутствии амидов замедляется скорость
роста кристаллов льда и существенно снижается
скорость укрупнения кристаллов в процессе
рекристаллизации [13]. Амиды были испытаны на
значительном количестве биологических объек-
тов, в том числе на эритроцитах и тромбоцитах
человека, но практическое применение получил
только диметилацетамид, который в составе крио-
консерванта «Тромбокриодмац» используют для
замораживания тромбоцитов человека [4, 17].
Показана эффективность комбинированных
криозащитных сред, содержащих ДМАц и полиолы,
при замораживании тромбоцитов [4]. Для полиолов
характерна высокая гидрофильность, т. е. способ-
ность образовывать водородные связи с молекула-
ми воды и, как следствие, обеспечивать мелкокрис-
таллическую структуру льда. Анализ физического
состояния бинарных систем вода – оксиэтилиро-
ванный глицерин со степенью полимеризации
n = 25, 30 (ОЭГn=25,30) и вода – оксиэтилированный
метилцеллозольв со степенью полимеризации
n = 33–35 (ОЭМЦn=33–35) методом дифференциаль-
ной сканирующей калориметрии показал, что ис-
следуемые системы при замораживании проявляли
способность к частичному стеклованию, если кон-
центрация полиолов составляла 5–45% [6, 28]. Эти
свойства во многом могут объяснять высокую
криопротекторную активность полиолов при замо-
Development of cryoprotective media based on
non-penetrating cryoprotectants is dictated by the need
to create ‘no-wash’ techniques, which would simp-
lify the process of cryopreservation and application of
erythrocytes [12, 16].
Application of mixture of cryoprotectants referring
to different classes of chemical compounds is a
prospective direction when developing cryoprotective
media. Combination of low- and high-molecular cryo-
protectants with sugars (dextran, sucrose, trehalose,
glucose) was effective during freezing of erythrocytes,
platelets, stem cells [15, 20, 21, 23–25]. Mixtures of
amides and polyols manifested the expressed cryo-
protective efficiency, whereas some of their physical
and chemical properties complemented each other;
media combining the representatives of these classes
allowed to reduce concentration of each cryopro-
tectant and thereby to decrease medium toxicity [9].
Cryoprotective effect of amides was associated with
their ability to penetrate rapidly through cell membranes
and interact with both lipid components of membranes
and water molecules, that was due to bipolar structure
of amides and relatively small molecules [3, 8, 13]. It
was established that presence of amides reduced the
rate of ice crystals growth and significantly decreased
the degree of crystals aggregation during recrystalliza-
tion [13]. Amides were tested in a number of biological
objects, including human erythrocytes and platelets, but
only dimethyl acetamide gained its practical application
for freezing of human platelets as a part of ‘Thrombo-
cryodmac’ cryopreservative [4, 17].
Efficiency of cryoprotective media combining
DMAc and polyols was shown during freezing of
platelets [4]. The polyols possess high hydrophilicity,
i. e. capacity to form hydrogen bonds with water mole-
cules and, as a result, to provide microcrystalline struc-
ture of ice. Differential scanning calorimetric analysis
of physical state of binary systems water – oxy-
ethylated glycerol with polymerization degree of n = 25,
30 (OEGn=25,30) and water – oxyethylated methyl
cellosolve with polymerization degree of n = 33–35
(OEMCn=33–35) showed that the studied systems were
able to partial vitrification, if the concentration of
polyols was 5–45% [6, 28]. To a large extent, these
properties could explain a high cryoprotective activity
of polyols when freezing blood cells [7, 12].
Oxyethyl derivatives of polyols (e. g. of glycerol and
ethylene glycol) are of special attention, as they are
high-molecular non-penetrating substances, which
could be the base for effective cryoprotective media
developed to freeze blood cells [1, 12]. Principally, the
effect of high-molecular cryoprotectants is associated
with cell dehydration [2]. On one hand, providing of
water efflux from a cell decreases the possibility of
intracellular crystallization when freezing; on another,
298 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
раживании клеток крови [7, 12]. Оксиэтильные
производные полиолов (глицерина и этиленгликоля)
заслуживают особого внимания, поскольку они
представляют собой высокомолекулярные непро-
никающие вещества, на основе которых возможна
разработка эффективных криозащитных сред для
замораживания клеток крови [1, 12]. Одним из
механизмов действия высокомолекулярных крио-
протекторов является дегидратация клеток [2]. С
одной стороны, выход воды из клетки снижает
вероятность внутриклеточной кристаллизации при
замораживании, с другой, чрезмерное обезвожи-
вание клеток приводит к повышению осмолярности
внутриклеточной среды, что может стать причи-
ной повреждения различных клеточных структур
и нарушения барьерной функции плазматической
мембраны. Поэтому одной из задач при создании
криозащитных сред на основе непроникающих
криопротекторов является уменьшение негативно-
го влияния дегидратации клеток, что может быть
достигнуто включением в состав сред консервиро-
вания различных добавок, в том числе проникаю-
щих криопротекторов. Присутствие проникающих
криопротекторов в составе таких криозащитных
сред может также снижать повреждающее дейст-
вие внутриклеточного льда на этапе заморажива-
ния-отогрева.
Оксиэтилированный метилцеллозольв (ОЭМЦ)
как непроникающий криопротектор был использо-
ван ранее при замораживании эритроцитов кордовой
и донорской крови человека [12, 16]. Исследование
криозащитных свойств сред на основе ОЭМЦ при
замораживании эритроцитов донорской крови чело-
века показало, что введение в состав сред углево-
дов приводило к снижению степени дегидратации
клеток на этапе экспозиции в криозащитных средах
и в итоге способствовало повышению сохранности
эритроцитов [22].
Целью представленной работы являлось ис-
следование эффективности криозащитных сред,
содержащих комбинации оксиэтилированного
метилцеллозольва и диметилацетамида в разных
соотношениях при замораживании-отогреве эрит-
роцитов человека.
Материалы и методы
Эритромассу получали методом центрифуги-
рования (930g, 15 мин) донорской крови человека
(n = 9), заготовленной на гемоконсерванте «Глюги-
цир» и хранившейся не более 2-х суток в холодиль-
нике (3°С). Гематокрит полученной эритромассы
составлял в среднем 70%.
В работе использовали многокомпонентные
среды, содержащие ОЭМЦn=33–35 и ДМАц в сле-
excessive cell dehydration results in rising intracellu-
lar environment osmolarity that may result in damage
of cell components and impairment of plasma mem-
brane barrier properties. That is why one of the objecti-
ves during development of cryoprotective media is to
minimize the negative effect of dehydration that could
be reached by introducing several supplements to pre-
servating media, penetrating cryoprotectants in parti-
cular. Presence of penetrating cryoprotectants in such
a cryoprotective media could also contribute to a de-
crease of damaging effect exhibited by intracellular
ice during freeze-thawing.
Oxyethylated methyl cellosolve (OEMC) was used
as non-penetrating cryoprotectant during freezing of
erythrocytes of human cord blood and adult donor blood
[12, 16]. Investigation of cryoprotective properties of
the media based on OEMC during freezing of erythro-
cytes of human adult donor blood showed that supple-
mentation of cryoprotective media with carbohydrates
allowed to decrease cell dehydration extent during ex-
posure in cryoprotective media and finally to elevate
erythrocyte post-thaw survival [22].
The research aim was to study the efficiency of
cryoprotective media containing combinations of
oxyethylated methyl cellosolve and dimethyl acetamide
in different ratios during freeze-thawing of human
erythrocytes.
Materials and methods
Erythromass was procured by centrifugation (930g,
15 min) from human adult donor blood (n = 9) stored
in Glugicyr preservative not longer than for 2 days in a
fridge (3°C). Average hematocrit of resulted erythro-
mass was 70%.
The experiments were conducted in multicomponent
media with following combinations of cryoprotectants
OEMCn=33–35 and DMAc, correspondingly: 1:1 (10 and
10%, hereinafter we use % w/w); 2:1 (10 and 5%);
3:1 (15 and 5%); 4:1 (20 and 5%); 5:1 (25 and 5%).
Cryoprotective efficiency of the studied media was
compared with ‘reference’ solutions of 20 and 30%
OEMCn=33–35. All the media were prepared with
150 mmol NaCl solution. Erythromass specimens were
supplemented with the studied solutions in 1:1 ratio
(v/v) at 20...22°C. Exposure duration was 45 min.
Thereafter the erythrocyte suspension in cryoprotecti-
ve media was placed into 2 ml plastic vials (Russia)
and frozen by plunging into liquid nitrogen. The frozen
samples of erythrocytes were stored at the liquid
nitrogen temperature during 2 months and warmed in
water bath at 40...42°C for 1 min.
Cryoprotective properties of the media were asses-
sed by the indices, characterizing erythrocyte post-thaw
survival such as hemolysis (percentage of hemolysed
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
299
дующих концентрационных соотношениях: 1:1 (10
и 10 %, здесь и далее указаны % масс.); 2:1 (10 и
5%), 3:1 (15 и 5%); 4:1 (20 и 5%); 5:1 (25 и 5%).
Криозащитную эффективность указанных сред
сравнивали с «базовыми» растворами 20 и 30%
ОЭМЦn=33–35. Все среды готовили на растворе
150 ммоль NaCl. Исследуемые среды добавляли
к эритромассе в соотношении 1:1 (объем/объем)
при температуре 20...22°С. Продолжительность
экспозиции составляла 45 мин. Затем взвесь эрит-
роцитов с криозащитными средами помещали в
полиэтиленовые ампулы (Россия) вместимостью
2 мл и замораживали погружением в жидкий азот.
Замороженные образцы эритроцитов после хране-
ния при температуре жидкого азота в течение
2-х месяцев отогревали на водяной бане при темпе-
ратуре 40...42°С в течение 1 мин.
Криозащитные свойства сред оценивали по по-
казателям, характеризующим сохранность эритро-
цитов: гемолиз (процент разрушенных клеток после
замораживания-отогрева), осмотическая хруп-
кость (процент разрушенных эритроцитов после за-
мораживания-отогрева и помещения в изотоничес-
кий раствор NаСl), внутриклеточное содержание
ионов калия и натрия. Уровень гемолиза и осмо-
тическую хрупкость эритроцитов после заморажи-
вания-отогрева определяли по выходу гемоглобина
из клеток спектрофотометрическим методом при
длине волны 540 нм и рассчитывали относительно
100%-го гемолиза [11]. Внутриклеточное содержа-
ние калия и натрия измеряли на пламенном фото-
метре ПАЖ-1 (СССР), для этого взвесь эритроци-
тов центрифугировали в течение 15 мин при 230g,
отделяли надосадок, и образцы отцентрифуги-
рованной эритромассы объемом 150 мкл гемолизи-
ровали в дистиллированной воде. В полученном
растворе, а также в надосадке определяли содер-
жание калия и натрия [11]; приведенные в работе
данные пересчитаны на 100%-й гематокрит.
Исследуемые показатели оценивали до заморажи-
вания после экспозиции клеток в криозащитных
средах относительно контроля – эритромассы в
физиологическом растворе в соотношении 1:1. По-
казатели после замораживания-отогрева сравнива-
ли со значениями, полученными до замораживания
после экспозиции клеток в средах. Гематокрит оп-
ределяли в капиллярах с использованием микро-
центрифуги МГЦ-8 (6800g).
Статистическую обработку полученных резуль-
татов осуществляли с использованием программ
«MS Excel» и «Statgraphics 5.0. Plus». Данные на
рисунках и в таблице представлены в виде средне-
го ± стандартная ошибка. Для оценки значимости
различий исследуемых показателей применяли
cells post freeze-thawing), osmotic fragility (percen-
tage of hemolysed cells after freeze-thawing and
transferring into NaCl isotonic solution) and intracel-
lular content of potassium and sodium ions. Hemolysis
level and osmotic fragility of erythrocytes in the samp-
les post freeze-thawing were measured spectrophoto-
metrically at 540 nm by release of hemoglobin and
scaled in terms of 100% hemolysis [11]. Intracellular
content of potassium and sodium ions was measured
using flame photometer PAZh-1 (USSR), to do this
the erythrocyte suspension was centrifuged during
15 min at 230g, the supernatant was removed and the
centrifuged erythromass samples of 150 µl were hemo-
lyzed in distilled water. Content of potassium and sodium
was measured in the procured solution and in the
supernatant [11]; data shown in the article are scaled
in terms of 100% hematocrit. The studied indices were
evaluated prior to freezing after exposure in cryopro-
tective media and compared with the control: erythro-
mass mixed with physiological saline in 1:1 ratio. Post-
thaw values were respect of the values obtained prior
to freezing after exposure of cells with media. Hema-
tocrit was determined in capillaries using MGC-8 mic-
rocentrifuge (6800g).
The obtained results were statistically processed
with Excel and Statgraphics 5.0. Plus software. Data
in the Figures and Table are the mean ± standard error
of the mean. Nonparametric Wilcoxon U-test for non-
paired samples was used to assess statistical signifi-
cance of the differences between studied indices.
Pearson’s analysis was used to evaluate the correlation
between parameters. ANOVA test was used for
statistical assessment of effect of solution composition,
i. e. ratio between non-penetrating and penetrating
cryoprotectants in the media.
Results and discussion
Assessment of cryoprotective efficiency of the
media based on OEMC allowed to reveal the depen-
dence of erythrocyte survival on composition of the
media. Application of cryoprotective solutions com-
bining OEMC and DMAc cryoprotectants resulted in
an increasing of erythrocytes osmotic resistance in all
the studied samples (Fig. 1) if compared with ‘refe-
rence’ solutions of OEMC. The media comprising the
cryoprotectants in 1:1 and 3:1 ratios were the most
effective. The indices of osmotic fragility of erythro-
cytes decreased in 2 times if compared to appropriate
indices of erythrocytes after freeze-thawing in 20%
OEMC solution and reduced in 4 times after freeze-
thawing in 30% OEMC solution (Fig. 1). It should be
noted that osmotic resistance of erythrocytes after
freeze-thawing in medium with 5:1 OEMC and DMAc
ratio was two times higher if compared with the one
300 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
непараметрический U-критерий Уилкоксона-
Манна-Уитни для непарных выборок. Для оценки
степени взаимообусловленности изменения пара-
метров использовали корреляционный анализ
Пирса; для статистической оценки эффекта соста-
ва раствора, т. е. соотношения непроникающего и
проникающего криопротекторов в криозащитных
средах – тест АNOVA.
Результаты и обсуждение
При исследовании криозащитной эффективности
сред на основе ОЭМЦ установлена зависимость
сохранности эритроцитов от состава этих сред. Ис-
пользование криозащитных растворов, содержащих
комбинации криопротекторов ОЭМЦ с ДМАц,
приводило к повышению осмотической устойчи-
вости эритроцитов во всех исследуемых образцах
(рис. 1) по сравнению с «базовыми» растворами
ОЭМЦ. Наиболее эффективными оказались сре-
ды, содержащие комбинации криопротекторов 1:1
и 3:1. Показатели осмотической хрупкости эритро-
цитов снижались в два раза относительно соответ-
ствующих показателей эритроцитов после замора-
живания-отогрева в 20%-м растворе ОЭМЦ и в
4 раза – 30%-м растворе ОЭМЦ (рис. 1). Следует
отметить, что осмотическая устойчивость эритро-
цитов после замораживания-отогрева в среде с соот-
ношением ОЭМЦ и ДМАц 5:1 была почти в два
раза выше по сравнению с данными, полученными
при использовании 30%-го раствора ОЭМЦ. Тест
ANOVA выявил достоверный эффект состава
раствора (т. е. соотношения непрони-
кающего и проникающего криопротек-
торов) по показателю осмотической
хрупкости (F(4;27) = 6,3; p = 0,001).
После замораживания-отогрева
эритроцитов практически во всех ис-
следованных криозащитных средах
уровень гемолиза составлял 2–4%
(рис. 2). Только в случае использования
комбинированной среды, содержащей
10% ОЭМЦ и 5% ДМАц (соотно-
шение 2:1) гемолиз повышался до 7%,
т. е. указанные концентрации, вероят-
нее всего, недостаточно эффективны
в данных условиях эксперимента.
Показателем, характеризующим
целостность клеточной мембраны и
функциональную полноценность эрит-
роцитов после замораживания-отогре-
ва, является внутриклеточное содер-
жание ионов калия и натрия [5, 10, 27].
Ионы калия и натрия необходимы для
поддержания мембранного потенциа-
ла, участвуют в функционировании
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
20 % ОЭМЦ 30% ОЭМЦ ОЭМЦ:ДМАЦ
1:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
2:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
3:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
4:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
5:1
Рис. 1. Осмотическая хрупкость эритроцитов (гемолиз после пере-
носа в изотоническую среду 0,9% NaCl) после замораживания-ото-
грева в растворах, содержащих комбинации криопротекторов.
Fig. 1. Osmotic fragility of erythrocytes (hemolysis after trasferring to
0.9% NaCl isotonic media) after freeze-thawing in media with different
cryoprotectants combinations.
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
, %
30%
ОЭМЦ
OEMC
20%
ОЭМЦ
OEMC
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1
Соотношение концентраций ОЭМЦ и ДМАц
OEMC to DMAc concentrations ratio
resulted from freeze-thawing of erythrocytes with 30%
OEMC. ANOVA test revealed a significant effect of
solution composition (ratio of non-penetrating and
penetrating cryoprotectants in the media) on the index
of osmotic fragility (F(4;27) = 6.3; p = 0.001).
Freeze-thawing of erythrocytes virtually in all the
cryoprotective media resulted in hemolysis of 2–4%
(Fig. 2). Only in the case of combined medium,
combining 10% OEMC and 5% DMAc (2:1 ratio) post-
thaw hemolysis increased up to 7%, i. e. these concen-
trations were likely non-optimal in the used expeimental
conditions.
Intracellular content of potassium and sodium ions
could serve as the index characterizing cell membrane
intregrity and functional value of erythrocytes post
freeze-thawing [5, 10, 27]. Potassium and sodium ions
are important for membrane potential maintenance,
contribute to intracellular enzymes function, osmotic
and acid-base balances and other metabolic processes
as well [18, 19]. Capacity to hold potassium cations
within cells can be considered as basis for preserving
their viability. The Table shows the data of intracellular
content of these ions in erythrocytes prior to and post
freeze-thawing in the media, containing 20 and 30%
OEMC, as well as the combination with DMAc.
Rising intracellular potassium content in the studied
samples prior to freezing after exposure in cryoprotec-
tive media is mainly associated with cell dehydration.
Freeze-thawing resulted in a decrease of intracellular
potassium content. Maximum preservation of this index
(in average 88 and 81% of the value prior to freezing)
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
301
внутриклеточных ферментов, поддер-
жании осмотического, кислотно-ос-
новного равновесия, а также в других
метаболических процессах [18, 19].
Способность удерживать катионы
калия внутри клеток рассматривается
как фундаментальное свойство сохра-
нения их жизнеспособности. В таб-
лице представлены значения внутри-
клеточного содержания этих ионов в
эритроцитах до и после заморажи-
вания-отогрева в средах, содержащих
20 и 30% ОЭМЦ, а также в комбини-
рованных средах с ДМАц.
Увеличение показателя внутри-
клеточного содержания калия в ис-
следуемых образцах после экспозиции
с криозащитными средами до замо-
раживания обусловлено, главным
образом, дегидратацией клеток. За-
мораживание-отогрев образцов приве-
ло к снижению внутриклеточного
содержания калия. После заморажи-
вания-отогрева эритроцитов в средах с соотноше-
нием ОЭМЦ и ДМАц 1:1 и 3:1 отмечена макси-
мальная сохранность внутриклеточного содержа-
ния калия (в среднем соответственно 88% и 81%
от значения до замораживания). Более выражен-
ное снижение содержания внутриклеточного калия
отмечено в образцах эритроцитов после заморажи-
вания-отогрева в средах, содержащих ОЭМЦ с
ДМАц в соотношениях 2:1 и 5:1 – до 68 и 66% от
значения до замораживания соответственно. В
первом случае это могло быть связано с недоста-
точной криозащитной эффективностью среды (из-
за низкой концентрацией ОЭМЦ и ДМАц – 10 и
5% соответственно), во втором, напротив, – высо-
ким (25%) содержанием ОЭМЦ в среде (таблица).
Максимальное снижение содержания калия
наблюдалось в исследуемых образцах эритроци-
тов после замораживания-отогрева в среде с 30%
ОЭМЦ, что, по-видимому, является следствием
повреждения клеточных мембран и выхода калия
из клеток. Сохранность внутриклеточного калия
составляла в этом случае около 46% от значения
до замораживания.
Внутриклеточное содержание натрия после
криоконсервирования также зависело от состава
криозащитных сред, в которых находились эритро-
циты. Достоверное увеличение внутриклеточного
содержания натрия после замораживания-отогрева
относительно показателей до замораживания
отмечалось во всех исследуемых образцах (таб-
лица). Наиболее высокое содержание внутрикле-
точного натрия в эритроцитах отмечалось после
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
20% ОЭМЦ 30% ОЭМЦ ОЭМЦ:ДМАЦ
1:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
2:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
3:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
4:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
5:1
Рис. 2. Гемолиз эритроцитов после замораживания-отогрева в раст-
ворах, содержащих комбинации криопротекторов.
Fig. 2. Indices of erythrocytes hemolysis after freeze-thawing in different
cryoprotective media.
Ге
м
ол
из
,
%
H
em
ol
ys
is
, %
30%
ОЭМЦ
OEMC
20%
ОЭМЦ
OEMC
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1
Соотношение концентраций ОЭМЦ и ДМАц
OEMC to DMAc concentrations ratio
was found after freeze-thawing of the erythrocytes in
the media combining OEMC and DMAc in 1:1 and
3:1 ratios. Bigger reduction of intracellular potassium
content was found in erythrocytes after freeze-thawing
in the media containing OEMC and DMAс in 2:1 and
5:1 ratios: down to 68% and 66% of the value before
freeze-thawing, correspondingly. In the first case it
was likely associated with insignificant cryoprotective
efficiency of the medium (due to low concentration of
OEMC and DMAc, 10 and 5%, respectively), in the
second case it was vice versa due to a high (25%)
concentration of OEMC in the medium (Table). Maxi-
mum loss of potassium content in the cells was obser-
ved in the studied erythrocyte samples after freeze-
thawing in the medium with 30% OEMC that was,
probably, due to damages of cell membranes and potas-
sium efflux out of the cells. Intracellular potassium con-
tent made in average only 46% of the index prior to
freezing.
Intracellular sodium content after freeze-thawing
also depended on composition of cryoprotective media,
used for erythrocytes cryopreservation. Post-thaw
intracellular sodium content increased significantly if
compared with the indices prior to freezing in all the
studied samples (Table). The highest intracellular
sodium content in erythrocytes was revealed after their
freeze-thawing in the media, containing 20 and 30%
OEMC and combinations of OEMC and DMAc in 5:1
ratio.
Thus the obtained results testify to the fact that
intracellular potassium and sodium content after freeze-
thawing of erythrocytes depends on the composition
302 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
дерсватсоС
noitisopmocaideM
л/ьломм,яилакеинажредоС
l/lomm,tnetnocmuissatoP
л/ьломм,яиртанеинажредоС
l/lomm,tnetnocmuidoS
иицизопскэелсоп
erusopxetsop
-яинавижаромазелсоп
авергото
waht-tsop
иицизопскэелсоп
erusopxetsop
-яинавижаромазелсоп
авергото
waht-tsop
йиксечиголоизиФ
)ьлортнок(ровтсар
enilaslacigoloisyhP
)lortnoc(
39,2±08,48 - 96,3±53,71 -
ЦМЭО%02
CMEO%02 *37,01±50,711 86,5±57,47 # 33,6±85,12 44,3±11,64 #
ЦМЭО%03
CMEO%03 *41,1±22,601 59,7±63,84 # *89,2±11,73 01,6±10,55 #
1:1цАМД:ЦМЭО
1:1cAMD:CMEO 63,7±46,29 97,6±54,18 96,2±39,31 23,2±46,23 #
1:2цАМД:ЦМЭО
1:2cAMD:CMEO *53,5±95,49 71,5±83,46 # 69,1±60,81 68,2±95,03 #
1:3цАМД:ЦМЭО
1:3cAMD:CMEO *38,6±62,99 98,2±16,97 # 40,2±33,91 90,4±53,92 #
1:4цАМД:ЦМЭО
1:4cAMD:CMEO *46,3±19,001 89,5±74,57 # 28,2±93,12 89,2±99,23 #
1:5цАМД:ЦМЭО
1:5cAMD:CMEO *62,4±14,101 68,3±13,76 # 02,2±31,91 12,2±84,53 #
замораживания-отогрева в средах, содержащих 20
и 30% ОЭМЦ, а также комбинацию ОЭМЦ с
ДМАц в соотношении 5:1.
Таким образом, полученные результаты сви-
детельствуют о том, что внутриклеточное содер-
жание ионов калия и натрия после замораживания-
отогрева эритроцитов зависит от состава исполь-
зуемых криозащитных сред. Следует отметить,
что максимальная потеря клетками калия и поступ-
ление в них натрия отмечались после заморажи-
вания-отогрева эритроцитов в растворах с 30%
ОЭМЦ. Присутствие ДМАц в криозащитной сре-
де в соотношении с ОЭМЦ 1:1 и 3:1 повышало
устойчивость клеточных мембран эритроцитов,
что подтверждается данными по осмотической
хрупкости эритроцитов после их переноса в изото-
ническую среду (см. рис. 1).
На рис. 3 представлены показатели гематокри-
та после экспозиции эритроцитов в исследуемых
криозащитных средах. Известно, что гематокрит
является одним из показателей, характеризующих
изменение объема эритроцитов в суспензии [26].
of the used cryoprotective media. It should be noted
that maximum efflux of potassium and influx of sodium
were observed after freeze-thawing of erythrocytes
in the solutions with 30% OEMC. The presence of
DMAc in cryoprotective medium with OEMC in 1:1
and 3:1 concentration ratios increased the resistance
of cell membranes of erythrocytes that was confirmed
by the data of osmotic fragility of erythrocytes after
their placing into isotonic medium (see Fig. 1).
Fig. 3 represents the indices of hematocrit after
exposure of erythrocytes in the studied cryoprotective
media. It has been known that hematocrit is one of the
indices characterizing the change of erythrocyte
volume in suspension [26]. It is seen, that exposure of
erythrocytes in the media with different composition
prior to freezing led to a cell dehydration of various
extent. Hematocrit value at exposure stage was found
to correlate with OEMC and DMAc ratio in cryo-
protective media and erythrocyte survival indices after
freeze-thawing. After exposure of erythrocytes in
cryoprotective media with the same concentration of
OEMC and with DMAc in ratios of 1:1 (10 and10%,
Внутриклеточное содержание калия и натрия в эритроцитах после экспозиции
и после замораживания-отогрева в криозащитных средах разного состава
Indices of intracellular content of potassium and sodium in erythrocytes
post exposure and following freeze-thawing in different cryoprotective media
Примечания: * – различия значимы по сравнению с показателями контроля (физиологический раствор); # – различия значимы
по сравнению с показателями до замораживания после экспозиции в криозащитных средах; p ≤ 0,05.
Notes: * – differences are significant comparing to the control (physiological saline); # – differences are significant comparing to the values
prior to freezing and after exposure in cryoprotective media; p ≤ 0.05.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
303
На этапе экспозиции эритроцитов в
различных средах до замораживания
наблюдается разная степень дегидра-
тации клеток. Нами были установлены
зависимость изменения гематокрита
на этапе экспозиции от соотношения
ОЭМЦ и ДМАц в криозащитных сред-
ах и его связь с показателями сохран-
ности эритроцитов после заморажи-
вания-отогрева. После экспозиции
эритроцитов в криозащитных средах
с одинаковой концентрацией непрони-
кающего криопротектора ОЭМЦ в
соотношениях с ДМАц 1:1 (10 и 10%
соответственно) и 2:1 (10 и 5% соот-
ветственно) мы отмечали разные по-
казатели гематокрита (рис. 3). При-
сутствие ДМАц в концентрации 10%
в среде (соотношение 1:1) способст-
вовало незначительному снижению
гематокрита, в среднем на 8% относи-
тельно контроля (эритромассы в фи-
зиологическом растворе), что может
свидетельствовать о менее выражен-
ной дегидратации клеток после экспо-
зиции в криозащитной среде. Сохран-
correspondingly) and 2:1 (10 and 5%, correspondingly)
we revealed different indices of hematocrit (Fig. 3).
The presence of 10% DMAc in the medium (with 1:1
ratio) enabled the insignificant reduction of hematocrit
in average by 8% comparing to the control (erythro-
mass in physiological saline), that could testify to a
less expressed cell dehydration after exposure in this
cryoprotective medium. Survival of erythrocytes after
freeze-thawing in this cryoprotective medium and
transferring to isotonic solution was 92% in average
(see Fig. 1). After exposure of erythrocytes in the
cryoprotective medium with 3:1 ratio of cryoprotectants
the hematocrit value decreased in average by 19%
comparing to the control. Increasing the concentration
of OEMC in the media with ratios 4:1 (20% OEMC
and 5% DMAc) and 5:1 (25% OEMC and 5% DMAc)
resulted in a decrease of hematocrit by 23 and 29%,
correspondingly, and fall of post-thaw survival of
erythrocytes. Maximum reduction of hematocrit, in
average by 30 and 33%, was revealed after exposure
of erythrocytes in cryoprotective media, containing 20
and 30% OEMC, correspondingly. Post-thaw survival
indices of erythrocytes in these media were significant-
ly lower (see Fig. 1, Table). Amides are known to be
diphilic substances, i.e. possess simultaneously hydro-
phobic and hydrophilic properties [8]. Penetrating
mainly through lipid components of cell membranes,
DMAc can form hydrogen bonds with water via oxygen
ность эритроцитов после замораживания-отогрева
в этой среде и переноса в изотоническую среду
составляла в среднем 92% (см. рис. 1). После экс-
позиции эритроцитов в криозащитной среде с соот-
ношением криопротекторов 3:1 показатель гемато-
крита уменьшился в среднем на 19% относительно
контроля. Увеличение концентрации ОЭМЦ в
средах с соотношением 4:1 (20% ОЭМЦ и 5%
ДМАц) и 5:1 (25% ОЭМЦ и 5% ДМАц) приводило
к снижению показателя гематокрита на 23 и 29%
соответственно, и уменьшению сохранности эрит-
роцитов после замораживания-отогрева. Макси-
мальное снижение гематокрита, в среднем на 30 и
33%, отмечалось после экспозиции эритроцитов в
криозащитных средах, содержащих 20 и 30%
ОЭМЦ соответственно. Сохранность эритроцитов
после замораживания-отогрева в этих средах была
достоверно ниже (см. рис.1, таблица). Известно,
что амиды обладают выраженной дифильностью,
т. е. гидрофобностью и гидрофильностью одновре-
менно [8]. Проникая преимущественно через
липидные компоненты клеточных мембран, ДМАц
может образовывать водородные связи с водой
через атом кислорода карбонильной группы и пре-
пятствовать, с одной стороны, чрезмерному обез-
воживанию эритроцитов, а с другой, внутриклеточ-
ной кристаллизации [3, 8]. Таким образом, присут-
ствие непроникающего криопротектора ОЭМЦ и
0
5
10
15
20
25
30
35
40
эр физ р-р 20% ОЭМЦ 30 % ОЭМЦ ОЭМЦ:ДМАЦ
1:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
2:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
3:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
4:1
ОЭМЦ:ДМАЦ
5:1
Рис. 3. Гематокрит после экспозиции эритроцитов в средах с разным
составом (до замораживания); * – различия значимы по сравнению
с контролем (эритроцитами в физиологическом растворе (ФР));
p ≤ 0,05.
Fig. 3. Indices of hematocrit after exposure of erythrocytes in media with
different composition (before freezing); * – differences are significant if
compared with the control (erythrocytes in physiological saline (PS));
p ≤ 0.05.
Ге
м
ат
ок
ри
т,
%
H
em
at
oc
rit
, %
30%
ОЭМЦ
OEMC
20%
ОЭМЦ
OEMC
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1
Соотношение концентраций
ОЭМЦ и ДМАц
OEMC to DMAc concentrations ratio
ФР
PS
304 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
проникающего криопротектора ДМАц в средах в
соотношениях 1:1 и 3:1 позволило снизить как нега-
тивное влияние чрезмерной дегидратации клеток
до замораживания, так и повреждающее действие
внутриклеточной кристаллизации при заморажи-
вании-отогреве, т. е. повысить эффективность ком-
бинированных криозащитных сред.
Для оценки взаимосвязи показателей сохран-
ности эритроцитов до и после замораживания-ото-
грева был проведен корреляционный анализ. Уста-
новлена отрицательная корреляция показателя
гематокрита на этапе экспозиции клеток с криоза-
щитными средами и осмотической хрупкостью
эритроцитов после замораживания (k = –0,92).
Выявлена отрицательная корреляция осмотической
хрупкости с сохранностью внутриклеточного калия
(k = –0,90) и положительная (k = 0,66) с содержани-
ем натрия после замораживания-отогрева. Потеря
клетками калия и поступление в них натрия являют-
ся одними из существенных критериев наличия
скрытых повреждений плазматической мембраны,
что подтверждается показателями осмотической
хрупкости после помещения размороженных эрит-
роцитов в изотонический раствор NaCl.
В наших предыдущих исследованиях криоза-
щитных свойств сред на основе ОЭМЦ показано,
что сохранность эритроцитов человека после за-
мораживания-отогрева зависела от состава среды
и соотношения ее компонентов. Так, включение
углеводов (сахарозы, маннита, глюкозы) с одно-
временным снижением содержания NaCl в составе
криозащитных сред на основе ОЭМЦ способство-
вало повышению сохранности эритроцитов. Однако
показатели осмотической хрупкости разморожен-
ных эритроцитов после переноса в изотоническую
среду оставались на высоком уровне [12]. Исполь-
зование комбинированных сред, включающих
ОЭМЦ и ДМАц, в данном исследовании позволило
снизить показатели осмотической хрупкости эрит-
роцитов после замораживания-отогрева. Это мож-
но объяснить снижением осмотической нагрузки
на клеточную мембрану в процессе криоконсерви-
рования, включая менее выраженную дегидрата-
цию клеток на этапе экспозиции. Комбинация
криопротекторов ОЭМЦ и ДМАц, относящихся к
разным классам химических соединений и об-
ладающих разным механизмом защитного дейст-
вия, позволила снизить исходную концентрацию
непроникающего криопротектора в 2 раза (до 10%)
в среде с соотношением ОЭМЦ и ДМАц 1:1 и в
1,5 раза (до 15%) – в среде с соотношением
ОЭМЦ и ДМАц 3:1. Криозащитная эффективность
этих сред была достоверно выше «базовых»
of carbonyl group and prevent, on one hand, extreme
dehydration of erythrocytes, and, on another, unfavor
the intracellular crystallization [3, 8]. Thus, the combi-
nation of non-penetrating cryoprotectant OEMC and
penetrating cryoprotectant DMAc in the media with
1:1 and 3:1 ratios provided a decrease of negative effect
of cell dehydration during exposure stage and reduction
of damaging effect exhibited by intracellular crystalli-
zation during freeze-thawing, thereby increased the
cryoprotective efficiency of combined media.
We performed analysis to assess correlations be-
tween indices characterizing erythrocytes state prior to
and after freezing. A negative correlation was found
between hematocrit value during exposure of cells in
cryoprotective media and post-thaw osmotic fragility
of erythrocytes (k = –0.92). Osmotic fragility correla-
ted with post-thaw ion content: negatively (k = –0.90)
with the one of potassium and positively (k = 0.66)
with sodium. Potassium efflux and sodium influx are
one of the important criteria of latent damages of
plasma membrane, that was also confirmed by the
indices of osmotic fragility (amount of hemolysed cells
placed into isotonic NaCl solution post-thaw).
Our previously reported investigations of cryoprotec-
tive properties of the media based on OEMC showed
that post-thaw survival of erythrocytes depended on
the nature of media components and their ratio. For
example, supplementation of the OEMC based media
with carbohydrates (sucrose, mannitol, glucose) with
simultaneous reduction of NaCl content resulted in an
increase of erythrocytes survival. Nevertheless, post-
thaw erythrocytes were characterized by high indices
of osmotic fragility after transfer to isotonic medium
[12]. Application of media combining OEMC and
DMAc in this research enabled to reduce the indices
of osmotic fragility of erythrocytes after freeze-
thawing. This could be explained by reduction of osmo-
tic load onto the cell membrane during cryopreserva-
tion, in particular, less expressed cell dehydration during
exposure in cryoprotective media. Combination of
OEMC and DMAc cryoprotectants, referring to
different classes of chemical compounds and exhibiting
various mechanism of protective effect, allowed to re-
duce the initial concentration of non-penetrating cryo-
protectant twice (down to 10%) in the medium with
OEMC and DMAc in 1:1 ratio in 1.5 times (down to
15%) in the medium with OEMC and DMAc in 3:1
ratio. Cryoprotective efficiency of these media was
significantly higher than that of ‘reference’ solutions
with 20 and 30% OEMC. High level of erythrocytes
survival was achieved at reduced concentration of
cryoprotectants in the medium, i. e. potentially low
toxicity both at cellular and organism level. It is one of
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
305
растворов с 20 и 30% ОЭМЦ. Cнижение содержа-
ния криопротекторов в криозащитной среде позво-
лит уменьшить ее токсичность на клеточном и
организменном уровне. Это является одним из
важных условий создания безотмывочных мето-
дов криоконсервирования эритроцитов для клини-
ческой практики.
Выводы
1. Показана эффективность использования
криозащитных сред, содержащих комбинации не-
проникающего (ОЭМЦ) и проникающего криопро-
текторов (ДМАц) для замораживания эритроцитов
человека.
2. Определены соотношения концентраций
ОЭМЦ и ДМАц в криозащитной среде 1:1 (10 и
10% масс. соответственно) и 3:1 (15 и 5% масс.
соответственно), обеспечивающие максимальную
сохранность эритроцитов после замораживания-
отогрева.
3. Использование криозащитных сред, содер-
жащих ОЭМЦ и ДМАц в соотношении 10 и 10%
масс., а также 15 и 5% масс. соответственно позво-
лило снизить концентрацию непроникающего крио-
протектора ОЭМЦ по сравнению с «базовыми»
растворами 20 и 30% ОЭМЦ и при этом повысить
осмотическую устойчивость криоконсервирован-
ных эритроцитов: сохранность размороженных
эритроцитов после помещения их в изотони-
ческую среду NaCl составляла в среднем 92%.
4. Установлена корреляция осмотической хруп-
кости эритроцитов после замораживания-отогрева
с показателями гематокрита до замораживания
после экспозиции в средах (k = –0,92), а также
показателями внутриклеточного содержания калия
(k = –0,90) и натрия (k = 0,66) после заморажи-
вания-отогрева.
the important requirements in developing ‘no-wash’
techniques to cryopreserve erythrocytes for clinical
application.
Conclusions
1. Cryoprotective media combining non-penetrating
cryoprotectant OEMC and penetrating cryoprotectant
DMAc are effective to cryopreserve human erythro-
cytes.
2. Highest post-thaw survival of erythrocytes could
be achieved when using cryoprotective medium with
OEMC and DMAc ratios of 1:1 (10 and 10% w/w,
correspondingly) and 3:1 (15 and 5% w/w, correspon-
dingly).
3. Using of cryoprotective media combining OEMC
and DMAc with 10 and 10% w/w, 15 and 5% w/w,
correspondingly allows to reduce the concentration of
non-penetrating cryoprotectant OEMC if compared
with ‘reference’ media with 20 and 30% w/w OEMC,
and to elevate osmotic resistance of cryopreserved
erythrocytes: survival of frozen-thawed erythrocytes
after trasferring them into isotonic solution of NaCl
was 92% in average.
4. Posthaw osmotic fragility of erythrocytes corre-
lates with hematocrit indices measured before freezing
after exposure in the media (k = –0.92) and post-thaw
intracellular content of potassium (k = –0.90) and
sodium (k = 0.66).
References
1. Babijchuk L.A., Zemlyanskikh N.G. Optimization and advantages
of washing-out method for erythrocytes cryopreservation with
PEO-1500 // Problems of Cryobiology. – 2001. – N1. – P. 35–
41.
2. Belous A.M., Grischenko V.I. Cryobiology. – Kiev: Naukova
Dumka, 1994. – 430 p.
3. Bidnyy S.Yu, Averyanov M.V. Serebryakov V.G. et al. Phase
transformations in dimethyl acetamide water system // Physi-
cochemical properties and biological effect of cryoprotectants:
Collection of scientific papers. – Kharkov, 1990. – P. 5–8.
4. Bogdanchikova O.A., Kireev V.A., Khodko A.T., Kompa-
niets A.M. Platelet cryopreservation. 2. Efficiency of cryopre-
servatives based on cryoprotectant combinations under dif-
ferent freezing regimens// Problems of Cryobiology. – 2010. –
Vol. 20, N4. – P. 443–451.
5. Gulevsky A.K., Bondarenko V.A., Belous A.M. Barrier properties
of biomembranes at low temperatures. – Kiev: Naukova Dumka,
1988. – 208 p.
6. Zinchenko A.V., Krasnikova A.O., Musatova I.B. et al. Phase
behaviour of hydro-oxyethylated methyl cellosolve system
with polymerization degree of n=33–35 below 273 K // Pro-
ceeding of the 5th Ukrainian Biophysical Society Meeting. –
Lutsk, 2011. – P. 152.
7. Kompaniets A.M., Nikolenko A.V., Chekanova V.V., Trots Yu.P.
Cryopreservation of erythrocytes under oligomer of oxyethy-
lated glycerol (n = 25) // Problems of Cryobiology. – 2005. –
Vol.15, N3. – P. 561–565.
Литература
1. Бабийчук Л.А., Землянских Н.Г. Оптимизация и преиму–
щества безотмывочного метода криоконсервирования
эритроцитов с ПЭО-1500 // Проблемы криобиологии. –
2001. – №1. – С. 35–41.
2. Белоус А.М., Грищенко В.И. Криобиология. – К.: Наук.
думка, 1994. – 430 с.
3. Бидный С.Ю., Аверьянов М.В., Серебряков В.Г. и др. Фазо-
вые превращения в системе диметилацетамид-вода //
Физико-химические свойства и биологическое действие
криопротекторов: Сб. науч. трудов. – Харьков, 1990. – С. 5–8.
4. Богданчикова О.А, Киреев В.А., Ходько А.Т., Компаниец А.М.
Криоконсервирование тромбоцитов. 2. Эффективность
криоконсервантов на основе комбинаций криопротекто-
ров при различных режимах замораживания // Проблемы
криобиологии. – 2010. – Т. 20, №4. – С. 443–451.
306 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
5. Гулевский А.К., Бондаренко В.А., Белоус A.M. Барьерные
свойства биомембран при низких температурах. – К.:
Наук. думка, 1988. – 208 с.
6. Зинченко А.В., Красникова А.О., Мусатова И.Б., Чекано-
ва В.В., Компаниец А.М. Фазовое поведение системы
вода-оксиэтилированный метилцеллозольв со степенью
полимеризации n = 33–35 ниже 273 К // Збірник тез
доповідей V з’їзду Українського біофізичного товариства. –
Луцк, 2011. – С. 152.
7. Компаниец А.М., Николенко А.В., Чеканова В.В., Троц Ю.П.
Криоконсервирование эритроцитов под защитой олиго-
мера оксиэтилированного глицерина (n = 25) // Проблемы
криобиологии. – 2005. – Т.15, №3. – С. 561–565.
8. Линник Т.П. Амиды алифатических кислот – эффективные
криопротекторы. II. Криозащитные свойства соединений
ряда амидов // Проблемы криобиологии. – 1999, №2. –
С. 22–31.
9. Линник Т.П., Мартынюк И.Н., Гавилей О.В., Белецкий Е.М.
Цитотоксическое действие диолов, амидов и их смесей
на сперму петухов и индюков до замораживания // Пробле-
мы криобиологии. – 2009. – Т. 19, №4, – С. 383–394.
10.Лоевский М.М., Воротилин А.М., Гулевский А.К., Бело-
ус А.М. Динамика содержания катионов и фосфороргани-
ческих соединений в эритроцитах после низкотемпера-
турной консервации (–196°С) под защитой 1,2-пропан-
диола и глицерина // Бюлл. экспер. биол. – 1982. – Т. 94,
№9. – С. 95–97.
11.Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в
клинике: Методы гематологических исследований. – М.:
Медицина, 1987. – 363 c.
12.Николенко А.В., Вязовская О.В. Исследование сохраннос-
ти эритроцитов в зависимости от состава криозащитной
среды на основе непроникающего криопротектора окси-
этилированного метилцеллозольва // Вісник Харківського
національного університету імені В.Н.Каразіна. Серія
«Біологія». – 2011. – №947, Вип. 13. – С. 152–158.
13.Новиков А.Н., Кулешова Л.Г., Линник Т.П. Механизмы роста
кристаллов льда в сложных биологических системах //
Биофизика. – 1991. – Т. 36, №1. – С. 122–127.
14.Пушкарь Н.С., Белоус А.М. Введение в криобиологию. –
Киев: Наук. думка, 1975. – 344 с.
15.Рамазанов В.В. Криозащитная эффективность комбини-
рованной среды с непроникающим и проникающим
криопротекторами при замораживании эритроцитарных
суспензий различного объема // Проблемы криобиологии
и криомедицины. – 2013. – Т. 23, №2. – С. 124–134.
16.А.с. №1622995, СССР, МПК А61N1/02. Криопротектор
эритроцитов человека / Л.П. Бредихина, О.В. Липина,
Л.А. Ханина и др. – Заявл. 03.10.1988, №4489413/30-14;
1991; Бюл. №1.
17.Патент 2326532, РФ, МПК A01N1/02. Способ криоконсервиро-
вания тромбоцитов / А.А. Костяев, Ф.С. Шерстнев, С.В. Уте-
мов и др. – Заявл. 29.08.2006; Публ. 20.06.2008; Бюл. №17.
18.Crawford A., Harris H. Balancing act: Na+ sodium K+ potas-
sium // Nursing. – 2011. – Vol. 41, Issue 7. – P. 44–50.
19.Edwards S. Regulation of water, sodium and potassium:
implications for practice // Nursing Standard. – 2001. – Vol. 15,
№22. – P. 36–42.
20.Glafke C., Akhoondi M., Oldenhof H. et al. Cryopreservation of
platelets using trehalose: the role of membrane phase behavior
during freezing // Biotechnol. Prog. – 2012. – Vol. 28, №5. –
P. 1347–1354.
21.Growe H., Oliver. A.E., Yoekstra F.A., Growe L.M. Stabilization
of dry membrane by mixtures of hydroxyethyl starch and glu-
cose: the role of vitrification // Cryobiology. – 1997. – Vol. 35,
№1. – P. 20–30.
22.Nikolenko A.V., Chekanova V.V., Schetinsky M.I., Vyazov-
ska O.V. Relation between cryoprotective and physico-
chemical properties of oxyethylated methyl cellosolve-based
media // Cryoletters. – 2013. – Vol. 34, №5. – P. 527–534.
8. Linnik T.P. Amides of aliphatic acids are effective cryo-
protectants. II. Cryoprotective properties of compounds of
amides series // Problems of Cryobiology. – 1999. – N2. –
P. 22–31.
9. Linnik T.P., Martynyuk I.N., Gaviley O.V., Beletsky E.M. Cytotoxic
effect of diols, amides and their mixtures on fowl and turkey
sperm prior to freezing // Problems of Cryobiology. – 2009. –
Vol.19, N4. – P. 383–394.
10.Loevsky M.M., Vorotilin A.M., Gulevsky A.K., Belous A.M. Dy-
namics of content of cations and phosphoorganic compounds
in erythrocytes after low-temperature preservation (–196°C)
under protection of 1,2-propane diol and glycerol // Bull. Eksper.
Biol. – 1982. – Vol. 94, N9. – P. 95–97.
11.Menshikov V.V. Laboratory methods of research in clinic:
Methods of hematological studies. – Moscow: Meditsyna,
1987. – 363 p.
12.Nikolenko A.V., Vyazovskaya O.V. Studying survival of erythro-
cytes depending on composition of cryoprotective media based
on non-penetrating cryoprotectant oxyethylated methyl
cellosolve // Visnyk Kharkivskogo Natsionalnogo Universytetu
Imeni V.N. Karazina. Series: Biologiya. – 2011. – N947,
Issue 13. – P. 152–158.
13.Novikov A.N., Kuleshova L.G., Linnik T.P. Mechanisms of growth
of ice crystals in complex biology systems // Biofizika. – 1991. –
Vol. 36, N1. – P. 122–127.
14.Pushkar N.S., Belous A.M. Introduction into cryobiology. – Kiev:
Naukova Dumka. – 1975. – 344 p.
15.Ramazanov V.V. Cryoprotective efficiency of medium com-
bining non-penetrating and penetrating cryoprotectants when
freezing erythrocyte suspensions of various volumes //
Problems of Cryobiology and Cryomedicine. – 2013. – Vol. 23,
N2. – P. 124–134.
16.Pat.1622995 of USSR, IPC A61N1/02. Cryoprotectant for hu-
man erythrocytes / L.P. Bredikhina, O.V. Lipina, L.A. Khanina
et al.; N4489413/30-14; Filed 03.10.1988; Publ. 1991; Bull. 1.
17.Pat. 2326532 of Russian Federation, IPC A01N1/02. Cryopre-
servation method of platelets / A.A. Kostyaev, F.S. Sherstnev,
S.V. Utemov et al.; Filed 29.08.2006; Publ. 20.06.2008; Bull. 17.
18.Crawford A., Harris H. Balancing act: Na+ sodium K+ potas-
sium // Nursing. –2011. – Vol. 41, Issue 7. – P. 44–50.
19.Edwards S. Regulation of water, sodium and potassium:
implications for practice // Nursing Standard. – 2001. – Vol. 15,
N22. – P. 36–42.
20.Glafke C., Akhoondi M., Oldenhof H. et al. Cryopreservation of
platelets using trehalose: the role of membrane phase behavior
during freezing // Biotechnol. Prog. – 2012. – Vol. 28, N5. –
P. 1347–1354.
21.Growe H., Oliver. A.E., Yoekstra F.A., Growe L.M. Stabilization
of dry membrane by mixtures of hydroxyethyl starch and glu-
cose: the role of vitrification // Cryobiology. – 1997. – Vol. 35,
N1. – P. 20–30.
22.Nikolenko A.V., Chekanova V.V., Schetinsky M.I., Vyazov-
ska O.V. Relation between cryoprotective and physico-
chemical properties of oxyethylated methyl cellosolve-based
media // Cryoletters. – 2013. – Vol. 34, N5. – P. 527–534.
23.Petrenko Y.A., Jones D.R.E., Petrenko A.Y. Cryopreservation
of human fetal liver hematopoietic stem / progenitor cells using
sucrose as an additive to the cryoprotective medium // Cryo-
biology. – 2008. –Vol. 57, N3. – P. 195–200.
24.Quan G.B., Han Y., Liu M.X., Gao F. Effects of pre-freeze
incubation of human red blood cells with various sugars on
postthaw recovery when using a dextran-rapid cooling
protocol // Cryobiology. – 2009. – Vol. 59, N3. – P. 258–267.
25.Quan G.B., Han Y., Liu M.X. et al. Addition of oligosaccharide
decreases the freezing lesions on human red blood cell mem-
brane in the presence of dextran and glucose // Cryobiology. –
2011. – Vol. 62, N2. – P. 135–144.
26.Savitz D., Sidel V.W., Solomon A.K. Osmotic properties of
human red cells // J. Gen. Physiol. – 1964. – Vol. 48, N1. –
P. 79–94.
проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
307
23.Petrenko Y.A., Jones D.R.E., Petrenko A.Y. Cryopreservation
of human fetal liver hematopoietic stem / progenitor cells using
sucrose as an additive to the cryoprotective medium // Cryo-
biology. – 2008. – Vol. 57, №3. – P. 195–200.
24.Quan G.B., Han Y., Liu M.X., Gao F. Effects of pre-freeze
incubation of human red blood cells with various sugars on
postthaw recovery when using a dextran-rapid cooling
protocol // Cryobiology. – 2009. – Vol. 59, №3. – P. 258–267.
25.Quan G.B., Han Y., Liu M.X. et al. Addition of oligosaccharide
decreases the freezing lesions on human red blood cell mem-
brane in the presence of dextran and glucose // Cryobiology. –
2011. – Vol. 62, №2. – P. 135–144.
26.Savitz D., Sidel V.W., Solomon A.K. Osmotic properties of
human red cells // J. Gen. Physiol. – 1964. – Vol. 48, №1. –
P. 79–94.
27.Valeri C.R. Blood banking and the use of frozen blood
products. – Cleveland: CRC Press, 1976. – 417 p.
28.Zhivotova E.N., Zinchenko A.V., Kuleshova L.G., Chekano-
va V.V., Kompaniets A.M. Physical states of aqueous solutions
of oxyethylated glycerol with polymerization degree of n = 30
at temperatures lower than 283 K // CryoLetters. – 2007. –
Vol. 28, №4. – P. 261–270.
27.Valeri C.R. Blood banking and the use of frozen blood
products. – Cleveland: CRC Press, 1976. – 417 p.
28.Zhivotova E.N., Zinchenko A.V., Kuleshova L.G., Chekano-
va V.V., Kompaniets A.M. Physical states of aqueous solutions
of oxyethylated glycerol with polymerization degree of n = 30
at temperatures lower than 283 K // CryoLetters. – 2007. –
Vol. 28, N4. – P. 261–270.
308 проблемы криобиологии и криомедицины
problems of cryobiology and cryomedicine
том/volume 23, №/issue 4, 2013
|
| id | nasplib_isofts_kiev_ua-123456789-68761 |
| institution | Digital Library of Periodicals of National Academy of Sciences of Ukraine |
| issn | 2307-6143 |
| language | Russian |
| last_indexed | 2025-12-07T18:11:19Z |
| publishDate | 2013 |
| publisher | Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України |
| record_format | dspace |
| spelling | Николенко, А.В. Вязовская, О.В. Чеканова, В.В. 2014-09-28T09:13:37Z 2014-09-28T09:13:37Z 2013 Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека / А.В. Николенко, О.В. Вязовская, В.В. Чеканова // Проблемы криобиологии и криомедицины. — 2013. — Т. 23, № 4. — С. 297-308. — Бібліогр.: 28 назв. — рос., англ. 2307-6143 https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68761 57.043:611.013:57.043 Перспективным направлением при разработке криозащитных сред для криоконсервирования эритроцитов является использование смеси криопротекторов, относящихся к разным классам химических соединений. В данном исследовании оценивали криозащитную активность комбинаций представителя класса полиолов – непроникающего криопротектора оксиэтилированного метилцеллозольва со степенью полимеризации n = 33–35 и класса амидов – проникающего криопротектора диметилацетамида (ДМАц). Перспективним напрямком при розробці кріозахисних середовищ для кріоконсервування еритроцитів є використання суміші кріопротекторів, які належать до різних класів хімічних сполук. У цьому дослідженні оцінювали кріозахисну активність комбінацій представника класу поліолів – непроникаючого кріопротектора оксиетильованого метилцелозольву зі ступенем полімерізації n = 33–35 і класу амидів – проникаючого кріопротектора диметилацетаміду (ДМАц). Using the media, which combine cryoprotectants being chemicals of different classes, is prospective when developing cryoprotective solutions to cryopreserve erythrocytes. This investigation was performed to evaluate cryoprotective activity of media combining representative of polyols, non-penetrating cryoprotectant oxyethylated methyl cellosolve with polymerization degree of n = 33–35 and the representative of amides, penetrating cryoprotectant dimethyl acetamide (DMAc). ru Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Проблемы криобиологии и криомедицины Теоретическая и экспериментальная криобиология Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека Cryoprotective Efficiency of Media Combining Oxyethylated Methylcellosolve and Dimethyl Acetamide during Freeze-Thawing of Human Erythrocytes Article published earlier |
| spellingShingle | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека Николенко, А.В. Вязовская, О.В. Чеканова, В.В. Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| title | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| title_alt | Cryoprotective Efficiency of Media Combining Oxyethylated Methylcellosolve and Dimethyl Acetamide during Freeze-Thawing of Human Erythrocytes |
| title_full | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| title_fullStr | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| title_full_unstemmed | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| title_short | Криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| title_sort | криозащитная эффективность сред, содержащих комбинации оксиэтилированного метилцеллозольва и диметилацетамида при замораживании-отогреве эритроцитов человека |
| topic | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| topic_facet | Теоретическая и экспериментальная криобиология |
| url | https://nasplib.isofts.kiev.ua/handle/123456789/68761 |
| work_keys_str_mv | AT nikolenkoav kriozaŝitnaâéffektivnostʹsredsoderžaŝihkombinaciioksiétilirovannogometilcellozolʹvaidimetilacetamidaprizamoraživaniiotogreveéritrocitovčeloveka AT vâzovskaâov kriozaŝitnaâéffektivnostʹsredsoderžaŝihkombinaciioksiétilirovannogometilcellozolʹvaidimetilacetamidaprizamoraživaniiotogreveéritrocitovčeloveka AT čekanovavv kriozaŝitnaâéffektivnostʹsredsoderžaŝihkombinaciioksiétilirovannogometilcellozolʹvaidimetilacetamidaprizamoraživaniiotogreveéritrocitovčeloveka AT nikolenkoav cryoprotectiveefficiencyofmediacombiningoxyethylatedmethylcellosolveanddimethylacetamideduringfreezethawingofhumanerythrocytes AT vâzovskaâov cryoprotectiveefficiencyofmediacombiningoxyethylatedmethylcellosolveanddimethylacetamideduringfreezethawingofhumanerythrocytes AT čekanovavv cryoprotectiveefficiencyofmediacombiningoxyethylatedmethylcellosolveanddimethylacetamideduringfreezethawingofhumanerythrocytes |